KR100999283B1 - 항염 및 피부자극완화 효과가 있는 울금, 시호 및 버드나무의 고체 발효 혼합 추출물을 함유한 화장료 조성물 - Google Patents

Abstract

본 발명은 울금, 시호 및 버드나무의 고체발효 혼합추출물을 함유하는 화장료조성물을 제공한다. 본 발명의 화장료 조성물은 항염 및 피부자극완화 효과가 있다.

항염, 울금, 시호, 버드나무, 고체발효

Description

항염 및 피부자극완화 효과가 있는 울금, 시호 및 버드나무의 고체 발효 혼합 추출물을 함유한 화장료 조성물 {Cosmetic composition comprising mixture extracts of solid fermentation products of Curcuma longa Linn, Bupleurum falcatum L. and Salix koreensis Andersson, having anti-inflammation and calming effect}

본 발명은 화장료 조성물에 관한 것이다.

피부 질환은 대부분의 질환과 마찬가지로 염증 반응을 동반하며, 대표적인 피부 질환인 알레르기 접촉피부염, 건선, 아토피성 피부염 등은 면역세포인 T세포가 매개하는 염증성 질환이다. 따라서 주요 피부 질환에 대한 관리 및 치료에는 반드시 항염증제가 응용되어야 한다. 이러한 염증성 질환을 치료하기 위해 스테로이드성 항염증 제제가 사용되고 있으나 스테로이드성 제제들은 여러 가지 많은 부작용을 나타내고 있어 그 사용을 제한하고 있다.

따라서, 현 시장에서는 염증에 관련된 산화질소합성효소(NOS)를 직접적으로 억제하여 알러지로부터 피부를 보호할 뿐만 아니라, 염증으로부터 피부를 보호하는 효과도 있는 천연 식물을 찾아내는 것이 요구되고 있다.

한편, 울금(Curcuma longa Linn)의 색소성분 쿠루쿠민은 뛰어난 항산화 작용이 있는 것으로 보고 되었으며, 자연적으로 체내에서 테토라히도로 쿠루쿠민이라는 더욱 강력한 항산화 작용을 보이는 물질로 전환되는 것으로 알려져 있다.

시호(Bupleurum falcatum L.)는 미나리과에 속하며, 기를 위로 끌어 올려주고 간의 기가 뭉쳐진 것을 풀어주는 작용으로 소양경에 나쁜 기운이 있는 것을 풀어 주는 효과가 있는 것으로 알려져 있다.

버드나무(Salix koreensis Andersson)는 아스피린의 주요작용 성분과 비슷한 성분(Salicyl)을 가지고 있어서 열을 내리게 하고 염증과 통증을 완화하는 작용을 한다고 알려져 있다.

지금까지 염증 및 피부자극 완화용 조성물을 찾기 위해 여러 가지 시도가 있었으나, 위 울금, 시호 및 버드나무의 고체 발효를 통한 혼합 추출물의 염증 예방 및 완화, 또는 피부자극완화 효과는 개시되지 않았다.

이에 본 발명자들은 울금, 시호 및 버드나무의 고체 발효를 통한 혼합 추출물이 항염 및 피부자극완화 효과가 있고 화장료 조성물로 적합함을 알아내어 본 발명을 완성하였다.

이하 본 발명을 더욱 상세히 설명한다.

본 발명은 울금, 시호 및 버드나무의 고체 발효를 통한 혼합 추출물을 함유하는 화장료 조성물을 제공한다.

본 발명에 사용되는 울금, 시호, 버드나무는 직접 재배하여 건조시킨 것을 사용하거나, 국내 재래시장 또는 한약재를 파는 곳에서 직접 구입하여 사용할 수 있다. 재배되거나 구입된, 울금, 시호 및 버드나무는 세척하여 건조시킨 후, 이를 세절한 후에 본 발명의 혼합 추출물 제조에 사용될 수 있다.

본 발명의 조성물에 함유되는 혼합 추출물은 통상의 고체 발효를 거친 후, 통상의 추출용매로 통상의 추출방법에 의해 제조된다.

예를 들어, 본 발명의 혼합 추출물은 다음과 같이 제조된다.

