KR102255036B1

KR102255036B1 - 달맞이꽃 추출물을 포함하는 항산화 및 피부 안티폴루션용 조성물

Info

Publication number: KR102255036B1
Application number: KR1020200038435A
Authority: KR
Inventors: 정진우; 김철환; 이승영; 최경민
Original assignee: 국립낙동강생물자원관
Priority date: 2020-03-30
Filing date: 2020-03-30
Publication date: 2021-05-21

Abstract

본 발명은 달맞이꽃 추출물을 포함하는 항산화 및 피부 안티폴루션용 조성물에 관한 것이다. 본 발명의 일실시예에 따른 항산화 및 피부 안티폴루션용 조성물은 달맞이꽃 추출물을 포함하는 것일 수 있다.
본 발명에 의하는 경우 항산화 활성과 함께 활성산소종 생산, DNA 손상, 세포사멸 및 미토콘드리아 막 손상을 억제하여 세포의 생존율을 증가시키는 효과를 가지는 조성물을 다양한 제형으로 제공할 수 있다.

Description

달맞이꽃 추출물을 포함하는 항산화 및 피부 안티폴루션용 조성물{Antioxidant and skin anti-pollution composition containing evening primrose EXTRACT}

본 발명은 달맞이꽃 추출물을 포함하는 항산화 및 피부 안티폴루션용 조성물에 관한 것이다. 보다 상세하게는 항산화 활성을 높이며, 미세먼지, 유기성 또는 무기성 오염원 등에 대한 피부 항오염 효과를 나타낼 수 있는 피부 안티폴루션 효과 및 세포사멸 방지를 통한 피부보호 활성을 가지는 달맞이꽃 추출물을 포함하는 항산화 및 피부 안티폴루션용 조성물을 제공하기 위한 것이다.

피부는 신체의 바깥쪽을 둘러싸고 있는 얇은 막으로서, 외부 환경의 물리적, 화학적인 자극으로부터 인체를 보호해주는 기능을 하며, 체내 수분의 증발을 억제하면서도 외부로부터 오염원의 과잉 침투를 방지한다. 최근 화학물질의 사용이 증가되면서 이의 제조, 사용, 폐기 과정에서 발생되는 다환 방향족 탄화수소류, 알데히드류, 질소산화물류, 질산염류, 미세먼지 등의 환경 오염원에 피부가 노출됨에 따라, 홍반, 부종, 가려움, 두드러기, 염증 등의 가벼운 피부 트러블과 아토피, 건선, 피부암 등의 피부병의 발병률이 높아지고 있다.

따라서, 외부 스트레스로부터 피부 세포를 보호하고 노화를 예방하기 위해서는 활성산소로 인한 산화적 스트레스를 억제하고, 활성산소를 효율적으로 제거할 수 있는 항산화 방어 강화가 중요하며, 최근에는 인체에 무해하고 보다 강력한 항산화력을 가진 천연 물질에 대한 연구가 활발하게 진행되고 있다.

현재 활성산소종을 제거하는 항산화 효소인 초산화물 디스무타제(dismutase)(SOD), 카탈라제(catalase) 및 항산화제인 비타민 C, 비타민 E 등이 피부노화, 피부암 발생을 억제한다고 보고되고 있다. 또한, 미용, 식품의 소재로 사용되고 있는 성분들은 히아루론산, 포도씨 추출물, 이소플라본, 콜라겐, 세라마이드, 코엔자임 Q10, 콘드로이틴, 리코펜, 알파 리포산 등이며, 이들의 피부미용효과는 주로 항산화 기능으로부터 기인하고 있다(박장서, 식품과학과 산업, 40, 19 (2007)).

한편, 자외선 등에 의한 외인성 피부노화와 함께 유전적 요인 도는 세포대상 불균형 등에 의한 내인성 요인에 의한 피부노화 등의 문제가 발생하는데, 최근 현대사회로 접어들면서, 환경오염이 심해지고 생활반경 주위의 공해 물질 농도가 높아지면서 사회적 문제로 대두되고 있다.

즉, 자연적인 세포 파괴, 피부 노화 등의 문제 뿐만 아니라 상술한 공해물질의 체내 유입에 의하여 피부노화, 세포 파괴가 촉진될 뿐만 아니라, 심지어는 각종 질병의 원인이 되는 문제점으로 지적되고 있다.

구체적으로 상술한 공해물질은 체내로의 침투뿐만 아니라 피부에 직접적으로 맞닿으면 피부에 악영향을 미치게 되는데, 피부염, 피부발진, 피부괴사 등의 악영향을 미치게 된다. 따라서, 자외선뿐만 아니라 공해물질로부터 피부를 보호할 수 있는 화장품에 대한 수요가 증가하고 있다.

상술한 공해물질에 속하는 것으로 벤조피렌을 예로 들 수 있다. 상기 벤조피렌은 자동차 배기가스 또는 담배 연기 등 불완전 연소로 인해 생성되며, 에폭시드로의 대사전환과 DNA와의 반응을 통해 세포 손상을 일으키는 유독 물질이다. 최근, 아토피성 피부염을 유발한다는 소식이 접해지면서 피부에 대한 악영향이 드러나고 있으며, 세포변이, 세포 손상 등의 문제로 피부 악화를 일으킬 수 있는 위험한 물질 중 하나이다.

또한, 상술한 공해물질에 속하는 것으로 질소산화물이 있다. 상기 질소산화물은 질소와 산소로 이루어진 화합물로 일산화질소, 이산화질소, 일산화이질소, 삼산화이질소, 사산화이질소, 오산화이질소 등과 이들의 이온화물이 있다. 일반적으로 질소가스는 안정하여 그 구성을 이루는 원자가 둘로 쪼개지기 어려우나, 매우 높은 온도가 가해지면 그 결합이 깨질 수 있다. 흔히, 자동차의 엔진 내부는 고온이 형성되어 자동차의 배기가스는 다량의 질소 산화물을 포함하게 된다.

상술한 질소산화물은 암모늄 또는 그 염을 포함할 수 있다. 질소산화물의 다른 형태인 질산기는 물과 반응하여 질산을 형성하고 산성비의 원인이 되기도 한다. 상기 질산은 대기 중의 알칼리성 물질인 암모늄과 결합하여 질산 암모늄을 생성하는데, 상기 질산암모늄은 대기중 입자상 물질로서 2차적 미세먼지이며 인체에 악영향을 미치게 된다. 상기 질산암모늄이 인체에 닿으면, 눈, 코 점막 그리고 피부에 염증을 일으키게 된다.

또한, 상술한 공해물질에 속하는 것으로 포름알데히드가 있다. 상기 포름알데히드는 실온에서 자극성이 강한 냄새를 띤 무색의 기체로 메탄알(methanal)이라고도 한다. 상기 포름알데히드는 탄소가 포함된 물질이 불완전 연소할 때에 쉽게 만들어지며 공기 중에서는 메테인과 같은 탄화수소에 햇빛과 산소가 가해지면서 합성된다. 상기 포름알데히드는 피부 알러지원이며, 피부에 접촉 시 피부 발진, 피부, 피부염 등의 문제를 일으킬 수 있다.

상기 기재한 오염물질들은 피부에 대하여 고농도의 접촉 시 직접적인 염증 또는 괴사의 원인이 되며, 대기 중의 잔량일지라도 지속적으로 접촉하면 피부에 지속적인 스트레스를 주므로 피부노화의 원인으로 작용한다.

위와 같은 오염물질이 피부에 미치는 영향에 비하여, 대중들의 위험 인식은 아직 낮은 편이나, 최근 미세먼지 등의 이슈가 떠오르면서 점차 그 위험성이 주목되고 있으며 점차적으로 오염물질의 위험성을 인식하는 사람들의 수가 늘어나고 있다.

