JP2007014270A

JP2007014270A - リン脂質組成物の製造方法

Info

Publication number: JP2007014270A
Application number: JP2005199289A
Authority: JP
Inventors: Misa Shiihara; 美沙椎原; Nariyuki Taniwaki; 成幸谷脇; Giyourei Riyuu; 暁麗劉
Original assignee: Nagase Chemtex Corp
Current assignee: Nagase Chemtex Corp
Priority date: 2005-07-07
Filing date: 2005-07-07
Publication date: 2007-01-25
Anticipated expiration: 2025-07-07
Also published as: JP4887674B2

Abstract

【課題】ホスファチジルイノシトールと、塩基交換反応により得られるホスファチジルセリン等のリン脂質との両方を高濃度で含有するリン脂質組成物を効率よく製造する方法を提供する。
【解決手段】ホスファチジルコリン及びホスファチジルエタノールアミンの少なくとも１種を合計で３０重量％以上含み、かつホスファチジルイノシトールを１０重量％以上含むリン脂質を、有機溶媒及び水からなる二相系中で攪拌した後、ヒドロキシル基含有化合物及びホスホリパーゼＤを添加して、ホスファチジルコリン及びホスファチジルエタノールアミンの少なくとも１種の塩基交換反応を行う工程からなる、リン脂質組成物の製造方法。
【選択図】なし

Description

本発明は、ホスファチジルイノシトールと、ホスファチジルコリン及びホスファチジルエタノールアミンの塩基交換反応により得られるリン脂質との両方を高濃度で含有するリン脂質組成物を効率よく製造する方法に関する。

リン脂質には、その種類に応じて様々な薬効があることが知られており、これまでに多くの研究がなされている。例えば、リン脂質の１種であるホスファチジルセリン（ＰＳ）には、記憶障害回復効果等の脳機能改善効果があることが報告されており（特許文献１参照）、ホスファチジルイノシトール（ＰＩ）は、中枢神経系障害の治療や代謝の改善に有効であることが報告されている（特許文献２、３参照）。
このように、これらのリン脂質はいずれも健康に重要なため、近年、２種以上のリン脂質を含有する製剤、特にＰＩとＰＳ等との両方を高濃度で含有する製剤が市場で求められている。

ＰＳ等は、ホスファチジルコリン（ＰＣ）をホスホリパーゼＤの存在下でアルコール類と塩基交換反応させることにより得る方法が知られている。
例えば、高濃度のＰＳを得る方法としては、ＰＣをホスホリパーゼＤの存在下でセリンと反応させる方法が知られている（特許文献４参照）。ＰＣの原料として大豆レシチン、卵黄レシチン等の天然材料を用いる場合、これらのレシチンにはＰＩも１０％程度含まれているが、ＰＳの収率を上げるために原料を精製してＰＣの濃度を上げるので、ＰＩはごく微量となる。また、ＰＩは、この反応ではＰＣのようにセリンと反応せず、むしろＰＣとセリンの反応を阻害する要因の一つとなっていることから、原料を精製して反応を行う必要があった。

高濃度のＰＳを得る方法としては、また、高いホスファチジル基転移活性を有するホスホリパーゼＤを用いる方法が報告されている（特許文献５参照）。この方法では、低純度のレシチンを精製することなく原料として用いることができるが、得られる組成物のＰＩの含量が充分ではなかった。

一方、高濃度のＰＩを得る方法としては、植物由来のレシチンを含水低級アルコールを含む溶剤で処理し、更にエタノールを含む水溶液で処理して濃縮する方法が報告されている（特許文献６参照）。この方法では、ＰＩを高濃度で得ることができるが、得られる組成物中のＰＳ等の濃度が数％程度であった。

塩基交換反応により得られるＰＳ等のリン脂質やＰＩを医薬品、食品として利用するには、それぞれ組成物中にＰＩが１５％以上、ＰＳ等が２０％以上含まれていることが必要である。従って、ＰＳ等とＰＩをともに高濃度で含有する組成物は、これまで別の製法で得られたＰＳ等とＰＩとを混合することにより調製されていたが、ＰＳ等の製造とＰＩの製造に別の材料と工程が必要であるので、製造コストが高くなるという問題があった。
特許第３０５３５３７号明細書特開平５−９７８７５号公報特開２０００−３００１８６号公報特公平５−４２９１７号公報特開平９−１７３０９２号公報特開平９−１６５号公報

