CN102549438A - Fkbp52-tau相互作用作为新颖治疗靶点用于治疗涉及tau机能失调的神经障碍 - Google Patents

Fkbp52-tau相互作用作为新颖治疗靶点用于治疗涉及tau机能失调的神经障碍 Download PDF

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Abstract

本发明一般涉及神经障碍(包括阿尔茨海默病)的神经保护和修复，该神经障碍涉及Tau机能失调。本发明描述并包括蛋白FKBP52和Tau之间的直接相互作用。更特别地，本发明涉及筛选用于预防和治疗涉及Tau机能失调的神经障碍的药物的方法，包括以下步骤：a)测定候选化合物调节Tau多肽和FKBP52多肽之间的相互作用的能力，和b)正向选择调节所述相互作用的候选化合物。最后本发明涉及神经障碍的诊断、预后和监测分析，该神经障碍涉及Tau机能失调。

Description

FKBP52-TAU相互作用作为新颖治疗靶点用于治疗涉及TAU机能失调的神经障碍
技术领域
本发明一般地涉及神经障碍(包括阿尔茨海默病)的神经保护和修复，该神经障碍涉及Tau机能失调。本发明描述了蛋白FKBP52和Tau之间的直接相互作用。本发明涉及作用于FKBP52-Tau相互作用的分子的筛选方法，从而调节病原性Tau的有害影响。最后本发明涉及神经障碍的治疗性诊断、预后和监测分析，该神经障碍涉及Tau机能失调。
发明背景
Tau蛋白是在中枢神经系统(主要是神经元)中广泛表达的主要微管相关蛋白(MAP)，其中它在调节微管动力学、轴突运输和神经突生长(neuriteoutgrowth)中起关键作用。Tau蛋白以位于染色体17上的单一基因初级转录物的外显子2、3和10的可变剪接产生的六种不同的异形体存在于成人脑中。它们的序列长度为352到441个氨基酸不等。越来越多的证据提示“聚集的”Tau的异常装配(天然未折叠蛋白)是涉及Tau机能失调的总称为tau蛋白病或神经障碍的一系列人类认知疾病的标志，其包括阿尔茨海默病、皮克病、皮质基底节退化症、轻度认知损害、进行性核上性麻痹和具有染色体17-连锁的震颤麻痹的额颞痴呆。Tau的异常(例如高磷酸化、突变、截断和“缠结”聚集)可能是致病过程的起作用的因素。迄今为止，Tau改变在诱导神经变性疾病中的作用尚未完全了解，因此译解控制Tau结构/功能的分子机制是非常重要的，并可以有助于发现这些疾病的新的治疗方法。
本发明基于Tau蛋白(所有6个异形体)特异性且直接地与亲免素FKBP52(FK506-结合蛋白)结合的发现。FKBP是强力免疫抑制药物FK506和雷帕霉素的普遍表达的细胞内受体家族，且因此发生于在称为亲免素的一大组蛋白质中。这些蛋白质显示大的分布，且在神经系统中尤其丰富，提示显著不同于其免疫调节作用的新颖和意外的功能。此外，已报道了FK506的神经保护作用。这些后来的观察提供了FKBP蛋白家族的新前景，以及FK506及其非免疫抑制性衍生物分子作为设计用于治疗神经系统损害和疾病的新治疗试验的特别关注。
最初鉴定并克隆为与类固醇受体相关(Lebeau等.，1992)的FKBP52呈现模块化组织，其包括四个单独的功能结构域(Callebaut等.，1992)。定位于蛋白质的N末端部中的FKBP52的FK506结合位点(结构域I)(aa 1到149)包含所有亲免素蛋白家族特征性的肽基脯氨酰基异构酶(PPI酶)活性(Chambraud等.，1993)。而第二结构域(aa 149到267)与结构域I具有共同的结构同源性，PPI酶活性是剩留的且其不结合FK506(14，15)；结构域II的显著方面是共有的ATP-GTP-结合序列(16)。覆盖结构域III和IV的C末端结构域包括假定的钙调素结合位点(Massol等.，1992)，且通过它的三个三十四肽重复序列(TPR)(aa 273到389)调节该蛋白质与HSP90的相互作用(Radanyi等.，1994)，后者也是类固醇受体复合物的组分(Catelli等.，1980，Tai等.，1986；Renoir等.，1990)。此外，FKBP52与HSP90的结合活性也通过特异性地磷酸化FKBP52的酪蛋白激酶II来调节(Myata等.，1997)。
最近报道，FKBP52与微管相互作用并阻止微管蛋白聚合(Chambraud等.，2007)。迄今为止获得的结果表明微管蛋白聚合被FKBP52抑制可能不仅是由微管蛋白的隔离产生或由FKBP52对其结构的改变(例如弯曲)产生，而且可能涉及微管蛋白组装成微管所需的另一个重要因素。
现在发明人在此假设，对一种或多种微管稳定因子，例如微管相关蛋白(MAP)的干预可以解释微管蛋白聚合被FKBP52抑制。采用典型的生物化学和细胞学方法，他们确定了FKBP52对Tau功能的作用的牢固基础，并发现FKBP52和Tau之间的直接和特异性的相互作用。这种FKBP52-Tau相互作用导致已知的Tau介导的细胞功能的调节，例如：微管蛋白聚合(FKBP52抑制这种功能)、Tau积累(FKBP52抑制这种积累)和神经突生长(neuriteoutgrowth)。
发明简述
发明人已发现亲免素FKBP52和微管相关蛋白Tau(以所有其已知异形体形式，高磷酸化或未高磷酸化的)之间的直接和特异性的蛋白-蛋白相互作用。本发明确认FKBP52-Tau相互作用提供可有利地用于涉及Tau机能失调的神经障碍(尤其是阿尔茨海默病)的新颖治疗方法的新靶点。
因此本发明提供用于鉴别分子的方法，所述分子调节FKBP52-Tau相互作用，从而有利地作用于涉及Tau机能失调的神经障碍的有害影响。
经由本发明方法鉴别其调节Tau和FKBP52之间相互作用的能力的分子是用于预防和治疗涉及Tau机能失调的神经障碍(且尤其是阿尔茨海默病)的药物候选物。
本发明也确认FKBP52-Tau相互作用提供可能涉及诊断、预后、临床随访的生物标志物。
发明详述
本发明的筛选方法：
本发明的第一个目的是筛选用于预防和治疗涉及Tau机能失调的神经障碍的药物的方法，包括以下步骤：
a)测定候选化合物调节Tau多肽和FKBP52多肽之间的相互作用的能力，和
b)正向选择调节所述相互作用的候选化合物。
如此处所使用，术语“涉及Tau机能失调的神经障碍”包括但不限于阿尔茨海默病、额颞痴呆、皮质基底节退化和额颞叶退化(也称为皮克病)、以及将来也许证实为涉及Tau的所有神经障碍，例如帕金森病。
在本发明上下文中，如此处所使用的术语“治疗(treating)”或“治疗(trerment)”是指逆转、缓解或抑制该术语适用的疾病或病症的发展，或该疾病或病症的一种或多种症状。
如本发明所使用，术语“预防”是指防止还没有诊断为患病的受试者发生该疾病或病症。
如本发明所使用，“调节FKBP52和Tau之间的相互作用的化合物”的表达是指具有抑制、降低或增强蛋白Tau和蛋白FKBP52之间相互作用的能力的任何化合物。
步骤a)中，适于筛选蛋白质-蛋白质相互作用的任何方法是合适的。
不管筛选方法的步骤a)的实施方式，完整的Tau蛋白和完整的FKBP52蛋白可用作结合伴体。或者，包括相互作用位点的Tau蛋白和FKBP52蛋白的片断可用作结合伴体。
因此，在一个实施方式中，本发明筛选方法的步骤a)由以下步骤组成：
a1)使待测试候选化合物与第一Tau多肽或其基本上同源的或基本上相似的氨基酸序列和(2)第二FKBP52多肽或其基本上同源的或基本上相似的氨基酸序列的混合物接触，
a2)测定所述候选化合物调节所述Tau多肽和所述第二FKBP52多肽之间的结合的能力。
术语“多肽”在此处是指没有特定长度的氨基酸聚合物。因此，肽、寡肽和蛋白质包括在“多肽”的定义中，且这些术语在整个说明书以及权利要求书中可互换使用。术语“多肽”不排除翻译后修饰，其包括但不限于磷酸化、乙酰化、糖基化等。尤其是，该术语包括多肽的所有磷酸化形式(例如Tau或FKBP的所有磷酸化形式)。该“多肽”定义也包括其同系物。
因此，术语“Tau多肽”是指包括与FKBP52蛋白相互作用的位点的Tau蛋白或其片段。以相同方式，术语“FKBP52多肽”是指包括与Tau蛋白相互作用的位点的FKBP52蛋白或其片段。
当大于80％，优选大于85％，优选大于90％的氨基酸是相同的，或大于约90％，优选大于95％的氨基酸是相似的(功能相同)时，两个氨基酸序列是“基本上同源”或“基本上相似”的。术语“序列同一性”是指两条肽之间的同一性。序列之间的同一性可通过比较可为比较目的而对准的各序列的位置来确定。当比较序列中的某位置被相同碱基或氨基酸占据时，则该序列在该位置是同一的。核酸序列之间的序列同一性程度是这些序列共有的位置上具有相同核苷酸的数目的函数。氨基酸序列之间的同一性程度是这些序列共有的相同氨基酸序列的数目的函数。为确定两个氨基酸序列或两个核酸序列的同一性百分比，序列进行对准从而进行最佳比较。例如，可在第一氨基酸序列或第一核酸序列的序列中引入空位以与第二氨基酸序列或第二核酸序列进行最佳对准。然后比较位于相应氨基酸位置或核苷酸位置的氨基酸残基或核苷酸。当第一序列中的位置被和第二序列中的相应位置相同的氨基酸残基或核苷酸占据时，该分子在该位置是同一的。两条序列之间的同一性百分比是由该序列共有的相同位置的数目的函数。在该比较中，所述序列的长度可以相同或不同。用于确定比较窗的序列最佳对准可通过Smith和Waterman的局部同源性算法(J.Theor.Biol.，91(2)pgs.370-380(1981)进行，通过Needleman和Wunsch的同源性比对算法(J.Miol.Biol.，48(3)pgs.443-453(1972))进行，通过经由Pearson和Lipman的方法来寻找相似性(PNAS，USA，85(5)pgs.2444-2448(1988))来进行，通过这些算法的计算机化执行(GAP，BESTFIT，FASTA and TFASTA in the Wisconsin Genetics Software Package Release 7.0，Genetic Computer Group，575，Science Drive，Madison，Wis.)来进行或通过检查来进行。术语“序列相似性”是指氨基酸可以修饰但保持相同功能。已知氨基酸根据其侧基的性质来分类，且一些氨基酸例如碱性氨基酸可以彼此交换，但仍保持它们的基本功能。
