KR101373997B1 - 항알러지 물질을 스크리닝하는 방법 - Google Patents

항알러지 물질을 스크리닝하는 방법 Download PDF

Info

Publication number
KR101373997B1
KR101373997B1 KR1020120088641A KR20120088641A KR101373997B1 KR 101373997 B1 KR101373997 B1 KR 101373997B1 KR 1020120088641 A KR1020120088641 A KR 1020120088641A KR 20120088641 A KR20120088641 A KR 20120088641A KR 101373997 B1 KR101373997 B1 KR 101373997B1
Authority
KR
South Korea
Prior art keywords
snare
syn4
allergic
complex
mast cells
Prior art date
Application number
KR1020120088641A
Other languages
English (en)
Other versions
KR20140022261A (ko
Inventor
권대혁
양유수
Original Assignee
성균관대학교산학협력단
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by 성균관대학교산학협력단 filed Critical 성균관대학교산학협력단
Priority to KR1020120088641A priority Critical patent/KR101373997B1/ko
Publication of KR20140022261A publication Critical patent/KR20140022261A/ko
Application granted granted Critical
Publication of KR101373997B1 publication Critical patent/KR101373997B1/ko

Links

Images

Classifications

    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/15—Medicinal preparations ; Physical properties thereof, e.g. dissolubility
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/02—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving viable microorganisms
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N2500/00—Screening for compounds of potential therapeutic value
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N2800/00—Detection or diagnosis of diseases
    • G01N2800/24—Immunology or allergic disorders

Landscapes

  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Food Science & Technology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • General Physics & Mathematics (AREA)
  • Pathology (AREA)
  • Pharmaceuticals Containing Other Organic And Inorganic Compounds (AREA)

Abstract

본 발명은 비만세포의 탈과립에 관여하는 SNARE(soluble NSF attachment protein receptor) 복합체 형성 저해능을 확인함으로써, 항알러지 물질을 스크리닝하는 방법에 관한 것이다. 본 발명의 방법을 이용하면, 항알러지 물질을 효과적으로 스크리닝하여 알러지 질환 개선 및 치료 물질의 개발에 이용할 수 있으며, 본 발명에서 확인한 결과를 바탕으로 알러지의 메커니즘을 보다 효과적으로 연구할 수 있는 장점이 있다.

