JP2014093953A

JP2014093953A - １−アシル−２，３−環状ホスファチジン酸またはその塩の製造方法

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Publication number: JP2014093953A
Application number: JP2012245864A
Authority: JP
Inventors: Koji Iimori; 幸二飯盛; Shinji Hayashi; 伸二林; Misaki Ishida; 実咲石田
Original assignee: NOF Corp
Current assignee: NOF Corp
Priority date: 2012-11-07
Filing date: 2012-11-07
Publication date: 2014-05-22
Anticipated expiration: 2032-11-07
Also published as: JP6003551B2

Abstract

【課題】コリンが低減された１−アシル−２，３−環状ホスファチジン酸またはその塩の製造法の提供。
【解決手段】特定のリゾホスファチジルコリンとホスホリパーゼＤ、ナトリウム原子およびカルシウム原子を含有する水溶液中で酵素反応させ、エタノール添加後、０〜８℃で１５〜３０時間静置し、得られたろ液をＮａ型の強酸性陽イオン交換樹脂処理することで、１−アシル−２，３−環状ホスファチジン酸またはその塩（式［II］）。

（式中、Ｒは炭素数１０〜２２のアシル基を表す。）
【選択図】なし

Description

本発明は、１−アシル−２，３−環状ホスファチジン酸またはその塩の製造方法に関する。

特開平５−２３００８８号公報（特許文献１）にて、真性粘菌(Physarum polycephalum) の培養液から精製され、構造決定されたユニークな構造のリゾリン脂質である１−アシル−２，３−環状ホスファチジン酸が報告されている。その化合物は、抗癌活性から神経再生など多岐にわたる機能を有しており、ヒト血清中に０. １μＭ程度存在するほか、涙液など生体中に普遍的に存在することが明らかとなってきている。

１−アシル−２，３−環状ホスファチジン酸の一般的な製造方法として、上記真性粘菌の培養液から精製する方法、リゾホスファチジルコリン（ＬＰＣ）を酵素であるホスホリパーゼＤで処理して得る方法、および化学合成して得る方法が挙げられる。

例えば、リゾホスファチジルコリン（ＬＰＣ）と酵素の賦活剤である塩化カルシウムを含む水溶液へホスホリパーゼＤを添加し、酵素反応（４０℃、１８時間）により１−アシル−２，３−環状ホスファチジン酸を得る製造方法（特許文献２：特開２０１１−２１１９２１号公報）が報告されている。特許文献２では、酵素反応後の溶液は、有機溶媒であるクロロホルムとメタノールの混液によって分液処理されている。

しかし、特許文献２の方法は、１−アシル−２，３−環状ホスファチジン酸を化粧品分野等へ応用することを考えた場合、クロロホルムなどの有機溶媒を使用している点で健康・安全性の面から好ましくない。また、賦活剤である塩化カルシウムを使用した場合、水溶液中で１−アシル−２，３−環状ホスファチジン酸がカルシウムイオンと錯体を形成するので、沈殿を生じやすく、収率の点で好ましくない。さらに、４０℃にて１８時間と長時間の酵素反応であるので、１−アシル−２，３−環状ホスファチジン酸が過度に酸化されるおそれがある。

また、リゾホスファチジルコリン（ＬＰＣ）をホスホリパーゼＤで処理する方法では、副生成物としてコリンが生成する。コリンは、ＥＵ、中国、韓国、アセアンなどで化粧品配合禁止成分とされており、現在のところ、効率よくコリンを低減する方法は報告されていない。コリン低減方法としては、油水分離、シリカゲルなどを使用したカラムクロマトグラフィー、およびイオン交換処理などが挙げられる。しかし、油水分離やカラムクロマトグラフィーでは、有機溶媒（ヘキサン、クロロホルムなど）が使用されるので健康・安全性の面で好ましくなく、またシリカゲルにより１−アシル−２，３−環状ホスファチジン酸の環状部分が分解するおそれがあり、効率よくコリンを低減することができない。

特開平５−２３００８８号公報特開２０１１−２１１９２１号公報

本発明の目的は、効率よくコリンが低減され、過酸化物価が低く、健康・安全性の面で優れた１−アシル−２，３−環状ホスファチジン酸またはその塩を簡便かつ高収率で、すなわち経済的有利に製造する方法を提供することである。

本発明者らは、上記課題に鑑み鋭意検討した結果、リゾホスファチジルコリン（ＬＰＣ）と特定のホスホリパーゼＤを使用し、特定の酵素反応工程、反応後処理工程、およびイオン交換樹脂処理工程を組み合わせることによって、上記目的を達成できることを見出した。

すなわち本発明は、式［Ｉ］で表されるリゾホスファチジルコリン（ＬＰＣ）と放線菌（Actinomadura属）由来のホスホリパーゼＤとをナトリウム原子の含有量が０．２質量％以下、およびカルシウム原子の含有量が０．０２質量％以下である水溶液中で５０〜６５℃にて４〜１０時間酵素反応させる工程と、
酵素反応の後処理として、エタノールを添加し、０〜８℃で１５〜３０時間静置保存し、反応液をろ過する工程と、
ろ過して得られたろ液をＮａ型の強酸性陽イオン交換樹脂により処理する工程とを含むことを特徴とする、式［II］で表される１−アシル−２，３−環状ホスファチジン酸またはその塩の製造方法である。

（式中、Ｒは炭素数１０〜２２のアシル基を表す。）

（式中、Ｒは炭素数１０〜２２のアシル基を表す。）

本発明の１−アシル−２，３−環状ホスファチジン酸またはその塩の製造方法によれば、効率よくコリンが低減され、過酸化物価が低く、健康・安全性の面で優れた１−アシル−２，３−環状ホスファチジン酸またはその塩を簡便かつ高収率で、すなわち経済的有利に製造することができる。