本発明は、上記現状に鑑み、ホスファチジルイノシトールと、塩基交換反応により得られるホスファチジルセリン等のリン脂質との両方を高濃度で含有するリン脂質組成物を効率よく製造する方法を提供する。

本発明者らは、前述の課題を解決すべく鋭意検討を重ねた結果、リン脂質の塩基交換反応を行う際、予めリン脂質と溶媒を攪拌することにより、原料のリン脂質がホスファチジルイノシトールを比較的多く含んでいても塩基交換反応が効率よく進行し、ホスファチジルイノシトールと、塩基交換反応により得られるホスファチジルセリン等のリン脂質の両方を高濃度で含有するリン脂質組成物が簡便に得られることを見出した。

すなわち、本発明は、ホスファチジルコリン及びホスファチジルエタノールアミンの少なくとも１種を合計で３０重量％以上含み、かつホスファチジルイノシトールを１０重量％以上含むリン脂質を、有機溶媒及び水からなる二相系中で攪拌した後、ヒドロキシル基含有化合物及びホスホリパーゼＤを添加して、ホスファチジルコリン及びホスファチジルエタノールアミンの少なくとも１種の塩基交換反応を行う工程からなる、リン脂質組成物の製造方法である。

以下に本発明を詳細に説明する。
本発明のリン脂質組成物の製造方法において、原料となるリン脂質としては、ホスファチジルコリン（ＰＣ）及びホスファチジルエタノールアミン（ＰＥ）の少なくとも１種を合計で３０重量％以上含み、かつホスファチジルイノシトール（ＰＩ）を１０重量％以上含むものを用いる。上記原料のリン脂質は、ＰＣ又はＰＥの何れかを３０重量％以上含んでいればよいが、ＰＣ及びＰＥの両方を合わせて３０重量％以上含んでいてもよい。好ましくは、ＰＣ及びＰＥの少なくとも１種の合計が、３０〜６０重量％であり、ＰＩが１０〜４０重量％である。

上記原料となるリン脂質は、いかなる起源のものでもよく、リン脂質を含む天然物、天然物からの抽出物、精製物、合成リン脂質等が挙げられる。具体的には、大豆、菜種、ひまわり、パーム由来のリン脂質等が挙げられ、大豆由来のものが好適である。このようなＰＩを比較的多く含むリン脂質の市販品としては、例えば、ＳＬＰ−ＷＨＩＴＥ（ＰＣ２５．６％、ＰＥ２４．１％、ホスファチジル酸（ＰＡ）８％、ＰＩ１２％、その他約３０％）、ＳＬＰ−ＰＩパウダー（一例：ＰＣ１８％、ＰＥ２２％、ＰＡ８％、ＰＩ１７％、その他約３５％）（いずれも辻製油製）等が挙げられる。
従来の塩基交換反応では、収率を上げるために、原料となるリン脂質を精製してＰＣ、ＰＥの濃度を上げていたが、本発明の製造方法では、ＰＣ、ＰＥの塩基交換反応により得られるホスファチジルセリン（ＰＳ）等と共にＰＩを多く含むリン脂質組成物を得ることを目的とすることから、ＰＩを比較的多く含むリン脂質を原料に用いる。このようなＰＩを多く含むリン脂質としては、ＰＣ、ＰＥを精製した時に発生するバイ・プロダクトも安価で好適である。

リン脂質の濃度は、後述の塩基交換反応時に５〜４０重量％であることが好ましく、１０〜３０重量％がより好ましい。５重量％未満であると得られるリン脂質の量が少なく、４０重量％を超えると塩基交換反応での転移率が低下する。

