KR20120003317A

KR20120003317A - 식물 추출물을 포함하는 비만세포의 과립 분비 억제용 조성물

Info

Publication number: KR20120003317A
Application number: KR1020100064099A
Authority: KR
Inventors: 권대혁; 오정미; 양유수; 최기두; 황재성; 이승규; 이주형; 오창규
Original assignee: 성균관대학교산학협력단; 포휴먼텍(주)
Priority date: 2010-07-02
Filing date: 2010-07-02
Publication date: 2012-01-10
Also published as: WO2012002777A2; WO2012002777A3

Abstract

본 발명은 일본잎갈나무(Larix leptolepis), 다릅나무(Maackia amurensis), 산괴불주머니(Corydalis speciosa), 짚신나물(Agrimonia pilosa), 만삼(Codonopsis pilosula), 버드나무(Salix koreensis), 산가막살나무 (Viburnum wrightii), 굴피나무(Platycarya strobilacea), 족제비싸리(Amorpha fruticosa), 돌배나무(Pyrus pyrifolia), 비수리(Lespedeza cuneata), 물양지꽃(Potentilla cryptotaeniae), 및 눈갯버들(Salix graciliglans)로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 추출물을 포함하는 비만세포의 과립 분비 억제용 조성물에 관한 것으로 이 조성물은 알레르기성 질환의 예방, 개선, 치료에 효과적이므로 알레르기성 질환의 개선, 예방 또는 치료용 약제학적 조성물, 식품 조성물, 의약외품 조성물, 및 화장료 조성물 등으로 사용될 수 있다.

Description

식물 추출물을 포함하는 비만세포의 과립 분비 억제용 조성물{Composition for inhibiting the degranulation of mast cell comprising plant extracts}

본 발명은 일본잎갈나무(Larix leptolepis), 다릅나무(Maackia amurensis), 산괴불주머니(Corydalis speciosa), 짚신나물(Agrimonia pilosa), 만삼(Codonopsis pilosula), 버드나무(Salix koreensis), 산가막살나무 (Viburnum wrightii), 굴피나무(Platycarya strobilacea), 족제비싸리(Amorpha fruticosa), 돌배나무(Pyrus pyrifolia), 비수리(Lespedeza cuneata), 물양지꽃(Potentilla cryptotaeniae), 및 눈갯버들(Salix graciliglans)로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 추출물을 유효성분으로 포함하는 비만세포의 과립 분비 억제용 조성물에 관한 것이다.

알레르기성 질환을 치료하기 위해서 항히스타민제, 교감신경자극제, 항알레르기약, 테오필린(Theophylline)제제, 스테로이드제제 등을 많이 사용하고 있다.

항히스타민제는 비교적 안전한 약으로 여러 가지 알레르기성 질환의 대중 요법으로서 가장 많이 사용되고 있다. 항히스타민제들은 히스타민 작용을 차단하는 효과는 비슷하나 그 부작용은 서로 많은 차이를 보이며, 가장 흔한 부작용으로 진전작용과 최면작용이 있고, 그 외 흥분, 과민, 불면, 불안, 어지러움, 악몽, 환각 등 중추흥분작용도 일어날 수 있으며, 특히 소아에게서 기이한 흥분 작용을 나타낸다는 보고가 있었다.

항히스타민제가 히스타민 작용에 직접 길항하여 속효성인 반면에, 항알레르기제{Cromolyn Sodium(DSCG)}는 알레르기 반응에 관여하는 세포로부터 히스타민, 류코트리엔 (leukotriene)등 알레르기 전달물질의 생성, 유지를 억제한다. 따라서 항히스타민제는 알레르기 발생 후의 증상을 억제하는데 주로 사용하는 반면에 항알레르기제는 알레르기 반응의 발생을 억제하는 예방약으로 사용되고 있어 효과가 나타나기까지는 2-4주간 이상 사용해야 한다. 따라서, 급성증상을 억제하는 약물로는 사용될 수 없다.

알레르기성 질환에서 스테로이드 제제는 항염 작용 및 면역억제 작용을 하므로, 아나휠락시스, 천식상태, 박리성 피부염 등 치명적인 급성 알레르기 반응에 있어서 매우 유용한 약제이다. 그러나 장기간 투여는 신경 예민, 불면, 불안 등 정신적인 장애, 비만, 피부이상 등 환자가 자각할 수 있는 부작용과 녹내장, 백내장, 위염, 골다공증 등과 같은 위험이 있으므로 주의를 요한다.

상기와 같이, 현재 알레르기성 질환의 치료제로 사용하고 있는 합성 의약품들은 병을 호전시키는 효과가 있는 반면 심각한 부작용을 초래한다는 약점이 있다.

그러므로 천연 식물 추출물을 사용하여 비만세포 과립의 분비를 억제하는 제품을 개발하는 것이 천연물 소재이므로 최종 제품 개발 시 소비자에게 친화적으로 접근 가능하므로 안전하며 합성 의약품 소재에 비해 산업적 응용이 수월한 형태임에 착안하여, 본 발명자들은 일본잎갈나무(Larix leptolepis), 다릅나무(Maackia amurensis), 산괴불주머니(Corydalis speciosa), 짚신나물(Agrimonia pilosa), 만삼(Codonopsis pilosula), 버드나무(Salix koreensis), 산가막살나무 (Viburnum wrightii), 굴피나무(Platycarya strobilacea), 족제비싸리(Amorpha fruticosa), 돌배나무(Pyrus pyrifolia), 비수리(Lespedeza cuneata), 물양지꽃(Potentilla cryptotaeniae), 및 눈갯버들(Salix graciliglans)의 추출물이 비만세포의 과립 분비 억제 효과가 있으며 특히, 일본잎갈나무 추출물은 아토피 피부염과 같은 알레르기성 질환을 호전시키는 효과가 있음을 동물 실험을 통해 확인함으로써 본 발명을 완성하였다.

본 발명의 목적은 일본잎갈나무(Larix leptolepis), 다릅나무(Maackia amurensis), 산괴불주머니(Corydalis speciosa), 짚신나물(Agrimonia pilosa), 만삼(Codonopsis pilosula), 버드나무(Salix koreensis), 산가막살나무 (Viburnum wrightii), 굴피나무(Platycarya strobilacea), 족제비싸리(Amorpha fruticosa), 돌배나무(Pyrus pyrifolia), 비수리(Lespedeza cuneata), 물양지꽃(Potentilla cryptotaeniae), 및 눈갯버들(Salix graciliglans)로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 추출물을 유효성분으로 포함하는 비만세포의 과립 분비 억제용 조성물을 제공하는 것이다.

본 발명의 목적은 상기 조성물을 포함하는 알레르기성 질환의 예방 또는 치료용 약제학적 조성물을 제공하는 것이다.

본 발명의 목적은 상기 조성물을 포함하는 알레르기성 질환의 개선 또는 예방용 식품 조성물을 제공하는 것이다.

본 발명의 목적은 상기 조성물을 포함하는 알레르기성 질환의 개선 또는 예방용 의약외품 조성물을 제공하는 것이다.

본 발명의 목적은 상기 조성물을 포함하는 알레르기성 질환의 개선 또는 예방용 화장료 조성물을 제공하는 것이다.

본 발명의 목적은 일본잎갈나무(Larix leptolepis), 다릅나무(Maackia amurensis), 산괴불주머니(Corydalis speciosa), 짚신나물(Agrimonia pilosa), 만삼(Codonopsis pilosula), 버드나무(Salix koreensis), 산가막살나무 (Viburnum wrightii), 굴피나무(Platycarya strobilacea), 족제비싸리(Amorpha fruticosa), 돌배나무(Pyrus pyrifolia), 비수리(Lespedeza cuneata), 물양지꽃(Potentilla cryptotaeniae), 및 눈갯버들(Salix graciliglans)로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상을 마쇄하는 단계, 상기 마쇄물을 물, 유기용매 또는 이들의 혼합용매로부터 선택된 용매로 추출하고 건조시키는 단계, 및 상기 건조물에 물, 유기용매 또는 이들의 혼합용매로부터 선택된 용매를 가하여 용해시키는 단계를 포함하는 상기 13종 식물의 추출물 제조방법을 제공하는 것이다.