울금, 시호, 버드나무를 1: 1: 1 중량비(wt/wt/wt)로 구성하여 건조 과정을 거친 후, 미생물 오염을 제거하고 원료의 활성성분 용출이 용이하게 되도록 80 내지 100℃에서 30분 내지 1시간 동안 습식 열처리를 하고, 30 내지 60℃ 및 pH 5.5 내지 8.5, 통성 혐기적인 발효 조건에서 바실러스속 미생물을 이용하여 고체 발효 하여 고분자 물질을 생산한다. 이후 제균 단계를 거쳐 정제수와 유기용매로서 저급 알코올 특히 에탄올을 1:1 내지 5의 부피비로 혼합 첨가하여 통상의 열수 또는 통상의 초음파 추출 방법을 사용하여 교반하여 추출액을 회수하고 이를 농축하여 정제하였다. 더욱 정제하고자 할 때는 4℃에서 분자량 10kD의 막 필터를 이용한 투석을 통해 저분자량의 물질을 제거할 수 있다. 분리된 용액의 부피와 동일한 부피의 증류수를 첨가하여 혼합 추출물의 점도를 낮춘 후 동결 건조하여 건조중량을 측정하여 생산성을 결정하였다.

본 발명의 혼합추출물 제조시 사용되는 바실러스속 균주는 그람 양성균으로서 내생 포자 형성능이 있으며, 장간균의 형태를 가지고 있다. 또한 호기성 또는 통성혐기성 조건에서 생장이 가능하지만 혐기적인 조건에서는 생장이 불가능하며 카탈라아제 생산 및 카제인과 젤라틴, 전분 분해능의 특징을 가진다. 생장 조건으로서는 7% 식염수 조건에서 생장이 가능하며 발효 조건인 약 45℃ 및 약 pH 5.0 내지 7.5에서 생장이 활발하다. 또한 글루코오스, 아라비노오스, 크실로오스, 만니톨을 이용하여 산을 생성할 수 있는 특징을 가진다.

이러한 바실러스속 균주에는 바실러스 서브틸리스(Bacillus subtilis, ATCC), 바실러스 낫토(Bacillus natto, ATCC), 바실러스 메가테리움 (Bacillus megaterium, ATCC), 바실러스 리케니포미스 (Bacillus licheniformis, ATCC), 바실러스 퍼밀러스 (Baciilus pumilus, ATCC)가 대표적으로 잘 알려져 있다.

본 발명의 혼합 추출물에서, 울금, 시호 및 버드나무는 다양한 중량비로 혼합될 수 있으며, 울금, 시호 및 버드나무가 각각 1: 1: 1 중량비(w/w/w)인 것이 바 람직하다.

본 발명의 혼합 추출물 제조에 사용되는 용매는 당업자에게 알려진 추출용매이면 어느 것이든 가능하다. 예를 들어, 물, 메탄올, 에탄올, 프로판올, 부탄올과 같은 C1~C4의 알코올, 또는 함수 C1-C4 알코올, 부틸렌글리콜과 같은 C1~C6의 글리콜, 함수 C1~C6의 글리콜, 에틸아세테이트, 헥산, 벤젠, 디에틸에테르, 디클로로메탄 등이 있으며, 단일 또는 2종 이상의 혼합 용매를 혼합하여 사용할 수 있다. 바람직한 천연 식물 추출용매는 에탄올을 포함하는 C1~C4의 알코올, 함수 C1~C4알코올이다.

본 발명의 화장료 조성물은 항염증 또는 피부자극완화 효과가 있으므로, 항염증용 또는 피부자극완화용의 기능성 화장품으로 사용가능하다.

또한 본 발명의 화장료 조성물은 현재 시판되는 화장품, 화장용비누, 화장용 세안제의 제형을 가진다. 예를 들어, 본 발명의 화장료 조성물은 화장수(스킨로션), 영양로션, 영양크림, 맛사지 크림, 에센스, 팩 또는 유화형 화운데이션와 같은 화장품제형일 수 있다. 또한, 본 발명의 화장료 조성물은 유아전용 화장수(스킨로션), 로션, 크림, 자외선차단 로션 또는 자외선차단 크림과 같은 제형일 수 있다. 또한, 본 발명의 화장료 조성물은 유아전용 목욕 세정제, 샴푸 또는 비누와 같은 화장용 세정제의 제형일 수 있다.

이들 각 제형은 그 제형의 제제화에 필요한 적절한 각종의 기제와 첨가물을 함유할 수 있으며, 이들 성분의 종류와 양은 당업자에 의해 용이하게 선정될 수 있다.