在一个实施方式中，步骤a2)在于产生说明所述候选化合物是否具有调节所述第一多肽和所述第二多肽之间的相互作用的能力的物理值，并将所述值与不存在所述候选化合物时进行的相同试验中获得的标准物理值相比较。取决于所进行的结合试验，上述“物理值”可以是各种各样的，但特别包括吸光度值、放射性信号和荧光信号强度值。如果在比较物理值与标准物理值后确定所述候选化合物调节所述第一多肽和所述第二多肽之间的结合，则在步骤b)正向选择该候选化合物。
调节(i)Tau多肽和(ii)FKBP52多肽之间相互作用的化合物包括与Tau多肽或与FKBP52多肽结合的那些化合物，条件是所述目标化合物的结合然后调节Tau和FKBP52之间的相互作用。
本发明多肽可通过本身是本领域已知的任何技术产生，例如但不限于，单独或组合使用的任何化学、生物学、遗传学或酶学技术。
知道所需序列的氨基酸序列后，本领域技术人员可以容易地通过产生多肽的标准技术来制备所述多肽。例如，它们可以通过用众所周知的固相法，优选用可商购的肽合成仪器(例如由Applied Biosystems，Foster City，California制备的那些)并根据厂商指导来合成。
或者，本发明的多肽可通过本领域众所周知的重组DNA技术来合成。例如，在将编码所需(多)肽的DNA序列引入表达载体并将这种载体引入表达所需多肽的适当的真核或原核宿主后，这些片断可作为DNA表达产物获得，随后可以用众所周知的技术将它们从宿主中分离出来。
多种宿主/表达载体组合可用于表达编码本发明多肽的核酸。可使用的有用的表达载体包括例如染色体片断、非染色体和合成DNA序列。适当的载体包括但不限于SV40和pcDNA的衍生物；和已知的细菌质粒，例如col EI、pCR1、pBR322、pMal-C2、pET、pGEX、pMB9及其衍生物；质粒，例如RP4；噬菌体DNA，例如噬菌体I的众多衍生物，例如NM989，以及其他的噬菌体DNA，例如M13和细丝状单链噬菌体DNA；酵母质粒，例如2微米质粒或2微米质粒的衍生物，以及着丝粒和整合酵母穿梭载体；用于真核细胞中的载体，例如可用于昆虫或哺乳动物细胞中的载体；来源于质粒和噬菌体DNA的组合的载体，例如已修饰以使用噬菌体DNA或表达控制序列的质粒；等等。
因此，哺乳动物和典型的人细胞，以及细菌、酵母、真菌、昆虫、线虫和植物细胞可用于本发明中，且可通过此处定义的核酸或重组载体来转染。适当细胞的实例包括但不限于，VERO细胞；HELA细胞，例如ATCC No.CCL2；CHO细胞系，例如ATCC No.CCL61；COS细胞，例如COS-7细胞和ATCC No.CRL 1650细胞；W138、BHK、HepG2、3T3，例如ATCC No.CRL6361；A549、PC12、K562细胞、293T细胞、Sf9细胞，例如ATCC No.CRL1711和Cv1细胞，例如ATCC No.CCL70。可用于本发明的其他适当的细胞包括但不限于原核宿主细胞菌株，例如大肠杆菌(例如菌株DH5-[α])、枯草杆菌、鼠伤寒沙门氏菌或假单胞菌属、链霉菌属和葡萄球菌属的菌株。可用于本发明的其他适当的细胞包括酵母细胞，例如酵母属细胞，例如酿酒酵母。
在一个实施方式中，本发明的任何Tau衍生的多肽或FKBP52多肽可检测分子标记以用于筛选目的。
根据本发明，所述可检测分子可以由能通过分光镜、光化学、生物化学、免疫化学或化学手段检测的任何化合物或物质组成。例如，有用的可检测分子包括放射性物质(包括含有32P、25S、3H或125I的那些)、荧光染料(包括5-溴脱氧尿苷、荧光素、乙酰氨基芴或毛地黄毒苷)、荧光蛋白(包括GFP和YFP)或可检测的蛋白或肽(包括生物素、多组氨酸尾部或其他的抗原标签，如HA抗原、FLAG抗原、c-myc抗原和DNP抗原)。
根据本发明，所述可检测分子位于或结合至位于目标氨基酸序列外部的氨基酸残基上，从而最小化或阻止任何对所述多肽之间或所述候选化合物和或任何所述多肽之间的结合产生人为影响。
在另一个具体实施方式中，本发明多肽与GST标签(谷胱甘肽S-转移酶)融合。在该实施方式中，所述融合蛋白的GST部分可用作可检测分子。在所述融合蛋白中，GST可以位于N末端或C末端。当GST可检测分子随后与抗GST抗体接触(包括与标记的抗GST抗体接触)时，可以检测到该分子。用各种可检测分子标记的抗GST抗体可容易地商购得到。
在另一个具体实施方式中，本发明多肽与多组氨酸标签融合。所述多组氨酸标签通常包括至少四个连续的组氨酸残基，且通常包括至少六个连续的组氨酸残基。这种多肽标签也可以包括高达20个连续的组氨酸残基。所述多组氨酸标签可以位于N末端或C末端。在该实施方式中，当所述多组氨酸标签与抗多组氨酸抗体接触(包括与标记的抗多组氨酸抗体接触)时，可以检测到该标签。用各种可检测分子标记的抗多组氨酸抗体可容易地商购得到。
在进一步的实施方式中，本发明多肽与由转录因子的DNA结合域或激活剂域组成的蛋白质部分融合。转录因子的所述蛋白部分结构域可以位于N末端或C末端。这种DNA结合域可以由来源于大肠杆菌的LexA蛋白的公知的DNA结合域组成。此外，转录因子的所述激活剂域可以由来源于酵母的公知的Gal4蛋白的激活剂域组成。
在本发明筛选方法的一个实施方式中，上面描述的第一Tau多肽和第二FKBP52多肽包括转录因子的部分。在所述试验中，第一和第二部分结合在一起产生与特异性的调控DNA序列结合的功能性转录因子，其再诱导报告DNA序列的表达，所述表达进一步进行检测和/或测定。所述报告DNA序列的表达的阳性检测意味着由于所述第一Tau多肽和第二FKBP52多肽结合在一起，活性转录因子形成。
通常，在双杂合测试中，转录因子的第一和第二部分分别由(i)转录因子的DNA结合域和(ii)转录因子的激活剂域组成。在一些实施方式中，DNA结合域和激活剂域均来源于相同的天然存在的转录因子。在一些实施方式中，DNA结合域和激活剂域来源于不同的天然存在的因子，而当结合在一起时，这两个部分形成活性的转录因子。此处转录因子所使用的术语“部分”包括涉及多个蛋白转录因子的完整蛋白，以及完整的转录因子蛋白的特异性功能蛋白结构域。
因此，在本发明的一个实施方式中，本发明筛选方法的步骤a)包括以下步骤：
(1)提供宿主细胞表达：
-(i)以上定义的Tau多肽和(ii)转录因子的第一蛋白部分之间的第一融合多肽，
-(i)以上定义的FKBP52多肽和(ii)转录因子的第二部分之间的第二融合多肽，
当所述第一和第二蛋白部分结合在一起时，所述转录因子在DNA靶调控序列上是活性的，和
所述宿主细胞还包含核酸，其含有(i)可由所述活性转录因子活化的调控DNA序列和(ii)可操作地与所述调控序列连接的DNA报告序列，
(2)使步骤1)提供的所述宿主细胞与待测试候选化合物接触，
(3)测定所述DNA报告序列的表达水平。
由上述步骤(3)测定的所述DNA报告序列的表达水平与当步骤(2)省略时所述DNA报告序列的表达相比较。存在所述候选化合物时所述DNA报告序列的不同表达水平意味着所述候选化合物有效调节Tau多肽和FKBP52多肽之间的结合，以及所述候选化合物可以通过筛选方法的步骤b)正向选择。
适当的宿主细胞包括但不限于原核细胞(例如细菌)和真核细胞(例如酵母细胞、哺乳动物细胞、昆虫细胞、植物细胞等)。然而优选的宿主细胞是酵母细胞，更优选是酿酒酵母细胞或粟酒裂殖酵母细胞。
双杂合测试的类似系统是本领域熟知的，因此可用于进行本发明筛选方法(参见Fields等.1989；Vasavada等.1991；Fearon等.1992；Dang等.，1991，Chien等.1991，US 5,283,173，US 5,667,973，US 5,468,614，US 5,525,490和US5,637,463)。例如，如这些文献中所描写的，Gal4激活剂域可用于进行本发明的筛选方法。Gal4由两种物理学上离散的模块化结构域组成，一种作为DNA结合域发挥作用，另一种作为转录-活化域。以上文献中描述的酵母表达系统利用了这种性质。在Gal4-活化的启动子控制下的Gal1-LacZ报告基因的表达依赖于经由蛋白质-蛋白质相互作用的Gal4活性的重建。用β一半乳糖苷酶的显色底物检测含有相互作用多肽的集落。用于鉴别蛋白质-蛋白质相互作用的竞争试剂盒(MATCHMAKER，TM)可从Clontech商购。
因此在一个实施方式中，以上定义的第一Tau多肽与Gal4的DNA结合域融合，且以上定义的第二FKBP52多肽与Gal4的激活剂域融合。
所述可检测的标志物基因的表达可通过定量所产生的相应的特异性mRNA的量来评估。然而，通常可检测的标志物基因序列编码可检测蛋白，从而所述可检测的标志物基因的表达水平通过定量所产生的相应蛋白质的量来评估。用于定量mRNA或蛋白质的量的技术是本领域熟知的。例如，在调控序列控制下的可检测的标志物基因可由上述β-半乳糖苷酶组成。