또한 다양한 오염원과 미세먼지 주의보에 의하여 미세먼지 등 외부 유해환경으로부터 피부를 지키는 제품이란 의미의 합성어로서 안티폴루션(Anti-pollution)이라는 용어 및 이러한 기능성 제품들에 대한 수요가 증가하고 있다. 특히 화장품 분야에 있어서, 안티폴루션 화장품이 주목받고 있고 있는 실정이다. 중국의 시장조사회사 QY 리서치 보고서에 따르면 미세먼지를 포함한 유해환경에 대한 안티폴루션 스킨케어 시장 규모는 다가오는 2025년에는 100억 달러로 확산될 전망이라고 밝힐 만큼 대기오염에 대한 심각성과 그에 따른 소비자의 관심이 날로 커지고 있다.

한편, 이러한 오염물질로부터 피부를 보호할 수 있는 조성물들이 연구되고 있으나, 아직까지는 그 다양성이 부족하고 효과가 뚜렷하지 않으며, 제조하기 어렵거나 구하기 어려운 물질로 제조되는 경우가 많아, 주변에서 쉽게 구할 수 있는 신규한 조성물의 개발이 요구되고 있다.

KR 10-2017-0053388 A KR 10-2018-0031487 A

본 발명의 목적은 항산화 활성과 함께 활성산소종 생산, DNA 손상, 세포사멸 및 미토콘드리아 막 손상을 억제하여 세포의 생존율을 증가시키는 효과를 낼 수 있게 하는 달맞이꽃 추출물을 포함하는 피부 보호용 조성물을 제공하기 위한 것이다.

본 발명의 목적은 미세먼지, 유기성 또는 무기성 오염원 등에 대한 피부 항오염 효과를 가질 수 있도록 하는 달맞이꽃 추출물을 포함하는 피부 안티폴루션용 조성물을 제공하기 위한 것이다.

본 발명의 목적은 피부자극을 최소화시키면서 오염원으로부터 피부를 보호함으로서 오염원에 의한 피부자극, 피브트러블 등의 문제를 개선할 수 있도록 하기 위한 것이다.

본 발명의 목적은 피부 도포성 및 흡수성이 우수하여 선호도가 높은 제형으로 이루어진 달맞이꽃 추출물을 포함하는 항산화 및 피부 안티폴루션용 조성물을 제공하기 위한 것이다.

상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명의 일 실시예에 따른 항산화 및 피부 안티폴루션용 조성물은 달맞이꽃 추출물을 포함하는 것일 수 있다.

상기 달맞이꽃 추출물은 달맞이꽃의 종자, 달맞이꽃의 줄기, 달맞이꽃의 잎, 달맞이꽃의 꽃, 달맞이꽃의 뿌리 및 이들의 혼합물로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나를 용매로 추출한 것일 수 있다.

상기 용매는 물, 탄소수 1 내지 10의 알코올 및 이들의 혼합물로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나인 것일 수 있다.

상기 항산화 및 피부 안티폴루션용 조성물에 있어서, 민들레 추출물, 어성초 추출물, 스피아민트 추출물, 애플민트 추출물, 페퍼민트 추출물, 레몬밤 추출물, 스위트 바질 추출물, 골든레몬타임 추출물, 파인애플 추출물, 세이지 추출물, 라벤더 추출물, 로즈마리 추출물, 카모마일 추출물, 파슬리 추출물, 차즈기 추출물, 노니 추출물, 도라지 추출물, 곰피 추출물, 회화나무 추출물 및 이들의 혼합물로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나를 더 포함하는 것일 수 있다.

본 발명의 다른 일 실시예에 따른 건강기능식품은 상기 항산화 및 피부 안티폴루션용 조성물을 포함하는 것일 수 있다.

본 발명의 또 다른 일 실시예에 따른 화장품은 상기 항산화 및 피부 안티폴루션용 조성물을 포함하는 것일 수 있다.

이하, 본 발명을 더욱 상세하게 설명한다.

본 발명의 일 실시예에 따른 항산화 및 피부 안티폴루션용 조성물은 달맞이꽃 추출물을 포함하는 것일 수 있다.

상기 달맞이꽃은 첫 해에는 원줄기 없이 뿌리잎이 방석처럼 자라다가 겨울을 지내고 다음 해에 줄기를 만들어 곧추 자라 꽃피는 두해살이풀을 말한다. 이는 전체에 짧은 털이 나고 줄기에 잎은 어긋나며 꽃은 황색이고 여름에 잎겨드랑이에 1개씩 밤에 펴서 다음 날 아침에 진다. 또한 꽃의 직경은 5cm 내외이며 4장의 꽃받침, 4장의 꽃잎, 8개의 수술, 그리고 1개의 암술이 있다. 열매는 윗부분이 벌어져 수백 개의 종자가 나온다. 큰달맞이꽃과 애기달맞이꽃 등이 같은 속에 속한다. 정원에 심기는 낮달맞이꽃은 낮에 꽃 핀다.

본 발명에서 말하는 "세포 보호"는 세포독성이 없고, 환원력 및 DPPH 라디칼 소거능이 높아 항산화 활성이 뛰어나며, 활성산소종 생산, DNA 손상, 세포사멸 및 미토콘드리아 막 손상을 억제하는 효과를 나타내는 것을 포함하는 것으로 한다.

본 명세서에서 "추출물(extract)"이란 생약을 적절한 침출액으로 짜내고 침출액을 증발시켜 농축한 제제를 의미하는 것으로, 이에 제한되지는 않으나, 추출처리에 의해 얻어지는 추출액, 추출액의 희석액 또는 농축액, 추출 액을 건조하여 얻어지는 건조물, 이들의 조정제물 또는 정제물일 수 있다.

본 명세서에서 "유효성분"이란 단독으로 목적하는 활성을 나타내거나 또는 그 자체는 활성이 없는 담체와 함께 활성을 나타낼 수 있는 성분을 의미한다.

본 발명에서 말하는 '피부 안티폴루션(Anti-pollution)'은 미세먼지, 유기오염원 또는 무기오염원 등의 오염물질에 의한 피부 오염, 피부 세포 사멸 또는 피부 세포 증식 저해, 또는 피부상태 저하를 개선하는 것을 말한다.

본 발명에서 오염물질은 미세먼지, 다환 방향족 탄화수소, 알데하이드류 및 질소산화물류를 포함하는 것일 수 있다.

상기 달맞이꽃 추출물을 포함하는 경우 우수한 항산화 활성 및 세포사멸과 DNA 결실을 보호하는 효과를 나타낼 수 있을 뿐만 아니라, 오염물질에 의한 세포 사멸, 세포 증식 저해 및 피부상태 저하의 문제가 개선되는 효과를 나타낼 수 있다.

바람직하게, 상기 달맞이꽃 추출물은 달맞이꽃의 줄기, 달맞이꽃의 잎, 달맞이꽃의 꽃의 혼합물을 용매로 추출한 것일 수 있다. 달맞이꽃의 종자, 달맞이꽃의 줄기, 달맞이꽃의 잎, 달맞이꽃의 꽃, 달맞이꽃의 뿌리 중 항산화 활성 자체는 달맞이꽃 종자가 우수하지만, 종자 및 뿌리를 제외한 줄기, 잎, 꽃을 혼합하여 추출하는 경우 상호작용에 의한 상승효과로서, 항산화 및 세포보호 활성이 증진될 뿐만 아니라, 피부 안티폴루션 효과가 크게 증진되는 효과를 나타낼 수 있다.

더 바람직하게 상기 달맞이꽃 추출물은 달맞이꽃의 줄기를 포함하고 상기 달맞이꽃의 줄기 100 중량부에 대하여 달맞이꽃의 잎 30 내지 150 중량부, 달맞이꽃의 꽃 80 내지 220 중량부의 혼합물을 용매로 추출된 것이고, 상기 달맞이꽃의 줄기, 달맞이꽃의 잎, 달맞이꽃의 꽃은 건조된 것을 용매로 추출한 것일 수 있다. 한 것일 수 있다. 상기 범위에 의하는 경우 항산화, 세포보호 활성 및 피부 안티폴루션 효과가 증진되는 효과가 높아질 수 있다. 따라서 적은 량으로 보다 우수한 효과를 낼 수 있어 세포독성의 문제없이 장기간 사용될 수 있다.

바람직하게 상기 용매는 물, 에탄올 및 이들의 혼합물로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나인 것일 수 있다. 상기 용매에 의하는 경우 본 발명에서 목적하는 유효성분을 수득하는데 유리할 수 있어 적은 함량의 추출물로 우수한 활성을 나타내게 할 수 있다.