Description

항알러지 물질을 스크리닝하는 방법{Method for Screening Antiallergy Substance}
본 발명은 항알러지 물질을 스크리닝하는 방법에 관한 것으로서, 보다 구체적으로는 비만세포의 탈과립에 관여하는 SNARE(soluble NSF attachment protein receptor) 복합체 형성 저해능을 확인함으로써, 항알러지 물질을 스크리닝하는 방법에 관한 것이다.
알러지 질환의 발생은 지난 몇십년 동안 많은 증가를 보였다. 환경, 유전학, 위생학, 음식과 같은 다양한 요소들이 아토피, 천식, 비염과 같은 알러지 질환의 발병에 영향을 미치는 것으로 알려져 있다. 코르티코스테로이드(corticosteroid)나 항히스타민제와 같은 몇몇 효과적인 치료 방법들이 개발되고 있지만, 아직까지 그 원인이 되는 기작이나 완전한 치료 방법에 대해서는 잘 알려져 있지 않다.
한편, 비만세포는 FceRI에 의한 타입 I 과민성 반응의 주요 이펙터 세포로 알려진 분비세포이다. 비만세포는 다양한 염증유발 매개체, 주화성 인자, 면역조절 사이토카인의 방출에 의하여 숙주를 방어하는 중추적인 역할을 한다고 알려져 있다. 또한, 아토피성 비염, 천식, 아토피성 피부염과 같은 알러지 질환에 밀접하게 관련되어 있다. 비만세포는 다양한 내부 물질의 배출에 의하여 특이한 알러젠이나 다른 자극에 급격하게 반응한다. 반응이 오면, 다가 항원에 의해 세포 표면의 FceRI와 교차결합하여 세포간 신호전달 캐스케이드(cascade)가 활성화되고, 탈과립을 유도한다. 이러한 과립들은 히스타민, 세로토닌, 헤파린, 세린 단백질 분해효소, 주화성 인자 및 면역조절 사이토카인을 포함하는 생물학적으로 활성화된 다양한 염증인자를 포함한다.
한편, 일반적으로 다양한 폴리페놀이 알러지 반응과 밀접한 관계가 있음이 알려져 있으나, 상기 폴리페놀들이 어떠한 메커니즘에 의해 항알러지 물질로서의 기능을 나타내는지에 대해서는 잘 알려져 있지 않다. 이에 대한 여러가지 가설로 첫째는, 폴리페놀이 가지고 있는 내재적인 항산화 능력을 통하여 알러지 공격 중의 자유 라디칼로 매개되는 세포 상처를 막는다는 가설이다. 둘째는, 각 폴리페놀 화합물이 그들의 인식가능한 결합 파트너가 있다는 것이다. 예를 들어, 플라보놀의 일종인 쿼세틴(quercetin)은 알러젠-IgE 복합체 형성을 저해하거나, 그 수용체인 FceRI (IgE의 고친화성 수용체)의 복합체와의 결합을 저해한다고 하며, EGCG는 CD4와 친화성이 있다고 알려져 있고, 이소플라본은 에스트로겐 수용체와 상호작용한다고 알려져 있다. 이러한 결합 파트너에 의하여 다양한 신호전달에 관여함으로써 알러지 기능을 나타낼 수 있다는 것이다. 셋째는, 폴리페놀-단백질 상호작용을 통해서, 알러지성 단백질의 구조를 변화시키거나, 생물학적 이용성을 감소시키는 등에 의해서 알러지성을 감소시킬 수 있다는 가설이 있다.
그러나, 이러한 가설들은 모든 폴리페놀들에 적용되는 것은 아니며, 일반적인 항알러지 효과에 대해서 설명하기에는 부족한 점이 있다.
이러한 배경하에서, 본 발명자들은 항알러지 효과를 가진다고 알려진 다양한 폴리페놀 화합물이 어떠한 기작에 의해 항알러지 효과를 나타낼 수 있는지에 대해 밝히기 위하여 예의 노력한 결과, 몇몇 폴리페놀 화합물이 비만세포에서 형성되는 SNARE 복합체 형성을 저해하며, 그러한 경향은 항알러지 효과를 확인할 수 있는 히스타민 및 β-헥소사미니다아제의 저해 경향과 상관관계가 있음을 확인함으로써, 본 발명을 완성하였다.
본 발명의 목적은 비만세포에서 SNARE(soluble NSF attachment protein receptor) 복합체의 형성을 확인하여, 상기 SNARE 복합체의 형성이 저해되는 경우 항알러지 물질로 판단하는, 항알러지 물질의 스크리닝 방법을 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 목적은 정제된 SN23/Syn4/Vp2 또는 SN23/Syn4/Vp8에 의한 막 융합을 저해하는 물질을 탐색하는 단계를 포함하는, 항알러지 물질의 스크리닝 방법을 제공하는 것이다.
상기 목적을 위한 하나의 양태로서, 본 발명은 (a) 비만세포에 항알러지 후보물질을 처리하는 단계; (b) 상기 비만세포에서 SNARE(soluble NSF attachment protein receptor) 복합체의 형성을 확인하는 단계; (c) SNARE 복합체의 형성이 저해되는 경우 항알러지 물질로 판단하는 단계를 포함하는, 항알러지 물질의 스크리닝 방법을 제공한다.
본 발명에서, 용어 "항알러지"는 일반적으로 알려진 알러지 질환을 저해하는 활성을 모두 포함하는 의미로서, 알러지 질환의 예방, 개선, 치료 등 알러지 질환에 반하는 모든 활성을 포함할 수 있다. 상기 "알러지"는 과민 반응이라는 의미로서, 어떠한 외래성 물질과 접한 생체가 그 물질에 대하여 정상과는 다른 반응을 나타내는 현상을 의미한다. 상기 알러지 질환은 다양한 질환이 포함될 수 있으며, 이에 제한되지는 않으나, 예컨대, 자가면역질환, 아토피성 질환, 천식, 두드러기, 습진, 아토피성 피부염, 알레르기성 접촉성 피부염 등을 포함할 수 있다.
본 발명에서, 용어 "후보물질"은 상기 항알러지 효과 및 기능을 나타낼 수 있을 것으로 예상되는 모든 물질을 의미한다. 상기 후보물질은 항알러지 효과를 나타낼 수 있을 것으로 예상되는 물질이면 제한없이 사용 가능하며, 화합물, 유전자 또는 단백질 등의 모든 가능 예상물질을 포함할 수 있으며, 바람직하게는 폴리페놀 화합물을 사용할 수 있다. 본 발명의 일실시예에서는 폴리페놀 화합물을 통하여 본 발명의 스크리닝 방법이 유효함을 확인하였다. 본 발명의 스크리닝 방법에서는 상기 후보물질에 의해 SNARE 복합체 형성이 저해될 경우 항알러지 물질로 결정할 수 있다.
본 발명에서, 용어 "비만세포(mast cell)"는 동물의 결합조직에 넓게 분포하는, 알러지의 주요인이 되는 면역 세포를 의미한다. 방추형의 세포에 소형의 원형핵을 가지며, 세포질에는 호염기성 과립이 다수 포함되어 있는 세포이다. 본 발명의 일실시예에서는 비만세포로서, RBL-2H3 세포를 이용하여 실험을 수행하였다.
비만세포의 표면에는 IgE 형태의 항체가 붙을 수 있는 표면 인자가 있다. 기질에 붙은 후 비교적 바로 떨어지는 다른 항체와는 달리 IgE 항체는 비만세포에 붙이면 거의 떨어지지 않는데, 이 때 IgE에 붙는 물질, 즉 알러젠이 인체 내로 들어와서 IgE와 결합을 하게 되면, 그 IgE와 결합하고 있는 비만세포가 활성화 된다. 이렇게 활성화된 비만세포는 다양한 신경전달물질을 과립 형태로 외부로 분비하여 알러지 반응을 유발시킨다. 이렇듯 과립 형태를 분비하는 것을 탈과립이라고 하는데, 비만세포에서 탈과립을 측정할 수 있는 물질로는 여러가지가 있으며, 그 중에서 가장 대표적인 것이 히스타민이며, 프로스타글란딘이나 류코트리엔, β-헥소사미니다아제 등이 있다.
본 발명의 일실시예에서는 비만세포의 탈과립률을 측정하기 위하여, 히스타민 분비 및 β-헥소사미니다아제를 대상으로 실험하였으며, 항알러지 효능을 갖는 폴리페놀 화합물의 히스타민 및 β-헥소사미니다아제의 분비 억제와 SNARE 단백질의 복합체 형성의 상관관계를 밝혀냄으로써, 항알러지 물질을 스크리닝하는 방법을 개발하였다.