또한 본 발명에 따른 항염 및 피부자극완화 효과를 가지는 화장료 조성물은 통상적인 사용방법에 따라 사용될 수 있으며, 사용자의 피부 상태 또는 취향에 따라 그 사용 횟수를 달리할 수 있다.

본 발명의 화장료 조성물에서, 혼합 추출물의 함량은 사용목적 및 사용자의 대상에 따라 다양하게 함유될 수 있다. 바람직한 혼합혼합 추출물의 함량은 화장료 조성물 총중량에 대하여 0.1 내지 5.0 중량% 이다.

본 발명의 화장료 조성물은 항염 및 피부자극완화 효과가 우수하다.

이하, 실시예, 비교예, 제제예 및 실험예를 들어 본 발명의 구성 및 효과를 상세히 설명하나, 본 발명이 이들로 한정되는 것은 아니다.

< 실시예 1> 천연 식물 혼합 추출물 제조

울금(현서약초시장) 30g, 시호(현서약초시장) 30g 및 버드나무(현서약초시장) 30g을 미생물 오염을 차단하고 활성성분이 용출되기 쉽게 하기 위해, 80 내지 100℃에서 1시간 동안 물중탕으로 습식 열처리하였다. 이후, 습식 열처리한 혼합물을 60℃ 온도에서, 제이인산칼륨 완충용액으로 pH 5.5로 조정한 완충용액을 혼합물 고형분 기준 10 중량%를 분산하여 통성 바실러스 서브틸리스(Bacillus subtilis, ATCC)를 1,000cfu/g 가 되도록 접종하여 24시간 동안 고체 발효하여 고분자 물질을 생산한 후 125℃, 30분동안 스팀 살균(고압멸균기, Sanyo)하는 제균 단계를 거쳤다. 생성된 고분자 물질을 포함한 고체 발효된 혼합물에 대해 4배 부피비(v/v)의 정제수로 60℃에서 1시간 동안 교반하고 추출액을 회수하고 이를 농축하여 1차 정제하였다. 분리된 용액의 부피와 동일한 부피의 증류수를 첨가하여 혼합 추출물의 점도를 낮춘 후 105℃ 오븐(dry oven, Sanyo)에서 3시간동안 건조하여, 건조 중량을 측정하였다. 그리고 감압농축기(Rotary evaporator,EYELA,Japan)를 이용하여 50℃에서 농축 후, 다시 정제수 200ml을 가한 후 동결건조하여 약 28g의 혼합 추출물을 제조하였다. 이중 1g을 각각 취하여 활성검색시료로 하였다.

< 비교예 1> 울금 혼합 추출물의 제조

울금, 시호 및 버드나무 대신에 울금 30g을 사용한 것을 제외하고는 실시예 1과 동일한 방법으로 추출하여 건조중량 10g을 얻었다.

< 비교예 2> 시호 혼합 추출물의 제조

울금, 시호 및 버드나무 대신에 시호 30g을 사용한 것을 제외하고는 비교예 1과 동일한 방법으로 하여 건조 중량 8.9g을 얻었다.

< 비교예 3> 버드나무 혼합 추출물의 제조

울금, 시호 및 버드나무 대신에 버드나무 30g을 사용한 것을 제외하고는 비 교예 1과 동일한 방법으로 하여 건조 중량 9.4g을 얻었다.

< 제제예 1> 화장수 제조

실시예1의 혼합 추출물을 함유하는 화장수 1kg을 하기 표의 조성으로 다음과 같은 방법으로 제조하였다.

하기 표에서, 혼합믹서기(Homogenizer, PT 6100, Kinematica)에 성분 11번에 성분 2, 3, 4 및 8번을 순서대로 투입하고 교반하여 25℃에서 용해시켰다. 그 후 성분 5번을 60℃로 가열하여 용해시킨 후 성분 10번을 투입, 교반하여 용해한 후 잔량의 성분 11번을 투입한다. 마지막으로 성분 1, 6, 7 및 9번을 25℃에서 투입하고 30분 교반한 뒤 72시간 숙성시켜 화장수를 제조하였다.

번호	원료	함량(중량%)
1	실시예1의 혼합 추출물	2.0
2	글리세린	3.0
3	부틸렌글리콜	3.0
4	프로필렌글리콜	1.0
5	피피지 -26- 부테스 -26/피이지-40 히드로게네이티드 캐스터오일	1.1
6	에탄올	8.0
7	트리에탄올아민	0.2
8	방부제	미량
9	색소	미량
10	향료	미량
11	정제수	to 100

< 제제예 2> 영양 로션 제조

실시예1의 혼합추출물을 함유하는 영양로션 1kg을 하기표의 조성으로 다음과 같은 방법으로 제조하였다.