바람직하게, 상기 상기 항산화 및 피부 안티폴루션용 조성물은 달맞이꽃 추출물 100 중량부에 대하여 세이지 추출물 1 내지 10 중량부; 곰피 추출물 1 내지 10 중량부 및 차즈기 추출물 0.5 내지 5 중량부를 더 포함하는 것일 수 있다. 상기 범위에 의하는 경우 항산화 활성, 세포 보호 활성이 크게 높아질 뿐만 아니라 피부 안티폴루션 활성이 보다 증진되는 효과를 낼 수 있다. 따라서 적은 함량으로 높은 효과를 나타내고, 세포독성의 문제가 없어 장기간 사용에 따른 부작용의 문제가 없다.

바람직하게, 상기 항산화 및 피부 안티폴루션용 조성물은 천연 유리 식물 추출물을 더 포함하는 것일 수 있다. 이를 통하여 미백 및 주름개선 등의 개선 효과가 상기 피부 안티폴루션 효과와 함께 제공되는 기능성 화장료 조성물로 제공될 수 있다.

바람직하게 상기 항산화 및 피부 안티폴루션용 조성물은 알로에 추출물을 포함하고, 상기 알로에 추출물 100 중량부에 대하여 어성초 추출물 1 내지 10 중량부, 밤껍질 추출물 1 내지 10 중량부, 해당화 추출물 1 내지 5 중량부, 신갈나무 추출물 1 내지 5 중량부 및 민들레 추출물 1 내지 5 중량부가 포함된 혼합 추출물이 더 포함되는 것일 수 있다. 상기 혼합 추출물이 더 포함되는 경우 피부 진정효과가 증진되어 피부자극 개선 및 피부 트러블 예방 활성을 높일 수 있다. 특히 기능성 화장료로 제공되어 항산화 및 피부 안티폴루션 효과와 함께 피부진정 및 피부트러블 예방 효과를 가지는 기능성 화장품으로 제공될 수 있다.

상기 건강기능식품은 여러 가지 영양제, 비타민, 광물(전해질), 합성 풍미제 및 천연 풍미제 등의 풍미제, 착색제 및 중진제(치즈, 초콜릿 등), 펙트산 및 그의 염, 알긴산 및 그의 염, 유기산, 보호성 콜로이드 증점제, Ph 조절제, 안정화제, 방부제, 글리세린, 알코올, 탄산 음료에 사용되는 탄산화제 등을 함유할 수 있다. 그 밖에 천연 과일 주스 및 과일 주스 및 야채 음료의 제조를 위한 과육을 함유할 수 있다. 이러한 성분은 독립적으로 또는 조합하여 사용할 수 있다. 또한, 건강기능식품은 육류, 소세지, 빵, 초콜릿, 캔디류, 스넥류, 과자류, 피자, 라면, 껌류, 아이스크림류, 스프, 음료수, 차, 기능수, 드링크제, 알콜 및 비타민 복합제 중 어느 하나의 형태일 수 있다.

또한 상기 건강기능식품은 식품첨가물을 추가로 포함할 수 있으며, "식품첨가물"로서의 적합여부는 다른 규정이 없는 한 식품의약품안정청에 승인된 식품첨가물공전의 총칙 및 일반시험법 등에 따라 해당 품목에 관한 규격 및 기준에 의하여 판정한다.

상기 "식품첨가물공전"에 수재된 품목으로 예를 들어, 케톤류, 글리신, 구연산 칼륨, 니코틴산, 계피산 등의 화학적 합성품, 감색소, 감초추출물, 결정셀룰로오스, 고랭색소, 구아검 등의 천연첨가물, L-글루타민산나트륨제제, 면류첨가알칼리제, 보존료제제, 타르색소제제 등의 혼합 제제류 등을 들 수 있다.

본 발명의 화장료 조성물은 해당 분야에서 통상적으로 제조되는 어떠한 제형으로도 제조될 수 있으며, 예를 들어, 용액, 현탁액, 페이스트, 겔, 크림, 로션, 파우더, 비누, 계면활성제-함유 클렌증, 오일, 분말 파운데이션, 유탁액 파운데이션, 왁스 파운데이션, 및 스프레이 등으로 제형화 될 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다. 보다 상세하게는, 유연 화장수, 영양 화장수, 영양 크림, 마사지 크림, 에센스, 아이크림, 클렌징 크림, 클렌징 포옴, 클렌징 워터, 팩, 스프레이 또는 파우더의 제형, 수중유(O/W)형 또는 유중수(W/O)형의 제형 또는 연고로 제조될 수 있다.

상기 화장품은 본 발명의 달맞이꽃 추출물 이외에도 피부학적으로 허용된 매질 또는 기제를 함유함으로써 당업계에서 통상적으로 사용되는 국소 적용 또는 전신 적용할 수 있는 보조제 형태로 제조될 수 있다.

적합한 화장품의 제형으로는 예를 들면, 용액, 겔, 고체 또는 반죽 무수 생성물, 수상에 유상을 분산시켜 얻은 에멀젼, 현탁액, 마이크로에멀젼, 마이크로캡슐, 미세과립구 또는 이온형(리포좀), 비이온형의 소낭 분산제의 형태, 크림, 스킨, 로션, 파우더, 연고, 스프레이 또는 콘실 스틱(conceal stick)의 형태로 제공될 수 있다. 또한, 포말(foam)의 형태 또는 압축된 추진제를 더 함유한 에어로졸 조성물의 형태로도 제조될 수 있다.

본 발명의 화장료 조성물을 첨가할 수 있는 제품으로는, 예를 들어, 수렴화장수, 유연화장수, 영양화장수, 각종 크림, 에센스, 팩, 파운데이션 등과 같은 화장품류와 클렌징, 세안제, 비누, 트리트먼트 또는 미용액 등이 있다. 구체적인 제형으로서는 스킨로션, 스킨 소프너, 스킨토너, 아스트린젠트, 로션, 밀크로션, 모이스처 로션, 영양로션, 맛사지크림, 영양크림, 모이스처 크림, 핸드크림, 에센스, 영양에센스, 팩, 비누, 샴푸, 클렌징 폼, 클렌징로션, 클 렌징크림, 바디로션, 바디클렌저, 유액, 프레스파우더, 루스파우더 또는 아이섀도 등의 제형을 포함한다.

본 발명은 항산화 활성과 함께 활성산소종 생산, DNA 손상, 세포사멸 및 미토콘드리아 막 손상을 억제하여 세포의 생존율을 증가시키는 효과를 낼 수 있게 하는 달맞이꽃 추출물을 포함하는 피부 보호용 조성물을 제공한다.

본 발명은 미세먼지, 유기성 또는 무기성 오염원 등에 대한 피부 항오염 효과를 가질 수 있도록 하는 달맞이꽃 추출물을 포함하는 피부 안티폴루션용 조성물을 제공한다.

본 발명은 피부자극을 최소화시키면서 오염원으로부터 피부를 보호함으로서 오염원에 의한 피부자극, 피브트러블 등의 문제를 개선할 수 있도록 한다.

본 발명은 피부 도포성 및 흡수성이 우수하여 선호도가 높은 제형으로 이루어진 달맞이꽃 추출물을 포함하는 항산화 및 피부 안티폴루션용 조성물을 제공한다.

