CN111788312A - 环状磷脂酸钠的制造方法 - Google Patents
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Abstract
本发明的课题在于，提供简便地制造能够用作饮品食品的环状磷脂酸钠的方法。根据本发明，提供环状磷脂酸钠的制造方法，其包括：使溶血型磷脂与磷脂酶D在钠盐的存在下在水性介质中反应的步骤；和回收向所得反应液中添加乙醇而产生的沉淀或上层液的步骤。
Description
技术领域
本发明涉及环状磷脂酸钠的制造方法。
背景技术
环状磷脂酸(以下有时简称为cPA)已知具有阻碍癌細胞的转移和浸润等生理活性(非专利文献1)，期待作为包括抗肿瘤剂在内的医药品、功能性标注食品和食品的用途，此外，由于具有促进生物体内的透明质酸合成的作用，因此被添加至化妆品中。
以往，作为这样的环状磷脂酸的制造方法，已知化学合成的方法(专利文献1和2)、利用基于使磷脂酶D作用于溶血型磷脂的酶反应的方法(专利文献3和4)。环状磷脂酸是脂质，不溶于水，因此需要制成钠盐等水溶性的盐，通过将化学合成的环状磷脂酸用氢化钠、氢氧化钠等强碱处理、转化为钠盐的方法，从而制备环状磷脂酸钠。
此外，已知环状磷脂酸钠的制造方法，其包括：在含有有机溶剂和/或水的体系中使磷脂酶D作用于溶血型磷脂(其中氢化物除外)，向得到的反应物中添加钠盐后，从反应物中去除溶剂(专利文献5)。
进一步，已知1-酰基-2,3-环状磷脂酸或其盐的制造方法，其特征在于，包括下述步骤：使溶血磷脂酰胆碱与放线菌(Actinomadura属，马杜拉放线菌属)来源的磷脂酶D在钠原子含量为0.2质量%以下、且钙原子含量为0.02质量%以下的水溶液中、在50~65℃进行4~10小时酶反应的步骤；作为酶反应的后处理，添加乙醇，在0~8℃静置保存15~30小时，将反应液过滤的步骤；和将过滤得到的滤液通过Na型的强酸性阳离子交换树脂进行处理的步骤(专利文献6)。
现有技术文献
专利文献
专利文献1：日本特开平6-228169号公报
专利文献2：日本特开平7-258278号公报
专利文献3：日本特开2001-178489号公报
专利文献4：日本特开2008-222643号公报
专利文献5：日本专利5933338号公报
专利文献6：日本特开2014-93953号公报
非专利文献
非专利文献1：Biochemica et Biophysica Acta 15288(2002),p.1-7。
发明内容
发明要解决的课题
专利文献5的实施例中记载的方法记载了在氯仿层中收集环状磷脂酸钠后，通过蒸馏除去氯仿而得到环状磷脂酸钠，但在考虑食品用途的情况下，期望不使用氯仿的方法。此外，专利文献6中记载的方法由于包括将滤液通过Na型强酸性阳离子交换树脂进行处理的步骤，因此操作繁杂。
本发明要解决的课题在于，提供简便地制造能够用作饮品食品的环状磷脂酸钠的方法。
解决课题的手段
本发明人等针对环状磷脂酸钠的制造方法进行了深入研究，结果发现，在使溶血型磷脂与磷脂酶D在钠盐的存在下在水性介质中反应后，通过回收向所得反应液中添加乙醇而产生的沉淀或上层液，能够简便地得到环状磷脂酸钠。本发明基于上述见解而完成。
即，根据本发明，提供以下的发明。
(1) 环状磷脂酸钠的制造方法，其包括：使溶血型磷脂与磷脂酶D在钠盐的存在下在水性介质中反应的步骤；和回收向所得反应液中添加乙醇而产生的沉淀或上层液的步骤。