상기 목적을 달성하기 위하여, 일 양태로 본 발명은 일본잎갈나무(Larix leptolepis), 다릅나무(Maackia amurensis), 산괴불주머니(Corydalis speciosa), 짚신나물(Agrimonia pilosa), 만삼(Codonopsis pilosula), 버드나무(Salix koreensis), 산가막살나무 (Viburnum wrightii), 굴피나무(Platycarya strobilacea), 족제비싸리(Amorpha fruticosa), 돌배나무(Pyrus pyrifolia), 비수리(Lespedeza cuneata), 물양지꽃(Potentilla cryptotaeniae), 및 눈갯버들(Salix graciliglans)로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 추출물을 유효성분으로 포함하는 비만세포의 과립 분비 억제용 조성물을 제공한다.

본 발명자들은 일본잎갈나무(Larix leptolepis), 다릅나무(Maackia amurensis), 산괴불주머니(Corydalis speciosa), 짚신나물(Agrimonia pilosa), 만삼(Codonopsis pilosula), 버드나무(Salix koreensis), 산가막살나무 (Viburnum wrightii), 굴피나무(Platycarya strobilacea), 족제비싸리(Amorpha fruticosa), 돌배나무(Pyrus pyrifolia), 비수리(Lespedeza cuneata), 물양지꽃(Potentilla cryptotaeniae), 및 눈갯버들(Salix graciliglans) 추출물에 비만세포의 과립 분비를 억제하는 효과가 있음을 확인하였다. 보다 구체적으로, 본 발명자들은 상기 식물 추출물의 처리에 따른 베타-헥소사미니다아제(β-hexosaminidase) 방출 저해 효과를 실험한 결과, 상기 식물 추출물들에 50% 이상의 비만세포 과립 분비 억제 효과가 있음을 확인하였다(표 2 및 도 2).

추가적으로, 상기 13종의 식물 추출물 중 가장 우수한 베타-헥소사미니다아제(β-hexosaminidase) 방출 저해 효과를 나타낸 일본잎갈나무 추출물을 아토피 피부염을 유발시킨 마우스에 도포한 결과 혈청 내 IgE 양이 유의하게 감소하고(도 3) 비만세포 수의 증가가 유의하게 억제되는바(도 4), 일본잎갈나무 추출물에 아토피 피부염을 포함한 알레르기성 질환을 완화시키는 우수한 효과가 있음을 확인하였다.

결과적으로 본 발명의 구체적인 실시예에 의해, 상기 13종의 식물 추출물들에 비만세포 과립 분비 억제 효과 및 이로 인한 알레르기성 질환의 완화 효과가 있음을 확인할 수 있었다.

본 발명에서, '비만세포(mast cell)'는 염증반응에 관여하는 세포로 IgE 항체가 활성화되고, 외부의 다른 항원이나 알레르겐(allergen)에 의해서 교차(crosslink)되면, 여러 가지 다양한 신호기작 (signalling pathway)에 의해 비만세포의 과립 안에 포집되어 있던 히스타민, 베타-헥소사미니다아제(β-hexosaminidase), 류코트리엔과 같은 염증유발 물질 등을 세포 외막 (plasma membrane)으로 방출한다. 이렇게 방출된 염증유발 물질들은 염증을 유발하는 수용체와 사이토카인 등을 활성화시킴으로써 그 염증을 더욱 심화시키는 작용을 한다. 특히, 비만세포에서 이러한 물질들의 방출은 알레르기성 질환 등과 밀접한 연관이 있다. 알레르기성 질환은 보편적으로 유전학적/면역학적으로 IgE 항체가 관련되고 후천적 요소 즉 환경적, 정신적 요인 인자들이 항원에 접촉, 노출에 의해 감작되어 발병되는 것으로 알려져 있다. 이 중 면역학적 요인은 현재 치료의 타겟이 되고 있으며, 면역학적 측면에서 이러한 알레르기성 물질들의 세포 외막으로의 방출을 제어함으로써 알레르기성 질환 치료제로 적용 가능하다.

본 발명에서의 용어, '비만세포의 과립 분비'는 상기 비만세포의 과립 안에 포집되어 있는 염증유발 물질의 분비를 말하며, 상기 염증유발 물질에는 히스타민, 베타-헥소사미니다아제(β-hexosaminidase), 류코트리엔 등이 포함된다.

본 발명에서의 용어, '비만세포의 과립 분비 억제'는 상기 비만세포의 과립 안에 포집되어 있던 염증유발 물질이 분비되는 것을 차단 또는 그 효율을 감소시키는 것을 말한다. 결과적으로, 비만세포의 과립 분비 억제를 통해 염증 유발 물질 분비에 의해 유도되는 다양한 알레르기성 질환의 개선, 예방, 치료가 가능하다.

본 발명에서, '베타-헥소사미니다아제(β-hexosaminidase)'은 비만세포의 과립에 포집되어 있다가 세포가 활성화되면 세포 외막으로 방출되는 것으로, 비만세포의 탈 과립화 (degranulation) 마커로 사용되고 있다 (Cheong H, Choi EJ, Yoo GS, Kim KM, Ryu SY, Ho C. Planta Med 1998;64;577). 본 발명의 구체적인 실시예에 따르면, 이러한 성질을 이용하여 식물 추출물의 비만세포의 과립 분비 저해 효과를 알아보기 위해 상기 13종의 식물 추출물 처리에 따른 베타-헥소사미니다아제(β-hexosaminidase) 저해율 실험을 수행하였고 그 결과 베타-헥소사미니다아제(β-hexosaminidase)의 방출이 현저히 저해됨을 확인할 수 있었다.

본 발명에서, '일본잎갈나무(Larix leptolepis)'는 높이는 약 30m에 달하고, 잎은 줄 모양이며 약 40~50개씩 짧은 가지에 모여나고 길이는 약 2∼3cm이다. 꽃은 자웅 1가화로 수꽃 이삭은 긴 타원형이고 암꽃 이삭은 넓은 달걀 모양으로 5월쯤에 꽃이 핀다. 열매는 구과로 넓은 달걀 모양으로 길이는 약 2~3.5cm이고 9∼10월경에 황갈색으로 익는다. 1년 된 가지는 약간 가늘고 적갈색을 띠며, 구과의 비늘 조각은 끝쪽이 반전한다. 상기 일본잎갈나무 추출물은 천연, 잡종, 변종 식물의 다양한 기관으로부터 추출될 수 있고 식물 조직 배양물에서도 추출 가능하며, 본 발명의 구체적인 실시예에 따르면 줄기에서 추출하였다. 이하, 본 명세서에서 특별히 문제되지 않는 한 잎갈나무도 상기 일본잎갈나무를 지칭한다.

본 발명에서, '다릅나무(Maackia amurensis)'는 잎이 지는 넓은잎키나무이며 높이는 약 10~20미터이다. 통나무의 속은 검은 재색을 띤다. 잎은 어긋나게 붙고 약 5~11개의 쪽잎으로 된 홀수 깃털모양의 겹잎이다. 쪽잎은 타원형의 닭알모양이고 민변두리이며 잎 양면에 털이 없다. 8월경 햇가지 끝에 겹송이 꽃차례를 이루고 흰색의 나비모양 작은 꽃이 많이 핀다. 열매는 꼬투리 열매이며 납작하고 긴타원형이며 길이는 약 5센티미터이다. 그 안에 여러 개의 씨앗이 들어 있으며 10월경에 여문다. 상기 다릅나무 추출물은 천연, 잡종, 변종 식물의 다양한 기관으로부터 추출될 수 있고 식물 조직 배양물에서도 추출 가능하며, 본 발명의 구체적인 실시예에 따르면 잎 또는 줄기에서 추출하였다.