以下、本発明の実施形態を説明する。本発明の１−アシル−２，３−環状ホスファチジン酸またはその塩の製造方法は、リゾホスファチジルコリン（ＬＰＣ）と特定のホスホリパーゼＤを使用し、特定の酵素反応工程、反応後処理工程、およびイオン交換樹脂処理工程を組み合わせたことを特徴とする。以下、各工程の詳細について説明する。なお、以下では、１−アシル−２，３−環状ホスファチジン酸またはその塩を１−アシル−２，３−環状ホスファチジン酸（塩）とも表記する。

〔酵素反応工程〕
本発明における酵素反応工程は、上記式［Ｉ］で表されるリゾホスファチジルコリン（ＬＰＣ）と放線菌（Actinomadura属）由来のホスホリパーゼＤとをナトリウム原子の含有量が０．２質量％以下、およびカルシウム原子の含有量が０．０２質量％以下である水溶液中で５０〜６５℃にて４〜１０時間酵素反応させる工程である。なお、酵素反応の際に用いる溶媒は水のみである。

本発明に使用されるリゾホスファチジルコリン（ＬＰＣ）は、上記式［Ｉ］で示されるものである。
上記式［Ｉ］および［II］中のＲは炭素数１０〜２２のアシル基であり、好ましくは、炭素数１２〜２０の直鎖状もしくは分岐鎖状の脂肪酸由来のアシル基である。
脂肪酸としては、カプリン酸、ラウリン酸、ミリスチン酸、パルミチン酸、ステアリン酸、イソステアリン酸等の飽和脂肪酸、パルミトレイン酸、オレイン酸、リノール酸、リノレン酸、アラキドン酸、エイコサペンタエン酸、ドコサヘキサエン酸等の不飽和脂肪酸、およびこれらの混合物であるヤシ油脂肪酸、パーム核油脂肪酸、牛脂脂肪酸、硬化牛脂脂肪酸、大豆リン脂質由来脂肪酸、卵黄リン脂質由来脂肪酸が挙げられる。

リゾホスファチジルコリン（ＬＰＣ）としては、純品のリゾホスファチジルコリン（ＬＰＣ）、ホスファチジルコリン（ＰＣ）とホスホリパーゼＡ２との酵素反応によって得られたリゾホスファチジルコリン（ＬＰＣ）、もしくはリゾレシチンを使用することができる。なお、ホスファチジルコリン（ＰＣ）とホスホリパーゼＡ２との酵素反応では、ホスファチジルコリン（ＰＣ）の２つのアシル基の内、Ｃ２位のアシル基が分解することで、１つのアシル基を有する（リゾ体）リゾホスファチジルコリン（ＬＰＣ）となる。

これらのリゾホスファチジルコリン（ＬＰＣ）の中でも、安価かつ簡単に入手可能なリゾレシチンを用いることが経済的に好ましい。しかし、リゾレシチンを用いた製造では、純品のリゾホスファチジルコリン（ＬＰＣ）を用いた製造と比較して、粘性が高い反応溶液となるので、反応溶媒の量を調整することなどが必要となる。
リゾレシチンとしては、市販品もしくはレシチンとホスホリパーゼＡ２との酵素反応によって得られたリゾレシチンを使用することができる。その中でも、大豆由来リゾレシチン、および卵黄由来リゾレシチンが好ましく、更に好ましくは大豆由来リゾレシチンである。
リゾレシチン中のリゾホスファチジルコリン（ＬＰＣ）の濃度は、好ましくは１０質量％以上、更に好ましくは１５質量％以上、特に好ましくは２０質量％以上である。１０質量％未満では効率よく１−アシル−２，３−環状ホスファチジン酸（塩）を得るのが困難となることがある。上記条件を満たすリゾレシチンとしては、例えば、リゾホスファチジルコリン（ＬＰＣ）を１８〜３０質量％含有する大豆由来リゾレシチンである「ＳＬＰ−ホワイトリゾ」（辻製油株式会社製）、リゾホスファチジルコリン（ＬＰＣ）を６５〜７５質量％含有する大豆由来リゾレシチンである「ＳＬＰ−ＬＰＣ７０」（辻製油株式会社製）が挙げられる。
なお、レシチンとは、グリセロリン脂質の一種であり、自然界の動植物においてすべての細胞中に存在し、生体膜の主要構成成分である。レシチンにはホスファチジルコリン（ＰＣ）が多く含まれており、工業的には、レシチンは各種のリン脂質を主体とする混合物の一般的な名称である。レシチンは、通常、動植物より得られた油から分離して得られる。

本発明に使用される放線菌（Actinomadura属）由来のホスホリパーゼＤとしては、放線菌（Actinomadura属）No.３６２由来のホスホリパーゼＤが好ましく、例えば、「ホスホリパーゼＤ」（名糖産業株式会社製）が挙げられる。なお、酵素反応に際しては、化粧料や医薬品等の皮膚外用剤に常用されている酸化防止剤などを本発明の効果に影響を及ぼさない程度で使用することも可能である。例えば、ビタミンＥ、ビタミンＣなどが酵素反応溶液中に含まれていてもよい。

酵素反応溶液中のリン脂質の濃度、ホスホリパーゼＤの濃度は、効率よく酵素反応が進行するように適宜設定される。酵素反応溶液中のリン脂質の濃度は、好ましくは５〜３５質量％であり、より好ましくは１０〜３０質量％である。５質量％未満では効率よく１−アシル−２，３−環状ホスファチジン酸（塩）を得ることが困難となることがあり、３５質量％を超えると反応溶液の粘性が高くなるため反応効率が低下することがある。