본 발명에서, 용어 "SNARE(soluble NSF attachment protein receptor)"는 세포막 융합 단백질로서, 이러한 SNARE 단백질에 관해서는 신경세포에서 시냅스막과의 융합에 대해서는 다양하게 연구되고 있었으나, 비만세포에서의 그 메커니즘에 대해서는 알려진 바 없었다. 상기 SNARE 단백질은 크게 둘로 분류되며, 수송 소낭(transport vesicle)의 멤브레인에 포함되어 있는 v-SNARE와 표적 구획의 막에 위치한 t-SNARE로 구분된다. t-SNARE는 두 개의 서브셋이 복합체를 형성할 수 있으며, 상기 t-SNARE 및 v-SNARE가 결합하여 최종적으로 삼중 SNARE 복합체를 형성하여 SNARE 단백질 복합체를 형성할 수 있다. 본 발명에서는 비만세포에서 상기 삼중 SNARE 복합체 형성을 억제하는 것이 히스타민 및 β-헥소사미니다아제의 분비 억제와 상관관계를 가짐을 확인함으로써, 항알러지 물질 스크리닝에 유용하게 사용될 수 있음을 밝혔다.
바람직하게는 상기 SNARE 복합체 형성의 저해는 SNARE 단백질 구성요소 자체를 저해하는 것은 아니고, t-SNARE의 두 개의 서브유닛과 v-SNARE 사이의 복합체 형성을 저해하는 것일 수 있으며, 보다 바람직하게는 SN23/Syn4/Vp2 또는 SN23/Syn4/Vp8로 구성된 SNARE 복합체의 형성을 저해하는 것일 수 있다. 이러한 복합체 형성 저해능을 확인함으로써, 항알러지 물질을 스크리닝하는 데에 이용할 수 있다.
본 발명의 일실시예에서는 비만세포에서 발현하는 SNARE 복합체 중에서, 상기 v-SNARE는 VAMP2 (Vp2), VAMP4 (Vp4), VAMP7 (Vp7) 및 VAMP8 (Vp8)를 구성요소로 할 수 있으며, t-SNARE는 syntaxin 3 (Syn3), syntaxin 4 (Syn4), syntaxin 5 (Syn5) 및 SNAP-23 (SN23)을 구성요소로 할 수 있음을 확인하였다. 그 중에서 SN23/Syn4/Vp2 또는 SN23/Syn4/Vp8 복합체 형성 억제가 특히 히스타민 및 β-헥소사미니다아제의 분비 억제와 상관관계가 있음을 확인함으로써, 비만세포에서의 탈과립이 SNARE 복합체 형성에 의해 조절받을 수 있음을 확인하였다.
따라서, 본 발명의 항알러지 물질의 스크리닝 방법은 항알러지 후보물질을 처리한 비만세포에서 SNARE(soluble NSF attachment protein receptor) 복합체의 형성을 확인하는 단계를 포함한다. 이에 따라, 상기 SNARE 복합체의 형성을 저해하는 경우 항알러지 물질로 판단할 수 있다. 상기 단계에서는 추가적으로 비만세포에서 분비되는 히스타민 및 β-헥소사미니다아제를 확인하여 SNARE 복합체 형성과의 상관관계를 확인하는 단계를 포함할 수 있다. 이러한 단계를 추가적으로 포함함으로써, 항알러지 물질의 판단을 보다 정확하게 할 수 있으며, SNARE 복합체 형성과 히스타민 및 β-헥소사미니다아제 분비 억제와의 관계를 보다 명확하게 확인하여 그 신뢰도를 높일 수 있다.
다른 하나의 양태로서, 본 발명은 (a) 정제된 SN23/Syn4/Vp2 또는 SN23/Syn4/Vp8의 SNARE 복합체를 준비하는 단계; 및 (b) 상기 SNARE 복합체에 의한 막 융합을 저해하는 물질을 탐색하는 단계를 포함하는, 항알러지 물질의 스크리닝 방법을 제공한다.
SNARE 단백질 복합체는 세포의 종류별로 다양한 복합체를 형성하며, 본 발명에서는 그 중에서 비만세포에서는 SN23/Syn4/Vp2 및 SN23/Syn4/Vp8 조합의 SNARE 복합체가 탈과립과 관련된 기능성 삼중 복합체임을 확인하였으며(도 3b), 이러한 복합체는 비만세포에서 알러지와 관련된 탈과립에 관계되어 특이적으로 나타나는 복합체의 형태이다. 따라서, 비만세포를 기반으로 하는 방법뿐만 아니라, 정제된 SN23/Syn4/Vp2 및 SN23/Syn4/Vp8 복합체 자체에 대한 효과만을 탐색하더라도, 항알러지 물질을 스크리닝하는 방법으로서 이용할 수 있다.
본 발명의 상기 방법은 정제된 SN23/Syn4/Vp2 또는 SN23/Syn4/Vp8 복합체에 의한 막 융합 저해 효과를 탐색할 수 있는 방법이면, 이에 제한되지 않고 다양한 방법이 사용될 수 있으나, 바람직하게는 SNARE 복합체를 리포좀에 삽입된 형태로 하여 막 융합 저해 물질을 탐색하는 것일 수 있다. 그 밖에 SNARE 복합체, 막 융합 및 항알러지 물질에 관해서는 상기에서 설명한 바와 같다.
본 발명의 방법을 이용하면, 항알러지 물질을 효과적으로 스크리닝하여 알러지 질환 개선 및 치료 물질의 개발에 이용할 수 있으며, 본 발명에서 확인한 결과를 바탕으로 알러지의 메커니즘을 보다 효과적으로 연구할 수 있는 장점이 있다.
도 1a는 비만세포 탈과립 활성을 스크리닝하기 위한, 11개 서브그룹의 32 폴리페놀 화합물을 나타내며, 도 1b는 각 폴리페놀 화합물이 RBL-2H3 세포로부터 β-헥소사미니다아제 및 히스타민 방출 억제에 미치는 영향을 나타낸다.
도 2는 IgE + DNP-BSA에 의한 자극과 A23817에 의한 자극에서 β-헥소사미니다아제 분비에 미치는 폴리페놀 화합물의 영향을 나타낸다.
도 3a는 다양한 SNARE의 mRNA를 RT-PCR로 분석한 결과를 나타내고, 도 3b는 다양한 SNARE 복합체의 지질 혼합능을 나타내며, 도 3c는 비만세포에서 SNARE 단백질 발현 및 SNARE 복합체의 지질 혼합능을 종합한 결과를 나타낸다.
도 4는 SNARE 복합체의 지질 혼합능에 대한 폴리페놀 화합물(MR)의 저해 효과를 나타낸다. PMF=Percentage maximum fluorescence intensity.
도 5a 내지 5d는 비만세포 탈과립(히스타민 및 β-헥소사미니다아제 분비)과 삼중 SNARE 복합체인 SN23/Syn4/Vp2 및 SN23/Syn4/Vp8의 막 융합과의 상관관계를 나타낸다.
도 6은 히스타민 분비와 SN23/Syn4/Vp2 및 SN23/Syn4/Vp8의 막 융합과의 3차원적인 상관관계를 나타낸다.
도 7a 및 7b는 다른 SNARE 항체를 이용한 면역침전 후 항-SN23 항체(a) 및 항-Syn4 항체(b)를 이용한 웨스턴 블랏 결과를 나타낸다. 도 7c 및 7d는 SNARE-매개 막 융합(지질 혼합 분석)과 SNARE 복합체 형성 간의 상관관계를 나타내며, 도 7e는 SNARE 유전자의 mRNA 발현량에 대한 폴리페놀의 영향을 나타낸다.
이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시 예는 오로지 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로서, 본 발명의 요지에 따라 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되지 않는다는 것은 본 발명이 속하는 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자에게 자명할 것이다.