즉 성분 2, 3, 4, 5 및 6번을 혼합믹서기(Homogenizer, PT 6100, Kinematica)에 투입하고 60℃에서 균질화한 후 성분 1, 7, 8 및 14번을 혼합하고 60℃에서 균질화한 후 성분 9번을 60℃에서 서서히 첨가하면서 균질화하였다. 그 후 성분 10, 11, 12, 13번을 투입하고 분산시켜 안정화시킨 후 72시간 숙성시켜 표제의 영양로션을 제조하였다.

번호	원료	함량(중량%)
1	실시예1의 혼합 추출물	2.0
2	시토스테롤	1.5
3	폴리글리세릴 2- 올레이트	1.2
4	세라마이드	0.2
5	세테아레스 -4	1.0
6	콜레스테롤	1.2
7	디세틸포스페이트	0.5
8	부틸렌글리콜	5.0
9	선플라워오일	3.0
10	카르복시비닐폴리머	0.2
11	산탄검	0.1
12	방부제	미량
13	향료	미량
14	정제수	to 100

< 제제예 3> 영양크림 제조

실시예 1의 혼합 추출물을 함유한 영양크림 1kg을 하기 표의 조성으로 다음과 같이 제조하였다.

번호	원 료	함량(중량%)
1	실시예1의 혼합 추출물	2.0
2	시토스테롤	1.5
3	폴리글리세틸 2- 올레이트	1.5
4	세라마이드	0.5
5	세테아레스 -4	1.8
6	콜레스테롤	2.5
7	디세틸포스페이트	0.5
8	부틸렌를리콜	4.0
9	선플라워오일	8.0
10	카르복시비닐폴리머	0.4
11	트리에탄올아민	0.4
12	방부제	미량
13	향료	미량
14	정제수	to 100

성분 2, 3, 4, 5 및 6번을 혼합믹서기(Homogenizer, PT 6100, Kinematica) 투입하고, 25℃에서 균질화한 비이온계 양친매성 지질과 성분 1, 7, 8, 및 14번을 혼합하고, 50℃에서 균질화 한 후 성분 9번을 서서히 첨가하여 균질화하였다. 그 후, 성분 10, 11, 12, 13번을 60℃에서 투입하고 분산시켜 안정화한 다음 72시간 숙성시켜, 표제의 영양크림을 제조하였다.

<제제예 4> 에센스 제제

실시예 1의 혼합 추출물을 함유한 에센스 1kg을 하기표의 조성으로 다음과 같이 제조하였다.

번호	원 료	함량(중량%)
1	실시예1의 혼합 추출물	2.0
2	시토 스테롤	1.5
3	씨12-20애씨드피이지-8에스텔	1.5
4	세라마이드	0.4
5	세테스-4	1.1
6	콜레스테롤	1.4
7	디세틸포스페이트	0.5
8	부틸렌글리콜	5.0
9	썬플라워씨드오일	12.0
10	사이클로메치콘	0.3
11	카르복시비닐폴리머	0.2
12	산탄검	0.1
13	방부제	미량
14	항료	잔량
15	정제수	to 100

성분 2, 3, 4, 5 및 6번을 혼합믹서기(Homogenizer, PT 6100, Kinematica)에 투입하고 25℃에서 균질화한 비이온계 양친매성 지질과 성분 1, 7, 8 및 15번을 혼합하고 균질화하여 마이크로플루이다이져를 통과시킨 후 이어 성분 9번을 서서히 첨가하여 균질화한 후 다시 마이크로플루이다이져에 재차 통과시켰다. 그 후, 성분 10, 11, 12, 13, 14번을 60℃에서 투입하고 분산시켜 안정화하고 72시간 숙성시켜 표제의 화장료 조성물인 에센스를 제조하였다.

< 실험예 1> 본 발명 혼합 추출물의 안전성 확인 실험

MTT 정량법은 생존세포에만 활성이 있는 미토콘드리아의 탈수소 효소작용에 의해 색소로 변하는 현상을 이용한다. 살아있는 세포수가 증가하면 시료중의 미토콘드리아 탈수소효소의 전체 활성이 증가하며, 이 효소 활성의 증가가 Formazan 색소의 생성 증가를 유도하기 때문에, Formazan 색소와 배지중의 대사활성이 있는 세포의 수와는 직선적인 상관관계를 나타내게 된다. 노란색의 수용성 Tetrazolium MTT은 미토콘드리아의 탈수소효소 작용에 의하여 보라색의 불용성 Formazan crystal로 환원되며, 이는 DMSO(dimethylsulfoxide,≥99.9%,Sigma) 용액에서 용해되어 570nm의 파장에서 흡광도를 나타낸다.