酵素反応に用いられる水溶液中には、ナトリウム原子、およびカルシウム原子が含まれる。酵素反応溶液中のナトリウム原子、およびカルシウム原子は、原料であるリゾホスファチジルコリン（ＬＰＣ）由来のもの、リゾレシチン由来のもの、あるいは酵素の賦活剤由来のものである。酵素の賦活剤としては、塩化ナトリウム、酢酸ナトリウム、硫酸ナトリウム、塩化カルシウム、酢酸カルシウム、硫酸カルシウムなどが挙げられる。
本発明においては、酵素反応溶液中のナトリウム原子の含有量が０．２質量％以下、好ましくは０．１質量％以下に、カルシウム原子の含量が０．０２質量％以下、好ましくは０．０１質量％以下になるように、原料や賦活剤の使用量を調整する。
ナトリウム原子の含有量が０．２質量％を超えると、後記のイオン交換樹脂処理が阻害されるおそれがある。カルシウム原子の含有量が０．０２質量％を超えると、水溶液中で１−アシル−２，３−環状ホスファチジン酸がカルシウムイオンと錯体を形成して、沈殿を生じるおそれがある。また、後記のイオン交換樹脂処理が阻害されるおそれもある。

ナトリウム原子、及びカルシウム原子の定量方法としては、誘導結合型高周波プラズマ（ＩＣＰ）を光源に用いた発光分光分析方法が挙げられる。

本発明におけるリゾホスファチジルコリン（ＬＰＣ）とホスホリパーゼＤとの酵素反応は、５０〜６５℃、好ましくは５５〜６０℃にて、４〜１０時間、好ましくは６〜８時間で反応させて行なわれる。
反応温度が５０℃未満の場合、酵素の活性が低下して反応率が低下するおそれがあり、６５℃を超えると、高温による酵素失活が進行し反応率が低下するおそれがある。また、反応時間が４時間未満の場合、酵素反応が平衡に到達せず１−アシル−２，３−環状ホスファチジン酸（塩）の収率の低下を招くおそれがあり、１０時間を越えても酵素反応が平衡に達しているため１−アシル−２，３−環状ホスファチジン酸の収率の増加は望めず、経済的に不利となるおそれがある上に、脂質の酸化により品質が悪化するおそれもある。

酸化の度合いは、過酸化物価の測定により確認することができ、測定方法は通常の油脂分析の方法を参考に実施することができる。
酵素反応の進行の確認は、薄層クロマトグラフィー（ＴＬＣ）により１−アシル−２，３−環状ホスファチジン酸のスポットを確認すること、または反応副生成物のコリンを定量することで可能である。定量的であるコリン定量による確認が好ましく、より好ましくは、ＴＬＣとコリン定量の両方による確認である。
ＴＬＣによる確認方法としては、１−アシル−２，３−環状ホスファチジン酸の単一スポットが確認できる方法であれば、特に限定されない。通常は、順相クロマトグラフィーで、スポットの発色剤としてヨウ素を用いる。
コリン定量による確認方法は、酵素反応によりリゾホスファチジルコリン（ＬＰＣ）からコリンが脱離（遊離コリン）し、１−アシル−２，３−環状ホスファチジン酸が生成するメカニズムを応用した方法であり、遊離コリン量／総コリン量×１００の式より反応率（酵素反応の進行度合い）を算出することができる。ここで、総コリン量とは、遊離コリン量とリゾホスファチジルコリン（ＬＰＣ）中の結合コリン量からなるものであり、その定量方法は特に限定されない。例えば、ラボアッセイＴＭリン脂質（コリンオキシダーゼ・ＤＡＯＳ法）キット（和光純薬工業株式会社製）を用いることで、総コリンの定量が可能である。また同様に、遊離コリンのみの定量方法も特に限定されない。例えば、ラボアッセイＴＭリン脂質（コリンオキシダーゼ・ＤＡＯＳ法）キット（和光純薬工業株式会社製）におけるホスホリパーゼＤ反応工程を除くことで、遊離コリンのみの定量が可能である。
本発明における酵素反応率は、好ましくは７０〜１００％であり、より好ましくは８０〜１００％である。７０％未満では効率よく反応が進行していないので、非経済的である。

〔反応後処理工程〕
本発明における上記酵素反応の後処理として、エタノールを添加する酵素失活工程と、０〜８℃で１５〜３０時間静置保存する澱出し工程と、反応液をろ過して沈殿物（澱）を除去するろ過工程とを行なう。

酵素失活工程においては、酵素反応溶液中の水に対して、６０〜８０質量％エタノール水溶液となるようにエタノールを添加することが、酵素を失活させる上で好適である。中でも、６５〜７５質量％エタノール水溶液となるようにエタノールを添加することが好ましい。酵素失活工程は、４０〜６０℃、好ましくは４５〜５５℃にて、１５〜９０分、好ましくは３０〜６０分で行なわれる。

澱出し工程においては、酵素失活工程後、０〜８℃で１５〜３０時間の静置保存を行なう。この静置保存時の温度および静置保存時間の設定は、一般に、静置保存温度に応じて、静置保存時間を適宜設定することができる。すなわち静置保存温度が高ければ静置保存時間を長く設定し、静置保存温度が低ければ静置保存時間を短く設定することができる。例えば、静置保存温度が０℃の場合、静置保存時間は１５〜２０時間が好ましく、静置保存温度が８℃の場合、静置保存時間は２５〜３０時間が好ましい。より好ましくは、３〜６℃にて１８〜２６時間の静置を行なう。静置保存温度が０℃未満では、１−アシル−２，３−環状ホスファチジン酸（塩）の収率が低下するおそれがあり、８℃を超えると静置保存時間が長くなる上、澱出しが不十分となるおそれがある。

ろ過工程においては、澱出し工程を経た酵素反応溶液をろ過して、沈殿物（澱）を除去することで、ろ液を得る。ろ過に際しては公知のろ紙やメッシュなどを用い、失活し変性した酵素残渣などの固形分を除去することで、ろ液が回収される。ろ紙やメッシュなどの素材などは特に限定されない。