(2) 根据(1)所述的环状磷脂酸钠的制造方法，其中，溶血型磷脂是大豆来源的溶血型磷脂。
(3) 根据(1)或(2)所述的环状磷脂酸钠的制造方法，其中，使溶血型磷脂与磷脂酶D在钠盐的存在下在水性介质中反应的步骤是使溶血型磷脂与磷脂酶D在乙酸钠-乙酸缓冲液中反应的步骤。
(4) 根据(1)至(3)中任一项所述的环状磷脂酸钠的制造方法，其中，使溶血型磷脂与磷脂酶D在钠盐的存在下在水性介质中反应的步骤是使溶血型磷脂与磷脂酶D在含有螯合剂的乙酸钠-乙酸缓冲液中反应的步骤。
(5) 根据(4)所述的环状磷脂酸钠的制造方法，其中，螯合剂是EDTA。
(6) 根据(3)至(5)中任一项所述的环状磷脂酸钠的制造方法，其中，回收向反应液中添加乙醇而产生的沉淀。
(7) 根据(1)或(2)所述的环状磷脂酸钠的制造方法，其中，使溶血型磷脂与磷脂酶D在钠盐的存在下在水性介质中反应的步骤是使溶血型磷脂与磷脂酶D在柠檬酸钠-柠檬酸缓冲液中反应的步骤。
(8) 根据(7)所述的环状磷脂酸钠的制造方法，其中，回收向反应液中添加乙醇而产生的上层液。
发明的效果
根据本发明的方法，可以简便地制造能够用作饮品食品的环状磷脂酸钠。
附图说明
图1示出通过薄层色谱检测环状溶血磷脂酸钠的结果。
图2示出通过薄层色谱检测环状溶血磷脂酸钠的结果。
具体实施方式
以下，进一步详细说明本发明。
本发明的环状磷脂酸钠的制造方法的特征在于，包括：使溶血型磷脂与磷脂酶D在钠盐的存在下在水性介质中反应的步骤；和回收向所得反应液中添加乙醇而产生的沉淀或上层液(上清液)的步骤。本发明的方法可以不使用氯仿、二氯甲烷、甲苯、乙醚、乙酸乙酯、己烷等有机溶剂(除了乙醇之外的有机溶剂)地实施。
作为溶血型磷脂，已知脂肪酸种类不同的物质、具有醚或乙烯基醚键的分子种类等，它们可以以市售品形式获取。
作为溶血型磷脂，可以使用大豆来源的溶血型磷脂、卵黄来源的溶血型磷脂、或者玉米来源的溶血型磷脂等，优选使用大豆来源的溶血型磷脂。
作为溶血型磷脂，可以使用例如将卵磷脂用于原料、将卵磷脂、卵磷脂级分等用磷脂酶A2处理而部分水解得到的溶血卵磷脂。例如，可以使用大豆溶血卵磷脂。大豆溶血卵磷脂可以购买市售品。
本发明中，使溶血型磷脂与磷脂酶D在钠盐的存在下在水性介质中反应。例如，可以使溶血型磷脂与磷脂酶D在乙酸钠-乙酸缓冲液中或柠檬酸钠-柠檬酸缓冲液中反应。通过存在钠盐，能够制造环状磷脂酸钠。
溶血型磷脂与磷脂酶D的反应可以在螯合剂的存在下进行。作为本发明中使用的螯合剂，为乙二胺四乙酸钠(EDTA)、二亚乙基三胺五乙酸、乙二醇醚二胺四乙酸、柠檬酸、酒石酸、植酸等，优选为乙二胺四乙酸钠(EDTA)、二亚乙基三胺五乙酸、乙二醇醚二胺四乙酸，最优选为EDTA。
在溶血型磷脂与磷脂酶D的反应中，优选不存在钙离子，存在钙离子的情况下，优选为微量。
本发明中使用的磷脂酶D只要在作用于溶血型磷脂的情况下生成cPA，则没有特别限定，特别优选使用源自链霉菌(Streptomyces sp.)或马杜拉放线菌(Actinomadula sp.)的磷脂酶D。
溶血型磷脂与磷脂酶D的反应可以通过例如加热至25℃~50℃、优选加热至30℃~45℃、在连续搅拌的同时反应5~30小时左右而进行。
溶血型磷脂与磷脂酶D的反应更具体而言可以通过以下的流程进行。
(方法1)向乙酸钠-乙酸缓冲液或者柠檬酸钠-柠檬酸缓冲液(pH4.0~7.0、优选为pH5.0~6.0)中添加溶血型磷脂(大豆溶血卵磷脂等)，分散溶解。将磷脂酶D根据期望分散在少量的精制水中后，添加至该溶液中。将所得混合液在25℃~50℃下搅拌5~30小时。