도 1은 달맞이꽃 추출물이 HaCaT 세포의 생존율에 미치는 영향을 실험한 결과에 관한 것이다.
도 2는 달맞이꽃 추출물이 과산화수소로 산화 스트레스를 유도한 HaCaT 세포의 생존율에 관한 것이다.
도 3은 달맞이꽃 추출물의 환원력에 관한 것이다.
도 4는 달맞이꽃 추출물의 DPPH 라디칼 소거능에 관한 것이다.
도 5는 달맞이꽃 추출물이 과산화수소를 처리하여 산화 스트레스를 유도한 HaCaT 세포의 활성산소종 생산에 미치는 효과에 관한 것이다.
도 6은 달맞이꽃 추출물이 과산화수소를 처리하여 산화 스트레스를 유도한 HaCaT 세포의 활성산소종 생산에 미치는 효과에 관한 것이다.
도 7은 달맞이꽃 추출물이 과산화수소를 처리하여 산화 스트레스를 유도한 HaCaT 세포의 활성산소종 생산에 미치는 효과에 관한 것이다.
도 8은 달맞이꽃 추출물이 과산화수소를 처리하여 산화 스트레스를 유도한 HaCaT 세포의 활성산소종 생산에 미치는 효과에 관한 것이다.
도 9는 달맞이꽃 추출물이 과산화수소를 처리하여 산화 스트레스를 유도한HaCaT 세포의 comet 생성에 미치는 영향에 관한 것이다.
도 10은 달맞이꽃 추출물이 과산화수소를 처리하여 산화 스트레스를 유도한HaCaT 세포의 comet 생성에 미치는 영향에 관한 것이다.
도 11은 달맞이꽃 추출물이 과산화수소를 처리하여 산화 스트레스를 유도한HaCaT 세포의 comet 생성에 미치는 영향에 관한 것이다.
도 12는 달맞이꽃 추출물이 과산화수소를 처리하여 산화 스트레스를 유도한 HaCaT 세포의 단백질 발현에 미치는 영향에 관한 것이다.
도 13은 달맞이꽃 추출물이 과산화수소를 처리하여 산화 스트레스를 유도한 HaCaT 세포의 단백질 발현에 미치는 영향에 관한 것이다.
도 14는 달맞이꽃 추출물이 과산화수소를 처리하여 산화 스트레스를 유도한 HaCaT 세포의 단백질 발현에 미치는 영향에 관한 것이다.
도 15는 달맞이꽃 추출물이 과산화수소를 처리하여 산화 스트레스를 유도한 HaCaT 세포의 단백질 발현에 미치는 영향에 관한 것이다.
도 16은 달맞이꽃 추출물이 과산화수소를 처리하여 산화 스트레스를 유도한 HaCaT 세포의 미토콘드리아 막 전위에 미치는 영향에 관한 것이다.
도 17은 달맞이꽃 추출물이 과산화수소를 처리하여 산화 스트레스를 유도한 HaCaT 세포의 미토콘드리아 막 전위에 미치는 영향에 관한 것이다.
도 18은 달맞이꽃 추출물이 과산화수소를 처리하여 산화적 스트레스가 유도된 HaCaT 세포의 사멸에 미치는 영향에 관한 것이다.
도 19는 달맞이꽃 추출물이 과산화수소를 처리하여 산화적 스트레스가 유도된 HaCaT 세포의 사멸에 미치는 영향에 관한 것이다.
도 20은 달맞이꽃 추출물이 과산화수소를 처리하여 산화적 스트레스가 유도된 HaCaT 세포의 사멸에 미치는 영향에 관한 것이다.

이하, 본 발명이 속하는 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자가 용이하게 실시할 수 있도록 본 발명의 실시예에 대하여 상세히 설명한다. 그러나 본 발명은 여러 가지 상이한 형태로 구현될 수 있으며 여기에서 설명하는 실시예에 한정되지 않는다.

[제조예 2: 달맞이꽃 추출물(APOB)의 제조]

경상북도 상주시에서 채집한 달맞이꽃을 물로 씻은 후 실온에서 공기로 건조하였다. 달맞이꽃의 뿌리부를 제외한 지상부(줄기, 잎, 꽃 = 1: 1: 1.2 중량부)만을 선별한 뒤 분쇄기를 사용하여 분쇄하여 분말을 얻었다. 상기 분말 100 g을 에탄올 2 L에 넣고 25℃에서 24시간동안 100 rpm에서 진탕혼합하였다. 이렇게 얻은 달맞이꽃 추출물을 필터를 사용하여 여과하였고, 진공회전농축기(N-1000S)를 사용하여 용매가 제거된 달맞이꽃 추출물의 분말을 획득하였다. 달맞이꽃 분말을 디메틸설폭사이드 (dimethyl sulfoxide, DMSO)에 녹여 100 mg/ml의 원액 (stock solution)을 제조한 후 4℃에서 보관하였다. 원액은 생리식염수를 사용하여 원하는 농도로 희석시켜 실험을 진행하였다.

또한, 동일한 방법으로, 달맞이꽃의 줄기 추출물(EA), 달맞이꽃의 잎 추출물(EB), 달맞이꽃의 꽃 추출물(EC), 달맞이꽃의 종자 추출물(ED)를 제조하였다. 한편, 혼합 추출물의 각 혼합범위에 따른 상승효과를 확인하기 위하여 하기의 [표 1]과 같은 조성을 가지는 혼합 추출물을 추가로 제조하였다.

	AP1	AP2	APOB	AP3	AP5
EA	100	100	100	100	100
EB	10	30	100	150	200
EC	20	80	120	220	300

(단위: 중량부)

이하에서 실시되는 모든 실험 결과는 평균값을 기초로 ±S.D.(표준편차)로 나타내었고, 결과값의 P-valus가 0.05 미만일 경우 유의한 것으로 판정하였다.

[실험예 1: 달맞이꽃 추출물(APOB)에 대한 항산화 및 안티폴루션 평가]

1. 세포 배양 및 세포 생존율분석

(1) 세포 배양

본 실험에 사용한 인간 피부각질세포(HaCaT human keratinocyte cell line) 세포주는 아메리칸 타입 컬쳐 컬렉션 (American Type Culture Collection, ATCC)에서 구입하였다. HaCaT 세포를 10% 소태아 혈청 (가열하여 불활성화시킴), 스트렙토마이신(100 μg/mL) 및 페니실린 (100 unit/mL)이 함유된 로스웰 파크 메모리얼인스티튜트 (Roswell Park Memorial Institute, RPMI) 1640 배지를 사용하여, 이산화탄소 배양기에서 5% CO2 및 37℃를 유지하며 배양하였다.

(2) APOB와 세포의 생존율 분석

세포 생존율을 분석하기 위해 처리된 인간 각질 세포를 6-웰 플레이트(6-well plate)에 3 x 10⁵ cells/ml로 접종하고 24시간 동안 배양한 후 다양한 농도의 APOB를 처리한 뒤 24시간동안 배양하였다.

도 1은 APOB를 다양한 농도로 처리하였을 때의 처리된 인간 각질 세포의 생존율을 나타낸 그래프이다. 그 결과, APOB는 세포 생존력에 별다른 영향을 주지 않는다는 점을 확인할 수 있었다.

(3) 과산화수소에 대한 저항활성 평가

EA 내지 ED 및 APOB가 과산화수소 처리된 인간 각질 세포주에 미치는 영향을 알아보기 위해 60 μg/ml 농도로 맞춰서 실험을 진행하였다. 먼저 APOB가 과산화수소를 30분동안 처리하여 산화 스트레스가 유도된 HaCaT 세포에 미치는 영향을 알아보기 위해, 3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5 diphenyltetrazolium bromide (MTT) 분석을 수행하였다. 세포에 MTT 0.5 mg/ml를 처리한 뒤 37℃에서 3시간 동안 배양하였다. 배양이 끝난 뒤, 배지를 제거하고 포르마잔(formazan) 침전물을 디메틸설폭사이드에 용해시켰다. 포르마잔 생성물의 흡광도를 Cytation-3 마이크로플레이트 리더(microplate reader)를 사용하여 540 nm 파장에서 측정하였다. 무처리된 세포를 정상군, 과산화수소 0.5 mM을 처리한 세포를 대조군1, 항산화제인 N-아세틸-L-시스테인 (N-acetyl-L-cysteine, NAC) 10 mM을 처리한 뒤 과산화수소 0.5 mM을 처리한 세포를 대조군 2, APOB를 처리한 뒤 APOB를 처리한 세포를 실험군으로 정하였다.