〔イオン交換樹脂処理（コリン低減）工程〕
本発明におけるイオン交換樹脂処理工程では、上記ろ過により得られるろ液がイオン交換樹脂処理に使用される。なお、上記ろ液は、濃縮もしくは希釈することなくそのままの状態でイオン交換樹脂処理に使用するのが効率の点で好ましい。
イオン交換樹脂としては、陽イオンであるコリンを低減するため、陽イオン交換樹脂であるＮａ型の強酸性陽イオン交換樹脂が使用される。例えば、Ｎａ型のスルホン酸基を有する強酸性陽イオン交換樹脂である「ダイヤイオンＳＫ 1B」（三菱化学株式会社製）が挙げられる。

なお、Ｎａ型の強酸性陽イオン交換樹脂よりもイオン交換能が優れるＨ型の強酸性陽イオン交換樹脂を使用すると、プロトン（酸性条件下）により１−アシル−２，３−環状ホスファチジン酸の環状部分の分解が進行するおそれがあり、好ましくない。
１−アシル−２，３−環状ホスファチジン酸の環状部分の分解により、リゾホスファチジン酸（ＬＰＡ）が生成するので、ＴＬＣによりリゾホスファチジン酸（ＬＰＡ）のスポットを確認することで、１−アシル−２，３−環状ホスファチジン酸の環状部分の分解の確認が可能である。ＴＬＣによる確認方法としては、リゾホスファチジン酸（ＬＰＡ）の単一スポットが確認できる方法であれば、特に限定されない。通常は、順相クロマトグラフィーで、スポットの発色剤としてヨウ素を用いる。

また、酸性陽イオン交換樹脂と塩基性陰イオン交換樹脂との併用では、１−アシル−２，３−環状ホスファチジン酸が得られ難いので好ましくない。さらに、弱酸性陽イオン交換樹脂では、イオン交換能が低く効率よくコリンを低減することが困難である。

本発明におけるイオン交換樹脂処理方法としては、コリンが十分に低減できる条件であれば、特に制限されない。なお、コリン低減の進行度合いの確認には、前述の遊離コリン定量を用いることができる。

イオン交換樹脂処理によるコリン低減率（（イオン交換樹脂処理前の液の遊離コリン量−イオン交換樹脂処理後の液の遊離コリン量）／イオン交換樹脂処理前の液の遊離コリン量×１００）は、好ましくは９０〜１００％である。９０％未満では効率よくコリンが低減できていない。

イオン交換樹脂処理後の液は、粉末化することも可能である。例えば、賦形剤としてシクロデキストリンを用いた凍結乾燥により、１−アシル−２，３−環状ホスファチジン酸を含有する粉末が製造できる。賦形剤により、さらさらとした取り扱いやすい脂質とすることが可能である。

本発明の製造方法により得られる１−アシル−２，３−環状ホスファチジン酸は、塩の形態をとることも可能である。すなわち、下記式［III］で示される１−アシル−２，３−環状ホスファチジン酸塩であってもよい。

式［III］中のＭとしては、アルカリ金属、アンモニウム、有機アンモニウムなどが挙げられる。アルカリ金属としては、例えば、ナトリウムが挙げられる。有機アンモニウムとしては、例えば、トリエチルアンモニウム、テトラメチルアンモニウムが挙げられる。なお、式［III］中のＲは、式［Ｉ］および［II］中のＲと同様である。
１−アシル−２，３−環状ホスファチジン酸塩の調製法としては、公知の方法を採用することができる。例えば１−アシル−２，３−環状ホスファチジン酸のナトリウム塩を調製する方法としては、例えば、本発明における上記Ｎａ型の強酸性陽イオン交換樹脂処理工程やＮａ塩を用いたｐＨ調整工程などが挙げられる。

以下、実施例および比較例を挙げて本発明をさらに詳細に説明する。下記の実施例１〜３および比較例１〜４について、後記の分析を行ない、更に評価を行なった。

〔実施例１〕
リゾホスファチジルコリン（ＬＰＣ）を２４質量％含有する大豆由来リゾレシチン（辻製油株式会社製「ＳＬＰ−ホワイトリゾ」）３０ｇへ水９０ｇを加え、更に、ビタミンＥ（理研ビタミン株式会社製「理研Ｅオイル８００」）０．０４８ｇを添加し、６０℃にて１時間撹拌しリゾレシチン溶液を調製した。
別に、放線菌（Actinomadura属）由来のホスホリパーゼＤ（名糖産業株式会社製）０．５ｇへ水３０ｇを加え、室温にて３０分間撹拌して得られた酵素溶液を上記リゾレシチン溶液へ加え、６０℃にて８時間撹拌した。なお、酵素反応の進行は、ＴＬＣおよびコリン定量により確認した。また、ＴＬＣによりリゾホスファチジン酸（ＬＰＡ）が生成していないことも確認した。
その後、９５容量％エタノール（発酵アルコール）３００ｇを加え、５０℃にて１時間撹拌した後、５℃にて２４時間静置保存し、ろ紙（アドバンテック東洋株式会社製、５Ｃ）を用いてろ過することでろ液を得た。
Ｎａ型のスルホン酸基を有する強酸性陽イオン交換樹脂であるダイヤイオンＳＫ 1B（三菱化学株式会社製）５０ｇを内径１．６ｃｍのカラムへ充填し、８０容量％エタノール水溶液５０ｍＬで洗浄した後、上記ろ液２００ｍＬをカラムへ加え、０．６５ｍＬ／分の速度で５時間イオン交換処理を行い、イオン交換処理溶液を得た。なお、ＴＬＣによりリゾホスファチジン酸（ＬＰＡ）が生成していないことを確認した。