在另一个实施方式中，步骤a)包括在存在或不存在待测试候选化合物的情况下使如上定义的第一Tau多肽和第二FKBP52多肽的混合物进行凝胶移位分析，然后通过进行所述多肽之间形成的复合物的检测来测定所述多肽一起的结合的步骤。凝胶移位分析可如本领域技术人员已知的方法进行。
因此在本发明的一个实施方式中，本发明筛选方法的步骤a)包括以下步骤：
(1)提供如上定义的第一Tau多肽和第二FKBP52多肽，
(2)使待测试候选化合物与所述多肽接触，
(3)用适当的移位底物与所述多肽和步骤(2)获得的所述候选化合物进行凝胶移位分析，
(4)检测并定量步骤(3)进行的移位分析上所述多肽之间形成的复合物。
然后将多肽之间形成的复合物的存在或量与当不存在待测试候选化合物时进行的分析所获得的结果相比较。
所述两种多肽之间形成的复合物的检测可通过以下步骤容易地进行：用适当的染料染色移位凝胶，然后测定对应于所分析蛋白质的蛋白质带，因为第一和第二多肽之间形成的复合物具有特定的表观分子量。凝胶中蛋白质的染色可采用本领域熟知的方法进行。适当的凝胶是本领域熟知的，但优选使用非变性凝胶。以通用方式，western印迹分析是本领域熟知的并被广泛描述(Rybicki等.，1982；Towbin等.1979；Kurien等.2006)。
在具体实施方式中，对应于进行凝胶移位分析的多肽的蛋白质带可通过特异性抗体检测。可使用抗Tau多肽的抗体和特异性地抗FKBP52多肽的抗体。
在另一个实施方式中，如上所述用可检测抗原标记所述两种多肽。因此，蛋白质带可通过抗所述可检测抗原的特异性抗体来检测。优选地，与Tau多肽偶联的可检测抗原和与FKBP52多肽偶联的抗原不同。例如，第一Tau多肽可以与GST可检测抗原融合，且第二FKBP52多肽可以与HA抗原融合。然后两种多肽之间形成的蛋白复合物可分别用抗GST和HA抗原的抗体来定量并测定。
在另一个实施方式中，步骤a)包括利用例如Edwards等(1997)或也如Szabo等(1995)所描述的光学生物传感器。该技术允许实时检测分子之间的相互作用而不需要标记的分子。事实上该技术是基于表面等离子体共振(SPR)现象。简言之，第一蛋白伴体与表面(例如羧甲基右旋糖酐基质)连接。然后在存在或不存在待测试候选化合物的情况下，第二蛋白伴体与之前固定的第一伴体一起孵育。然后检测结合，包括结合水平，或所述蛋白伴体之间结合的不存在。为此目的，使光束指向在不含有待测试样品的基质的表面区域侧，并由所述表面反射。随着角度和波长组合的变化，SPR现象引起反射光强度的降低。第一和第二蛋白伴体的结合引起基质表面上折射指数的变化，这种变化检测为SPR信号的变化。
在本发明的另一个实施方式中，筛选方法包括采用亲和层析。
用于上述筛选方法的候选化合物也可通过任何免疫亲和层析技术使用如上定义的(i)第一Tau多肽或(ii)第二FKBP52多肽预先固定在其上的任何层析基质根据本领域技术人员熟知的技术来选择。简言之，如上定义的Tau多肽或FKBP52多肽可采用常规技术结合至柱上，包括化学偶合至适当的柱基质(例如琼胶糖、Affi Gel
Figure BPA00001530772400101
或本领域技术人员熟知的其他基质)上。在该方法的一些实施方式中，亲和柱包含嵌合蛋白，其中如上定义的Tau多肽或FKBP52多肽融合至谷胱甘肽-S-转移酶(GST)上。然后使候选化合物与所述第一和第二多肽中的另一种多肽预先地、同时地或随后地与亲和柱的层析基质接触。洗涤后，对层析基质进行洗脱，且通过检测和/或定量所述较晚施加的第一或第二多肽来分析收集的洗脱液，从而确定候选化合物是否调节(i)第一Tau多肽和(ii)第二FKBP52多肽之间的结合和/或调节到何种程度。
本发明筛选方法的另一个实施方式中，用荧光分子或底物标记如上定义的第一Tau多肽和第二FKBP52多肽。因此，待测试候选化合物对如上定义的第一Tau多肽和第二FKBP52多肽之间的结合的潜在改变效应通过荧光定量来测定。
例如，如上定义的第一Tau多肽和第二FKBP52多肽可以与自动荧光多肽(如上述GFP或YFP)融合。如上定义的第一Tau多肽和第二FKBP52多肽也可用适于荧光检测和/或用荧光能量转移(FRET)分析进行所述多肽之间结合的定量的荧光分子来标记。如上定义的第一Tau多肽和第二FKBP52多肽可通过与如GFP或YFP的荧光分子的共价化学结合来用荧光分子直接标记。如上定义的第一Tau多肽和第二FKBP52多肽也可例如通过所述多肽和所述荧光分子之间的非共价结合来用荧光分子间接标记。事实上，如上定义的所述第一Tau多肽和第二FKBP52多肽可与受体或配体融合，且所述荧光分子可与相应配体或受体融合，这样荧光分子可与所述第一Tau多肽和第二FKBP52多肽非共价地结合。适当的受体/配体偶可以是生物素/抗生蛋白链菌素配对成员或可以选自抗原/抗体配对成员。例如，本发明多肽可以与多组氨酸尾融合，且荧光分子可以与抗多组氨酸尾的抗体融合。
如已说明的，本发明筛选方法的步骤a)包括用FRET通过荧光分析测定候选化合物调节如上定义的Tau多肽和FKBP52多肽之间的相互作用的能力。因此，在一个具体实施方式中，如上定义的第一Tau多肽用第一荧光团物质标记，且第二FKBP52多肽用第二荧光团物质标记。第一荧光团物质的波长值基本上等于第二荧光团的激发波长，其中所述第一和第二多肽的结合通过测定第二荧光团物质的发射波长处发射的荧光信号强度来检测。或者，第二荧光基团质也可以具有第一荧光团的发射波长，从而所述第一和第二多肽的结合通过测定第一荧光团物质的波长处发射的荧光信号强度来检测。
所使用的荧光团可以是各种适当的种类，例如众所周知的镧族元素螯合物。这些螯合物已被描述为在特异性生物亲和试验的生物缀合和显著能量迁移后具有化学稳定性、长效荧光(持续时间大于0.1ms)。文献US 5,162,508公开了二吡啶穴状化合物。具有TEKES型光敏剂(EP0203047A1)和三吡啶型光敏剂(EP0649020A1)的聚羧酸盐螯合物也是已知的。文献WO96/00901公开了二乙烯基三胺五乙酸(DPTA)螯合物，其使用喹诺酮作为敏化剂。具有其他敏化剂和其他示踪金属的另外的DPT螯合物对于诊断或成像应用也是已知的(例如，EP0450742A1)。
在优选的实施方式中，筛选方法的步骤a)中进行的荧光分析包括均相时间解析荧光(HTRF)分析，例如文献WO 00/01663或US6,740,756中所描述的，该两个文献的全部内容以引用方式合并于此。HTRF是基于TR-FRET的技术，其采用TRF(时间解析荧光)和FRET两者的原理。更具体地说，本领域技术人员可采用基于如Leblanc等(2002)描述的时间解析扩增穴状化合物发射(TRACE)技术的HTRF分析。HTRF供体荧光团是铕穴状化合物，其具有与穴状化合物包封的稳定性结合的镧系元素的长效发射。XL665，由红藻纯化得到的修饰的别藻青蛋白，是HTRF主要受体荧光团。当这两种荧光团通过生物分子相互作用组合在一起时，在激发期间由穴状化合物捕获的一部分能量通过620nm处的荧光发射释放，同时将其余能量转移给XL665。然后该能量作为在665nm处的特定荧光由XL665释放。665nm处的光仅通过具有铕的FRET来发射。因为铕穴状化合物始终存在于该分析中，即使当生物分子相互作用不能使XL665紧密接近时，仍能检测到620nm处的光。
因此，在一个实施方式中，筛选方法的步骤a)可以包括以下步骤：
(1)使包含以下组分的分析前样品形成接触：
-与第一抗原融合的第一Tau多肽，
-与第二抗原融合的第二FKBP52多肽，
-待测试候选化合物，
(2)将以下组分加入步骤(2)所述的分析前样品中：
-特异性抗所述第一抗原的用European穴状化合物标记的至少一种抗体，
-抗第二所述抗原的用XL665标记的至少一种抗体，
(3)在所述European穴状化合物的激发波长处照射步骤(2)的分析样品，
(4)检测和/或定量XL665发射波长处发射的荧光信号，
(5)将步骤(4)获得的荧光信号与当不存在待测试候选化合物时制备的步骤(1)的分析前样品获得的荧光进行比较。
如果在上述步骤(5)中，荧光信号强度与当不存在待测试候选化合物时制备的步骤(1)的分析前样品获得的荧光信号强度不同(更低或更高)，则可在筛选方法的步骤b)中正向选择该候选化合物。
用European穴状化合物标记或用XL665标记的抗体可以抗不同的目的抗原，包括GST、多组氨酸尾部、DNP、c-myx、HA抗原和其包含的FLAG。这些抗体包括可从CisBio(Bedfors，MA，USA)商购得到的那些，以及特别地分别称为61GSTKLA或61HISKLB的那些。
在一个具体实施方式中，本发明方法还可以包括测定候选化合物调节淀粉样前体蛋白(APP)多肽和FKBP52多肽之间的相互作用的能力的步骤。事实上，最近研究表明，FKBP52通过其FK506相互作用域与APP形成稳定的复合物。该研究确定了FKBP52在调节A β肽的毒性中的新作用(Sanokawa-Akakura R，Cao W，Allan K，Patel K，Ganesh A，Heiman G，Burke R，Kemp FW，Bogden JD，Camakaris J，Birge RB，Konsolaki M.Control ofAlzheimer′s amyloid beta toxicity by the high molecular weight immunophilinFKBP52and copper homeostasis in Drosophila.PLoS One.2010Jan13；5(1)：e8626)。因此，调节Tau和FKBP52之间的相互作用和APP和FKBP52之间的相互作用的化合物可用于治疗阿尔茨海默病。