실험예 1: 재료 준비
POPC(1-palmitoyl-2-dioleoyl-sn-glycero-3-phosphatidylcholine), DOPS(1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-phosphatidylserine), NBD-PS(cholesterol, 1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-phosphoserine-N-(7-nitro-2-1,3-benzoxadiazol-4-yl)), rhodamine-PE(1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine-N-(lissaminerhodamine B sulfonyl))는 Avanti Polar Lipids Inc. (Alabaster, Al)에서 얻었으며, 다른 모든 화학물질들은 Sigma-Aldrich Co. (MO, USA)에서 구입하였다.
항-SNAP-23 (ab4114), 항-VAMP8 (ab6186), 항-syntaxin 4 (ab101879) 폴리클로날 혈청과 항-SNAP-23 모노클로날 항체 (ab57961)는 Abcam (Cambridge, UK)에서 구입하였으며, 항-VAMP2 (V1389) 과 항-β-actin (A1978) 항체는 Sigma (St. Louis, MO, USA)에서 구입하였다.
RBL-2H3 세포는 ATCC (CRL-2256)에서 구입하여 높은 포도당에 10%의 열적으로 비활성화시킨 소태아 혈청과 항생제를 넣은 DMEM (Dulbecco's modified Eagle's medium) 배지에서 37℃, 5% CO2 조건에서 배양하였다.
실험예 2: 비만세포 자극 및 탈과립 분석
탈과립 분석은 상층액에서 β-헥소사미니다아제 혹은 히스타민 분비량을 정하였다.
RBL-2H3 세포들을 24-웰 플레이트에 500 μl의 배양액에 깔아주고 밤새워 키웠다 (2 x 105 cells/well). 세포들을 HEPES-완충 식염수(140 mM NaCl, 5 mM KCl, 1 mM CaCl2, 0.6 mM MgCl2, 0.1% glucose, 0.1% BSA and 10 mM HEPES)로 세척해주고, 항-디니트로페닐 (dinitrophenyl; DNP)-IgE (100 ng/ml, Sigma)에서 3시간동안 민감하게 한 후, 30분간 폴리페놀들 (10μM)을 처리 혹은 무처리하여 배양하였다. 배양 후, 세포들을 항원-유도 탈과립을 위하여, 소혈청 알부민(BSA)과 결합된 DNP-그룹으로 자극하거나 (200 ng/ml, DNP-BSA), 혹은 이오노포어(ionophore)-유도 탈과립을 위해 10 μM A23187로 자극한다. 탈과립은 HEPES-완충 식염수에서 37℃에서 30분간 비색계 생화학 방법(colorimetric biochemical assay)을 통해서 상층액에서 β-헥소사미니다아제 혹은 히스타민의 측정을 통해 정량하였다. 상층액 분배액을 96 웰 플레이트 (50 μl/well)에 옮겨주고 50 μl 기질 용액(100 mM 시트르산 중 1 mM p-니트로페닐-N-아세틸-β-d-글루코사미니드; 1 mM p-nitrophenyl-N-acetyl-β-d-glucosaminide in 100 mM citrate, pH 4.5)에 37℃에서 3시간동안 배양하였다. 100 μl의 NaCO3-NaHCO3 완충용액에서 (1:1 mixture, 100 mM NaCO3-NaHCO3, pH 10.0) 반응을 중단시킨 후에, 마이크로 플레이트 리더를 이용해 405nm에서 흡광도를 측정하였다. 분비 활성은 세포내 상대적 총 β-헥소사미니다아제 함유량으로 계산하였다. 총 β-헥소사미니다아제 함유량은 0.1 % 트리톤 X-100으로 용해된 세포에 의해 결정하였다. 상층액은 또한 효소 면역분석 (EIA) 시스템(Oxford Biomedical Research, Oxford, MI, USA)에 의해 히스타민의 분비를 측정하기 위해 이용하였다. 상층액에서 β-헥소사미니다아제 혹은 히스타민 분비의 퍼센트는 다음 공식을 이용하여 계산하였다.
β-헥소사미니다아제 혹은 히스타민 분비(%) = ((T - B - N)/(C - N)) × 100
T(Test): DNP-BSA (+), 폴리페놀 (+) / B(Blank): DNP-BSA (-), 폴리페놀 (+) / C(Control): DNP-BSA (+), 폴리페놀 (-) / N(Normal): DNP-BSA (-), 폴리페놀 (-).
실험예 3: 면역침강법 및 면역블랏 분석
총 0.5-1 x 106 세포를 단백질 분해효소 저해제 칵테일(Calbiochem, Germany)을 포함하는 1 ml의 용해 완충액(50 mM Tris-HCl, 150 mM NaCl, 1 % Triton X-100, 1 mM EDTA, pH 7.5)에서 용해하였다. 용해물을 13,000 rpm, 4℃에서 세포 잔해를 제거하기 위해 원심분리하고, 100 μl의 protein G Sepharose (GE healthcare)로 2시간동안 4℃에서 사전처리하였다. SNARE 단백질에 대한 항체들을 (SNAP-23, Syntaxin 4, VAMP2, 및 VAMP8) 용해물에 넣어주고 2시간동안 4℃에서 결합하도록 놓아두었다. 항체-항원 복합체를 protein G 현탁액을 넣어준 후 밤새 침강시켰다. 용해 완충액으로 강하게 세척한 후, 침전물을 면역블랏 분석을 수행하였다. 면역침전된 단백질들과 세포 용해물들을 12% SDS-PAGE 젤에서 분리하고, 니트로셀룰로스 멤브레인 (Whatman, Germany)에 옮겨서 분석하였다. 5% 탈지분유와 0.5% BSA를 포함한 TBST (10 mM Tris-HCl, 150 mM NaCl, 0.05 % Tween-20, pH 8.0)로 1시간동안 상온에서 블락킹한 후, 블랏을 SNAP-23 혹은 syntaxin4 (희석비율 1:1000)의 1차 항체로 밤새 탐침하였다. TBST로 세척한 후에, 멤브레인에 홀스래디쉬 퍼옥시다제(horseradish peroxidase)와 컨쥬게이션된 2차 항-마우스 IgG 항체(A4416, Sigma)를 처리하고, 강화된 화학발광 (enhanced chemiluminescence; ECL) 용액으로 인화하였다.
실험예 4: RNA 분리 및 역전사 PCR
총 RNA를 RBL-2H3 세포에서 TRIZOL 시약 (Qiagen)을 이용하여 분리하였다. 구체적으로, 1 x 106 세포를 1 ml TRIZOL로 균질 현탁화하였다. 200 ul의 클로로포름을 TRIZOL 용해물에 넣어주고, 섞어준 후 3분동안 상온에서 배양하였다. 용액을 13,000 rpm 마이크로원심분리기에서 10분간 4℃에서 원심분리하였다. 원심분리 후에, 상층 수용상을 새로운 튜브에 옮겨주고, 같은 양의 이소프로필알콜을 튜브에 넣어준 후, RNA 정제를 계속하였다. RNA를 260nm에서 분광광도계를 이용하여 측량하고 260/280 비를 통하여 질을 결정하였다. 4㎍의 총 RNA를 이용하여 역전사 (reverse transcription)를 M-MLV (Moloner murine leukemia virus) 역전사효소로 수행하였다. SNARE 유전자 발현은 반정량 PCR로 수행하였다.