본 발명에서, '산괴불주머니(Corydalis speciosa)'는 현호색과로 한국, 일본, 중국 동북부, 헤이룽강, 우수리강 등에 분포하며, 습한 산지에서 자생한다. 높이는 약 40cm이다. 원줄기는 속이 비고 곧게 자라며 가지가 갈라지고 전체에 흰빛을 띤다. 잎은 어긋나고 약 2회 깃꼴로 갈라지며 길이는 약 10∼15cm, 나비는 약 4∼6cm이다. 갈래조각은 달걀 모양이며 다시 깃처럼 갈라지고 마지막갈래조각은 줄 모양의 긴 타원형이며 끝이 뾰족하다. 꽃은 4∼6월경에 노란색으로 피며 길이는 약 2∼2.3cm이고 총상꽃차례에 달린다. 포는 달걀 모양 바소꼴이고 때로 갈라진다. 화관은 끝이 입술 모양으로 갈라지고 밑부분은 꿀주머니로 된다. 수술은 약 6개이며 다시 2개씩 갈라진다. 열매는 삭과로서 줄 모양이며, 종자는 둥글고 검은빛이며 겉에 가늘고 오목한 점이 흩어져 있다. 상기 산괴불주머니 추출물은 천연, 잡종, 변종 식물의 다양한 기관으로부터 추출될 수 있고 식물 조직 배양물에서도 추출 가능하며, 본 발명의 구체적인 실시예에 따르면 전초에서 추출하였다.

본 발명에서, '짚신나물(Agrimonia pilosa)'은 쌍떡잎식물 장미목 장미과의 여러해살이풀로 한국·일본·중국·인도·히말라야·몽골·아무르·시베리아·유럽·사할린 등지에 분포한다. 풀밭이나 길가에서 서식하고 줄기는 높이가 약 30∼100cm이고 전체에 털이 있다. 잎은 어긋나고 약 5∼7개의 작은잎으로 구성된 깃꼴겹잎이다. 작은잎은 크기가 고르지 않지만 끝에 달린 3개는 크기가 비슷하고 아래쪽으로 갈수록 작아지며 긴 타원 모양 또는 달걀을 거꾸로 세운 모양이고 양끝이 좁으며 가장자리에 톱니가 있다. 잎자루 밑 부분에 약 1쌍의 턱잎이 있는데, 턱잎은 반달 모양이고 끝이 뾰족하며 아랫부분 가장자리에 몇 개의 큰 톱니가 있다. 꽃은 6∼8월경에 황색으로 피고 줄기와 가지 끝에 총상꽃차례를 이루며 달린다. 꽃받침은 길이가 약 3mm이고 세로줄이 있으며 윗부분이 약 5개로 갈라지고 겉에 갈고리 같은 털이 있다. 꽃잎은 약 5개이고 달걀을 거꾸로 세운 모양 또는 둥근 모양이며, 수술은 약 5∼10개이다. 열매는 수과이고 길이가 약 3mm이며 꽃받침에 싸여 있는데, 꽃받침에 있는 갈고리 같은 털 때문에 물체에 잘 붙는다. 상기 짚신나물 추출물은 천연, 잡종, 변종 식물의 다양한 기관으로부터 추출될 수 있고 식물 조직 배양물에서도 추출 가능하며, 본 발명의 구체적인 실시예에 따르면 전초에서 추출하였다.

본 발명에서, '만삼(Codonopsis pilosula)'은 쌍떡잎식물 초롱꽃목 초롱꽃과의 덩굴성 여러해살이풀로 깊은 산속에서 자란다. 한국·중국·우수리강 등지에 분포한다. 잎은 호생하지만 짧은 가지에서는 대생하고 난형 또는 난상 타원형이며 둔두 원저이고 길이는 약 1-5cm, 나비는 약 1-3.5cm로서 양면에 잔털이 있으며 특히 맥 위에 많고 표면은 녹색, 뒷면은 분백색이며 가장자리가 보통 밋밋하고 엽병은 길이가 2-3cm로서 털이 있다. 삭과는 편원추형이며 꽃받침이 숙존하고 9-10월경에 익어 끝이 3쪽으로 터져 종자를 쏟아낸다. 종자는 작고 많은데 길고 둥글며 날개가 없는 갈색으로 광택은 없다. 꽃은 7-8월경에 피며 측지 끝에 약 1개씩 달리고 그 밑의 엽액에서도 계속 피며 꽃받침은 약 5개로 갈라지고 털이 없으며 길이는 약 15mm, 나비는 약 5mm로서 피침형이다. 화관은 종형이며 자주색이고 길이는 약 2.5cm, 지름은 약 1.5cm로서 끝이 약 5개로 갈라지며 열편은 삼각형이고 길이는 약 5mm이다. 덩굴줄기는 다른 물체에 감아 오른다. 전체에 털이 있고 자르면 유액이 나온다. 뿌리줄기는 곤봉 모양이다. 뿌리는 원주형으로 길이는 약 20-30cm, 지름은 약 0.5-2(10)cm이며 겉이 황갈색을 띤다. 상기 만삼 추출물은 천연, 잡종, 변종 식물의 다양한 기관으로부터 추출될 수 있고 식물 조직 배양물에서도 추출 가능하며, 본 발명의 구체적인 실시예에 따르면 지상부에서 추출하였다.

본 발명에서, '버드나무(Salix koreensis)'는 버드나무과(Salicaceae)에 속하는 낙엽성 활엽 교목으로 4월경 개화하며 암수딴그루로 식과는 5월경에 결실을 맺는다. 꽃은 암수딴그루이다. 수꽃은 길이 약 1∼2cm이며 꿀샘과 수술이 2개씩이고 수술대 밑에는 털이 난다. 암꽃은 길이 약 1∼2cm이고 약 1∼2개의 꿀샘이 있다. 꽃대에 털이 나고 포는 녹색의 달걀 모양이며 털이 난다. 씨방은 달걀 모양으로서 자루가 없으며 털이 나고 암술대는 약간 길며 암술머리는 4개이다. 열매는 삭과(로서 5월경에 익으며 털이 달린 종자가 들어 있다. 한국·일본, 중국 북동부 등지에 분포한다. 상기 버드나무 추출물은 천연, 잡종, 변종 식물의 다양한 기관으로부터 추출될 수 있고 식물 조직 배양물에서도 추출 가능하며, 본 발명의 구체적인 실시예에 따르면 줄기에서 추출하였다.

본 발명에서, '산가막살나무 (Viburnum wrightii)'는 잎은 마주나기하며, 난상타원형이고, 점첨두이다. 뒷면에 선점이 있고, 측맥이 뚜렷하게 가장자리까지 뻗는다. 가장자리에 치아상의 톱니가 있다. 가는 가지가 많고 갈색이다. 꽃은 늦은 봄에 백색으로 피며, 열매는 핵과로 타원상난형이고, 가을에 적색으로 익는다. 양수이지만 음지에서도 잘 자라며, 토양을 가리지 않으나 비옥한 사질양토에서 잘 자란다. 내공해성, 내염성이 강하다. 상기 산가막살나무 추출물은 천연, 잡종, 변종 식물의 다양한 기관으로부터 추출될 수 있고 식물 조직 배양물에서도 추출 가능하며, 본 발명의 구체적인 실시예에 따르면 잎, 줄기, 및 꽃에서 추출하였다.