本发明的细胞水平(in cellulo)筛选方法：
本发明说明书之前描述的体外筛选的任何一个实施方式结束时正向选择的候选化合物可进行进一步的选择步骤以进一步测定其对Tau介导的细胞功能(例如微管蛋白聚合)、Tau积累、Tau聚集和所有翻译后Tau修饰的性能。为此目的，可进一步选择根据如上所述的一般体外筛选方法正向选择的候选化合物调节Tau介导的细胞功能、Tau积累、Tau聚集和所有翻译后Tau修饰的能力。
因此本发明的另一方面涉及筛选用于预防和治疗涉及Tau机能失调的神经障碍的药物的方法，其中所述方法包括以下步骤：
i)通过进行权利要求1到6任一项所述的体外筛选方法来筛选调节Tau和FKBP52蛋白之间的相互作用的化合物，和
ii)对步骤i)结束时正向选择的化合物的Tau介导的细胞功能、Tau积累、Tau聚集和所有翻译后Tau修饰进行筛选。
在上述筛选方法的某些优选实施方式中，所述筛选方法的步骤ii)包括以下步骤：
(1)使细胞与步骤i)结束时正向选择的化合物接触，
(2)测定该化合物调节Tau介导的细胞功能、Tau积累、Tau聚集和所有翻译后Tau修饰的能力，
(3)将步骤(2)测定的Tau介导的细胞功能、Tau积累、Tau聚集和所有翻译后Tau修饰与当不存在所述正向选择的化合物的情况下进行步骤(1)时测定的Tau介导的细胞功能、Tau积累、Tau聚集和所有翻译后Tau修饰进行比较。
为进行步骤(1)，任何细胞可能是合适的，但优选神经元。
上述步骤(1)可通过将一定量待测试候选化合物加入培养基来进行。通常，制备多个培养物样品，从而将增加量的待测试候选化合物加入不同的培养物样品中。通常，也制备至少一个不含候选化合物的培养物样品，其作为阴性对照来进行进一步比较。任选地，也制备至少一个含有调节Tau介导的细胞功能、Tau积累、Tau聚集和所有翻译后Tau修饰的已知试剂的培养物样品，其作为阳性对照来使所述方法标准化。
因此，步骤(3)可通过将与待测试候选化合物一起孵育的细胞培养物所获得其中Tau介导的细胞功能、Tau积累、Tau聚集和所有翻译后Tau修饰被调节的细胞的百分比与用不含所述候选化合物的阴性对照细胞培养物所获得的其中Tau介导的细胞功能、Tau积累、Tau聚集和所有翻译后Tau修饰被调节的细胞的百分比进行比较来进行。例证性地，候选化合物的效力可通过将(i)与其一起孵育的细胞培养物所测定的其中Tau介导的细胞功能、Tau积累、Tau聚集和所有翻译后Tau修饰被调节的细胞的百分比与(ii)与调节Tau介导的细胞功能、Tau积累、Tau聚集和所有翻译后Tau修饰的已知试剂一起孵育的细胞培养物的上清液所测定的其中Tau介导的细胞功能、Tau积累、Tau聚集和所有翻译后Tau修饰被调节的细胞的百分比进行比较来评估。进一步例证性地，候选化合物的效力可通过测定其中Tau介导的细胞功能、Tau积累、Tau聚集和所有翻译后Tau修饰被调节细胞的百分比接近于或高于用调节Tau介导的细胞功能、Tau积累、Tau聚集和所有翻译后Tau修饰的已知试剂所测定的其中Tau介导的细胞功能、Tau积累、Tau聚集和所有翻译后Tau修饰被调节的细胞的百分比所需加入细胞培养物中的候选化合物的量来评估。
本发明的候选化合物：
根据本发明的一个实施方式，候选化合物可选自下组：肽、拟肽、有机小分子、抗体、适体或核酸。例如本发明候选化合物可以选自之前合成的化合物文库，或数据库中结构确定的化合物的文库，或选自已经从头合成的化合物的文库。
在一个具体的实施方式中，候选化合物可以选自有机小分子。
如此处所使用的，术语“有机小分子”是指大小与通常用于药物的有机分子相当的分子。该术语排除生物大分子(例如蛋白质、核酸等)；优选的有机小分子的大小范围为最高2000Da，最优选最高约1000Da。
本发明候选化合物可选自通过干扰其合成、翻译和配体/底物/产物结合来中和FKBP52的PPI酶活性的分子。
在优选的实施方式中，所述分子选自蛋白FKBP52的结构域I的PPI酶配体，优选阻止、阻断或抑制FKBP52的结构域I的PPI酶活性的PPI酶配体。
有利地，本发明分子可在不诱导免疫抑制活性的情况下阻止/抑制/阻断蛋白FKBP52的结构域I的PPI酶活性。
第一系列的分子是缺乏免疫抑制活性的FK506衍生物。FK506由以下结构式表示：
Figure BPA00001530772400151
一种特别优选的分子家族可由以下结构式表示的也称为VA-10367(Vertex公司)的人神经菌毛素(neurophilin)化合物的新型类似物组成：
Figure BPA00001530772400161
其他实例包括缺乏免疫抑制活性的雷帕霉素衍生物，例如国际专利申请公布说明书WO2005084673中描写的美立霉素(meridamycin)。雷帕霉素的其他衍生物包括Ruan B等描述的那些(Ruan B，Pong K，JoW F，BoWlby M，Crozier RA，Liu D，Liang S，Chen Y，Mercado ML，Feng X，Bennett F，vonSchack D，McDonald L，Zaleska MM，Wood A，Reinhart PH，Magolda RL，Skotnicki J，Pangalos MN，Koehn FE，Carter GT，Abou-Gharbia M，Graziani EI.Binding ofrapamycin analogs to calcium channels and FKBP52contributes totheir  neuroprotective  activities.Proc  Natl  Acad  Sci  USA.2008Jan8；105(1)：33-8.Epub 2007Dec 27)，如WYE-592或ILS-290：
WYE-592
Figure BPA00001530772400171
ILS-90
本发明分子可由本领域技术人员已知的任何常规方法来合成。
在另一个具体的实施方式中，本发明候选化合物可以是特异性地针对蛋白Tau和蛋白FKBP52之间的相互作用位点或影响FKBP52-Tau相互作用和/或其功能性细胞功能的抗体。
术语“抗体”或“多种抗体”是指特征为特异性针对FKBP52与Tau或其任何功能性衍生物的相互作用位点的抗体(上述抗体优选是单克隆抗体)，或其抗原结合片段、F(ab′)2或单链Fv型的，或由其衍生的任何类型的重组抗体。本发明的这些抗体包括针对FKB52与Tau的相互作用位点制备的特异性多克隆抗血清。
例如，本发明抗体可由易于根据典型方法由动物脾细胞(特别是对涉及Tau和FKBP52或其任何功能性衍生物之间的相互作用的肽序列免疫的小鼠或大鼠的脾细胞)和骨髓瘤细胞系的细胞形成的、以及通过产生识别涉及原先用于动物免疫的Tau和FKBP52或其任何功能性衍生物之间的相互作用的肽序列的单克隆抗体的杂交瘤的能力来选择的任何杂交瘤来产生。根据本发明该实施方式的抗体可以是通过重组DNA技术制备的小鼠抗体的人源化形式，不同于编码H链和L链的小鼠和/或人基因组DNA序列或编码H链和L链的cDNA克隆。
或者根据该实施方式的抗体可以是人抗体。例如，这种人抗体可通过如PCT/EP99/03605所描述的重症综合性免疫缺陷(SCID)小鼠的人外周血淋巴细胞(PBL)再增殖来制备，或通过使用能产生如美国专利5,545,806所描述的人抗体的转基因非人类动物来制备。来源于这些抗体的片段，例如Fab、F(ab)′2和(“单链可变区片段”)也形成本发明的一部分，前提是它们保持原有的结合性能。这些片段例如通常由以木瓜蛋白酶、胃蛋白酶或其他蛋白酶酶促消化该抗体而产生。本领域技术人员熟知，单克隆抗体或其片段可以修饰从而用于各种用途。酶、荧光或放射类型的合适的标记物可以标记本发明涉及的抗体。
在另一个具体实施方式中，本发明候选化合物可选自适体。适体在分子识别方面是抗体的替代形式。适体是寡核苷酸或寡肽序列，其具有以高亲合性和特异性有效识别任何种类的靶分子的能力。这类配体可通过如Tuerk C.和Gold L.，1990中所描述的随机序列文库的指数富集配体的系统进化(SELEX)来分离。随机序列文库可由DNA的组合化学合成获得。在该文库中，各成员是单一序列的最终化学修饰的线形低聚物。该类分子的可能的修饰、用途和优点已在Jayasena S.D.，1999中进行综述。肽适体由平台蛋白(例如通过双杂合法选自组合文库的大肠杆菌硫氧还蛋白(Colas等，1996))显示的构象上受限的抗体可变区组成。
在另一个实施方式中，候选分子可选自阻断蛋白FKBP52合成的分子。
合成是指FKBP52基因的转录。小分子可结合在FKBP52的启动子区上并抑制转录因子的结合，或这些分子可以结合转录因子并抑制FKBP52-启动子的结合，以使FKBP52不表达。
本发明也涉及包括反义RNA和DNA分子的寡核糖核苷酸序列及起到抑制FKBP52mRNA翻译作用的核酶的用途。反义RNA和DNA分子的作用是通过结合至靶mRNA并阻止蛋白质翻译来直接阻断mRNA的翻译。关于反义DNA，寡脱氧核糖核苷酸来源于翻译起始位点。核酶是能够催化RNA的特异性裂解的酶性RNA分子。核酶作用的机制包括核酶分子与互补的靶RNA的序列特异性杂交，随后核苷酸内切。