Human dermal fibroblast cell(cascade)(인간 피부 섬유아세포)을 3000~5000 cells/well의 농도로 하여 96 well plate에 씨딩(seeding)하였다. Medium은 FBS 10%를 함유한 DMEM (Dubelcco사 Modified Eagle Medium, Gibco)를 사용하였다. 24시간 후, 혼합 추출물을 농도별로 첨가하고, 37℃, 5% CO2에서 3일간 배양하였다. 상등액을 제거하고 0.5%(w/v) MTT 용액을 10ul/well씩 가한 후 4 시간 후에 MTT를 제거하고 DMSO를 첨가하여 570nm에서 흡광도를 측정하여 그 결과를 표 1과 도1에 나타내었다.

혼합 추출물의 농도 (ug/ml)	세포 생존율 (%)
	비교예1	비교예2	비교예3	실시예1
10	98	100	97	100
20	97	99	99	101
50	99	95	95	105
100	98	97	98	110

즉 피부 섬유아세포에 대하여 본 발명의 혼합 추출물은 독성이 없는 안전한 원료임을 알 수 있었다.

< 실험예 2> 본 발명 혼합 추출물의 항염증 효과 확인

리폭시게나제(5-LO, 5-lipoxygenase)는 리놀산, 리놀렌산, 아라키돈산과 같이 분자 내에 1,4-cis , cis-pentadiene(1,4-pentadiene) 구조를 갖는 불포화 지방산에 분자상 산소를　첨가하여 1,3-cis , trans-diene 5-hydroperoxide를 생성하는 산화효소로 아라키돈산으로부터 각종 염증 및 알러지성 질환에 관여하는 로이코트리엔(leucotriene) 생합성의 첫번째 반응에 관여하는 효소이다. 따라서 구조적, 메커니즘적으로 5-LO와 유사한 SLO(soybean lipoxygenase)를 이용하여 본 발명의 혼합 추출물의 리폭시게나제의 저해활성을 측정하여 항염 효과를 확인하였다.

리폭시게나제는 대두(soybean)에서 정제한 sigma사 제품을 사용하였으며 563 unit/ml로 희석하여 사용하였다. UV 통과 96 well plate에 Tris-HCl (100 mM, pH 8.5) 완충액(buffer) 155 ul에 시료(sample) 5ul와 20 ul의 효소액을 첨가하고 상온에서 5분 동안 방치하였다. 33 uM의 리노렌산(linolenic acid)(sigma, USA) 20 ul를 첨가하고 234 nm에서 200초 동안 흡광도의 변화를 측정하였다. 흡광도의 변화를 가지고 리폭시게나제 저해능을 측정하여 그 결과를 표2와 도2에 나타내었다.

혼합 추출물의 농도 (v/v)	LO inhibition activity (%)
	비교예1	비교예2	비교예3	실시예1	Quercetin
0.1	1.2	0.89	2.1	3.1	5.1
0.3	8.6	5.4	4.8	9.4	15.6
1.3	12.3	10.9	11	20.6	27.4
2.5	23	20.1	20.8	45	54

상기 표2에서 나타낸 바와 같이, 본 발명에 따른 울금, 시호, 버드나무의 고체 발효를 통한 혼합 추출물은 단일 물질인 quercetin과 비슷하게 높은 리폭시케나제 활성을 억제하는 효과를 나타내어 항염 효과가 우수함을 알 수 있었다.

< 실험예 3> 본 발명 혼합 추출물의 항염증 효과 확인

그람음성 박테리아의 세포 벽 구성성분인 Lipopolysaccharide(LPS)는 대식세포를 활성화시키기 때문에 염증 모델로 사용된다. 활성화된 대식세포는 TNF-α, 인터루킨(interleukin), prostaglandin E2 (PGE2)를 포함한 다양한 염증성 매개물질을 생산한다. PGE2는 포스포리파제(phospholipase)에 의해 인지질(phospholipid)로부터 아라키돈산(arachidonic acid)을 유리시키며 사이클로옥시게나제(cyclooxygenase) 경로를 거쳐 전환된다. 따라서, PGE2 생성 저해를 통해 항염증 효과를 평가하였다.