본 발명에서, '굴피나무(Platycarya strobilacea)'는 약 10m까지 자라는 낙엽교목으로 저지대의 하천가 등 햇볕이 잘 드는 곳에 서식하고 꽃은 5~6월경, 열매는 9월경에 익는다. 잎의 길이는 약 15~30cm이다. 소엽은 약 7~19매로 좁은 장타원형으로 길이는 약 5~11cm이고, 기부는 절형, 좌우부동형으로 윗쪽이 크며 중거치가 있고 양면에 털이 있다가 없어진다. 웅화수는 길이가 약 5~8cm, 자화수는 길이가 약 2~4cm이며 과수는 장타원형이고 길이는 약 3~5cm이며, 흑갈색의 털이 없다. 포편은 떨어지지 않고 피침형이다. 상기 굴피나무 추출물은 천연, 잡종, 변종 식물의 다양한 기관으로부터 추출될 수 있고 식물 조직 배양물에서도 추출 가능하며, 본 발명의 구체적인 실시예에 따르면 꽃에서 추출하였다.

본 발명에서, '족제비싸리(Amorpha fruticosa)'는 콩과에 속하는 낙엽 관목으로 키는 약 3m 정도 자란다. 약 11~25장의 잔잎으로 된 겹잎이 어긋나는데 잔잎은 난형이고 가장자리는 밋밋하다. 자줏빛이 도는 꽃은 5~6월쯤 줄기 끝에 총상 꽃차례를 이루며 무리져 핀다. 씨가 약 1개씩 들어 있는 열매는 9월경에 익는다. 상기 족제비싸리 추출물은 천연, 잡종, 변종 식물의 다양한 기관으로부터 추출될 수 있고 식물 조직 배양물에서도 추출 가능하며, 본 발명의 구체적인 실시예에 따르면 잎 및 줄기에서 추출하였다.

본 발명에서, '돌배나무(Pyrus pyrifolia)'는 중부이남 산지에서 자라는 낙엽소교목으로 높이가 약 5m까지 자라며, 잎은 호생. 심장형과 비슷하며, 길이는 약 7-12cm이다. 잎자루와 꽃자루에는 털이 없거나, 솜털이 돋아난다. 지름 약 3cm 전후의 작은 열매가 달리며, 산돌배와 달리 꽃받침은 끝이 뾰족하고, 조락성으로 열매가 맺히면 일찍 떨어져버린다. 꽃은 4-5월경에 잎보다 먼저 피우며, 열매는 다갈색이며, 10월경에 결실한다. 상기 돌배나무 추출물은 천연, 잡종, 변종 식물의 다양한 기관으로부터 추출될 수 있고 식물 조직 배양물에서도 추출 가능하며, 본 발명의 구체적인 실시예에 따르면 잎 및 줄기에서 추출하였다.

본 발명에서, '비수리(Lespedeza cuneata)'는 여러해살이풀이다. 줄기는 곧추 서고 가지를 많이 치며 털이 배게 나고 세로 능선이 있다. 잎은 어긋나게 붙으며 잎꼭지는 짧고 약 3개의 쪽잎으로 된 겹잎이다. 쪽잎은 띠 모양의 쐐기 모양인데 끝은 둔하거나 오목하고 변두리에 비단털이 있다. 7~8월경 잎아귀에 보라색줄이 있는 작은 나비 모양꽃이 여러개 핀다. 꽃받침은 약 5갈래로 갈라지고 갈라진 조각은 버들잎 모양이고 털이 있다. 수꽃술은 약 10개인데 두몸수꽃술이다. 열매는 둥그스럼한 꼬투리열매이며 겉면에 그물모양의 줄이 있으며 잔털이 있다. 씨앗은 약 1개 들어 있다. 상기 비수리 추출물은 천연, 잡종, 변종 식물의 다양한 기관으로부터 추출될 수 있고 식물 조직 배양물에서도 추출 가능하며, 본 발명의 구체적인 실시예에 따르면 전초에서 추출하였다.

본 발명에서, '물양지꽃(Potentilla cryptotaeniae)'은 쌍떡잎식물 장미목 장미과의 여러해살이풀로 한국·중국 동북부·일본·우수리강 유역·아무르 등지에 분포하고, 깊은 산 속의 냇가에 서식한다. 꽃은 7∼8월경에 황색으로 피고 가지 끝에 취산꽃차례를 이루며 달린다. 꽃의 지름은 약 1cm이고, 꽃받침조각은 달걀 모양의 바소꼴이며, 부악편은 거꾸로 세운 바소꼴이다. 꽃잎은 약 5개이고 달걀을 거꾸로 세운 모양의 원형이며 길이가 약 4mm로 꽃받침조각과 거의 같고, 수술은 약 20개이며, 암술은 수가 많다. 줄기는 전체에 털이 있고 뿌리에서 나온 잎은 꽃이 필 때 말라 없어지고, 줄기에서 나온 잎은 어긋나고 3 장의 작은잎이 나온 잎이고, 잎자루는 줄기 밑 부분에서 길지만 윗부분에서는 짧으며, 턱잎은 길이의 절반 이상이 잎자루에 붙는다. 상기 물양지꽃 추출물은 천연, 잡종, 변종 식물의 다양한 기관으로부터 추출될 수 있고 식물 조직 배양물에서도 추출 가능하며, 본 발명의 구체적인 실시예에 따르면 전초에서 추출하였다.

본 발명에서, '눈갯버들(Salix graciliglans)'은 버드나무목 버드나무과에 속하는 낙엽활엽관목이다. 원산지는 대한민국이고, 아시아 등지에 분포한다. 나무의 크기는 약 1~2m정도이고, 잎은 좁은 피침형태로 길이가 약 10cm이다. 상기 눈갯버들 추출물은 천연, 잡종, 변종 식물의 다양한 기관으로부터 추출될 수 있고 식물 조직 배양물에서도 추출 가능하며, 본 발명의 구체적인 실시예에 따르면 화서에서 추출하였다.

본 발명의 조성물은 상기 13종의 식물 추출물과 같은 천연 추출물을 기초로 하는바, 안전하고 독성 또는 부작용이 거의 없으므로 장기간의 복용이 가능하다는 장점이 있다. 또한, 상기 조성물은 인간뿐만 아니라, 알레르기성 질환이 발병될 수 있는 소, 개 등의 동물에게 사용될 수도 있다.

본 발명에 따른 비만세포 과립 분비 억제용 조성물은 베타-헥소사미니다아제(β-hexosaminidase) 방출 저해, 아토피 피부염을 유발시킨 마우스의 혈청 내 IgE 양 감소, 및 비만세포 수의 증가 억제에 우수한 효과를 발휘하므로 알레르기성 질환의 개선, 예방, 및 치료에 효과적이다.

따라서 또 다른 하나의 양태로, 본 발명은 상기 비만세포 과립 분비 억제용 조성물을 포함하는 알레르기성 질환 예방 또는 치료용 약제학적 조성물 및 상기 비만세포 과립 분비 억제용 조성물을 투여하여 알레르기성 질환을 예방 또는 치료하는 방법을 제공한다.

본 발명에서의 용어, '예방'은 본 발명에 따른 비만세포 과립 분비 억제용 조성물의 투여로 상기 알레르기성 질환의 발병을 억제 또는 지연시키는 모든 행위를 말한다.

본 발명에서의 용어, '치료'는 본 발명에 따른 비만세포 과립 분비 억제용 조성물의 투여로 상기 알레르기성 질환의 증세가 호전되거나 이롭게 변경하는 모든 행위를 말한다.