〔実施例２〕
リゾホスファチジルコリン（ＬＰＣ）を２４質量％含有する大豆由来リゾレシチン（辻製油株式会社製「ＳＬＰ−ホワイトリゾ」）３０ｇへ水９０ｇを加え、更に、ビタミンＥ（理研ビタミン株式会社製「理研Ｅオイル８００」）０．０４８ｇを添加し、６０℃にて１時間撹拌しリゾレシチン溶液を調製した。
別に、放線菌（Actinomadura属）由来のホスホリパーゼＤ（名糖産業株式会社製）０．５ｇへ水３０ｇを加え、室温にて３０分間撹拌して得られた酵素溶液を上記リゾレシチン溶液へ加え、５０℃にて５時間撹拌した。てお、酵素反応の進行は、ＴＬＣおよびコリン定量により確認した。また、ＴＬＣによりリゾホスファチジン酸（ＬＰＡ）が生成していないことも確認した。
その後、９５容量％エタノール（発酵アルコール）３００ｇを加え、５０℃にて１時間撹拌した後、１℃にて１７時間静置保存し、ろ紙（アドバンテック東洋株式会社製、５Ｃ）を用いてろ過することでろ液を得た。
Ｎａ型のスルホン酸基を有する強酸性陽イオン交換樹脂であるダイヤイオンＳＫ 1B（三菱化学株式会社製）５０ｇを内径１．６ｃｍのカラムへ充填し、８０容量％エタノール水溶液５０ｍＬで洗浄した後、上記ろ液２００ｍＬをカラムへ加え、０．６５ｍＬ／分の速度で５時間イオン交換処理を行い、イオン交換処理溶液を得た。なお、ＴＬＣによりリゾホスファチジン酸（ＬＰＡ）が生成していないことを確認した。

〔実施例３〕
リゾホスファチジルコリン（ＬＰＣ）を７０質量％含有する大豆由来リゾレシチン（辻製油株式会社製「ＳＬＰ−ＬＰＣ７０」）２１ｇへ水９９ｇを加え、更に、ビタミンＥ（理研ビタミン株式会株式会社製「理研Ｅオイル８００」）０．０４８ｇを添加し、６０℃にて１時間撹拌しリゾレシチン溶液を調製した。
別に、放線菌（Actinomadura属）由来のホスホリパーゼＤ（名糖産業株式会社製）０．５ｇへ水３０ｇを加え、室温にて３０分間撹拌して得られた酵素溶液を上記リゾレシチン溶液へ加え、６０℃にて８時間撹拌した。なお、酵素反応の進行は、ＴＬＣおよびコリン定量により確認した。また、ＴＬＣによりリゾホスファチジン酸（ＬＰＡ）が生成していないことも確認した。
その後、９５容量％エタノール（発酵アルコール）３００ｇを加え、５０℃にて１時間撹拌した後、５℃にて２４時間静置保存し、ろ紙（アドバンテック東洋株式会社製、５Ｃ）を用いてろ過することでろ液を得た。
Ｎａ型のスルホン酸基を有する強酸性陽イオン交換樹脂であるダイヤイオンＳＫ 1B（三菱化学株式会社製）５０ｇを内径１．６ｃｍのカラムへ充填し、８０容量％エタノール水溶液５０ｍＬで洗浄した後、上記ろ液１００ｍＬをカラムへ加え、０．６５ｍＬ／分の速度で５時間イオン交換処理を行い、イオン交換処理溶液を得た。なお、ＴＬＣによりリゾホスファチジン酸（ＬＰＡ）が生成していないことを確認した。

〔比較例１〕
リゾホスファチジルコリン（ＬＰＣ）を２４質量％含有する大豆由来リゾレシチン（辻製油株式会社製「ＳＬＰ−ホワイトリゾ」）３０ｇへ塩化カルシウム水溶液９０ｇ（塩化カルシウム（二水和物）を０．２２１ｇ含有）を加え、更に、ビタミンＥ（理研ビタミン株式会社製「理研Ｅオイル８００」）０．０４８ｇを添加し、６０℃にて１時間撹拌しリゾレシチン溶液を調製した。
別に、放線菌（Actinomadura属）由来のホスホリパーゼＤ（名糖産業株式会社製）０．５ｇへ水３０ｇを加え、室温にて３０分間撹拌して得られた酵素溶液を上記リゾレシチン溶液へ加え、４０℃にて１８時間撹拌した。なお、酵素反応の進行は、ＴＬＣおよびコリン定量により確認した。また、ＴＬＣによりリゾホスファチジン酸（ＬＰＡ）が生成していないことも確認した。
その後、９５容量％エタノール（発酵アルコール）３００ｇを加え、５０℃にて１時間撹拌した後、５℃にて２４時間静置保存し、ろ紙（アドバンテック東洋株式会社製、５Ｃ）を用いてろ過することでろ液を得た。
Ｎａ型のスルホン酸基を有する強酸性陽イオン交換樹脂であるダイヤイオンＳＫ 1B（三菱化学株式会社製）５０ｇを内径１．６ｃｍのカラムへ充填し、８０容量％エタノール水溶液５０ｍＬで洗浄した後、上記ろ液２００ｍＬをカラムへ加え、０．６５ｍＬ／分の速度で５時間イオン交換処理を行い、イオン交換処理溶液を得た。なお、ＴＬＣによりリゾホスファチジン酸（ＬＰＡ）が生成していないことを確認した。