도 2는 달맞이꽃 추출물(APOB)이 과산화수소 처리하여 산화 스트레스를 유도한 HaCaT 세포의 생존율에 미치는 효과를 나타낸 그래프이다. 그 결과, 과산화수소를 처리한 대조군 1의 생존력은 현저하게 감소하였다. 그러나, 달맞이꽃 추출물을 전처리한 실험군은 NAC를 전처리한 대조군 2와 마찬가지로 APOB의 농도 의존적으로 생존율이 증가하였다. 따라서, APOB의 과산화수소에 대한 저항활성을 확인할 수 있었다.

한편, 위와 동일한 방법으로 APOB와 동일한 농도로 설정된 EA 내지 ED에 대한 저항활성을 평가하였고, 객관적인 비교를 위하여 control과 비교하여, EA 내지 ED의 결과를 1 내지 10의 지수로 평가하여 하기의 [표 2]에 나타내었다. 상기 지수는 그 숫자가 높을수록 과산화수소에 대한 세포 보호활성이 우수한 것이다. 각 지수는 반올림을 적용하였다.

	Con	EA	EB	EC	ED	APOB	AP1	AP2	AP3	AP5
과산화수소에 대한 세포 보호활성	10	2	3	5	7	8	3	7	8	6

(단위: 지수)

상기 [표 2]를 참조하면, 단일 추출물의 경우 ED가 과산화수소에 대한 세포 보호활성이 가장 우수하다. 한편, EA 내지 EC는 상대적으로 과산화수소에 대한 세포 보호활성이 낮지만, 일정한 혼합구성으로 APOB와 같이 제공되는 경우 상호작용에 의한 상승효과로서, 과산화수소에 대한 세포 보호활성이 향상되어 ED 보다 우수한 활성을 나타낼 수 있다는 점을 확인할 수 있다. 또한 혼합 추출물의 구성에 있어서도 AP2, APOB, AP3의 범위에 의하는 경우 상호작용에 의한 상승효과가 나타난다는 점을 확인할 수 있다.

2. 달맞이꽃 추출물의 환원력 및 DPPH 라디칼 소거능 분석

(1) 달맞이꽃 추출물의 환원력 분석

APOB의 환원력을 분석하기 위해, Fe³⁺/페리시안화합물(ferric cyanide) 복합체가 Fe²⁺ 형태로 환원되는 정도를 분석하였다. APOB(0~100 μg/ml)을 0.1M 인산염완충용액(phosphate buffer, pH 6.6) 50 ml에 용해시키고, 페리시안화 칼륨(potassium ferricyanide) 0.5g을 첨가하여 혼합하였다. 혼합액을 50℃에서 30분간 반응시켰고 10% 트리클로로 아세트산(trichloroacetic acid, 50 ml, 5 g)을 첨가하여 혼합하였다. 혼합액 100 μl에 증류수 100 μl와 0.1% 염화제2철(ferric chloride, 10 ml, 0.01 g)을 첨가하여 Cytation-3 마이크로플레이트 리더를 사용하여 700 nm 파장에서 흡광도를 측정하였다. 대표적 항산화제인 아스코르빈산 (ascorbic acid) 100 μg/ml을 양성대조군, APOB를 실험군으로 하였다. 아스코르빈산이 Fe³⁺/페리시안화합물 (ferric cyanide) 복합체를 Fe²⁺ 형태로 환원한 정도를 100%로 놓고 APOB의 환원력을 분석하였다.

도 3은 달맞이꽃 추출물(APOB)의 환원력을 나타낸 그래프이다. 하기의 도 3을 참조하면, 달맞이꽃 추출물의 환원력은 농도 의존적으로 증가한다는 점을 확인할 수 있었다.

한편, 위와 동일한 방법으로 EA 내지 ED에 대한 환원력을 평가하였고, 객관적인 비교를 위하여 APOB의 값을 10으로 하고, EA 내지 ED의 결과를 1 내지 10의 지수로 평가하여 하기의 [표 3]에 나타내었다. 상기 지수는 그 숫자가 항산화 활성이 우수한 것이다. 각 지수는 반올림을 적용하였다.

	APOB	EA	EB	EC	ED	AP1	AP2	AP3	AP5
항산화 활성	10	3	3	4	8	4	9	9	6

(단위: 지수)

상기 [표 3]을 참조하면, 단일 추출물의 경우 ED가 항산화 활성이 가장 우수하다. 한편, EA 내지 EC는 상대적으로 환원 활성이 낮지만, 일정한 혼합구성으로 APOB와 같이 제공되는 경우 상호작용에 의한 상승 작용으로 우수한 항상화 효과로서, ED 보다 우수한 환원 활성을 나타낼 수 있다는 점을 확인할 수 있다. 또한 과산화수소에 대한 저항활성과 마찬가지로 혼합 추출물의 구성에 있어서도 E2, APOB, AP3의 범위에 의하는 경우 상호작용에 의한 상승효과가 나타난다는 점을 확인할 수 있다.

(2) 달맞이꽃 추출물의 DPPH 라디칼 소거능 분석

APOB의 2,2-디페닐-1-피크릴하이드라질(2,2-Diphenyl-1-picrylhydrazyl, DPPH) 라디칼 소거능을 분석하기 위해, APOB(0~100μg/ml) 100μl에 DHHP 라디칼 (최종농도 0.2 mM)가 포함된 메탄올 용액 100μl를 첨가하여 혼합하였다. 혼합액을 25℃에서 30분간 반응시킨 뒤, 분광광도계를 사용하여 517nm 파장에서 혼합액의 흡광도를 측정하였다. 대표적 항산화제인 아스코르빈산(ascorbic acid) 100μg/ml을 양성대조군, APOB를 실험군으로 하였다.

도 4는 달맞이꽃 추출물(APOB)의 DPPH 라디칼 소거능을 나타낸 그래프이다. 그 결과, APOB의 DPPH 라디칼 소거능은 농도 의존적으로 증가한다는 점을 확인할 수 있었다.

(3) 포름알데하이드에 대한 저항 활성 평가

EA 내지 ED 및 APOB가 포름알데하이드가 처리된 인간 각질 세포주에 미치는 영향을 알아보기 위해 60 μg/ml 농도로 맞춰서 실험을 진행하였다. 사람 각질 세포(HaCaT)에 포름알데히드(1㎍/mL)를 처리하고, 무처리 군(control), EA 내지 APOB, AP1 내지 AP5를 처리한 군으로 구별하여 24 시간 동안 배양하였다. 그 후 그 후 5mg/mL 농도의 MTT solution을 넣고 3시간 배양한 다음 배지를 제거하고 dimethyl sulfoxide(DMSO)를 150㎕씩 각 well에 넣어주고 10분간 shaking 하고 570nm(reference 655nm) 조건으로 흡광도를 측정하였고 객관적인 비교를 위하여 세포생존율을 control의 결과와 비교하여 1 내지 10의 지수로 평가하였다. 상기 지수는 그 숫자가 높을 수록 포름알데하이드에 대한 저항활성이 우수한 것이다. 그 결과를 [표 4]에 나타내었다. 각 지수는 반올림을 적용하였다.

	Con	EA	EB	EC	ED	APOB	AP1	AP2	AP3	AP5
포름알데하이드에 대한 저항활성	1	2	3	3	4	7	3	6	6	4

(단위: 지수)

상기 [표 4]를 참조하면, 과산화 수소에 대하 저항활성과 마찬가지로, 각 실시예에 따른 포름알데하이드에 대한 저항활성을 확인할 수 있다. 또한 AP2, APOB 및 AP3에 의하는 경우 상승효과가 나타나는 점을 확인할 수 있다.

(4) 과산화 수소 및 방향족 화합물에 대한 피부 저항활성 평가

실리콘(1cm x 1cm) 시편을 세척한 뒤 정제수 처리군(control), 정제수와 혼합된 EA 내지 APOB, AP1 내지 AP5를 도포하여 처리한 군으로 구별하고, 상기 각 시편에 나프탈렌(Naphtalene), 아세나프틸렌(Acenaphthylene), 아세나프텐(Acenaphthene), 플루오렌(Fluorene), 벤조피렌(Benzopyrene)을 600ppm 함유하는 용액에 1 시간 이상 침지시킨 뒤 상온에서 건조하였다. 이후, 각 시편을 인산완충생리식염수로 세척하고, 시편에 잔류하는 나프탈렌, 아세나트틸렌, 아세나프텐, 플루오렌 및 벤조피렌의 함량을 분석하고 상기 control의 값을 10으로 고정하고, 상기 control 결과와 비교하여 각 실시예의 결과를 1 내지 10의 지수로 평가하였다. 상기 지수는 그 숫자가 낮을수록 방향족 화합물에 대한 저항 효과가 우수한 것이다. 그 결과를 하기의 [표 5]에 나타내었다. 각 지수는 반올림을 적용하였다.