为抑制FKBP52基因或基因产物的活性，可采用针对三种不同类型的靶标：DNA、RNA和蛋白质的定制技术；例如，FKBP52的基因或基因产物可通过同源重组改变，遗传密码的表达可在RNA水平通过反义寡核苷酸、干扰RNA(RNAi)或核酶来抑制，且蛋白质功能可通过抗体或药物改变。
本发明的另一个实施方式是抑制FKBP52的表达的分子，优选选自由反义分子、RNAi和核酶组成的列表的抑制FKBP52表达的分子在制备预防或治疗需要的受试者的神经原纤维缠结中Tau聚集或沉积的疾病的药物中的用途。
本发明的治疗方法：
在进一步的方面，本发明提供用于预防和治疗涉及Tau机能失调的神经障碍的方法，包括将治疗有效量的调节Tau和FKBP52蛋白之间的相互作用的化合物施用于需要的受试者。所述化合物可通过本发明筛选方法来鉴别。
更具体地，本发明涉及用于预防和治疗涉及Tau机能失调的神经障碍的调节Tau和FKBP52蛋白之间的相互作用的化合物。
本发明方法可用于预防和治疗涉及Tau机能失调的神经障碍，包括阿尔茨海默病、额颞痴呆、进行性核上性麻痹、皮质基底节退化和额颞叶退化(也称为皮克病)，以及将来也许证实为涉及Tau的所有神经障碍，例如帕金森病。
根据本发明，术语“患者”或“需要其患者”是指可能受涉及Tau机能失调的神经障碍侵袭的人或非人哺乳动物(例如狗、猫、马...)。
本发明化合物的“治疗有效量”是指以适合于任何医学治疗的合理的效益/风险比治疗涉及Tau机能失调的神经障碍的化合物的足够量。然而，应理解，本发明化合物和本发明组合物的总每日用量将由主治医师在合理医学判断范围内确定。任何特定患者的具体的治疗有效剂量水平将取决于多种因素，包括待治疗疾病和疾病严重性；所使用具体化合物的活性；所使用具体组合物；患者的年龄、体重、总体健康、性别和饮食；给药次数、给药途径和所使用具体化合物的排泄率；治疗持续时间；与所使用具体化合物联合使用或同时给药的药物；以及医学领域熟知的类似因素。例如，本领域技术人员可以以低于实现预期治疗效应所需剂量的剂量开始，然后逐渐增加剂量直到实现预期效果。
调节Tau和FKBP52蛋白之间相互作用的本发明化合物可以与药学可接受的赋形剂组合。“药用的”或“药学可接受的”是指当适当地施用于哺乳动物(尤其是人)时不产生有害、过敏或其他的不良反应的分子实体和组合物。药学可接受的载体或赋形剂是指非毒性固体、半固体或液体填充剂、稀释剂、包封材料或任何类型的制剂助剂。
在进一步的方面，本发明提供用于预防和治疗阿尔茨海默病的方法，包括将治疗有效量的调节Tau和FKBP52蛋白之间的相互作用和FKBP52和APP之间的相互作用的化合物给药于需要其受试者。
本发明的诊断方法：
本发明的进一步方面涉及诊断、预后和监测分析。
因此，在具体的实施方式中，本发明涉及测试被认为患有或易患涉及Tau机能失调的神经障碍的受试者的方法，其包括分析从所述受试者获得的目标样品来测定FKBP52蛋白和Tau蛋白之间的复合物水平的步骤。
如此处所使用，术语“目标样品”包括含有从受试者获得的并可用于诊断分析的各种样品类型。此处的样品可以是任何类型的样品，例如任何细胞样品、生物流体(包括血液、血清、尿、脊髓液...)或从受试者的组织获得的任何活检样品。在优选实施方式中，目标样品是脊髓液样品。
在具体的实施方式中，本发明的方法包括使目标样品与能够选择性地与存在于目标样品中的FKBP52蛋白和Tau蛋白的复合物相互作用的结合伴体接触。在另一个具体的实施方式中，本发明方法可包括使目标样品与能够选择性地与FKBP52蛋白相互作用的结合伴体以及能够选择性地与存在于目标样品中的Tau蛋白相互作用的另一种结合伴体接触。
本发明的结合伴体可以是多克隆或单克隆的抗体，优选单克隆抗体。在另一个实施方式中，结合伴体可以是适体。
本发明结合伴体(例如抗体或适体)可用可检测分子或物质(例如荧光分子、放射性分子或本领域已知的任何其他标记物)来标记。本领域已知标记物通常(直接或间接地)提供信号。
如此处所使用，涉及抗体的术语“标记的”旨在包括通过将可检测物质(例如放射性物质或荧光团(例如异硫氰酸酯荧光素(FITC)或藻红蛋白(PE)或靛青(Cy5))耦合至抗体或适体的抗体直接标记，以及通过与可检测物质的反应性的探针或抗体间接标记。本发明抗体或适体可用放射性分子通过本领域已知的任何方法来标记。例如放射性分子包括但不限于用于闪烁研究的放射性原子，例如I123、I124、In111、Re186、Re188。
上述分析通常包括将结合伴体(即抗体或适体)结合到固相载体中。可用于实施本发明的固相载体包括如硝化纤维素(例如，以膜或微量滴定孔的形式)；聚氯乙烯(例如，片材或微量滴定孔)；聚苯乙烯胶乳(例如，珠或微量滴定板)；聚偏二氟乙烯；重氮化纸；尼龙膜；活化珠；磁性响应珠等的基质。
FKBP52蛋白和Tau蛋白之间的复合物的水平可采用标准免疫诊断技术来测定，包括免疫分析，例如竞争、直接反应或夹心型试验。这类分析包括但不限于，凝集试验；酶标记和介导的免疫分析，例如ELISA；生物素/抗生物素蛋白型分析；放射免疫分析；免疫电泳法；免疫沉淀法。
更具体地，可使用ELISA法，其中微量滴定板的孔以本发明的一组结合伴体涂覆。然后将包含或疑似包含FKBP52蛋白和Tau蛋白之间的复合物的目标样品加入涂覆的孔。在孵育足以使得形成抗体-抗原复合物的时间后，可以洗涤该板以去除未结合部分，并添加可检测地标记的第二结合分子。使所述第二结合分子与任何捕获的样品标志物蛋白反应，洗涤该板并用本领域熟知的方法检测第二结合分子的存在。
或者可能优选的是免疫组织化学(IHC)法。IHC特别地提供在组织样品中原位检测靶标的方法。因此IHC中保持了目标样品的总体细胞完整性，从而允许检测FKBP52蛋白和Tau蛋白之间的复合物的存在和位置。通常用福尔马林固定样品，包埋到石蜡中并切成切片用于染色和随后用光学显微镜检查。目前IHC法采用直接标记或者基于第二抗体或基于半抗原的标记。已知的IHC体系的实例包括例如，EnVision(TM)(DakoCytomation)、Powervision(R)(Immunovision，Springdale，AZ)、NBA(TM)试剂盒(Zymed Laboratories Inc.，South San Francisco，CA)、HistoFine(R)(Nichirei Corp，Tokyo，Japan)。
在具体实施方式中，可在与本发明结合伴体一起孵育后将组织切片加载在载玻睛或其他支持体上。然后，对加载在适当的固体支持体上的样品进行显微检查。为生成显微照片，含有样品的切片可以加载在载玻片或其他平面支持体上，以通过选择性染色目标蛋白的存在来突出显示。
因此IHC样品可以包括：例如(a)含有细胞样品或组织样品的制剂，(b)固定并包埋所述细胞，和(c)检测所述细胞样品中FKBP52蛋白和Tau蛋白之间的复合物。在一些实施方式中，IHC染色程序可以包括例如以下步骤：切下和修剪组织、固定、脱水、石蜡渗入、切成薄切片、加载在载玻片上、烘烤、脱蜡、再水化、抗原恢复、封闭步骤、施加第一抗体、洗涤、施加第二抗体(任选与适当的可检测标记偶联)、洗涤、复染和显微镜检验。
在一个实施方式中，本发明的方法还可包括将FKBP52蛋白和Tau蛋白之间的复合物的水平与预定阈值进行比较的步骤。所述比较指示是否受试者被认为患有或易患涉及Tau机能失调的神经障碍。预定阈值可指由受试者总体群体或选择性群体获得的目标样品中FKBP52蛋白和Tau蛋白之间的复合物的量。例如，选择性群体可以由显然健康的受试者组成，例如之前不具有指示涉及Tau机能失调的神经障碍的存在的任何迹象或症状的个体。在另一个实例中，预定值可由患有确定的涉及Tau机能失调的神经障碍的受试者组成。预定值可以是临界值或范围。预定值可基于显然健康的受试者和患有确定的涉及Tau机能失调的神经障碍的受试者之间的比较测量来确定。
此外，不希望被理论束缚，发明人相信FKBP52的异常表达或活性和/或尤其是其结合Tau的能力决定了个体是否患涉及Tau机能失调的神经障碍或个体是否有发生涉及Tau机能失调的神经障碍的风险。
因此，在具体实施方式中，本发明涉及测试被认为患有或易患涉及Tau机能失调的神经障碍的受试者的方法，其包括分析从所述受试者获得的目标样品以检测编码FKBP52蛋白的基因和/或其相关启动子中突变的存在的步骤。
用于检测编码FKBP52蛋白的基因中的突变的典型技术可以包括限制片段长度多态性、杂交技术、DNA测序、核酸外切酶抗性、微量测序、用ddNTP进行的固相延伸、用ddNTP进行的溶液中延伸、寡核苷酸测定；用于检测单核苷酸多态性的方法，例如动态等位基因特异性杂交、连接酶链反应、微测序、DNA“芯片”、与PCR或分子信标结合的具有单或双标记的探针的等位基因特异性寡核苷酸杂交等等。
在另一个具体实施方式中，本发明涉及测试被认为患有或易患涉及Tau机能失调的神经障碍的受试者的方法，其包括分析从所述受试者获得的目标样品以分析编码FKBP52蛋白的基因的表达的步骤。
分析编码FKBP52蛋白的基因的表达可通过检测转录核酸或翻译蛋白的表达的任何各种众所周知的方法来评估。
在优选实施方式中，编码FKBP52蛋白的基因的表达通过分析所述基因的mRNA转录物或mRNA前体(例如新生RNA)的表达来评估。所述分析可通过从来自受试者的目标样品的细胞制备mRNA/cDNA，并使mRNA/cDNA与参照多核苷酸杂交来评估。所制备的mRNA/cDNA可用于杂交或扩增试验，包括但不限于Southern和Northern分析、聚合酶链反应分析(例如定量PCR(TaqMan))和探针阵列(例如GeneChip(TM)DNA阵列(AFF YMETRIX))。