本発明の製造方法では、ヒドロキシル基含有化合物及びＰＬＤを添加してリン脂質の塩基交換反応を行う前に、リン脂質を有機溶媒及び水からなる二相系中で攪拌する。
上記有機溶媒としては特に限定されず、ｎ−ヘプタン、ｎ−ヘキサン、石油エーテル等の脂肪族炭化水素；シクロペンタン、シクロヘキサン等の環状脂肪族炭化水素；ジエチルエーテル、テトラヒドロフラン等のエーテル類；酢酸メチル、酢酸エチル等のエステル類；四塩化炭素、クロロホルム等のハロゲン化炭化水素類；アセトン、メチルエチルケトン、ジエチルケトン等のケトン類等を挙げることができる。これらは、１種又は２種以上を用いることができる。上記有機溶媒としては、極性溶媒及び非極性溶媒を含むものが好ましい。

上記水としては、イオン交換水、精製水、蒸留水、水道水等が挙げられ、これらに酢酸等を含有させてｐＨ調製のための緩衝液としてもよい。上記水としては、緩衝液を用いるのが好ましい。上記緩衝液の濃度は、０．１〜２．０Ｍが好ましく、０．４〜１．０Ｍがより好ましい。
上記二相系において、水の混合比は、有機溶媒に対して好ましくは２０重量％以下であり、より好ましくは２〜１５重量％、更に好ましくは５〜１０重量％である。

上記二相系において、有機溶媒が極性溶媒及び非極性溶媒を含む場合、その混合比は特に限定されないが、好ましくは、極性溶媒：非極性溶媒が０．５：９．５〜５：５である。
このような有機溶媒及び水からなる二相系としては、例えば、ヘキサン：アセトン：水、ヘプタン：アセトン：水、ヘキサン：酢酸エチル：水の組み合わせ等が挙げられる。

上記リン脂質の攪拌は、好ましくは１０〜４０℃、より好ましくは２０〜３０℃で行う。また、上記攪拌は、３０分〜２時間行うことが好ましい。攪拌は一般的な攪拌機を用いることができる。攪拌の強度は特に制限はないが、液を上下に混合できる程度でよい。
本発明の方法において、上記リン脂質は、通常、有機溶媒に溶解した状態であり、上記攪拌により、リン脂質と有機溶媒及び水がエマルションを形成していてもよい。

本発明の製造方法では、有機溶媒及び水からなる二相系中でリン脂質を攪拌した後、ヒドロキシル基含有化合物及びホスホリパーゼＤ（ＰＬＤ）を添加して、ＰＣ及び／又はＰＥの塩基交換反応を行う。
上記ヒドロキシル基含有化合物としては、アルコール類、含窒素アルコール類、糖類、ポリオール類、ヒドロキシ環状化合物等が挙げられる。
アルコール類としては、例えば、メタノール、エタノール、プロパノール、アスコルビン酸等が挙げられる。
含窒素アルコール類としては、例えば、セリンなどのアミノ酸；１−アミノ−２−プロパノールなどが挙げられる。
糖類としては、例えば、アデノシン、グアノシン、イノシン、キサントシン、デオキシアデノシン、デオキシグアノシン等のヌクレオシド；グルコース、トレハロース、Ｎ−アセチル−Ｄ−グルコサミン等が挙げられる。
ポリオール類としては、例えば、グリセロール、エチレングリコール、プロピレングリコール等が挙げられる。
ヒドロキシ環状化合物としては、例えば、麹酸、アルブチン等が挙げられる。

本反応系中におけるヒドロキシル基含有化合物の濃度は、好ましくは２０〜４０重量％、より好ましくは２５〜３０重量％である。

上記ＰＬＤとしては、リン脂質の塩基部分を加水分解することができるものであれば特に限定されず、例えば植物由来のＰＬＤ、微生物由来のＰＬＤ等が挙げられる。植物由来のＰＬＤとしてはキャベツ、大豆由来のＰＬＤ等が挙げられ、微生物由来のＰＬＤとしては放線菌、糸状菌由来のＰＬＤ等が挙げられる。
本反応系中におけるＰＬＤの濃度は、リン脂質１ｇに対し、好ましくは５〜２００Ｕ、より好ましくは２０〜１００Ｕである。なお、１Ｕは、９５％大豆ホスファチジルコリンを基質とし、基質濃度０．１６％の０．２Ｍ酢酸緩衝液（ｐＨ４．０、１０ｍＭのＣａＣｌ_２、１．３％のＴｒｉｔｏｎＸ−１００を含む）を３７℃にて反応させた時、１分間に１μｍｏｌのコリンを遊離する酵素量である。