본 발명에서의 용어, '알레르기성 질환'은 알레르기에 의하여 일어날 수 있는 질환은 모두 포함하고, 항원항체반응에 기인하는 병적 현상은 물론이고 항원항체반응이 증명되는 질환과 매우 유사하지만 항원항체반응은 증명되지 않는 것, 또는 항원항체반응의 관여가 증명되지 않지만 가능성이 높은 것 등도 포함한다. 알레르기성 질환을 기관별로 예를 들면, 호흡기계에는 기관지천식 ·고초열 ·혈관운동신경성 비염 ·비후성 비염 ·알레르기성 기관지염 ·뢰플러 증후군(일과성 폐침윤) 등, 소화기계에는 식이성 알레르기성 위염 ·알레르기성 설사 ·알레르기성 구내염 ·장성자반병 등, 순환기계에는 결절성 동맥주위염 ·폐색성 동맥내막염 ·협심증 ·심내막염 등, 피부 관계에는 두드러기 ·퀸케 부종(혈관신경성 부종) ·결절성 홍반 ·자반병·아토피 등, 눈 관계에는 플릭텐 ·교감성 안염 ·알레르기성 결막염 ·알레르기성 각막염 등이며, 그 밖에 미만성 사구체신염이나 편두통 등을 들 수 있다. 또한, 알레르기성 질환을 즉시형(아나휠락시스형)과 지발형(투베르쿨린형)으로 크게 분류하기도 한다. 즉시형에는 고초열 ·기관지천식 ·두드러기 ·퀸케 부종 ·소화관 알레르기 등, 지발형에는 접촉성 피부염이나 약제 알레르기 등을 포함한다.

본 발명에 따른 조성물은, 포유동물에 투여된 후 활성 성분의 신속, 지속 또는 지연된 방출을 제공할 수 있도록 당업계에 잘 알려진 방법을 사용하여 약제학적 제형으로 제조될 수 있다. 제형의 제조에 있어서, 본 발명에 따른 조성물을 담체와 함께 혼합 또는 희석하거나, 용기 형태의 담체 내에 봉입시키는 것이 바람직하다.

이에, 본 발명의 약제학적 조성물은 알레르기성 질환을 예방하고 치료하기 위한 통상의 방법에 따라 정제, 환제, 산제, 과립제, 캡슐제, 현탁제, 내용액제, 유제, 시럽제, 에어로졸, 주사용액 등의 형태로 제형화 하여 사용될 수 있다. 예를 들어, 본 발명의 약제학적 조성물에 포함될 수 있는 담체, 부형제 및 희석제로는 락토즈, 덱스트로즈, 수크로스, 솔비톨, 만니톨, 자일리톨, 에리스리톨, 말티톨, 전분, 아카시아 고무, 알지네이트, 젤라틴, 칼슘 포스페이트, 칼슘 실리케이트, 셀룰로즈, 메틸 셀룰로즈, 미정질 셀룰로스, 폴리비닐 피롤리돈, 물, 메틸히드록시벤조에이트, 프로필히드록시벤조에이트, 탈크, 마그네슘 스테아레이트 및 광물유를 들 수 있다. 제제화할 경우에는 보통 사용하는 충진제, 증량제, 결합제, 습윤제, 붕해제, 계면활성제 등의 희석제 또는 부형제를 사용하여 조제된다.

경구투여를 위한 고형제제에는 정제, 환제, 산제, 과립제, 캡슐제 등이 포함되며, 이러한 고형제제는 복합 조성물에 적어도 하나 이상의 부형제, 예를 들면, 전분, 탄산칼슘, 수크로스, 락토오스, 젤라틴 등을 섞어 조제될 수 있다. 또한, 단순한 부형제 이외에 마그네슘 스테아레이트, 탈크 같은 윤활제도 사용될 수 있다. 경구투여를 위한 액상제제로는 현탁제, 내용액제, 유제, 시럽제 등이 포함되며, 흔히 사용되는 단순 희석제인 물, 리퀴드 파라핀 이외에 여러 가지 부형제, 예를 들면, 습윤제, 감미제, 방향제, 보존제 등이 사용될 수 있다.

비경구투여를 위한 제제는 멸균된 수용액, 비수성용제, 현탁제, 유제, 동결건조 제제, 좌제 등을 포함할 수 있다. 비수성용제와 현탁용제로는 프로필렌글리콜, 폴리에틸렌 글리콜, 올리브 오일 등과 같은 식물성 기름, 에틸올레이트와 같은 주사 가능한 에스테르 등이 사용될 수 있다.

또한, 본 발명의 약제학적 조성물은 담체, 부형제 또는 희석제를 추가로 포함할 수 있다. 담체, 부형제 또는 희석제로는 락토즈, 텍스트로즈, 수크로스, 솔비톨, 만니톨, 자일리톨, 에리스리톨, 말티톨, 전분, 아카시아 고무, 알지네이트, 젤라틴, 칼슘 포스페이트, 칼슘 실리케이트, 셀룰로오즈, 메틸 셀루로오즈, 하이드록시 프로필 메틸 셀룰로오즈, 미정질 셀룰로오즈, 폴리비닐 피롤리돈, 물, 메틸히드록시벤조에이트, 플로필히드록시벤조에이트, 프로필히드록시벤조에이트, 탈크, 마그네슘 스테아레이트, 이산화규소 등의 광물 등이 사용될 수 있다.

본 발명에 따른 약제학적 조성물의 투여량은 약제학적으로 유효한 양이어야 한다. 본 발명에서의 용어, '약제학적으로 유효한 양'은 의학적 치료에 적용 가능한 합리적인 수혜/위험 비율로 질환을 예방 또는 치료하기에 충분한 양을 의미하며, 유효 용량 수준은 제제화 방법, 환자의 상태 및 체중, 환자의 성별, 연령, 질환의 정도, 약물형태, 투여경로 및 기간, 배설 속도, 반응 감응성 등과 같은 요인들에 따라 당업자에 의해 다양하게 선택될 수 있다. 유효량은 당업자에게 인식되어 있듯이 처리의 경로, 부형제의 사용 및 다른 약제와 함께 사용할 수 있는 가능성에 따라 변할 수 있다.

본 발명의 약제학적 조성물은 마우스, 가축, 인간 등의 포유동물에 다양한 경로를 통해 투여될 수 있다. 투여의 모든 방식은 예상될 수 있으며, 예를 들어 경구, 비경구, 정맥내, 진피내, 및 피하 주사에 의해 투여될 수 있다.

다른 하나의 양태로, 본 발명은 상기 비만세포 과립 분비 억제용 조성물을 포함하는 알레르기성 질환의 예방 또는 개선용 식품 조성물을 제공한다.

상기 식품 조성물은 본 발명의 목적에 따라 기능성 식품일 수 있는바, 상기 '기능성 식품'은 식품의 생체 조절 기능을 강조한 식품으로 물리적, 생화학적, 생물공학적인 방법을 이용하여 특정 목적에 작용 및 발현하도록 부가가치를 부여한 식품이다. 이러한 기능성 식품의 성분은 생체 방어와 신체 리듬의 조절, 질환의 방지 및 회복에 관계하는 신체 조절 기능을 생체에 대하여 충분히 발휘하도록 설계하여 가공하게 되며, 식품으로 허용 가능한 식품 보조 첨가제, 감미료 또는 기능성 원료를 함유할 수 있다.

본 발명에 따른 비만세포 과립 분비 억제용 조성물을 첨가할 수 있는 식품 조성물로는, 예를 들어, 각종 식품류, 예를 들어, 음료, 껌, 차, 비타민 복합제, 건강보조 식품류 등이 있고 상기 음료에는 천연 과일주스, 과일주스 음료, 야채 음료 등이 포함된다.

본 발명의 식품 조성물은 공지의 제조방법에 따라 타정, 정제, 과립, 분말, 캡슐, 액상의 용액, 환 등의 제형으로 제조될 수 있다.