〔比較例２〕
リゾホスファチジルコリン（ＬＰＣ）を２４質量％含有する大豆由来リゾレシチン（辻製油株式会社製「ＳＬＰ−ホワイトリゾ」）３０ｇへ水９０ｇを加え、更に、ビタミンＥ（理研ビタミン株式会社製「理研Ｅオイル８００」）０．０４８ｇを添加し、６０℃にて１時間撹拌しリゾレシチン溶液を調製した。
別に、放線菌（Actinomadura属）由来のホスホリパーゼＤ（名糖産業株式会社製）０．５ｇへ水３０ｇを加え、室温にて３０分間撹拌して得られた酵素溶液を上記リゾレシチン溶液へ加え、６０℃にて８時間撹拌した。なお、酵素反応の進行は、ＴＬＣおよびコリン定量により確認した。また、ＴＬＣによりリゾホスファチジン酸（ＬＰＡ）が生成していないことも確認した。
その後、９５容量％エタノール（発酵アルコール）３００ｇを加え、５０℃にて１時間撹拌した後、５℃にて２４時間静置保存し、ろ紙（アドバンテック東洋株式会社製、５Ｃ）を用いてろ過することでろ液を得た。
Ｈ型のスルホン酸基を有する強酸性陽イオン交換樹脂である「アンバーライトＩＲ１２０Ｂ H AG」（オルガノ株式会社製）５０ｇを内径１．６ｃｍのカラムへ充填し、８０容量％エタノール水溶液５０ｍＬで洗浄した後、上記ろ液２００ｍＬをカラムへ加え、０．６５ｍＬ／分の速度で５時間イオン交換処理を行い、イオン交換処理溶液を得た。なお、ＴＬＣにより、１−アシル−２，３−環状ホスファチジン酸のスポットが消失していること、リゾホスファチジン酸（ＬＰＡ）が生成していることを確認した。

〔比較例３〕
リゾホスファチジルコリン（ＬＰＣ）を２４質量％含有する大豆由来リゾレシチン（辻製油株式会社製「ＳＬＰ−ホワイトリゾ」）３０ｇへ水９０ｇを加え、更に、ビタミンＥ（理研ビタミン株式会社製「理研Ｅオイル８００」）０．０４８ｇを添加し、６０℃にて１時間撹拌しリゾレシチン溶液を調製した。
別に、放線菌（Actinomadura属）由来のホスホリパーゼＤ（名糖産業株式会社製）０．５ｇへ水３０ｇを加え、室温にて３０分間撹拌して得られた酵素溶液を上記リゾレシチン溶液へ加え、６０℃にて８時間撹拌した。なお、酵素反応の進行は、ＴＬＣおよびコリン定量により確認した。また、ＴＬＣによりリゾホスファチジン酸（ＬＰＡ）が生成していないことも確認した。
その後、９５容量％エタノール（発酵アルコール）３００ｇを加え、５０℃にて１時間撹拌した後、５℃にて２４時間静置保存し、ろ紙（アドバンテック東洋株式会社製、５Ｃ）を用いてろ過することでろ液を得た。
Ｈ型のスルホン酸基を有する強酸性陽イオン交換樹脂である「アンバーライトＩＲ１２０Ｂ H AG」（オルガノ株式会社製）２５ｇとＯＨ型の強塩基性陰イオン交換樹脂である「アンバーライトＩＲＡ４０２ＢＬ OH AG」（オルガノ株式会社製）２５ｇとを良く混ぜ合わせ、内径１．６ｃｍのカラムへ充填し、８０容量％エタノール水溶液５０ｍＬで洗浄した後、上記ろ液２００ｍＬをカラムへ加え、０．６５ｍＬ／分の速度で５時間イオン交換処理を行い、イオン交換処理溶液を得た。なお、ＴＬＣにより、１−アシル−２，３−環状ホスファチジン酸のスポットが消失していること、リゾホスファチジン酸（ＬＰＡ）のスポットが無いことを確認した。

〔比較例４〕
リゾホスファチジルコリン（ＬＰＣ）を２４質量％含有する大豆由来リゾレシチン（辻製油株式会社製「ＳＬＰ−ホワイトリゾ」）３０ｇへ食塩水９０ｇ（塩化ナトリウムを３．８５ｇ含有）を加え、更に、ビタミンＥ（理研ビタミン株式会株式会社製「理研Ｅオイル８００」）０．０４８ｇを添加し、６０℃にて１時間撹拌しリゾレシチン溶液を調製した。
別に、放線菌（Actinomadura属）由来のホスホリパーゼＤ（名糖産業株式会社製）０．５ｇへ水３０ｇを加え、室温にて３０分間撹拌して得られた酵素溶液を上記リゾレシチン溶液へ加え、６０℃にて８時間撹拌した。なお、酵素反応の進行は、ＴＬＣおよびコリン定量により確認した。また、ＴＬＣによりリゾホスファチジン酸（ＬＰＡ）が生成していないことも確認した。
その後、９５容量％エタノール（発酵アルコール）３００ｇを加え、５０℃にて１時間撹拌した後、５℃にて２４時間静置保存し、ろ紙（アドバンテック東洋株式会社製、５Ｃ）を用いてろ過することでろ液を得た。
Ｎａ型のスルホン酸基を有する強酸性陽イオン交換樹脂であるダイヤイオンＳＫ１Ｂ（三菱化学株式会社製）５０ｇを内径１．６ｃｍのカラムへ充填し、８０容量％エタノール水溶液５０ｍＬで洗浄した後、上記ろ液２００ｍＬをカラムへ加え、０．６５ｍＬ／分の速度で５時間イオン交換処理を行い、イオン交換処理溶液を得た。なお、ＴＬＣによりリゾホスファチジン酸（ＬＰＡ）が生成していないことを確認した。

〔分析例（酵素反応溶液中のナトリム原子濃度およびカルシウム原子濃度）〕
酵素反応開始直前に少量の酵素反応溶液を精密にサンプリングし、水にて３倍希釈したものを試料溶液とした。誘導結合型高周波プラズマ（ＩＣＰ）を光源に用いた発光分光分析機（株式会社島津製作所製、ＩＣＰ−ＡＥＳ）を用いてナトリウム原子、およびカルシウム原子の定量をした。