	Con	APOB	EA	EB	EC	ED	AP1	AP2	AP3	AP5
방향족 화합물에 대한 저항활성	10	6	9	8	8	8	9	7	6	8

(단위: 지수)

상기 [표 5]를 참조하면, EA 내지 ED 및 APOB에 의하는 경우 방향족 화합물에 대한 저항활성이 나타난다는 점을 확인할 수 있다. 특히 APOB에 의하는 경우 EA 내지 ED에 비하여 개선된 저항활성을 나타낼 수 있다는 점을 확인할 수 있다. 한편, AP2, APOB, AP3에 의하는 경우 일정한 범위에서 상호 작용에 의한 상승효과가 도출되는 점을 확인할 수 있다.

3. 달맞이꽃 추출물을 처리한 세포의 ROS 생산정도 측정

세포 내 활성산소종 (reactive oxygen species, ROS)의 생산정도를 측정하기 위해 산화민감염료인 2′,7′-dichlorodihydrofluorescein diacetate (DCF-DA)를 사용하였다. 배양된 HaCaT 세포에 인산완충식염수 (phosphate-buffered saline, PBS)로 2번 워싱한 후, 10 μM DCF-DA를 첨가한 뒤 37℃에서 30분간 암실에서 반응시켰다. 반응액을 PBS로 워싱한 뒤, FL-1 형광을 유세포측정기 (FACS Calibur)로 측정하였다. 무처리된 세포를 정상군, APOB 60 μg/ml만 처리한 세포를 대조군 1, NAC 10 mM만 처리한 세포를 대조군 2, 과산화수소 0.5mM을 처리한 세포를 양성대조군, NAC 10 mM을 처리한 뒤 과산화수소 0.5 mM을 처리한 세포를 음성대조군, APOB 60 μg/ml을 처리한 뒤 과산화수소 0.5 mM을 처리한 세포를 실험군으로 정하였다.

도 5 내지 8은 달맞이꽃 추출물이 과산화수소를 처리하여 산화 스트레스를 유도한 HaCaT 세포의 활성산소종 생산에 미치는 효과를 나타낸 도면으로, 도 5는 HaCaT 세포의 활성산소종 생산정도를 나타낸 현광현미경 사진이고 (200배율), 도 6은 활성산소종의 생산정도를 유세포측정기로 측정한 결과를 나타내는 그래프이고, 도 7은 현광현미경에서 측정된 형광발현정도를 나타낸 그래프이고, 도 8은 활성산소종의 생산정도를 나타낸 그래프이다. 그 결과, 30분동안 과산화수소를 처리한 양성대조군은 세포내 활성산소종 생산에 상당한 증가를 보인 반면에, NAC를 전처리한 음성대조군 및 APOB를 전처리한 실험군에서는 활성산소종 생산이 억제되는 것을 확인하였다.

4. comet assay를 이용한 달맞이꽃 추출물을 처리한 세포의 DNA 손상정도 측정

코밋 어세이 (comet assay)는 단일세포전기영동법 (single cell gel electrophoresis assay)을 이용하여 세포에 DNA 손상정도를 측정하는 실험법이다.

세포가 손상되면 DNA 이중가닥이 절단되어 파편이 생기는데 그 파편이 생긴 흔적이 혜성 (comet)이 지나가는 모양과 흡사하다. DNA 분자량의 크기가 작을수록 핵으로부터 멀리 이동되므로 손상되어 잘려진 DNA 가닥이 많을수록 혜성 꼬리처럼 긴 모양이 생긴다. APOB가 과산화수소를 30분동안 처리하여 산화 스트레스를 유도한 HaCaT 세포의 DNA 손상에 미치는 영향을 분석하기 위해, 코밋 어세이를 수행하였다. APOB를 처리한 HaCaT 세포를 PBS로 워싱한 뒤, 0.5% 아가로오스 젤 (agarose gel)과 혼합하였다. 슬라이드 글라스 (slide glass)에 1% 아가로스 젤로 코팅된 슬라이드 글라스에 혼합액을 올려준 뒤 커버 글라스 (cover glass)로 덮어 4℃에서 10분간 보관하였다. 젤이 굳은 후, 커버글라스를 제거하고 다시 0.5% 아가로오스 젤을 슬라이드 위에 떨어뜨린 후, 4℃에서 40분간 보관하였다. 젤이 굳은 것을 확인하고 용해완충용액 (2.5 M NaCl 및 500 mM Naethylene diamine tetra acetic acid (EDTA))와 1% 트리톤 (triton) X-100을 섞어 커버 글라스를 벗긴 슬라이드 슬라이드 글라스를 담가 4℃에서 1시간 동안 침지시켜 주었다. 이어서, DNA의 이중가닥을 풀기위해 언와인딩 (unwinding) 완충용액 (300 mM NaOH, 10 mM Na2EDTA, pH 13)에 슬라이드 글라스를 침지시킨 뒤 전기영동 탱크에 슬라이드 글라스를 옮겼다. 그런 다음, 25 V/300 mA의 전압에서 20분간 전기영동 하였다. 전기영동이 끝난 뒤, 슬라이드를 25℃에서 5분동안 0.4 M Tris (pH 7.5)으로 3회 워싱하고, 20 μg/ml 요오드화 프로피듐 (propidium iodide, PI)으로 염색하고, 형광현미경 (Carl Zeiss)으로 관찰하였다. 무처리된 세포를 정상군, APOB 60 μg/ml만 처리한 세포를 대조군 1, 과산화수소 0.5 mM을 처리한 세포를 양성대조군, NAC 10 mM을 처리한 뒤 과산화수소 0.5 mM을 처리한 세포를 음성대조군, APOB 60 μg/ml을 처리한 뒤 과산화수소 0.5 mM을 처리한 세포를 실험군으로 정하였다.

도 9 내지 11은 달맞이꽃 추출물(APOB)이 과산화수소를 처리하여 산화 스트레스를 유도한 HaCaT 세포의 comet 생성에 미치는 영향을 나타낸 도면으로, 도 9는 comet의 생성정도를 나타낸 현광현미경 사진이며, 도 10은 comet 꼬리의 운동 (tail moment, TM)을 측정한 그래프이며, 도 11은 comet 꼬리의 길이 (tail length, TL)를 측정한 그래프이다. 그 결과, 과산화수소를 처리한 양성대조군의 꼬리 길이와 꼬리 운동 값이 증가하였지만, NAC를 전처리한 음성대조군과 APOB를 전처리한 실험군의 꼬리 길이와 꼬리 운동 값은 감소하였다.

이에 따라, APOB가 DNA 손상을 억제한다는 것을 확인할 수 있었다.

5. 달맞이꽃 추출물을 처리한 세포의 단백질 추출 후 western blot 분석

과산화수소 처리된 세포는 산화 스트레스를 받게 되고, 세포내 활성산소종이 생성되며, 생성된 활성산소종이 DNA 이중가닥을 절단한다. 이 때, DNA의 이중가닥을 유지시켜주는 단백질인 히스톤 단백질 γH2AX가 인산화 (phosphorylation)되며, γH2AX 단백질이 인산화되는 정도를 분석하여 DNA 손상정도를 판단할 수 있다. 또한, 세포가 산화 스트레스를 받아 활성산소종을 생성하게 되면 세포에 손상을 야기하고, 야기된 손상이 복구되기 힘들 정도로 심각하면 세포사멸이 일어나게 된다. 세포사멸이 진행되면, 세포사멸 인자가 활성화되면 불필요한 세포의 단백질을 분해하기 위해 단백질 분해효소인 캐스페이즈-3 (caspase-3)과 폴리(ADP-리보오스) 중합효소 (poly(ADP-ribose) polymerase, PARP)가 활성화된다. caspase-3 및 PARP 활성화정도에 따라 세포사멸의 정도를 판단할 수 있다. 또한, 세포가 산화 스트레스를 받게 되면 Kelch-like ECHassociated protein 1 (Keap1)의 발현이 증가되고, Nuclear factor erythroid 2-related factor 2 (Nrf2) 및 헴산화효소 (heme oxygenase, HO-1)가 활성화되어 산화 스트레스에 대항하는 항산화 활동을 한다. Nrf2 및 HO-1는 세포의 산화 스트레스를 억제하는 항산화 활성에 중요한 역할을 하며, Nrf2 및 HO-1 발현정도에 따라 세포의 산화 스트레스에 대항하는 항산화 활동을 판단할 수 있다.