또한, 본 발명의 식품 조성물은 통상의 여러 가지 향미제, 천연 탄수화물 등을 추가로 함유할 수 있다. 향미제로는 타우마틴, 스테비아 추출물과 같은 천연 향미제가 있으며 사카린, 아스파르탐 등의 합성 향미제를 사용하기도 한다. 상술한 천연 탄수화물은 포도당, 과당과 같은 모노사카라이드, 말토스, 수크로스와 같은 디사카라이드, 덱스트린, 사이클로덱스트린과 같은 폴리사카라이드, 자일리톨, 소르비톨, 에리트리톨과 같은 당알콜 등을 포함할 수 있다. 이 외에도 본 발명의 식품 조성물은 여러 가지 영양제, 비타민, 광물(전해질), 합성 풍미제나 천연 풍미제 등의 풍미제, 착색제, 중진제(치즈, 초콜릿 등), 펙트산 및 그의 염, 알긴산 및 그의 염, 무수 구연산과 같은 유기산, 보호성 콜로이드 증점제, pH 조절제, 안정화제, 방부제, 글리세린, 알코올, 탄산 음료에 사용되는 탄산화제, 천연 과일 주스, 과일 주스 음료 및 야채 음료 제조를 위한 과육 등 식품학적으로 허용 가능한 식품 보조 첨가제를 추가로 함유할 수 있다. 이러한 첨가제는 독립적으로 또는 조합하여 사용될 수 있다.

다른 하나의 양태로, 본 발명은 상기 비만세포 과립 분비 억제용 조성물을 포함하는 알레르기성 질환의 예방 또는 개선용 의약외품 조성물을 제공한다.

본 발명의 조성물은 알레르기성 질환의 예방 또는 개선을 목적으로 의약 외품 조성물에 첨가될 수 있다. 본 발명에 따른 비만세포 과립 분비 억제용 조성물을 의약외품 첨가물로 사용할 경우, 상기 13종의 식물 추출물이 그대로 첨가되거나 다른 의약외품 또는 의약외품 성분과 함께 사용될 수 있고, 통상적인 방법에 따라 적절하게 사용될 수 있다.

유효 성분의 혼합양은 사용 목적(예방, 건강 또는 치료적 처치)에 따라 적합하게 결정될 수 있다. 바람직하게는, 상기 의약외품 조성물은 소독청결제, 샤워폼, 가그린, 물티슈, 세제비누, 핸드워시, 가습기 충진제, 마스크, 연고제, 코팅제 또는 필터충진제의 제조에 사용될 수 있다.

다른 하나의 양태로, 본 발명은 상기 비만세포 과립 분비 억제용 조성물을 포함하는 알레르기성 질환의 예방 또는 개선용 화장료 조성물을 제공한다. 본 발명에 따른 화장료 조성물에는 pH 조절제, 향료, 유화제, 방부제 등을 필요에 따라 부가하여 통상의 화장료 제조 방법으로 용액, 현탁액, 유탁액, 페이스트, 겔, 크림, 로션, 파우더, 비누, 계면활성제 함유 클린싱, 오일, 분말 파운데이션, 유탁액 파운데이션, 왁스 파운데이션, 크림, 에센스 및 스프레이 등으로 제형화될 수 있다. 조성물은 예컨대 항산화제, 안정화제, 용해화제, 비타민, 안료, 향료 등의 통상적인 보조제, 및 담체를 포함하지만 이에 제한되지 아니한다.

제형이 페이스트, 크림 또는 겔인 경우에는 담체 성분으로서 동물성유, 식물성유, 왁스, 파라핀, 전분, 트라칸트, 셀룰로오스 유도체, 폴리에틸렌 글리콜, 실리콘, 벤토나이트, 실리카, 탈크 또는 산화아연 등이 이용될 수 있지만 이에 제한되지 아니한다. 제형이 파우더 또는 스프레이인 경우에는 담체 성분으로서 락토오스, 탈크, 실리카, 알루미늄 히드록시드, 칼슘 실리케이트 또는 폴리아미드 파우더가 이용될 수 있고, 특히 스프레이인 경우에는 추가적으로 클로로플루오로히드로카본, 프로판/부탄 또는 디메틸 에테르와 같은 추진체를 포함할 수 있지만 이에 제한되지 아니한다. 제형이 계면-활성제 함유 클린징인 경우에는 담체 성분으로서 지방족 알코올 설페이트, 지방족 알코올 에테르 설페이트, 설포숙신산 모노에스테르, 이세티오네이트, 이미다졸리늄 유도체, 메틸타우레이트, 사르코시네이트, 지방산 아미드 에테르 설페이트, 알킬아미도벤타인, 지방족 알코올, 지방산 글리세리드, 지방산 디에탄올아미드, 식물성 유, 라놀린 유도체 또는 에톡실화 글리세롤 지방산 에스테르 등이 이용될 수 있지만 이에 제한되지 아니한다.

다른 하나의 양태로, 본 발명은 일본잎갈나무(Larix leptolepis), 다릅나무(Maackia amurensis), 산괴불주머니(Corydalis speciosa), 짚신나물(Agrimonia pilosa), 만삼(Codonopsis pilosula), 버드나무(Salix koreensis), 산가막살나무 (Viburnum wrightii), 굴피나무(Platycarya strobilacea), 족제비싸리(Amorpha fruticosa), 돌배나무(Pyrus pyrifolia), 비수리(Lespedeza cuneata), 물양지꽃(Potentilla cryptotaeniae), 및 눈갯버들(Salix graciliglans)로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상을 마쇄하는 단계, 상기 마쇄물을 물, 유기용매 또는 이들의 혼합용매로부터 선택된 용매로 추출하고 건조시키는 단계, 상기 건조물에 물, 유기용매 또는 이들의 혼합용매로부터 선택된 용매를 가하여 용해시키는 단계를 포함하는 일본잎갈나무, 다릅나무, 산괴불주머니, 짚신나물, 만삼, 버드나무, 산가막살나무, 굴피나무, 족제비싸리, 돌배나무, 비수리, 물양지꽃, 및 눈갯버들로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 추출물 제조방법을 제공한다.

본 발명에 따른 13종 식물 추출물은 1 단계로 본잎갈나무, 다릅나무, 산괴불주머니, 짚신나물, 만삼, 버드나무, 산가막살나무, 굴피나무, 족제비싸리, 돌배나무, 비수리, 물양지꽃, 또는 눈갯버들을 마쇄하는 과정을 포함한다. 바람직하게는 일정 시간 건조시켜 마쇄한다. 2 단계로 상기 마쇄물을 물, 유기용매 또는 이의 혼합용매를 이용하여 추출함으로써 수득할 수 있고, 당 분야에서 공지되 바와 같은 냉침 추출, 가열 추출, 초음파 추출, 냉각 추출 등 다양한 추출법에 따라 추출할 수 있다. 추출 방법은 특별히 제한되지 않고, 유효 성분이 파괴되지 않거나 최소화된 조건에서 실온 또는 가온하여 추출할 수 있다. 아울러, 당 분야에서 공지된 바와 같이 열풍 건조, 동결 건조, 진공 건조 등 다양한 건조법에 따라 건조할 수 있다. 3단계로 상기 건조물에 물, 유기용매 또는 이들의 혼합용매로부터 선택된 용매를 가하여 용해시켜 13종의 식물 추출물을 수득한다.

본 발명의 구체적인 실시예에 따르면, 천연물 (100g)에 무수 메탄올 1000ml를 가하여 환류 냉각기가 달린 추출기에서 80℃에서 2시간 동안 가온 추출하였다. 추출물을 여과한 후 남은 잔사물(Residue)을 위와 같은 방법으로 1회 이상 더 추출하고, 얻은 추출액을 합하여 감압농축한 후 동결건조하여 건조 추출물을 수득하였다.

추출 및 용해에 사용될 수 있는 유기 용매에는, 에탄올, 메탄올, 이소프로판올, 부탄올, 에틸렌, 아세톤, 헥산, 에테르, 클로로포름, 에틸아세테이트, 부틸아세테이트, 디클로로메탄, N, N-디메틸포름아미드(DMF), 디메틸설폭사이드(DMSO), 1,3-부틸렌글리콜, 프로필렌글리콜 또는 이들의 혼합용매가 있으며, 바람직하게는 메탄올, 에탄올 등의 C₁~C₄의 저급 알코올 사용할 수 있으며, 본 발명의 구체적인 실시예에서는 메탄올을 사용하였다.