(方法2)向含有EDTA的乙酸钠-乙酸缓冲液(pH4.0~7.0、优选为pH5.0~6.0)中添加溶血型磷脂(大豆溶血卵磷脂等)，分散溶解。将磷脂酶D根据期望分散在少量的精制水中后，添加至该溶液中。将所得混合液在25℃~50℃下搅拌5~30小时。
本发明中，使溶血型磷脂与磷脂酶D在钠盐的存在下在水性介质中反应后，回收向所得反应液中添加乙醇而产生的沉淀或上层液。本发明中发现，通过使溶血型磷脂与磷脂酶D在乙酸钠-乙酸缓冲液的存在下在水性介质中反应，所生成的环状溶血磷脂酸钠通过添加乙醇而沉淀，通过回收该沉淀，成功地简便地回收环状溶血磷脂酸钠(即，不使用有机溶剂，且不进行利用强酸性阳离子交换树脂的处理等)。进一步，本发明中发现，通过使溶血型磷脂与磷脂酶D在柠檬酸钠-柠檬酸缓冲液的存在下在水性介质中反应，所生成的环状溶血磷脂酸钠通过向反应液中添加乙醇并搅拌和静置，存在于生成的上层液与下层液之中的上层液中，通过回收该上层液，成功地简便地回收环状溶血磷脂酸钠(即，不使用有机溶剂，且不进行利用强酸性阳离子交换树脂的处理等)。
应予说明，通过添加乙醇而回收沉淀可以进行多次。
本发明的一例中，将通过添加乙醇(第1次添加)而产生的沉淀物利用离心操作(例如3000转、5分钟)进行回收，将其溶解在精制水中。本发明的一例中，可以将向所得溶液中添加乙醇(第2次添加)而产生的沉淀物利用离心操作(例如3000转、5分钟)进行回收。
此外，本发明的另一例中，可以添加乙醇并进行搅拌后，静置，分液去除下层部分，得到上层液。回收该上层液而进行减压浓缩，去除乙醇后，溶解在精制水中后，进行冷冻干燥，可以得到含有环状溶血磷脂酸钠的粉末。
根据期望，将上述回收的环状溶血磷脂酸钠溶解在精制水中后冷冻干燥，可以得到含有环状溶血磷脂酸钠的粉末。
通过以下的实施例说明本发明，但本发明不因这些实施例而受到任何限定。应予说明，下述实施例中使用的大豆溶血卵磷脂(SLPホワイトリゾ)的钙含量少。
实施例
实施例1
向1M乙酸钠-乙酸缓冲液(pH5.5)100ml中添加大豆溶血卵磷脂(LPC70)10g，分散溶解。将磷脂酶D(名糖产业公司制；马杜拉放线菌来源)400mg分散在少量的精制水中后，添加至该溶液中，在40℃搅拌16小时。反应后，将添加100ml的乙醇而产生的沉淀物进行3000转、5分钟离心分离，回收，溶解在50ml的精制水中。向其中添加50ml的乙醇，将生成的沉淀物进行3000转、5分钟离心分离，回收，溶解在30ml的精制水中后，冷冻干燥，得到含有环状溶血磷脂酸钠的4.2g的粉末。
实施例2
向含有10mM的EDTA的1M乙酸钠-乙酸缓冲液(pH5.5)100ml中添加大豆溶血卵磷脂(LPC70)10g，分散溶解。将磷脂酶D(名糖产业公司制；马杜拉放线菌来源)400mg分散在少量的精制水中后，添加至该溶液中，在40℃搅拌16小时。反应后，将添加100ml的乙醇而产生的沉淀物进行3000转、5分钟离心分离，溶解在50ml的精制水中。向其中添加50ml的乙醇，将生成的沉淀物进行3000转、5分钟离心分离，回收，溶解在35ml的精制水中后，冷冻干燥，得到4.0g的粉末。
实施例3