〔分析例（酵素反応停止直前の反応率）〕
酵素反応溶液へエタノールを加え、酵素反応を停止する直前に、少量の酵素反応溶液を精密にサンプリングし、５０容量％エタノール水溶液にて５０倍希釈したものをコリン定量用の試料溶液とした。なお、イオン交換処理前後の液の遊離コリン定量は、水にて１２．５倍希釈したものを遊離コリン定量用の試料溶液とした。
下記のとおりコリン定量を行い、反応率＝遊離コリン量／総コリン量×１００の式より酵素反応停止直前の反応率の算出を行った。

遊離コリン定量は下記のとおりに行った。
１．発色液の調製
一つの容器にコリンオキシダーゼ（From Alcaligenes species）（東洋紡株式会社製）、ペルオキシダーゼ（From Horseradish Type-I ）（ＳＩＧＭＡ社製）、Ｎ−エチル−Ｎ−（２−ヒドロキシ−３−スルホプロピル）−３，５−ジメトキシアニリンナトリウム（ＤＡＯＳ）（同仁化学研究所製）、４−アミノアンチピリン（和光純薬工業株式会社製）をそれぞれ量りとり、５０ｍｍｏＬ／ＬのＴｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．５）緩衝液を加えて、濃度がそれぞれ２ｕｎｉｔ／ｍＬ、４２ｕｎｉｔ／ｍＬ、０．７７ｍＭ、０．２４ｍＭとなるように調製した。
２．検量線作成用標準検体の調製
塩化コリンをイオン交換水で希釈し、塩化コリン標準検体２００μｇ／ｍＬ、１００μｇ／ｍＬをそれぞれ調製した。
３．発色反応
試験管を用い、下記標準検体と試料溶液をそれぞれ別々のウェルに入れ、それらに発色液を３ｍＬずつ加え、３７℃で５分間反応させた。なお、発色液３ｍＬのみのブランクも作成した。
・標準検体（１００μｇ／ｍＬ）２０μＬ
・標準検体（２００μｇ／ｍＬ）２０μＬ
・コリン定量用の試料溶液２０μＬ
４．コリン濃度の算出
反応後、６００ｎｍにおける吸光度をマイクロプレートリーダーで測定し、塩化コリン濃度からコリン濃度へ換算した検量線の作成、さらにその検量線から試料溶液中のコリン濃度を算出した。
総コリン定量は、ラボアッセイＴＭリン脂質（コリンオキシダーゼ・ＤＡＯＳ法）キット（和光純薬工業株式会社製）の測定法に準じて行った。

〔分析例（ＴＬＣ）〕
試料の固形分が２質量％となるようにメタノールを加え希釈して試料溶液とし、試料溶液の２μＬについて、マイクロピペットを用いて正確に薄層プレートに点着し、展開溶媒（クロロホルム：メタノール：酢酸＝１３：５：２）にて展開した。展開終了後、薄層プレートを風乾して展開溶媒を除去後、発色剤（ヨウ素）を入れた密閉ガラス容器に薄層プレートを静置し、スポットを形成させた。１−アシル−２，３−環状ホスファチジン酸のＲｆ値は約０．７であり、リゾホスファチジン酸（ＬＰＡ）のＲｆ値は約０．４である。

〔分析例（過酸化物価）〕
イオン交換処理後の溶液１３ｇ（固形分１．５質量％）を２００ｍＬ共栓付き三角フラスコに精密に量りとり、酢酸とクロロホルムの混液（３：２）２５ｍＬを加え、静かに振り混ぜて試料を完全に溶解させた。飽和ヨウ化カリウム溶液（用時調製）１ｍＬを加え直ちに栓をしてゆるく振り混ぜた後、暗所に正確に１０分間放置した。精製水３０ｍＬを加え、栓をして激しく振り混ぜる。１質量％デンプン溶液（和光純薬工業株式会社製のテンプン試薬（溶性・生化学用）を使用した）１ｍＬを加えた後、０．０１ｍｏＬ／Ｌのチオ硫酸ナトリウム溶液で滴定した。次の式より過酸化物価を算出した。
過酸化物価（ｍｅｑ／ｋｇ）＝Ａ×１０／Ｂ（Ａ：０．０１ｍｏＬ／Ｌのチオ硫酸ナトリウム溶液の滴定数（ｍＬ）、Ｂ：試料の固形分量（ｇ））。

１）Ｎａ型：強酸性陽イオン交換樹脂「ダイヤイオンＳＫ 1B」（三菱化学株式会社製）
Ｈ型：強酸性陽イオン交換樹脂「アンバーライトＩＲ１２０Ｂ H AG」（オルガノ株式会社製）
ＯＨ型：強塩基性陰イオン交換樹脂「アンバーライトＩＲＡ４０２ＢＬ OH AG」（オルガノ株式会社製）

〔評価項目及び評価基準〕
（１）酵素反応停止直前の反応率
◎：反応率８０〜１００％（非常に効率よく反応が進行している。）
○：反応率７０〜７９％（効率よく反応が進行している。）
×：反応率７０％未満（効率よく反応が進行していない。）

（２）イオン交換処理によるコリン低減率（（イオン交換処理前の液の遊離コリン量−イオン交換処理後の液の遊離コリン量）／イオン交換処理前の液の遊離コリン量×１００）なお、表１および２の「イオン交換処理後の液の遊離コリン量」の欄に記載。
○：イオン交換処理によるコリン低減率９０〜１００％（効率よくコリンが低減できている。）
△：イオン交換処理によるコリン低減率８０〜８９％（あまり効率よくコリンが低減できていない。）
×：イオン交換処理によるコリン低減率８０％未満（効率よくコリンが低減できていない。）