有利地，由编码FKBP52蛋白的基因转录的mRNA的表达水平的分析包括例如通过RT-PCR的核酸扩增过程(其实验实施方式在美国专利No.4,683,202中阐明)、连接酶链反应(BARANY，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，第88卷，第189-193页，1991)、自持序列复制(GUATELLI等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，第57卷，第1874-1878页，1990)、转录扩增系统(KWOH等，1989，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，第86卷，第1173-1177页，1989)、Q-β复制酶(LIZARDI等，Biol.Technology，第6卷，第1197页，1988)、滚环复制(美国专利No.5,854,033)或任何其他的核酸扩增方法，随后使用本领域技术人员熟知的技术检测扩增的分子。如果这种分子以极低数目存在，则这些检测方案对核酸分子的检测是特别有用的。如此处所使用，扩增引物定义为可退火至基因的5′或3′区(分别为正和负链，或反之亦然)并在其间包含短的区域的一对核酸分子。通常，扩增引物的长度约为10到30个核苷酸并位于长度为约50到200个核苷酸的区域的侧翼。在适当的条件下和利用适当的试剂，这种引物允许扩增包含位于引物侧翼的核苷酸序列的核酸分子。
在另一个具体实施方式中，本发明涉及测试被认为患有或易患涉及Tau机能失调的神经障碍的受试者的方法，其包括分析从所述受试者获得的目标样品以测定FKBP52蛋白的浓度的步骤。
测量FKBP52蛋白的浓度可通过使用与FKBP52蛋白特异性结合的如上所述的结合伴体来评估，尤其是用抗体(例如，放射标记的、发色团标记的、荧光团标记的或酶标记的抗体)、抗体衍生物(例如，与底物偶联的抗体或与蛋白/配体对(例如，生物素-抗生蛋白链菌素)蛋白的蛋白或配体偶联的抗体)、或抗体片断(例如，单链抗体、分离的抗体高变区等)来评估。
所述分析可通过本领域技术人员熟知的多种技术来评估，包括但不限于，酶免疫分析(EIA)、放射免疫分析(RIA)、Western印迹分析和酶联免疫吸附分析(RIA)。
本发明方法可以包括将来自受试者的目标样品中编码FKBP52蛋白的基因的表达水平或FKBP52蛋白的浓度与预定阈值进行比较。预定阈值可指由受试者的总体群体或选择性群体获得的目标样品中测定的表达水平或浓度。例如，选择性群体可以由显然健康的受试者组成，例如之前不具有指示涉及Tau机能失调的神经障碍的存在的任何迹象或症状的个体。在另一个实例中，预定值可由患有确定的涉及Tau机能失调的神经障碍的受试者组成。预定值可以是临界值或范围。预定值可基于显然健康的受试者和患有确定的涉及Tau机能失调的神经障碍的受试者之间的比较测量来确定。
在另一个具体实施方式中，本发明涉及测试被认为患有或易患涉及Tau机能失调的神经障碍的受试者的方法，其包括分析从所述受试者获得的目标样品以检测FKBP52蛋白的翻译后修饰的步骤。
FKBP52蛋白的翻译后修饰包括但不限于磷酸化、乙酰化、糖基化等。检测FKBP52蛋白的翻译后修饰可通过采用对FKBP52蛋白的翻译后形式特异性的结合伴体来评估。如上所述，所述结合伴体可以是与FKBP52蛋白的特定形式特异性结合的抗体(例如，放射标记的、发色团标记的、荧光团标记的或酶标记的抗体)、抗体衍生物(例如，与底物偶联的抗体或与蛋白/配体对(例如，生物素-抗生蛋白链菌素)蛋白的蛋白或配体偶联的抗体)、或抗体片断(例如，单链抗体、分离的抗体高变区等)。所述分析可通过本领域技术人员熟知的多种技术来评估，包括但不限于，酶免疫分析(EIA)、放射免疫分析(RIA)、Western印迹分析和酶联免疫吸附分析(RIA)。
然后上述方法可特别适于在以涉及Tau机能失调的神经障碍为特征或与涉及Tau机能失调的神经障碍相关的临床征兆发作之前给予受试者预防治疗的预测性或预言性目的。临床征兆可以包括但不限于任何CNS活动的任何种类的机能失调(例如运动/感官活动、睡眠障碍、抑郁状态、失忆障碍等...)。更特别地，本发明方法也可用于监测患有涉及Tau机能失调的神经障碍的受试者的治疗。
本发明将进一步以以下附图和实施例进行说明。然而，这些实施例和附图将不以任何方式解释为对本发明范围的限制。
附图说明
图1：脑中的FKBP52。通过采用抗FKBP52抗体761的Western印迹法分析来自不同的成年大鼠脑区的二十μg的细胞溶质蛋白。肌动蛋白用作加载对照。
图2：FKBP52和Tau蛋白之间的缔合。A)GST下拉分析(Pull-downassay)：Tau的免疫印迹(IB)显示与GST-标记的FKBP52或作为对照的仅GST一起孵育的可溶性微管提取蛋白的结合。B)共免疫沉淀分析：可溶性微管提取物用免疫纯化的抗FKBP52抗体或作为对照的免疫前血清进行免疫沉淀(IP)。上清液(S)和沉淀物(P)用抗Tau抗体(克隆DC25)进行免疫印迹。C)通过点印迹试验监测Tau蛋白直接结合FKBP52的能力。将不同量的重组Tau(hT40)点样到硝化纤维素膜上，然后用抗FKBP52抗体测定结合的FKBP52(0.5μg)。点样在硝化纤维素膜上的5μg GST作为对照。定量：100％对应于乳饱和前加载的0.5μg的FKBP52，0％对应于乳饱和后加载的0.5μg的FKBP52。背景定义为加载GST而不是hT40时的信号。减去背景后计算得到由hT40捕获的FKBP52的水平。
图3：Tau磷酸化对于其与FKBP52相互作用的相关性。A)通过SDS-Page分析重组Tau(hT40)、P-Tau和HP-Tau。hT40的磷酸化和高磷酸化导致如用抗Tau抗体(克隆DC25)进行的免疫印迹(IB)上所示的重组Tau的凝胶迁移的明显减少。B)用2.2μg的HP-Tau(1)、P-Tau(2)、纯的重组hT40(3)，恰在点样前向其中添加用于产生P-Tau(4)或HP-Tau(5)的相同量的细胞溶质，进行点印迹分析。点6是指GST(5μg)加载。
图4：原代皮层神经元和PC12细胞中FKBP52和TAU的共定位。A)用50nM NGF处理5天的原代皮层神经元和PC12细胞的免疫荧光染色。细胞溶质提取后进行TAU和FKBP52的双重染色以显示细胞骨架结合。箭头指示神经细胞轴突的远端部分中和PC12细胞神经突的末端处两种蛋白的优先共定位。
B)原代皮层神经元的共焦图像。如(A)进行双重染色。0.5μm切片的分析证实轴突远端部中的优先共定位(参见箭头)。
图5：FKBP52对由重组Tau异形体诱导的微管蛋白聚合的影响。通过使样品从4℃转换到37℃来进行微管蛋白聚合，且在345nm处监测混浊度变化15min。由大鼠脑纯化得到的微管蛋白(1mg/ml)在不存在(◆)或存在1.7μM(对于HT40为23μg)的不同人Tau异形体而不含FKBP52(◇)或含有3.5μM(55μg)FKBP52(▲)的情况下进行孵育，所述Tau异形体的微管结合域的重复序列和N末端的插入物的数目彼此不同。Tau异形体的标记使用公布的命名法(28)。G：如(A)中进行该对照实验，除了用3.5μM GST(▲)代替FKBP52。
图6：FKBP52过度表达对Tau积累和神经突生长的影响。A)在不存在或存在1μg/ml Dox(强力霉素)下用或不用NGF(50nM)处理PC12细胞。通过采用抗FKBP52抗体761的western印迹分析十μg的总蛋白提取物的FKBP52水平。B)如(A)中所述测定用或不用Dox处理的H7C2细胞中的FKBP52水平。兔FKBP52用作外源性蛋白来解释内源性大鼠蛋白的凝胶迁移率的小差异。C)H7C2和PC12也用或不用NGF处理5天，在存在或不存在Dox的情况下一周；50μg提取物用抗Tau(抗体克隆DC25)进行SDS-PAGE和免疫印迹。肌动蛋白用作加载对照。D)含有或不含Dox的情况下存在NGF(50nM)的情况下典型的H7C2细胞。由随机照片量化神经突长度(参见材料和方法)。在3个单独实验中获得类似结果。**：P＜0.01(Student-Newman-Keuls检验，Anova)。
图7：Tau聚合的离心沉降和western印迹分析：(A)氧化条件：Ox(B)还原条件：Red。S：上清液，P：沉淀。
图8：氧化条件下Tau聚合的离心沉降和western印迹分析：0.5mg/ml的重组Tau，1：单独；2：具有FKBP52；3：具有GST。S：上清液，P：沉淀。
图9：氧化条件下FKBP52和Tau聚合的离心沉降和western印迹分析：0.5mg/ml的重组Tau，1：单独或存在FKBP52；2：1mg/ml；3：0.5mg/ml；4：0.25mg/ml；5：0.125mg/ml。S：上清液，P：沉淀。
图10：阿尔茨海默病和对照脑中FKBP52的表达水平。在来自正常和阿尔茨海默病的可溶性组织匀浆级分中进行FKBP52的Western印迹分析。GAPDH用作加载对照。用Image-J软件量化化学发光强度。
图11：阿尔茨海默病和对照中mRNA FKBP52的表达水平。用mRNAGAPDH标准化后进行mRNA FKBP52的量化。
具体实施方式
实施例1：TAU蛋白功能中FKBP52的作用
材料和方法