APOB가 과산화수소를 30분동안 처리하여 산화 스트레스가 유도된 HaCaT 세포의 DNA 손상, 세포사멸 및 항산화 활성에 미치는 영향을 분석하기 위해, γH2AX, caspase-3, PARP, Keap1, NrF2 및 HO-1 단백질의 발현정도를 측정하였다. HaCaT 세포에 용해완충용액 (20 mM sucrose, 1 mM EDTA, 20 μM Tris-Cl (pH 7.2), 1 mM 디티오트레이톨 (dithiothreitol, DTT), 10 mM KCl, 1.5mM MgCl2 및 5 μg/ml 아프로티닌 (aprotinin))을 첨가한 뒤 30분 동안 반응시킨 후, 12,000 rpm에서 20분간 원심분리하여 세포막 성분 등을 제거한 상층액을 얻었다. 상층액을 단백질 추출 키트 (Bio-Rad Protein Assay Kit)를 사용하여 상층액에 존재하는 단백질을 정량하였다. 30~50 μg의 용해액 (lysate)을 폴리아크릴아마이드 젤 전기영동(Poly Acrylamide Gel Electrophoresis, SDS-PAGE)로 분리하여, 이를 폴리비닐리덴 플루오라이드(polyvinylidene fluoride, PVDF) 막으로 전달하였다. 발현정도를 확인하려는 단백질과 결합하는 1차 항체 및 2차 항체를 처리한 뒤 enhanced chemiluminescence (ECL, Amersham Corp) 용액을 처리한 뒤 X-ray 필름에 감광하였다. 대조군과 실험군은 실험예 5와 동일하게 설정하였다.

도 12 내지 14는 달맞이꽃 추출물(APOB)이 과산화수소를 처리하여 산화 스트레스를 유도한 HaCaT 세포의 단백질 발현에 미치는 영향을 나타낸 도면으로, 도 12는 γH2AX 및 인산화된 γH2AX의 발현정도를 나타낸 전기영동 사진이며, 도 13은 γH2AX 발현정도에 따른 인산화된 γH2AX 단백질의 비율의 변화를 나타낸 그래프이며, 도 14는 caspase-3 및 PARP의 활성화정도를 나타낸 전기영동 사진이며, 도 15는 달맞이꽃 추출물(APOB)의 처리 시간에 따른 keap1, Nrf2 및 HO-1의 발현정도를 나타낸 전기영동 사진이다.

그 결과, 과산화수소를 처리한 양성대조군은 γH2AX의 인산화가 증가하였으므로 DNA가 손상된 것을 알 수 있었으며, caspase-3 및 PARP가 활성화되어 세포사멸이 진행되고 있는 것을 알 수 있었다. 그러나, NAC를 전처리한 음성대조군과 달맞이꽃 추출물(APOB)을 전처리한 실험군은 γH2AX의 인산화가 감소하였으므로 DNA가 손상이 억제된 것을 알 수 있었으며, caspase-3 및 PARP가 활성화되지 않아 세포사멸이 억제된 것을 알 수 있었다. 또한, 달맞이꽃 추출물(APOB)의 처리 시간에 따라 Nrf2 및 HO-1의 발현이 증가되었으므로 항산화 활동이 활발한 것을 확인할 수 있었다.

6. 달맞이꽃 추출물을 처리한 세포의 미토콘드리아 막 포텐셜 분석

APOB를 처리한 세포의 미토콘드리아 막 포텐셜 분석활성산소종은 세포 내 미토콘드리아를 공격하여 손상을 야기한다. 미토콘드리아에 손상이 야기되면 미토콘드리아 막 포텐셜(mitochondrial membrane potential, MMT)이 변하는 탈분극 상태가 되는데, 탈분극 정도를 분석하여 미토콘드리아의 손상정도를 측정할 수 있다. 미토콘드리아 막 포텐셜을 알아보기 위해 JC-1이라는 형광염료를 사용할 수 있다. JC-1은 세포사멸이 일어나지 않은 세포에서는 JC-1이 응집체 형태로 결합되어 붉은색 형광을 띄는 반면에, 세포사멸이 일어나는 세포에서는 JC-1이 단량체로 결합되어 붉은색의 형광이 감소하고 녹색 형광이 증가하게 된다. 이러한 붉은색 형광과 녹생 형광의 발현의 변화를 통해, 미토콘드리아 막 포텐셜의 변화를 측정하여 세포사멸 정도를 분석할 수 있다.

HaCaT 세포를 배양한 뒤, 세포만 모아서 JC-1 (10 ㎍/ml)을 포함하고 있는 인산완충식염수에 현탁하였다. 37℃에서 15분 동안 반응시킨 뒤, 세포만 모아서 인산완충식염수에 현탁하여 유세포측정기를 사용하여 측정하였다. 대조군과 실험군은 실험예 5와 동일하게 설정하였다.

도 16 및 17은 달맞이꽃 추출물(APOB)이 과산화수소를 처리하여 산화 스트레스를 유도한 HaCaT 세포의 미토콘드리아 막 전위에 미치는 영향을 나타낸 도면으로, 도 16은 JC-1 응집체가 JC-1 단량체로 변하는 정도를 유세포측정기로 측정하여 나타낸 그래프이며, 도 17은 JC-1 응집체가 JC-1단량체로 변하면서 달라지는 붉은색 형광 값을 나타낸 그래프이다. 그 결과, 과산화수소를 처리한 양성대조군은 미토콘드리아 막이 손상되어 전위의 변화가 일어났으며 (탈분극), JC-1의 붉은색 형광값이 감소하였고 녹색 형광값이 증가하였다. 그러나, NAC를 전처리한 음성대조군과 APOB를 전처리한 실험군의 미토콘드리아 막의 전위의 변화가 관찰되지 않았으며, JC-1의 붉은색 형광값은 정상군의 값과 유사하였다.

7. 달맞이꽃 추출물을 처리한 세포의 사멸정도 분석

활성산소종은 세포의 손상을 야기하여 세포사멸 (apoptosis)을 유도한다. 정상세포의 세포막 내에는 포스파티딜세린 (phosphatidylserine)이라는 단백질이 존재하는데, 세포사멸이 유도된 세포는 세포막의 안과 밖이 뒤집혀세포막 내에 있어야 할 포스파티딜세린이 세포막 밖에 존재하게 된다. 이때, 포스파티딜세린과 결합하는 형광염료인 아넥신 V (annexin V)를 처리하여 발현되는 형광의 정도를 분석하여 세포사멸의 유무를 측정할 수 있다. APOB가 과산화수소를 30분동안 처리하여 산화 스트레스를 유도한 HaCaT 세포의 사멸에 미치는 영향을 알아보기 위해, 아넥신 V-FITC(annexin V-FITC) 세포사멸 검출 키트 (BD Biosciences)를 사용하였다. HaCaT 세포에 APOB를 24시간동안 처리한 후 인산완충식 염수로 워싱하고 아넥신 (annexin) V와 프로피디움 요오드화물 (propidium iodide, PI)가 혼합된 바인딩 (binding) 버퍼 5 μl를 이용하여 암실의 상온에서 15분간 염색시킨 다음, 염색된 세포는 유세포분석기 (FACS calibur)를 이용하여 사멸세포를 나타내는 아넥신 V 양성 세포들을 측정하였다. 대조군과 실험군은 실험예 5과 동일하게 설정하였다.