본 발명에 따른 비만세포의 과립 분비 억제용 조성물은 알레르기성 질환의 예방, 개선, 치료에 효과적이므로 알레르기성 질환의 개선, 예방 또는 치료용 약제학적 조성물, 식품 조성물, 의약외품 조성물, 및 화장료 조성물 등으로 사용될 수 있다.

도 1은 생체 내 비만세포의 활성기작을 도식화한 것으로, 비만세포에서 IFCeRI 에 IgE 가 부착하고 알레르겐이 교차한 후 세포 내에서 탈과립이 일어나는 일련의 신호기작 과정을 도식화한 것이다.
도 2는 식물 추출물의 과립 분비 형성 저해능을 알아보기 위한 베타-헥소사미니다아제(β-hexosaminidase) 저해율 분석 결과 50% 이상의 저해 효과를 보인 천연물 식물 추출물들을 도시한 것이다. 도 2하단의 숫자는 표 1의 일련번호를 제시한 것이다.
도 3은 생후 7주의 Nc/Nga 암컷 마우스에 DNCB 용액을 도포하여 아토피성 피부염을 유발시킨 뒤, 일본잎갈나무 추출물을 도포한 군, 음성 대조군(vechicle), 및 양성대조군(dex.)의 혈청 내 IgE 농도를 나타낸 것이다.
도 4는 NC/Nga mice의 조직을 생검하여, Toluidin Blue로 염색한 후, 염색된 비만세포(상단)와 그 수(하단)를 나타낸 것이다.

이하，본 발명의 이해를 돕기 위하여 바람직한 실시예를 제시한다. 그러나 하기의 실시예는 본 발명을 더욱 쉽게 이해하기 위하여 제공되는 것일 뿐，실시예에 의하여 본 발명의 내용이 한정되는 것은 아니다. 아울러, 본 발명에 개시된 모든 문헌은 참조로서 통합된다.

실시예 1: 식물로부터 천연물 추출물의 제조

본 실험에 사용한 모든 식물은 한국식물추출물 은행에서 구입하였다. 구입한 식물(100g)을 정제수로 세척하고 건조한 다음에 무수 메탄올 1000ml를 가하여 환류 냉각기가 달린 추출기(모델명:HB 4 basic, 제조사:IKA)에서 80℃에서 2시간 동안 가온추출하였다. 추출물을 Whatman No.2여지로 여과한 후 남은 잔사물(Residue)을 위와 같은 방법으로 1회 이상 더 추출하고, 여과된 추출액을 합하여 감압농축(모델명:Rotavapor, 제조사:Buchi, 온도:40℃)한 후 동결건조(모델명:FD5518, 제조사:본듸로, 온도:-45℃, 압력:50 mTorr)하여 건조추출물을 수득하였다. 모든 식물 추출물들은 이와 동일한 방법으로 추출하였다. 본 실험에 사용한 87가지의 식물명, 이 식물이 속하는 과명 및 추출한 식물의 부위를 하기 표 1에 기재하였다.

실험예 1: RBL -2 H3 세포에서 과립분비 저해 효과

1.1. RBL -2 H3 세포 준비 및 처리

RBL-2H3 세포는 ATCC에서 구입하였으며, 불활성화시킨 10% 태아 소 혈청, 항생물질 4mM glutamine, 50U/ml penicillin, 및 50g/ml streptomycin)이 들어간 DMEM 배지가 깔린 플레이트(100 mm dish)에서 배양하였다. 계대배양을 위해 배지를 흡입한 후 PBS 2 ml을 넣고 피펫팅하여 세포를 디시(dish) 벽으로부터 분리하여 1,000×g에서 5분간 원심분리하여 세포를 모은 후, 새로운 배지를 넣어 피펫팅하여 세포 펠렛을 분산하여 새로운 배양 플레이트에 넣고 37℃, 5%의 CO₂ 가스가 공급되는 배양기 내에서 배양하였다. 실험에 사용된 DNP-IgE 항체, DNP-BSA는 SIGMA사에서 구입하여 사용하였다. RBL-2H3 세포의 플레이트에서 배지를 흡입한 후 PBS를 넣어 세척한 후, 0.25% Trysin-EDTA 3ml을 넣고, 5분간 5%의 CO₂ 가스가 공급되는 배양기 내에서 배양하였다. 세포를 플레이트 벽으로부터 떼어낸 후 세포수를 헤마사이토미터로 측정하여 2× 10⁵ cell/well의 농도로 새로운 배지에 분산하여 접종하였다. 24시간 후 DNP-IgE 항체 10ng/ml을 첨가한 후 5% 탄산가스 배양기에서 3시간 동안 배양하였다. 반응 후 배지를 제거하고 PBS로 3회 세정한 후 Tyrodes's buffer(10mM Hepes, 130mM NaCl, 5mM KCl, 1.4mM CaCl₂, 1mM MgCl₂, 5.6mM glucose, and 0.1% BSA, pH 7.4)에 87가지의 식물 추출물을 각각 넣고 30분간 반응시킨 후 0.2ug/ml DNP-BSA를 첨가한 후 20분간 배양기에서 반응시키고, 반응의 정지를 위해서 얼음 위에 10분간 플레이트를 올려놓은 후, 상등액을 회수하여 베타-헥소사미니다아제(β-hexosaminidase) 방출을 저해하는지 여부를 측정하였다.

1.2. 베타-헥소사미니다아제(β-hexosaminidase) 측정

베타-헥소사미니다아제(β-hexosaminidase) 방출은 상등액 50ul와 Citrate buffer (0.1M citrate, pH 4.5)에 1.3 mg/ml의 p-nitrophenyl-N-acetyl-β-D-glucosaminide를 포함하는 기질용액(substrate solution) 동일 양 (50ul)을 37°C 배양기에서 90분 동안 반응시킨 후, 0.2M glycine (pH 10.7) 150ul 을 이용하여 반응을 중단시킨 후, 405nm에서 측정하였다. 실험은 독립적으로 적어도 3번 이상 반복하여 수행하였으며, 분석은 SPSS 10.0 프로그램의 one-way analysis of variance (ANOVA)를 통해 수행하였으며, P<0.05 일 때 통계적으로 유의하다고 판단하였다. 하기 실험식에 따라 베타-헥소사미니다아제(β-hexosaminidase) 저해율을 계산하였다.

[베타-헥소사미니다아제(β-hexosaminidase) 저해율]

β- hexosaminidase inhibition (%)=(1-(T-B-N/C-N))*100

Control(C) : DNP-BSA(+), test sample (-)

Test (T) : DNP-BSA(+), test sample (+)

Blank (B) : DNP-BSA(-), test sample (+)

Normal (N) : DNP-BSA(-), test sample (-)

그 결과는 하기 표 2에 나타냈으며, 표 2의 결과에서 비만세포 과립분비 저해효과가 50% 이상인 식물 추출물들은 도 2에 별도로 표기하였다.

상기 표 2에 나타난 바와 같이, 식물 추출물의 RBL-2H3 세포에서의 베타-헥소사미니다아제(β-hexosaminidase) 저해효과를 분석한 결과 총 87종의 식물 추출물 중 16종(PL65, PL18, PL55, PL73, PL39, PL35, PL46, PL54, PL09, PL19, PL26, PL68, PL27, PL53, PL40, PL17)이 50%이상 베타-헥소사미니다아제(β-hexosaminidase) 저해효과를 보였으며, 이중 일본잎갈나무 추출물(줄기, PL65)을 포함해 7종(PL65, PL18, PL55, PL73, PL39, PL35, PL46, PL54)이 80% 이상의 비만세포의 과립분비 저해 효과를 나타냄을 확인할 수 있었다.