抗体和试剂：抗Tau mAB(克隆DC25)和抗Tau mAB(Tau5)分别来自Sigma和Calbiochem。抗FKBP52pAB 761如所述(9)。GTP来自Sigma，强力霉素来自Clontech。
微管蛋白的制备和微管组装分析：从Janvier(Le Genest-St.-Isle，France)获得雄性成年Sprague-Dawley大鼠(体重约为250g)。根据研究规则通过断头处死它们，且全脑立即用于如(9)所述制备微管蛋白。微管组装分析如(9)所述进行。
蛋白质纯化和不同的Tau异形体和FKBP52蛋白的过度表达：在克隆hT40、hT39、hT37、hT34、hT24、hT23的大肠杆菌中表达人脑Tau的六种异形体并如(28)所述进行纯化。如(23)中亲合纯化全长FKBP52。对于微管蛋白聚合分析，在4℃用2单位的凝血酶(GE Healthcare)切割与谷胱甘肽-琼脂糖珠(GE Healthcare)结合的FKBP52过夜，并相对含10％甘油的缓冲液L(0.1M Mes，1mM EGTA，1mM MgCL2，0.1mM EDTA)透析，并在使用前补充至1mM GTP和1mM DTT和10μM PPACK(凝血酶的强力不可逆抑制剂)(Biomol)。
重组Tau的磷酸化和高磷酸化：如(18)所述，大鼠脑提取物用作激酶活性来源。简言之，在存在或不存在冈田酸的情况下重组hT40与成年大鼠脑的细胞溶质一起孵育，分别得到HP-Tau(高磷酸化-Tau)和P-Tau(磷酸化-Tau)。
蛋白结合分析：GST下拉分析：预加载1nmol GST-FKBP52或1nmolGST的100μl的谷胱甘肽-琼脂糖珠用500μl的缓冲液A(补充1mM DTT和1mM GTP的缓冲液L)洗涤4次，然后重悬于含有蛋白微管提取物的相同缓冲液中。通过用以1/1000稀释的抗Tau抗体(克隆DC25)的SDS/PAGEwestern印迹分析来分析蛋白中Tau异形体的存在。
共免疫沉淀分析：如(12)所述的用1mg细胞溶质微管提取物进行该分析。
点印迹分析：将含有不同量hT40的100μl缓冲液施加于硝化纤维素膜上，在室温下用含有0.1％吐温20(PBS-T)的磷酸盐缓冲盐水(PBS)中的5％非脂肪乳封闭，用PBS-T和缓冲液A洗涤，然后在室温下与含有0.5μg重组FKBP52的100μl缓冲液A一起孵育2h。用缓冲液IP(50mM Tris(pH7.5)/150mM NaCl/2mM MgCl2/0.1％Brij97(Sigma)/10％甘油/蛋白酶抑制剂)和用PBS-T洗涤膜。用PBS-T中的乳封闭后，该膜与抗FKBP52761抗体到一起孵育。通过ECL揭示FKBP52的存在。用Quantity-one软件采用配备有16bit CCD照相机(Biorad)的Chemidoc XRS进行定量。
细胞系和稳定的DNA转染：
H7C2细胞的产生：将编码兔FKBP52的cDNA插入pTRE2载体(Clontech)的HindIII和AccI限制性位点来形成pTRE2-FKBP52。在表达反向四环素控制的反式激活因子(transactivator)的可商购PC12Tet-on细胞系(Clontech)中采用lipofectamineTM(Invitrogen)进行100μg的pTR2-FKBP52和10μg的pTK-潮霉素的转染。用100μg/ml潮霉素选择稳定转染的细胞并单独筛选。
细胞培养：PC12细胞和H7C2细胞在37℃、90％O2/10％CO2下在含有10％(v/v)马血清和5％(v/v)FBS(Invitrogen)的DMEM中生长。通过在5天中添加神经生长因子(NGF)(Invitrogen)来诱导在涂覆有10μg/ml聚(L)-赖氨酸(Sigma)的塑料皿上生长的细胞的分化神经元表型。进行来自胚胎期17天大鼠胎儿的脑皮质的原代培养。将解离细胞接种在涂有聚(L-鸟氨酸)的玻璃盖玻片上(50000个细胞/ml)，并在37℃、95％O2/5％CO2下在确定的培养基中培养。
免疫细胞化学：细胞在预涂在12孔组织培养板中的玻璃盖玻片上生长。原代细胞和PC12细胞在含有0.05％曲通的PEM缓冲液(80mM PIPES，1mMMgCl2，2mM EGTA，pH6.9)中分别孵育2.5min和3min，用温的不合曲通的PEM冲洗，在-20℃下用甲醇固定5min，并与亲合-纯化的抗FKBP52761(1/1000)和抗Tau5(1/100)一起孵育。分别以1/500和1/1000使用抗兔AlexaFluor 488-偶联(Invitrogen)、抗小鼠FITC-偶联或CyTM3红偶联(GE-Healthcare)的抗体。采用带有×63物镜的蔡司axioplan 2显微镜通过表面荧光或通过共焦显微镜(蔡司，Thornwood，NY，USA)检查盖玻片。
神经突生长的定量：用Neuron J软件分析三个孔中各孔的PC12和H7C2细胞的随机视野照片(random field photographs)。通过测定随机选定的至少200个细胞的最长神经突来确定平均神经突长度。
结果
Tau FKBP52缔合：如来自几个脑区的细胞溶质蛋白的Western印迹所示，FKBP52广泛分布于脑中(图1)。为了研究MAP是否可能涉及FKBP52对微管稳定性的作用(9)，通过将与琼脂糖珠结合的GST-FKBP52GST与由成年大鼠脑制得的微管细胞溶质一起孵育来进行GST下拉分析。用抗MAP1b、MAP2和Tau的抗体通过免疫印迹法分析特异性结合的蛋白质。在这些实验条件下，MAP1b或MAP2没有观察到免疫反应性，但存在Tau免疫反应性(图2A)。在大鼠脑组织匀浆中，Tau以多条带出现，代表具有各种磷酸化程度的不同剪接异形体。采用GST-FKBP52的大鼠脑细胞溶质微管的下拉实验中也发现了几种Tau类型。采用纯化GST的对照中没有检测到Tau免疫反应性(图2A)。为证实这种缔合的特异性，用抗FKBP52的多克隆抗体来免疫沉淀成年大鼠脑细胞溶质的微管。用单克隆Tau抗体通过Western印迹分析免疫沉淀物。Tau与FKBP52发生共免疫沉淀，但不与免疫前血清发生共免疫沉淀(图2B)。因此，Tau和FKBP52在大鼠脑中形成复合物。这些实验没有解决Tau与FKBP52的结合是否是直接的或是否这种结合包括其他因素的问题。为研究该问题，将重组Tau(hT40，最长的异形体，在大肠杆菌中表达并纯化)点样在硝化纤维素上，并与纯化的重组FKBP52一起孵育。然后，用抗FKBP52的多克隆抗体检测被Tau分离的蛋白。如图2C所示，Tau以剂量依赖性的方式保留FKBP52，但GST并不保留FKBP52。这些发现表明FKBP52和Tau之间的直接相互作用。
Tau磷酸化对其与FKBP52的相互作用的影响：为明确Tau磷酸化是否调节其与FKBP52的缔合，用重组的磷酸化Tau(P-Tau)和高磷酸化Tau(HP-Tau)进行点印迹实验(18)(图3A)。通过用这些恰在点样前添加的磷酸化ht40、非磷酸化ht40或恰在点样前向其中添加用于获得与磷酸化或高磷酸化ht40的相同量的细胞溶质蛋白的ht40作为诱饵的实验来测定FKBP52和P-Tau或HP-Tau之间的相互作用的特异性。如图3B所示，由Tau募集的FKBP52的量取决于其磷酸化状态。73％(±7)的FKBP52被2.2μg HP-Tau保留，而用作对照的相同量的hT40和存在细胞溶质蛋白的情况下的hT40仅分别保留3.5％和6.6％。当P-Tau用作诱饵时，仅捕获41％(±15)的FKBP5。HP-Tau和P-Tau与FKBP52之间的结合的差异可通过特异性位点处Tau磷酸化的不同程度或通过Tau磷酸化的总量来解释，或通过两种机制的结合来解释(图3A)。在任何情况下，这些结果强调了Tau磷酸化对于其与FKBP52的结合的重要性。
原代皮层神经元和PC12细胞中Tau和FKBP52的共定位：用大鼠原代皮层神经元通过免疫荧光实验来检查Tau和FKBP52的亚细胞定位。培养6天并温和提取以选择性去除未结合细胞溶质蛋白而同时保持与细胞骨架相连的蛋白后，用单克隆抗体Tau5和亲合纯化的多克隆抗FKBP52抗体在神经元上进行双重染色。与之前的报道(19)一致，Tau集中于轴突的远端部和生长锥颈部，该处也观察到FKBP52的强积累(图4)。也在PC12细胞的生长锥处发现FKBP52和Tau的共定位和积累(图4)。最近已报道，Tau选择性富集在轴突尖端，这可能是由于它的特异性锚定(20)。我们的结论提示，FKBP52可能参与Tau的捕集，因此能影响其亚细胞分布。
FKBP52体外抑制由Tau诱导的微管蛋白聚合：为阐明Tau和FKBP52之间的功能性相互作用，建立微管动力学试验。在仅用纯化的大鼠脑微管蛋白进行的实验中，不形成微管，而在用人重组Tau异形体进行的实验中，观察到反映微管组装的吸光度增加(图5)。然而，当在纯化的重组FKBP52存在下将Tau加入微管蛋白时，微管形成被阻止，而GST是无效的。人Tau的六种异形体得到类似的结果(图5)。我们推断FKBP52抑制Tau促进微管组装的作用。
FKBP52阻止PC12细胞中的Tau积累和神经突生长：采用允许产生稳定转化的PC12细胞系的基于四环素-反应元件的FKBP52-诱导型表达体系(21)来确定FKBP52的细胞作用。在阳性测试的克隆中，一个克隆，即所谓的H7C2，被选择和用于研究FKBP52过度表达对PC12细胞的影响，以及进一步研究FKBP52和Tau之间的可能关系。在基础条件下H7C2细胞表达内源性FKBP52，且用Dox(强力霉素)处理导致重组FKBP52蛋白表达的明显增加(图6A)。Dox处理5天后H7C2细胞中FKBP52诱导为约4倍。