上記塩基交換反応は、ｐＨ３．５〜１０の条件で行うことが好ましく、ｐＨ４〜９がより好ましい。また、反応温度は、１０〜４０℃が好ましく、２０〜３０℃がより好ましい。

上記塩基交換反応により、リン脂質中のＰＣ、ＰＥ等と、セリン等のヒドロキシル基含有化合物とが反応してＰＳ等が得られる。ＰＩは、通常、上記塩基交換反応においてヒドロキシル基含有化合物と反応しにくいので、原料のリン脂質に含まれるＰＩがほぼそのままリン脂質組成物に含まれる。
本発明の製造方法により得られるリン脂質組成物の例として、ＰＩ及びＰＳを含むリン脂質組成物以外に、ＰＩ及びホスファチジン酸を含むリン脂質組成物、ＰＩ及びホスファチジルエタノールを含むリン脂質組成物等が挙げられる。

塩基交換反応を行った後は、例えば加熱等の処理でＰＬＤを失活させ、遠心分離法等により有機溶媒層と水層を分離して有機溶媒層を得たあと、有機溶媒を減圧下で除去することによって濃縮する。次いで、アセトン又はエタノールで晶析を行い、固液分離によって固形物を得、乾燥することにより本発明のリン脂質組成物を単離することができる。

本発明のリン脂質組成物の製造方法では、リン脂質の塩基交換反応を行う前にリン脂質と溶媒を攪拌することにより、原料のリン脂質にＰＩが比較的多く含まれていても塩基交換反応が効率よく進行し、ＰＩと、塩基交換反応により得られるＰＳ等のリン脂質の両方を高濃度で含有するリン脂質組成物、好ましくはＰＩを１５重量％以上、ＰＳ等を２０重量％以上含むリン脂質組成物を効率よく製造することができる。本発明の方法では、ＰＩとＰＳ等のリン脂質を別に調製する必要がないことから、上記リン脂質組成物を工業的に安価で製造することが可能である。

以下に、実施例を示して本発明を更に詳細に説明するが、本発明はこれらの実施例に限定されるものではない。実施例中の「％」は、「重量％」を示す。
実施例１
ＳＬＰ−ＰＩパウダー（辻製油製）を濃度が１０％になるようにへプタン：アセトン混合溶媒（８５：１５）９０ｍｌに溶解した後に、６ｍｌの１Ｍ酢酸緩衝液（ｐＨ４．０）を加え、３０℃にて２時間攪拌した（前処理）。
その後、水層にセリンを２５％、ＰＬＤ８０Ｕ／レシチン（ｇ）になるように添加し、水層量を１７ｍｌに調整した。３０℃にて一晩攪拌し、反応させた後、２時間静置した。下層の水層を分離してから、上層の溶媒層を減圧濃縮した。濃縮液に対して３倍量のエタノールを加え、沈殿させた。沈殿物を乾燥したあとに、クロロホルム：メタノール（２：１）溶液に溶解し、リン脂質含量を高速液体クロマトグラフィー法（ＨＰＬＣ法）により下記の条件で分析を行った。表１に示すリン脂質組成物が得られた。
ＨＰＬＣ条件
使用カラム：ジーエルサイエンス社製ＵｎｉｓｉｌＱＮＨ_２（４．６ｍｍＩ．Ｄ．×２５０ｍｍ）
移動相：アセトニトリル／メタノール／５０ｍＭリン酸二水素アンモニウム＝１８５６／８７４／２７０
流速：１．３ｍＬ／分
検出：ＵＶ２０５ｎｍ
また、転移率を図１に示す。なお、転移率は、下記式によって求められる値である。
転移率（％）＝反応後ＰＳの濃度／反応前（ＰＣ＋ＰＥ）濃度×１００