도 18 내지 20은 달맞이꽃 추출물(APOB)이 과산화수소를 처리하여 산화적 스트레스가 유도된 HaCaT 세포의 사멸에 미치는 영향을 나타낸 도면으로, 도 18은 4',6'-디아미노-2-페닐인돌 (4',6'-diamidino-2-phenylindol, DAPI)로 염색한 세포 핵을 촬영한 형광현미경 사진이며, 도 19는 실험군과 대조군의 세포사멸정도를 측정하여 나타낸 그래프이며, 도 20은 세포사멸이 유도된 세포의 DNA를 추출하여 전기영동하여 DNA 절단정도를 나타낸 사진이다. 그 결과, 과산화수소를 처리한 양성대조군은 세포사멸이 유도되어 세포 핵이 파괴된 것을 관찰할 수 있었고, 아넥신 V 양성세포 및 DNA 절단정도가 증가하였다. 그러나, NAC를 전처리한 음성대조군과 APOB를 전처리한 실험군의 세포 핵은 정상군의 형태와 유사하였으며, 아넥신 V 양성세포 및 DNA 절단정도가 감소하는 점을 확인할 수 있었다.

따라서, 실험예의 결과를 종합해보았을 때, APOB은 세포독성이 없고, 환원력 및 DPPH 라디칼 소거능이 높아 항산화 활성이 뛰어나며, 활성산소종 생산, DNA 손상, 세포사멸 및 미토콘드리아 막 손상을 억제함으로서 우수한 세포 보호활성을 나타낸다는 점을 확인할 수 있다. 또한 과산화수소, 포름알데하이드 및 방향족 화합물에 대한 저항활성으로 피부 안티폴루션 효과로서 오염원에 의한 피부 손상을 보다 효과적으로 억제할 수 있다는 점을 확인할 수 있다. 특히 줄기, 잎, 꽃 각각의 추출물에 비하여 상승효과가 나타나며, 종자 추출물에 대하여 보다 우수한 효과를 나타내는 것을 확인할 수 있다.

[실험예 2: 안티폴루션 수분크림 제형에 대한 혼합조성 평가]

APOB의 화장료 제형과 함께 추가적인 상승효과를 가지는 기능성 제형을 평가하기 위하여 APOB 및 하기의 [표 6]의 조성을 가지는 화장료를 수분크림에 적용될 수 있는 혼합조성물 제조하였다. 한편, 세이지 추출물(HC1), 곰피 추출물(HC2) 및 차즈기 추출물(HC3)는 열수추출물을 사용하였다.

	T1	T2	T3	T4	T5
APOB	100	100	100	100	100
HC1	-	0.1	1	10	20
HC2	-	0.1	1	10	20
HC3	-	0.1	0.5	5	10

(단위: 중량부)

상기 T1 내지 T5의 조성을 포함하는 혼합 제형의 피부 안티폴루션 활성을 평가하였고, 그 결과를 하기의 [표 7]에 나타내었다.

	Con	T1	T2	T3	T4	T5
과산화수소에 대한 세포 보호활성	10	8	8	9	9	8
포름알데하이드에 대한 저항활성	1	7	7	8	8	7
방향족 화합물에 대한 저항활성	10	6	6	5	5	7

(단위: 지수)

그 결과 상기 T3 및 T4 제형에 의하는 경우 안티폴루션 활성을 보다 향상시킬 수 있다는 점을 확인할 수 있었다. 따라서 상기 범위에 의하는 경우 기능성 화장료로서 항산화 효과와 함께, 피부 안티폴루션 효과를 보다 향상시킬 수 있다는 점을 확인할 수 있다.

[실험예 3: 피부 트러블 화장료 제형 첨가제 실험]

각 식물 소재를 건조 및 분쇄한 뒤 열수추출 하여 알로에 추출물(H1), 어성초 추출물(H2), 밤껍질 추출물(H3), 해당화 추출물(H4), 신갈나무 추출물(H5) 및 민들레 추출물(H6)를 제조하였다. 상기 H1 내지 H6를 하기의 [표 9]와 같은 조성에 따라 혼합하여 식물 혼합 추출물 F1을 제조하였다.

	F1	F2	F3	F4	F5	F6	F7	F8
H1	100	100	100	100	100	100	100	100
H2	10	-	-	0.1	1	5	10	20
H3	-	10	-	0.1	1	5	10	20
H4	-	-	-	0.1	1	3	5	10
H5	-	-	-	0.1	1	3	5	10
H6	-	-	10	0.1	1	3	5	10

(단위: 중량부)

상기 H1, F1 내지 F8에 따른 피부진정효과를 확인하기 위하여, 상기 H1, F1 내지 F8의 마스크 팩을 제조하고, 10인의 피시험자에게 각 실시예에 대한 보습성을 평가하도록 하였다. 그 결과를 1 내지 10의 지수로 평가하였다. 또한 피부진정효과를 실험하기 위하여 10인의 피시험자의 피부에 에탄올을 도포하고 닦아낸 뒤 H1, F1 내지 F8의 마스크 팩의 사용에 따른 피부 진정효과를 평가하여 그 결과를 1 내지 10의 지수로 평가하였다. 각 실험결과를 평균 값으로, 하기의 [표 9]에 나타내었다. 한편, 보습성 및 피부진정효과는 그 숫자가 높을수록 효과가 우수한 것이다.

	H1	F1	F2	F3	F4	F5	F6	F7	F8
보습성	5	5.1	5.3	5.4	4.8	7.1	7.2	6.9	5.2
피부진정효과	5	5.2	5.5	5.5	5.6	6.6	6.7	6.8	5.7

(단위: 지수)

상기 [표 9]를 참조하면, 일정한 혼합비를 가지는 혼합조성의 경우 알로에 추출물에 비하여 우수한 보습성 및 피부진정효과를 가진다는 점을 알 수 있다. 특히 F5 내지 F7의 경우 상당 정도의 상승효과를 가진다는 점을 알 수 있다. 따라서 달맞이꽃 추출물에 상기 식물 추출물의 혼합물을 더 포함하는 화장료를 제조하는 경우 피부 안티폴루션 효과와 함께 피부 보습성 및 피부 자극을 완화하는 효과가 배가된 기능성 화장료 조성물로 제공할 수 있다.

이상에서 본 발명의 바람직한 실시예에 대하여 상세하게 설명하였지만 본 발명의 권리범위는 이에 한정되는 것은 아니고 다음의 청구범위에서 정의하고 있는 본 발명의 기본 개념을 이용한 당업자의 여러 변형 및 개량 형태 또한 본 발명의 권리범위에 속하는 것이다.

Claims

달맞이꽃 추출물을 포함하고,
상기 달맞이꽃 추출물은 달맞이꽃의 줄기를 포함하고 상기 달맞이꽃의 줄기 100 중량부에 대하여 달맞이꽃의 잎 30 내지 150 중량부, 달맞이꽃의 꽃 80 내지 220 중량부의 혼합물이 용매로 추출된 것인
항산화 및 피부 안티폴루션용 조성물.
삭제
제 1항에 있어서,
상기 용매는
물, 탄소수 1 내지 10의 알코올 및 이들의 혼합물로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나인 것
항산화 및 피부 안티폴루션용 조성물.
제 1항에 있어서,
민들레 추출물, 어성초 추출물, 스피아민트 추출물, 애플민트 추출물, 페퍼민트 추출물, 레몬밤 추출물, 스위트 바질 추출물, 골든레몬타임 추출물, 파인애플 추출물, 세이지 추출물, 라벤더 추출물, 로즈마리 추출물, 카모마일 추출물, 파슬리 추출물, 차즈기 추출물, 노니 추출물, 도라지 추출물, 곰피 추출물, 회화나무 추출물 및 이들의 혼합물로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나를 더 포함하는 것인
항산화 및 피부 안티폴루션용 조성물.
제 1항, 제3항 및 제4항 중 어느 한 항에 따른 조성물을 포함하는 건강기능식품.
제 1항, 제3항 및 제4항 중 어느 한 항에 따른 조성물을 포함하는 화장품.