실험예 2 : 아토피 피부염 증상 완화 효과

2.1. : 실험동물

본 실험에 사용된 모든 동물 실험은 경기바이오센터에서 운영하는 동물실험윤리위원회의 승인 후 수행하였다. 생후 7주의 Nc/Nga 암컷 마우스는 중앙실험동물(Seoul, Korea)에서 구입하여 사용하였다. 모든 마우스는 온도 24±2℃, 습도 50±10%로 최적환경 조건을 유지시킨 실험실에서 12시간 명암주기로 사육하였으며, 먹이는 자유롭게 먹을 수 있게 하였다. 실험 전 1주 동안 검역 및 순화하여 마우스 생후 8주부터 실험을 시작하였다.

2.2. 아토피성 피부염 유발

마우스의 귀 하단부에서부터 꼬리 상단부 부위까지의 털을 제모 크림을 이용하여 제모한 뒤, 1일 후부터 2,4-dinitrochlorobenzene(DNCB) 용액을 200㎕씩 도포하였다. 1% DNCB 용액(acetone : olive oil = 4 : 1)으로 1주간 3회 1차 도포하였고, 0.2% DNCB 용액으로 3회씩 3주간 2차 도포하여 피부염을 유발하였다.

2.3. 시험 물질 제조 및 처리

시험 물질은 각각 EtOH : H₂O : butyleneglycol = 1 : 4 : 5로 섞은 용매에 0.1%로 녹여 1일 1회 100㎕씩 20일간 도포하였다. 음성 대조군으로 용매를, 양성 대조군으로 덱사메타손(dexamethasone)을 용매에 0.1%으로 녹인 것을 사용하였으며, 시험 물질과 동일한 방법으로 도포하였다.

2.4. 혈청 IgE 측정.

혈청 IgE을 측정하기 위하여, 시험 물질의 처리 시작시와 종료시에 미세관을 이용하여 마우스 눈에서 혈액을 채취하였다. 혈액 채취 후 1시간 동안 상온에서 보관 후 1000g, 4℃ 조건에서 원심 분리하여 혈청을 분리하였고, 사용 전까지 -70℃ 냉동고에 보관하였다. 혈청 내 IgE 수준 측정은 BD Bioscienc에서 제공하는 BD OptEIA^TM ELISA set을 사용하여 제시된 방법에 따라 수행하였다. 시료 도포 4주 후에 혈청 내의 IgE양을 측정한 결과 음성 대조군과 비교하여 양성 대조군과 일본잎갈나무 식물 추출물 0.1% 처리군에서 IgE양이 유의하게 감소하였다.

2.5. 조직 병리학적 검사.

피부조직을 관찰하기 위하여 시험 물질 처리 종료일에 마우스의 귀 하단부 피부 조직을 적출하였다. 적출한 조직은 10% 포르말린 용액에서 고정시킨 후, 파라핀 포매, 조직 절편 및 염색 과정을 중앙실험동물에 의뢰하였다. Hematoxylin & Eosin으로 염색한 조직 절편은 광학현미경으로 200배 관찰하여 피부 조직의 상태를 육안으로 확인하였다. 또한 Toluidine blue 염색을 통해 비만세포를 염색하여 광학 현미경으로 100배 확대하여 관찰하였고, 임의적으로 5 부위를 선택하여 비만세포 수를 측정한 후 평균값으로 통계 처리하였다. NC/Nga mice의 조직을 생검하여, Toluidin Blue로 염색한 후, 비만세포의 수를 측정하였다. 각 슬라이드의 5곳을 임의적으로 선택 후 세포를 측정하고 평균값으로 통계 처리한 결과, 음성 대조군과 비교하여 양성 대조군 0.1% 처리군, 일본잎갈나무 추출물 0.1% 처리군에서 유의한 감소가 나타났다.

Claims

일본잎갈나무(Larix leptolepis), 다릅나무(Maackia amurensis), 산괴불주머니(Corydalis speciosa), 짚신나물(Agrimonia pilosa), 만삼(Codonopsis pilosula), 버드나무(Salix koreensis), 산가막살나무 (Viburnum wrightii), 굴피나무(Platycarya strobilacea), 족제비싸리(Amorpha fruticosa), 돌배나무(Pyrus pyrifolia), 비수리(Lespedeza cuneata), 물양지꽃(Potentilla cryptotaeniae), 및 눈갯버들(Salix graciliglans)로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 추출물을 유효성분으로 포함하는 비만세포의 과립 분비 억제용 조성물.
제1항에 있어서, 상기 일본잎갈나무 추출물은 줄기에서, 다릅나무 추출물은 잎 또는 줄기에서, 산괴불주머니 추출물은 전초에서, 짚신나물 추출물은 전초에서, 만삼 추출물은 지상부에서, 버드나무 추출물은 줄기에서, 산가막살나무 추출물은 잎, 줄기, 또는 꽃에서, 굴피나무 추출물은 화서에서, 족제비싸리는 잎 또는 줄기에서, 돌배나무는 잎 또는 줄기에서, 비수리 추출물은 전초에서, 물양지꽃 추출물은 전초에서, 및 눈갯버들 추출물은 꽃에서 추출한 것을 특징으로 하는 조성물.
제1항에 있어서, 상기 추출물은 메탄올 추출물인 것을 특징으로 하는 조성물.
제1항에 있어서, 상기 조성물은 비만세포의 과립 내 히스타민, 베타-헥소사미니다아제(β-hexosaminidase), 또는 류코트리엔의 분비를 억제하는 것을 특징으로 하는 조성물.
제1항의 조성물을 유효성분으로 포함하는 알레르기성 질환 예방 또는 치료용 약제학적 조성물.
제1항의 조성물을 유효성분으로 포함하는 알레르기성 질환 개선 또는 예방용 식품 조성물.
제1항의 조성물을 유효성분으로 포함하는 알레르기성 질환 개선 또는 예방용 의약외품 조성물.
제1항의 조성물을 유효성분으로 포함하는 알레르기성 질환 개선 또는 예방용 화장료 조성물.
제5항 내지 제8항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 알레르기성 질환은 천식, 두드러기, 또는 아토피인 것을 특징으로 하는 조성물.
일본잎갈나무(Larix leptolepis), 다릅나무(Maackia amurensis), 산괴불주머니(Corydalis speciosa), 짚신나물(Agrimonia pilosa), 만삼(Codonopsis pilosula), 버드나무(Salix koreensis), 산가막살나무 (Viburnum wrightii), 굴피나무(Platycarya strobilacea), 족제비싸리(Amorpha fruticosa), 돌배나무(Pyrus pyrifolia), 비수리(Lespedeza cuneata), 물양지꽃(Potentilla cryptotaeniae), 및 눈갯버들(Salix graciliglans)로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상을 마쇄하는 단계;
상기 마쇄물을 물, 유기용매 또는 이들의 혼합용매로부터 선택된 용매로 추출하고 건조시키는 단계; 및
상기 건조물에 물, 유기용매 또는 이들의 혼합용매로부터 선택된 용매를 가하여 용해시키는 단계를 포함하는 일본잎갈나무, 다릅나무, 산괴불주머니, 짚신나물, 만삼, 버드나무, 산가막살나무, 굴피나무, 족제비싸리, 돌배나무, 비수리, 물양지꽃, 및 눈갯버들로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 추출물 제조방법.
제10항에 있어서, 상기 유기용매는 에탄올, 메탄올, 이소프로판올, 부탄올, 에틸렌, 아세톤, 헥산, 에테르, 클로로포름, 에틸아세테이트, 부틸아세테이트, 디클로로메탄, N, N-디메틸포름아미드(DMF), 디메틸설폭사이드(DMSO), 1,3-부틸렌글리콜, 또는 프로필렌글리콜인 것을 특징으로 하는 제조방법.