比較例１
ＳＬＰ-ＰＩパウダー（辻製油製）を濃度が１０％になるようにヘプタン：アセトン混合溶媒（８５：１５）９０ｍｌに溶解した後に、６ｍｌの１Ｍ酢酸緩衝液（ｐＨ４．０）及びセリンを２５％、ＰＬＤ８０Ｕ／レシチン（ｇ）になるように添加し、水層容積を１７ｍｌに調整した後、３０℃にて一晩攪拌し、反応させた。下層の水層を分離してから、上層の溶媒層を減圧濃縮した。濃縮液に対して３倍量のエタノールを加え、沈殿させた。沈殿物を乾燥したあとに、クロロホルム：メタノール（２：１）溶液に溶解し、リン脂質含量をＨＰＬＣ法により実施例１と同じ条件で分析を行った。結果を表１及び図１に示す。

表１及び図１から明らかなように、塩基交換反応の前に攪拌（前処理）を行った実施例１の方が、前処理を行わなかった比較例１と比較してＰＣ、ＰＥからＰＳへの転移率がよく、実施例１で得られたリン脂質組成物中のＰＩ濃度が１５重量％を超え、かつＰＳ濃度が２０重量％を超えていた。

実施例２
ＳＬＰ-ＷＨＩＴＥ（辻製油製）を濃度が２０％になるようにヘプタン：アセトン混合溶媒（７５：２５）９０ｍｌに溶解した後に、６ｍｌの１Ｍ酢酸緩衝液（ｐＨ４．０）を加え、３０℃にて２時間攪拌した（前処理）。
その後、水層にセリンを２５％、ＰＬＤ８０Ｕ／レシチン（ｇ）になるように添加し、水層量を１７ｍｌに調整した。３０℃にて一晩攪拌し、反応させた後、２時間静置した。上層の溶液をクロロホルム：メタノール（２：１）で希釈し、ＨＰＬＣ分析により、転移率を求めた。結果は図２に示す。

比較例２
攪拌（前処理）を行わずに反応を行う以外は、実施例２の同じ条件で反応、分析を行い、転移率を求めた。結果は図２に示す。

図２から明らかなように、塩基交換反応の前に攪拌（前処理）を行った実施例２の方が、前処理を行わなかった比較例２と比較してＰＣ、ＰＥからＰＳへの転移率がよかった。また、この転移率の違いは、リン脂質の濃度が２０重量％の実施例２及び比較例２よりも、１０重量％の実施例１及び比較例１の方が大きかった。

本発明のリン脂質組成物の製造方法では、リン脂質の塩基交換反応を行う前にリン脂質と溶媒を攪拌することにより、原料のリン脂質にＰＩが比較的多く含まれていても塩基交換反応が効率よく進行し、ＰＩと、塩基交換反応により得られるＰＳ等のリン脂質との両方を高濃度で含有するリン脂質組成物、好ましくはＰＩを１５重量％以上、ＰＳ等を２０重量％以上含むリン脂質組成物を効率よく製造することができる。このような組成物の例として、ＰＩ１５重量％以上及びＰＳ２０重量％以上を含むリン脂質組成物以外に、ＰＩ２０重量％以上及びホスファチジン酸２０重量％以上を含むリン脂質組成物、ＰＩ１８重量％以上及びホスファチジルエタノール２０重量％以上を含むリン脂質組成物等が挙げられる。本発明の方法では、ＰＩとＰＳ等のリン脂質を別に調製する必要がないことから、上記リン脂質組成物を工業的に安価で製造することが可能である。

実施例１及び比較例１におけるリン脂質の転移率を表わすグラフである。実施例２及び比較例２におけるリン脂質の転移率を表わすグラフである。

Claims

ホスファチジルコリン及びホスファチジルエタノールアミンの少なくとも１種を合計で３０重量％以上含み、かつホスファチジルイノシトールを１０重量％以上含むリン脂質を、有機溶媒及び水からなる二相系中で攪拌した後、ヒドロキシル基含有化合物及びホスホリパーゼＤを添加して、ホスファチジルコリン及びホスファチジルエタノールアミンの少なくとも１種の塩基交換反応を行う工程からなる、リン脂質組成物の製造方法。
前記有機溶媒が、極性溶媒及び非極性溶媒を含むものである請求項１記載の方法。
塩基交換反応時のリン脂質の濃度が、全化合物に対して５〜４０重量％である請求項１又は２記載の方法。
ヒドロキシル基含有化合物がセリンである請求項１〜３のいずれか一項記載の方法。