실험예 5: 재조합 단백질 클로닝 , 발현 및 정제
RBL-2H3 세포에서 얻어진 총 RNA를 역전사를 하여 cDNA로 만들었다. 만든 cDNA는 snap23 , syntaxin 4, vamp2 , vamp4 vamp7 , vamp8로 증폭하였다. PCR 산물은 GST-태깅된 단백질로 정제하기 위해 pGEX-4T-1 벡터에 클로닝하였다. 비만세포의 SNARE 단백질을 위한 단백질 발현과 정제 과정은 기존에 공지된 방법을 사용하였다. 형질전환된 E. coli BL21 (DE3) Codon(+) 세포를 LB 배양액에서 OD600 가 0.8이 되도록 키우고, 단백질 발현은 0.3 mM IPTG 처리로 유도하였다. GST-SNAREs는 글루타치온 아가로스 비드에 의해 정제하고, GST는 트롬빈으로 절단하였다. 정제된 단백질은 SDS-PAGE 전기영동을 수행하고, 순도는 모든 단백질들이 최소한 90%가 되게 하였다.
실험예 6: 막에서의 SNARE 단백질의 재구성
100 nm LUV(large unilamellar vesicles)는 폴리카보네이트 필터(Avanti Polar Lipids Inc., Alabaster, Al)를 통한 삼출에 의해 준비하였다. FRET 반응을 의한 지질 몰 비는 각각 t-소포낭(t-vesicle)을 위해서는 65:35 (POPC : DOPS), v-소포낭(v-vesicle)을 위해서는 62:35:1.5:1.5 (POPC : DOPS : NBD : Rhodamine B)로 하였다. 공지된 바와 같이, 2개의 t-SNARE 복합체 (binary t-SNARE complexs)와 VAMP2 또는 VAMP8는 50:1의 지질 대 단백질 비로 t-소포낭과 v-소포낭으로 재구성되었다. 각 t-와 v-소포낭의 최종 지질 농도는 1mM이다.
실험예 7: FRET -기반의 지질 혼합 분석( lipid mixing assay )
지질 혼합을 측정하기 위하여, v-SNARE 리포좀을 t-SNARE 리포좀과 1:9의 비로 혼합하였다. 형광은 여기 파장(excitation wavelength) 및 방출 파장(emission wavelength)을 각 465와 530 nm에서 측정하였다. 형광의 변화는 SpectraMax M2 (Molecular Devices Inc., USA) 분광흡광계를 이용하여 기록하였다. 최대 형광세기 (maximum fluorescence intensity)는 0.1 % Triton X-100를 첨가하여 얻어졌다. 모든 지질 혼합 실험은 37℃에서 수행하였다.
실험예 8: UV 흡광도 측정
폴리페놀들의 UV 흡광도 스펙트럼은 20μM 농도로 완충용액 (50 mM Tris-HCl, 150 mM NaCl, 2.5 mM CaCl2, pH 8.0)에서 SpectraMax M2 (Molecular Devices Inc., USA) 분광흡광계를 이용하여 기록하였다. SNARE 복합체-폴리페놀 혼합물의 흡광도 스펙트럼은 [폴리페놀]/[SNARE 복합체]의 몰비가 0.8일때 250에서 700nm에서 측정하였다.
실시예 1: 히스타민 및 β-헥소사미니다아제 의 분비 저해에 대한 폴리페놀의 효과
알러지 질환의 주요인이 되는 비만세포(mast cell)의 탈과립을 비색계 생화학 방법을 통해 검출하기 위한 중요 마커로서, 히스타민 및 β-헥소사미니다아제가 있다. β-헥소사미니다아제는 비만세포의 분비 과립으로 저장되어 있다가 비만세포가 면역학적으로 활성화될 때 히스타민과 함께 분비된다. 다수의 폴리페놀들은 비만세포로부터 히스타민 및 β-헥소사미니다아제의 분비를 저해하여 항알러지 효과를 가진다고 알려져 있다. 따라서, 폴리페놀들이 히스타민 및 β-헥소사미니다아제 분비를 억제하는지 알아보기 위하여 11 서브클래스의 32개 폴리페놀 화합물(도 1a)을 10 μM 농도로 RBL-2H3 세포에 처리하였다. 또한, 양성 대조군으로 PI3(phosphatidyl inositol 3) 키나아제 저해제인 Ly294002 (LY)를 처리하였다.
IgE와 DNP-BSA에 의한 탈과립 자극 후에, 분비된 히스타민 및 β-헥소사미니다아제를 분석하였다(도 1b). 그 결과, 폴리페놀 화합물의 저해 활성은 히스타민 및 β-헥소사미니다아제 분비에서 각각의 화합물별로 차이가 있음을 확인할 수 있었다. 이러한 결과로부터 비만세포 탈과립에 있어서 폴리페놀 화합물들은 각각 과립 특이적으로 히스타민 및 β-헥소사미니다아제의 분비를 저해한다는 것을 확인할 수 있었다. 그에 따라, 히스타민 및 β-헥소사미니다아제의 분비가 어떠한 요인에 의하여 자극받고 작동되는지에 대하여 연구하기 위해 추가적인 실험을 수행하였다.
추가적으로, IgE + DNP-BSA가 아닌 칼슘 이오노포어(calcium ionophore) A23817로도 비만세포를 자극하였다. 그 결과, β-헥소사미니다아제의 분비에 있어서, 폴리페놀 화합물의 효과는 IgE + DNP-BSA에 의한 자극과 A23817에 의한 자극에서 거의 유사하였다(도 2, 기울기=0.97, R2=0.95). 이러한 결과는 비만세포 자극의 방법은 과립 분비 결과에 영향을 미치지 않음을 의미한다.
실시예 2: 비만세포 탈과립에 대한 기능성 삼중 복합체의 관여
비만세포에서는 세가지 유형의 과립이 보고되어 있다. 상기 과립 물질의 엑소시토시스(exocytosis)는 과립 막과 원형질막의 융합을 필요로 한다. 따라서, 이러한 과정에서 SNARE (soluble N-ethyl-maleimide-sensitive factor attachment protein receptors) 단백질이 관여하는지에 관하여 실험을 하였다. 그 결과, 신경세포의 SNARE 단백질과는 다른, 몇몇 이소폼(isoform)의 SNARE 단백질이 비만세포에서 동정되었다. 비만세포의 원형질막에서 t-SNARE로서 syntaxin3, syntaxin4 및 SNAP-23이, 과립 막에서 v-SNARE로서 VAMP2, VAMP3, VAMP7 (TI-VAMP, tetanus toxin-insensitive VAMP) 및 VAMP8가 보고되어 있다. 이러한 SNARE 단백질들이 비만세포에서 막 융합에 관여한다고 추정되었으나, 기능성 삼중 SNARE 복합체가 매개하는 비만세포의 탈과립은 명확하게 특정되어 알려지고 있지 않았다. 비만세포의 엑소시토시스 현상에서 기능성 SNARE 단백질의 역할은 아직까지 완전히 밝혀지지 않았고, 비만세포의 탈과립 조절은 많은 부분이 불명확한 상태이다.
이에, 본 발명자들은 신경세포에서 엑소시토시스 현상의 다양한 특징을 확인하기 위해 널리 사용되고 있는 SNARE-유도 지질 혼합 분석(lipid mixing assay)을 이용하여 SNARE 복합체가 막 융합에 어떻게 관여하는지 확인하였다.