（３）イオン交換処理後の液の１−アシル−２，３−環状ホスファチジン酸のＴＬＣ
○：イオン交換処理前後で１−アシル−２，３−環状ホスファチジン酸のスポットの濃さが無変化
×：イオン交換処理前にはあった１−アシル−２，３−環状ホスファチジン酸のスポットがイオン交換処理後に消失

（４）イオン交換処理後の液のＬＰＡのＴＬＣ
スポット無し○：ＬＰＡのスポットが無く、１−アシル−２，３−環状ホスファチジン酸のスポットが有る。
スポット無し×：ＬＰＡのスポットが無く、１−アシル−２，３−環状ホスファチジン酸のスポットも無い。
スポット有り×：ＬＰＡのスポットが有り、１−アシル−２，３−環状ホスファチジン酸のスポットが無い

（５）イオン交換処理後の液の固形分の過酸化物価
○：１５ｍｅｑ／ｋｇ未満（ほとんど酸化されていない。）
×：１５ｍｅｑ／ｋｇ以上（過度に酸化されている。）

（６）イオン交換処理翌日の液の外観（室温保存）
イオン交換処理後の液を透明ガラス容器に密閉して２５℃で翌日まで保存し、その外観を観察した。
○：透明な液（安定性良好）
△：少量の沈殿（わずかに安定性不良）
×：分離、沈殿（安定性不良）

実施例１、２、３の結果から、本発明の１−アシル−２，３−環状ホスファチジン酸（塩）の製造方法によれば、効率よくコリンを低減することができる。なお、各実施例における酵素反応溶液中のナトリウム原子濃度が０．１％では、コリンのイオン交換を阻害していないことがわかる。
また、本発明方法によれば、簡便かつ高収率で、過酸化物価の低い１−アシル−２，３−環状ホスファチジン酸（塩）を製造することができ、経済的に有利であることがわかる。さらに、本発明方法では、クロロホルム等の有機溶媒を使用しないので、健康・安全性の面でも優れる。

また、イオン交換処理後翌日の液の外観観察では、沈殿などが見られていないことから安定な物質が得られていることもわかる。実施例１、２、３の比較から、実施例２は反応温度が少し低く、反応時間も少し短いため、実施例１、３よりは反応率が少し低いが、本発明の効果を十分に奏するものである。また、実施例３は、リゾホスファチジルコリン（ＬＰＣ）の濃度が実施例１、２の濃度の２倍以上濃いが、本発明に効果に悪影響を及ぼしていないことがわかる。

一方、比較例１では、反応温度が低く、反応時間が長時間であることから、反応率が低く、過酸化物価が高い（酸化が進行している）。また、酵素反応溶液中の賦活剤由来のカルシウム原子濃度が０．０４％であり、カルシウムイオンによるコリンのイオン交換阻害によって中程度にしかコリンを低減できていない。そのため、イオン交換処理後翌日の液の外観観察では少量の沈殿が見られ、少し不安定な物質であることもわかる。

比較例２では、効率よくコリンを低減でき、反応率もよく、かつ過酸化物価が低い。しかし、Ｈ型の強酸性陽イオン交換樹脂処理を用いたため、１−アシル−２，３−環状ホスファチジン酸の環状部分が分解し、リゾホスファチジン酸（ＬＰＡ）が生成し、全ての１−アシル−２，３−環状ホスファチジン酸が分解していることがＴＬＣにより確認されている。また、イオン交換処理後翌日の液の外観観察では液が分離しており、非常に不安定な物質であることがわかる。

比較例３では、反応率がよく、かつ過酸化物価が低い。しかし、中程度にしかコリンを低減できておらず、１−アシル−２，３−環状ホスファチジン酸が全て消失していることがＴＬＣにより確認されている。これは、Ｈ型の強酸性陽イオン交換樹脂による１−アシル−２，３−環状ホスファチジン酸の環状部分の分解を抑制するために、ＯＨ型の強塩基性陰イオン交換樹脂を使用したことにより、陰イオンである１−アシル−２，３−環状ホスファチジン酸（塩）が影響を受けて消失したためと推測される。
なお、ＴＬＣによりリゾホスファチジン酸（ＬＰＡ）のスポットが無いことも確認されており、リゾホスファチジン酸（ＬＰＡ）が生成していたとしても、リゾホスファチジン酸（ＬＰＡ）も陰イオンであるため、陰イオン交換樹脂に吸着されていることがわかる。
また、イオン交換処理後翌日の液の外観観察では液が分離しており、非常に不安定な物質であることもわかる。

比較例４では、過酸化物価は低いものの、やや反応率が低く、酵素反応溶液中の賦活剤由来のナトリウム原子濃度が１．０％であり、ナトリウムイオンがコリンのイオン交換を阻害し、結果、コリンがほとんど低減できていないことがわかる。また、イオン交換処理後翌日の液の外観観察では沈殿が見られ、非常に不安定な物質であることもわかる。

本発明方法により製造された式［II］で表される１−アシル−２，３−環状ホスファチジン酸またはその塩は、医薬品、医薬部外品、化粧品、食品等の分野において種々利用することができる。

Claims

式［Ｉ］で表されるリゾホスファチジルコリンと放線菌（Actinomadura属）由来のホスホリパーゼＤとをナトリウム原子の含有量が０．２質量％以下、およびカルシウム原子の含有量が０．０２質量％以下である水溶液中で５０〜６５℃にて４〜１０時間酵素反応させる工程と、
酵素反応の後処理として、エタノールを添加し、０〜８℃で１５〜３０時間静置保存し、反応液をろ過する工程と、
ろ過して得られたろ液をＮａ型の強酸性陽イオン交換樹脂により処理する工程とを含むことを特徴とする、式［II］で表される１−アシル−２，３−環状ホスファチジン酸またはその塩の製造方法。

（式中、Ｒは炭素数１０〜２２のアシル基を表す。）

（式中、Ｒは炭素数１０〜２２のアシル基を表す。）