在1M柠檬酸钠-柠檬酸缓冲液(pH6.0)100ml中，溶解10g的ホワイトリゾ(辻制油公司制)，添加马杜拉放线菌来源磷脂酶D(名糖产业公司制)200mg，在40℃进行16小时酶反应。向反应液中添加100ml的99%乙醇，进行搅拌后，在室温下静置1小时，分液去除下层部分，得到上层液135ml。回收该上层液，用旋转蒸发仪进行减压浓缩，去除乙醇后，溶解在40ml的精制水中后，进行冷冻干燥，得到含有环状溶血磷脂酸钠的粉末5.2g。
实施例4
在1M柠檬酸钠-柠檬酸缓冲液(pH6.0)100ml中，溶解10g的辻制油公司制大豆溶血卵磷脂(LPC70)，添加马杜拉放线菌来源磷脂酶D(名糖产业公司制)200mg，在40℃进行16小时酶反应。向反应液中添加100ml的99%乙醇，进行搅拌后，在室温下静置1小时，分液去除下层部分，得到上层液135ml。回收该上层液，用旋转蒸发仪进行减压浓缩，去除乙醇后，溶解在40ml的精制水中后，进行冷冻干燥，得到含有环状溶血磷脂酸钠的粉末4.5g。
＜通过薄层色谱检测环状溶血磷脂酸钠＞
称量实施例1、实施例3和实施例4中得到的含有环状溶血磷脂酸钠的粉末10mg，溶解在1ml的氯仿：甲醇：水(60：30：5、V/V)中。将所得溶液在Merck公司硅胶薄层板上点样5微升，用氯仿：甲醇：乙酸：水(60：30：3：5、V/V)的混合溶剂展开。其后，将板干燥，喷雾含有3%乙酸铜的8%磷酸、2%硫酸溶液，在150℃下加热3分钟，确认环状溶血磷脂酸钠的点。以用日本专利第593338号记载的方法制备的环状溶血磷脂酸钠作为对照。
结果示于图1和图2。
图1的A示出用日本专利第593338号记载的方法制备的环状溶血磷脂酸钠的结果，图1的B示出实施例1中制备的试样的结果。
如图1所示，实施例1中得到的环状溶血磷脂酸钠与对照的用日本专利第593338号记载的方法制备的环状溶血磷脂酸钠Rf值相同。
图2的A示出用日本专利第593338号记载的方法制备的环状溶血磷脂酸钠的结果，图2的B示出用实施例4所示的方法制备的试样的结果。图2的C示出用实施例3所示的方法制备的试样的结果。如图2所示，实施例3和4中得到的环状溶血磷脂酸钠与对照的用日本专利第593338号记载的方法制备的环状溶血磷脂酸钠Rf值相同。
Claims (8)
1.环状磷脂酸钠的制造方法，其包括：使溶血型磷脂与磷脂酶D在钠盐的存在下在水性介质中反应的步骤；和回收向所得反应液中添加乙醇而产生的沉淀或上层液的步骤。
2.根据权利要求1所述的环状磷脂酸钠的制造方法，其中，溶血型磷脂是大豆来源的溶血型磷脂。
3.根据权利要求1或2所述的环状磷脂酸钠的制造方法，其中，使溶血型磷脂与磷脂酶D在钠盐的存在下在水性介质中反应的步骤是使溶血型磷脂与磷脂酶D在乙酸钠-乙酸缓冲液中反应的步骤。
4.根据权利要求1至3中任一项所述的环状磷脂酸钠的制造方法，其中，使溶血型磷脂与磷脂酶D在钠盐的存在下在水性介质中反应的步骤是使溶血型磷脂与磷脂酶D在含有螯合剂的乙酸钠-乙酸缓冲液中反应的步骤。
5.根据权利要求4所述的环状磷脂酸钠的制造方法，其中，螯合剂是EDTA。
6.根据权利要求3至5中任一项所述的环状磷脂酸钠的制造方法，其中，回收向反应液中添加乙醇而产生的沉淀。
7.根据权利要求1或2所述的环状磷脂酸钠的制造方法，其中，使溶血型磷脂与磷脂酶D在钠盐的存在下在水性介质中反应的步骤是使溶血型磷脂与磷脂酶D在柠檬酸钠-柠檬酸缓冲液中反应的步骤。
8.根据权利要求7所述的环状磷脂酸钠的制造方法，其中，回收向反应液中添加乙醇而产生的上层液。
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