지질 혼합 분석을 수행하기 전에, 먼저 역전사 PCR을 이용하여 SNARE 유전자의 전사를 분석하였다(도 3a). 그 결과, RBL-2H3 세포에서 syntaxin 3 (Syn3), syntaxin 4 (Syn4), syntaxin 5 (Syn5), SNAP-23 (SN23), VAMP2 (Vp2), VAMP4 (Vp4), VAMP7 (Vp7) 및 VAMP8 (Vp8)은 발현하는 반면, syntaxin 1a (Syn1a) 및 SNAP-25 (SN25)는 발현하지 않았다. 이러한 결과는 비만세포에서 기보고된 mRNA 발현 양상과 일치한다. SN25는 오로지 신경세포에서만 배타적으로 발현된다고 알려져 있다.
이에 따라, 비만세포 탈과립을 매개하는 SNARE 단백질 복합체가 무엇인지를 확인하기 위하여, 정제한 SNARE 단백질들을 LUV에서 재구성하고, 다양한 조합의 지질 혼합능을 측정하였다(도 3b). SN25는 다양한 조합으로 지질 혼합이 이루어질 수 있으나, 비만세포에서 발현하지 않기 때문에 배제하였다. 또한, Syn1a 역시 비만세포에서 발현하지 않기 때문에 동일한 이유로 배제하였다. 다음으로, SN23/Syn3 조합의 t-SNARE 복합체는 v-SNARE 단백질과 전혀 막 융합을 유도하지 못했다. 결과적으로, SN23/Syn4 조합의 t-SNARE 복합체에서만 Vp2 및 Vp8의 v-SNARE 단백질과 막 융합을 유도, 즉 지질 혼합을 유도할 수 있음을 확인하였다. 이러한 결과를 통해, SN23/Syn4/Vp2 및 SN23/Syn4/Vp8 조합의 SNARE 복합체가 비만세포에서 탈과립과 관련된 기능성 삼중 복합체임을 시사하며, 그에 따라 이후 실험에서 상기 두가지 조합의 SNARE 복합체에 대해서 실험을 진행하였다.
실시예 3: SNARE 복합체 특이적인 결합에 의한 SNARE -유도 막 융합의 저해
실시예 2에서 확인된 두가지 조합의 SNARE 단백질 복합체에 대하여, 항알러지 효과가 일부 알려진 폴리페놀들의 존재 하에서 추가적으로 지질 혼합 분석을 수행하였다.
SN23/Syn4/Vp2 및 SN23/Syn4/Vp8에 의해 유도된 지질 혼합을 분석하였다. 항알러지 효과가 있다고 알려진 폴리페놀인 미리세틴(myricetin; MR)을 투여한 결과, 두 가지 SNARE 복합체에 의한 막 융합을 저해함을 확인하였다(도 4). 이러한 결과는, 항알러지 효과가 있는 상기 폴리페놀 화합물이 SNARE 복합체 형성을 저해한다는 것을 명확하게 보여준다.
실시예 4: 서로 다른 과립에 대한 SNARE -매개 엑소시토시스의 저해
비만세포의 탈과립과 SNARE-유도 막 융합 사이의 관계를 확인하기 위하여, 다양한 폴리페놀을 이용하여 탈과립의 저해 및 SNARE-유도 막 융합의 저해를 확인한 후, 둘 사이의 관계를 그래프로 나타내었다(도 5). SN23/Syn4/Vp2-유도 막 융합과 β-헥소사미니다아제 분비 저해(도 5a), SN23/Syn4/Vp2-유도 막 융합과 β-헥소사미니다아제 분비 저해(도 5b), SN23/Syn4/Vp8-유도 막 융합과 히스타민 분비 저해(도 5c), SN23/Syn4/Vp8-유도 막 융합과 히스타민 분비 저해(도 5d) 각각에 대한 상관관계를 도식화하였다. 그 결과, 몇몇 폴리페놀들에서, 특히 도 5에서 분홍색으로 표시한 폴리페놀들에서 탈과립의 저해와 SNARE-유도 막 융합의 저해가 의존적임을 발견할 수 있었다. 예컨대, 도 7a에서 분홍색으로 표시된 11개의 폴리페놀들은 SN23/Syn4/Vp8-유도 막 융합이 저해될수록 β-헥소사미니다아제 분비가 저해되는 경향을 나타내었다. 다만, 도 7b에서 나타난 바와 같이, SN23/Syn4/Vp2-유도 막 융합과 β-헥소사미니다아제 분비 저해 간에는 상관관계를 발견할 수 없었는데, 이는 β-헥소사미니다아제 분비의 저해는 SN23/Syn4/Vp8-유도 막 융합의 저해와 관련이 있음을 의미한다. 한편, 히스타민 분비 저해의 경우, SN23/Syn4/Vp8-유도 막 융합과 SN23/Syn4/Vp2-유도 막 융합 저해 모두에 대하여 상관관계를 발견할 수 있었다(도 7c 및 7d).
과립은 앞서 언급한 바와 같이 세가지 유형의 과립이 보고되고 있는데, 타입 I의 과립은 아민이 없으며, 리소좀의 마커인 β-헥소사미니다아제를 포함하고, 타입 II의 과립은 β-헥소사미니다아제 및 히스타민 모두를 포함하지만, 유형 III의 과립은 히스타민을 포함하는 것으로 알려져 있다. 이러한 분류에 근거하여, Vp8은 유형 I 및 유형 II의 과립을 조절하는데 반해, Vp2는 유형 III의 과립을 조절하는 것으로 해석될 수 있다.
그에 따라, 히스타민 분비는 Vp8 및 Vp2 모두에 의해 조절됨을 확인하였기 때문에, 히스타민 분비 억제 및 SN23/Syn4/Vp8-유도 막 융합과 SN23/Syn4/Vp2-유도 막 융합 저해 사이의 상관관계를 확인하고자 하였다. 각각의 폴리페놀에 대한 결과를 하나의 그래프에 나타낸 결과, 도 6에 나타난 바와 같이, 세가지 변수 사이에 일정한 상관관계를 발견할 수 있었다. 이러한 결과는 H=ax+by의 간단한 방정식을 만족시켰다(H: 히스타민 분비 저해 %, x: Vp2-유도 막 융합 저해 %, y: Vp8-유도 막 융합 저해 %). 즉, 0.72의 R2 와 함께 a=0.62, b=0.27의 결과를 만족시켰다. 이러한 결과는 히스타민 분비의 저해가 SN23/Syn4/Vp8-유도 막 융합 저해와 SN23/Syn4/Vp2-유도 막 융합 저해 두 가지의 요소가 동시에 관여한다는 것을 의미한다.
실시예 5: SNARE 복합체 형성의 선택적 저해 확인
동시-면역침강법(co-immunoprecipitation)을 이용하여, 폴리페놀들이 SNARE 복합체 형성을 선택적으로 저해한다는 사실을 확인하였다.
하기와 같은 두 세트의 실험을 수행하였다. 첫째로, 항-Syn4 항체, 항-Vp2 항체 또는 항-Vp8 항체로 SNARE 단백질을 면역침강한 후, 항-SN23 항체를 이용하여 웨스턴 블랏을 수행하였다(도 7a). 둘째로, 항-SN23 항체, 항-Vp2 항체 또는 항-Vp8 항체로 SNARE 단백질을 면역침강한 후, 항-Syn4 항체를 이용하여 웨스턴 블랏을 수행하였다(도 7b). 도 7a 및 7b의 첫번째 열에서, 항-SN23 항체를 처리하더라도 Syn4의 양의 변화가 없으며, 항-Syn4 항체를 처리하더라도 SN23의 양의 변화가 없다는 사실을 통하여, 폴리페놀들은 SN23과 Syn4 둘로 이루어진 t-SNARE 복합체 형성 자체를 저해하는 것은 아님을 확인할 수 있었다. 그러나, Vp2 또는 Vp8의 양은 폴리페놀 의존적으로 선택적인 감소를 보였으며, 이러한 결과는 도 7a 및 7b 양쪽의 패턴이 유사하였다. 이러한 결과를 통하여, 폴리페놀들은 t-SNARE(SN23/Syn4)와 v-SNARE(Vp2 또는 Vp8) 사이의 복합체 형성을 저해하는 과정을 통하여, SNARE 복합체 형성을 저해한다는 것을 명확하게 알 수 있었다.
또한, 세포 내의 복합체 형성(도 7a 및 7b의 상대적 밴드 강도)과 복합체 저해 활성 사이에 1차적인 상관관계를 보이며(도 7c 및 7d), 이러한 결과는 폴리페놀이 SNARE 복합체 형성을 저해함으로써, SNARE-유도 막 융합을 저해한다는 것을 의미한다. 더불어, 각각의 폴리페놀이 SNARE 단백질 자체의 발현에는 영향이 전혀 없음을 확인하였으며(도 7e), 이는 SNARE 단백질 자체의 저해가 아닌 복합체 형성 저해에 의한 것이라는 사실을 보다 명확히 확인시켜 준다.