接着检查FKBP52对Tau的积累的影响。由在存在或不存在Dox下用或不用NGF (50nM)处理5天的PC12细胞或H7C2细胞的培养提取物通过Western印迹法测定Tau蛋白的量。在PC12细胞中，用NGF处理后FKBP52表达无变化(图6B)。如所预期的，NGF处理后，观察到PC12和H7C2细胞中Tau均增加。然而，当H7C2细胞在NGF之外还暴露于Dox，从而过度表达FKBP52时，不发生Tau蛋白的额外积累。用NGF和Dox处理的PC12细胞中仍然观察到Tau蛋白增加，排除Dox是引起缺乏Tau降低之原因的可能性(图6C)。总之，FKBP52阻止PC12细胞中由NGF诱导的Tau的积累。
由于Tau的一种作用是刺激神经突生长(12)，我们研究了FKBP52过度表达对PC12和H7C2细胞中神经突长度的效果。不存在NGF时，H7C2细胞中没有观察到神经突生长，不管它们是否用Dox处理一周。然而在用50nMNGF和Dox处理的H7C2细胞中，与对照(不用Dox处理的H7C2)相比，观察到神经突长度40％(±7)的减小(图6D)。在用10或20nM NGF处理的H7C2细胞中观察到Dox对神经突长度的相同影响。可以排除Dox本身参与神经突生长过程，因为经Dox处理和未经Dox处理的PC12细胞之间没有观察到神经突长度的差异。由FKBP52过度表达导致的神经突生长的抑制与显示PC12细胞中FKBP52的丧失导致神经突延伸形成的我们之前的报道(9)一致。FKBP52对神经突长度的影响可通过Tau与FKBP52结合从而将Tau从微管中去除来解释。另外，通过FKBP52的过度表达阻止Tau积累与神经突长度减小一致，并提示该亲免素在Tau功能中的潜在作用。
讨论
该新发现的FKBP52的“抗Tau”活性使得我们重新检验该蛋白的功能，该蛋白最初被确认并克隆为激素类固醇受体的调节剂(8，22)。FKPB52是多模块蛋白，包括肽基脯氨酰异构酶(“旋转异构酶”)节段，其功能被FK506(23)、雷帕霉素和一些相关的非免疫抑制性衍生物阻断。FKBP52和Pin1之间有着显著的结构相似性：这两种蛋白都具有肽基-脯氨酰异构酶(PPI酶)活性和特异性蛋白-蛋白相互作用结构域(7)。由于Pin1PPI酶活性恢复阿尔茨海默病模型中磷酸化Tau蛋白的功能(7)，在Tau和FKBP52之间的观察到的相互作用可能暗示tau蛋白病(包括阿尔茨海默病)的发病机理。必须记住，不同于FKBP12(24)，FKBP52不结合钙调磷酸酶(25)，因此FKBP52不介导FK506的免疫抑制能力。因此，通过非免疫抑制的FK506/雷帕霉素衍生物进行的FKBP52的旋转异构酶活性的药理学调节可以提供用于预防/降低错误折叠的Tau的致病效应的新方法。
除了其肽基脯氨酰异构酶活性外，FKBP52用作分子伴侣蛋白。该活性取决于分子伴侣蛋白HSP90和其他蛋白所结合的其三十四肽重复域(26)。已经注意到伴侣蛋白-共伴侣(co-chaperone)蛋白复合物在以Tau积累为特征的神经退化疾病中起关键作用(27)。我们现在报道FKBP52可以降低Tau的功能/积累，因此提示其可能参与到这些所述的共伴侣蛋白系统中(27)。
我们的结果确立了FKBP52在Tau功能中的作用。该报告中描述的相互作用很值得进一步研究，因为FKBP52的有效的药理学靶标可能在不久的将来变成现实。
实施例2：FKBP52对体外TAU寡聚作用的影响
Tau蛋白的聚集体是多种神经退化性疾病的特征(Delacourte A and BuéL，2000)。体外Tau聚集的条件的研究形成不同的实验系统，包括氧化条件、通过聚苯胺(例如肝素)的诱导和通过脂肪酸(例如花生四烯酸)的诱导(Barghorn S和Mandelkow E，2002)。
为研究FKBP52对Tau寡聚的影响，我们通过沉降分析监测在氧化条件下在存在或不存在重组FKBP52的情况下重组Tau蛋白(这里使用最长的异形体)聚合的能力。在4℃下在Tris 10mM pH7.4中透析Tau(0.5mg/ml)过夜并以14000rpm离心，定量western印迹用于监测Tau蛋白的聚合。在该条件下，沉降分析揭示沉淀部分中Tau的存在，与存在DTT的情况(其中没有获得Tau的可检测沉淀聚合物)进行的实验相反(图7)。该实验意味着Tau在氧化条件下自我聚合，并证实了，如已经报道的，半胱氨酸在Tau寡聚过程的第一步中的重要性(Schweers等1995)。
监测在氧化介质中共孵育Tau和FKBP52对Tau寡聚过程的影响。如图8所示，当在等分子的FKBP52存在下进行透析时，没有观察到沉淀部分中Tau的可检测的存在，而当在作为对照的GST存在下进行共孵育时，可观察到Tau的可沉淀聚合物。
然而，当在FKBP52的浓度发生改变(1到0.1mg/ml)(其中Tau浓度恒定(0.5mg/ml))的情况下进行沉降分析实验时，0.1或0.25mg/ml的FKBP52的存在导致沉淀中Tau聚合物增加，其中相对于Tau等分子或两倍量的FKBP52的存在阻止Tau的可沉淀聚合物的存在(图9)。这些结果提示FKBP52的双重作用：第一：FKBP52对Tau的构象活性，可能涉及FKBP52的肽基脯氨酰异构酶活性，从而使Tau形成有利的促聚集形式；第二：FKBP52可通过潜在的位阻保护Tau经由二硫键形成而寡聚的能力。
实施例3：阿尔茨海默病患者脑中的FKBP52蛋白的下调
通过National BrainBank(GIE NeuroCEB)获得的人脑前额皮质在5倍体积的含有Tris 10mM、蔗糖0.32M、DTT 1mM和蛋白酶抑制剂混合物的缓冲液中匀浆化。组织匀浆在4℃下以14000RPM离心5min。上清液用作可溶部分。沉淀通过在相同条件下匀浆化溶解，并用作不可溶部分。通过western印迹法分析可溶部分和不可溶部分中的FKBP52水平。可溶部分和不可溶部分中的FKBP52水平分别占总FKBP52的80和20％。
为阐明患者脑中FKBP52蛋白表达水平是否可能改变，我们比较了正常对照(n＝3)和阿尔茨海默病患者(n＝12)的前额皮质中FKBP52蛋白的表达。如图10所示，可溶部分中观察到阿尔茨海默病脑中FKBP52明显下降。用GAPDH(甘油醛-3-磷酸脱氢酶)标准化后，与对照比较，阿尔茨海默病脑的可溶部分中发现的FKBP52的表达水平占35％(±24)。不可溶部分中没有检测到FKBP52的蛋白表达水平的变化；该最后观察的现象提示FKBP52不被Tau聚集体捕集。
随后通过实时定量RT-PCR(QPCR)分析人患病的和对照的脑前额皮质中FKBP52基因的mRNA表达水平。如图11所示，患病脑相对于对照没有观察到FKBP52mRNA水平的改变。这些结果表明患者脑中FKBP52蛋白表达的降低归因于转录后机制。
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Claims (10)

1.筛选用于预防和治疗涉及Tau机能失调的神经障碍的药物的方法，包括以下步骤：
a)测定候选化合物调节Tau多肽和FKBP52多肽之间的相互作用的能力，和
b)正向选择调节所述相互作用的候选化合物。
2.如权利要求1所述的方法，其中步骤a)由以下步骤组成：
a1)使待测试候选化合物与第一Tau多肽或其基本上同源的或基本上相似的氨基酸序列和第二FKBP52多肽或其基本上同源的或基本上相似的氨基酸序列的混合物接触，
a2)测定所述候选化合物调节所述Tau多肽和所述第二FKBP52多肽之间的结合的能力。
3.如权利要求1或2所述的方法，其中所述Tau多肽或FKBP52多肽用可检测分子标记。
4.如权利要求3所述的方法，其中所述Tau多肽用第一荧光团物质标记，和所述FKBP52多肽用第二荧光团物质标记。
5.如权利要求4所述的方法，其中所述第一荧光团物质的发射波长值基本等于第二荧光团物质的激发波长值，以使得所述Tau多肽和所述FKBP52多肽的结合通过测量第二荧光团物质的发射波长值处发射的荧光信号强度来检测。
6.如权利要求1至5任一项所述的方法，其中所述候选化合物选自下组：肽、拟肽、有机小分子、抗体、适体或核酸。
7.筛选用于预防和治疗涉及Tau机能失调的神经障碍的药物的方法，其中所述方法包括以下步骤：
i)通过进行权利要求1到6任一项的体外筛选方法来筛选调节Tau和FKBP52蛋白之间的相互作用的化合物，和
ii)对步骤i)结束时正向选择的化合物进行Tau介导的细胞功能、Tau积累、Tau聚集和所有翻译后Tau修饰的筛选。
8.用于预防和治疗涉及Tau机能失调的神经障碍的调节Tau和FKBP52蛋白之间的相互作用的化合物。
9.测试被认为患有或易患涉及Tau机能失调的神经障碍的受试者的方法，其包括分析从所述受试者获得的目标样品的步骤，该步骤用于：
i)测量FKBP52蛋白和Tau蛋白的复合物的水平；和/或
ii)检测编码FKBP52蛋白的基因和/或其相关启动子中突变的存在；和/或
iii)分析编码FKBP52蛋白的基因的表达；
iv)测量FKBP52蛋白的浓度；和/或
v)检测FKBP52蛋白的翻译后修饰。
10.如权利要求9所述的方法，其中所述目标样品选自任何细胞样品；生物流体，包括血液、血清、尿、脊髓液；或从受试者的组织中获得的任何活检样品。
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