Claims (9)

  1. (a) 비만세포에 후보 폴리페놀을 처리하는 단계;
    (b) 상기 비만세포에서 SN23/Syn4/Vp2 또는 SN23/Syn4/Vp8의 SNARE(soluble NSF attachment protein receptor) 복합체의 형성을 확인하는 단계;
    (c) SNARE 복합체의 형성이 저해되는 경우 후보 폴리페놀을 항알러지 물질로 판단하는 단계를 포함하는, 항알러지 효능을 발휘하는 폴리페놀의 스크리닝 방법.
  2. 제1항에 있어서, 상기 (b) 단계에서 상기 비만세포에서 분비되는 히스타민 및 β-헥소사미니다아제를 확인하여 SNARE 복합체 형성과의 상관관계를 확인하는 단계를 추가로 포함하는 것인 방법.
  3. 제1항에 있어서, 상기 비만세포는 RBL-2H3 세포인 것인 방법.
  4. 삭제
  5. 삭제
  6. 제1항에 있어서, 상기 (b) 단계는 지질 혼합 분석(lipid mixing assay)에 의해 수행되는 것인 방법.
  7. 삭제
  8. (a) 정제된 SN23/Syn4/Vp2 또는 SN23/Syn4/Vp8의 SNARE 복합체를 준비하는 단계; 및
    (b) 상기 SNARE 복합체에 의한 막 융합을 저해하는 폴리페놀을 탐색하는 단계를 포함하는, 항알러지 효능을 발휘하는 폴리페놀의 스크리닝 방법.
  9. 제8항에 있어서, 상기 (a) 단계에서 준비되는 SNARE 복합체는 리포좀에 삽입된 형태인 것인 방법.
KR1020120088641A 2012-08-13 2012-08-13 항알러지 물질을 스크리닝하는 방법 KR101373997B1 (ko)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
KR1020120088641A KR101373997B1 (ko) 2012-08-13 2012-08-13 항알러지 물질을 스크리닝하는 방법

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
KR1020120088641A KR101373997B1 (ko) 2012-08-13 2012-08-13 항알러지 물질을 스크리닝하는 방법

Publications (2)

Publication Number Publication Date
KR20140022261A KR20140022261A (ko) 2014-02-24
KR101373997B1 true KR101373997B1 (ko) 2014-03-12

Family

ID=50268290

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
KR1020120088641A KR101373997B1 (ko) 2012-08-13 2012-08-13 항알러지 물질을 스크리닝하는 방법

Country Status (1)

Country Link
KR (1) KR101373997B1 (ko)

Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
KR100901074B1 (ko) 2008-09-03 2009-06-03 성균관대학교산학협력단 신경전달물질 배출을 조절하기 위한 폴리페놀 화합물
KR100901638B1 (ko) 2009-03-23 2009-06-09 성균관대학교산학협력단 꽃 추출물을 함유하는 ｓｎａｒｅ 복합체 형성을 억제하기 위한 조성물
KR20120001964A (ko) * 2010-06-30 2012-01-05 성균관대학교산학협력단 알러지성 질환의 치료 및 예방을 위한 펩타이드
KR20120003317A (ko) * 2010-07-02 2012-01-10 성균관대학교산학협력단 식물 추출물을 포함하는 비만세포의 과립 분비 억제용 조성물

Patent Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
KR100901074B1 (ko) 2008-09-03 2009-06-03 성균관대학교산학협력단 신경전달물질 배출을 조절하기 위한 폴리페놀 화합물
KR100901638B1 (ko) 2009-03-23 2009-06-09 성균관대학교산학협력단 꽃 추출물을 함유하는 ｓｎａｒｅ 복합체 형성을 억제하기 위한 조성물
KR20120001964A (ko) * 2010-06-30 2012-01-05 성균관대학교산학협력단 알러지성 질환의 치료 및 예방을 위한 펩타이드
KR20120003317A (ko) * 2010-07-02 2012-01-10 성균관대학교산학협력단 식물 추출물을 포함하는 비만세포의 과립 분비 억제용 조성물

Also Published As

Publication number Publication date
KR20140022261A (ko) 2014-02-24

Similar Documents

Publication Publication Date Title
Sartori et al. BIN1 recovers tauopathy-induced long-term memory deficits in mice and interacts with Tau through Thr 348 phosphorylation
Lian et al. Selective changes of calcineurin (protein phosphatase 2B) activity in Alzheimer's disease cerebral cortex
Zhang et al. Aurora B phosphorylates multiple sites on mitotic centromere-associated kinesin to spatially and temporally regulate its function
Sharma et al. A close association of torsinA and α-synuclein in lewy bodies: a fluorescence resonance energy transfer study
Zemanovic et al. Dynamic phosphorylation of the C terminus of Hsp70 regulates the mitochondrial import of SOD2 and redox balance
Joyce et al. Age-related gene response of human corneal endothelium to oxidative stress and DNA damage
Basurto-Islas et al. Mechanism of tau hyperphosphorylation involving lysosomal enzyme asparagine endopeptidase in a mouse model of brain ischemia
WO2006007411A2 (en) Methods and compositions for modulating bax-mediated apoptosis
Shao et al. FOXP1 enhances fibrosis via activating Wnt/β-catenin signaling pathway in endometriosis
Yang et al. Polyphenols differentially inhibit degranulation of distinct subsets of vesicles in mast cells by specific interaction with granule-type-dependent SNARE complexes
Jin et al. Neuronal STAT3/HIF-1α/PTRF axis-mediated bioenergetic disturbance exacerbates cerebral ischemia-reperfusion injury via PLA2G4A
Long et al. Identification of a family of fatty-acid-speciated sonic hedgehog proteins, whose members display differential biological properties
Ryan et al. The role of the mitochondria in apoptosis induced by 7β-hydroxycholesterol and cholesterol-5β, 6β-epoxide
Tian et al. Lipid raft-dependent endocytosis of close homolog of adhesion molecule L1 (CHL1) promotes neuritogenesis
Xu et al. RNASET2 impairs the sperm motility via PKA/PI3K/calcium signal pathways
Nayak et al. 2-aryl benzimidazole conjugate induced apoptosis in human breast cancer MCF-7 cells through caspase independent pathway
Fang et al. HSP70 is required for the proper assembly of pericentriolar material and function of mitotic centrosomes
Wei et al. Targeting the Dvl-1/β-arrestin2/JNK3 interaction disrupts Wnt5a-JNK3 signaling and protects hippocampal CA1 neurons during cerebral ischemia reperfusion
Ishikawa et al. p150glued deficiency impairs effective fusion between autophagosomes and lysosomes due to their redistribution to the cell periphery
Buzgariu et al. Chapter Twenty‐Six Methods to Investigate Autophagy During Starvation and Regeneration in Hydra
KR101373997B1 (ko) 항알러지 물질을 스크리닝하는 방법
de Andrade et al. Developmentally dynamic colocalization patterns of DSCAM with adhesion and synaptic proteins in the mouse retina
Liu et al. Regulation of sheep α-TTP by dietary vitamin E and preparation of monoclonal antibody for sheep α-TTP
Wang et al. Expression of USP2‐69 in mesangial cells in vivo and in vitro
CN102549438A (zh) Fkbp52-tau相互作用作为新颖治疗靶点用于治疗涉及tau机能失调的神经障碍

Legal Events

Date Code Title Description
A201 Request for examination
E902 Notification of reason for refusal
E701 Decision to grant or registration of patent right
GRNT Written decision to grant
FPAY Annual fee payment

Payment date: 20170102

Year of fee payment: 4

FPAY Annual fee payment

Payment date: 20180226

Year of fee payment: 5

LAPS Lapse due to unpaid annual fee