실험 방법으로서는 RAW 264.7 cell을 10% FBS를 포함하는 DMEM (Dubelcco‘s Modified Eagle Medium, Gibco) 배양액에 5 X 10⁴ cell/well의 농도로 96 well plate에 씨딩(seeding)하였다. 37℃, 5% CO2 조건에서 하루 동안 배양한 후, 무혈청 DMEM 배지로 3번 세척하였다. 그 후, 두 시간 동안 500uM 아스피린이 첨가된 배지로 배양하고, 시료와 1ug/ml LPS를 함께 넣고 20 시간을 더 배양하였다. 배양이 완료되면 배양액에 포함된 PGE2를 PGE2 enzyme-immunoassay kit를 이용하여 정량하여 그 결과를 표 3과 도 3에 나타내었다.

혼합 추출물의 농도 (ug/ml)	PGE2 inhibition(%)
	비교예1	비교예2	비교예3	실시예1	Quercetin
10	8.6	6.7	10.2	12.5	9.5
20	22.2	19.5	38.4	48.9	53
50	40.1	46.3	57.6	64.7	80
100	61.2	59.7	68	75

상기 표3에서 나타낸 바와 같이, 울금, 시호, 버드나무의 고체 발효를 통한 혼합 추출물은 RAW 264.7 cell에서, 농도의 증가에 따라 PGE2의 저해율이 증가하여 그 억제 효과가 우수함이 확인되었다.

< 실험예 4> 본 발명 혼합 추출물의 피부면역 강화 효과 확인

사이토카인(Cytokine)은 다양하고, 강력한 생물학적 활성을 가지고 있는 small- 또는 medium-sized proteins 혹은 glycoproteins로서, 특이적인 수용체를 가지고 있는 세포와 반응하여 작용을 나타낸다. 현재까지 적어도 60 종류의 다양한 사이토카인이 존재하는 것으로 알려져 있다. 인터루킨(Interleukin)와 Colony stimulating factors는 일반적으로 면역조절작용 및 도혈세포의 성장 조절작용을 담당하는 사이토카인이고, 인터페론(interferon)는 항바이러스작용 및 면역조절작용을 주로 하는 사이토카인이며, 케모카인(Chemokine)는 chemoattractant 및 성장조절작용을 주로 하는 사이토카인이다. 한편 성장인자(Growth Factors)는 결제조직의 성장 및 기능을 조절하는 작용을 하는 사이토카인이다.

실험 방법으로서 면역세포들이 배지 내에 분비하는 사이토카인인 Tumor necrosis factor-α(TNF-α)와 Interleukin-6 (IL-6)의 양을 ELISA kit 이용하여 측정하였다. 우선 사람 면역세포인 B cell(Raji)과 T cell(Jurkat)을 이용하여 DMEM (Gibco) 배지에서 10% FBS를 사용하여 세포의 농도를 1 X 10⁵cell/ml의 농도 정도를 배양시킨 후 이 배양배지를 원심 분리하여 상등액을 취한 다음 다양한 농도의 표준물질로서 TNF- α, IL-6들과 함께 37℃에서 30분간 배양후 405nm에서 흡광도를 측정하여 표준곡선을 작성하였다. ELISA kit를 이용하여 인간 면역세포인 B cell (Raji)과 T cell(Jurkat)에 시료 투여 후 얻어진 O.D 값을 비교하여 표준곡선에서 얻어진 값으로 cytokine의 양을 측정하여 그 결과를 표 4와 표 5에 나타내었다.

혼합 추출물의 농도 (ug/ml)	IL-6 생산량(pg/ml)
	비교예1	비교예2	비교예3	실시예1	대조군(용매)
10ug/ml	298.45	287.42	301.78	358.45	211.55
100ug/ml	570.48	562.24	580.52	690.68	211.55

혼합 추출물의 농도 (ug/ml)	TNF-α 생산량 (pg/ml)
	비교예1	비교예2	비교예3	실시예1	대조군(용매)
10ug/ml	534.37	520.21	518.59	620.38	485.37
100ug/ml	986.02	945.17	973.11	1150.57	485.37

면역 세포들이 배지내로 분비하는 사이토카인으로서 Iinterleukin 6 (IL-6)와 TNF-α의 양을 측정한 결과, 본 발명의 혼합 추출물을 첨가하였을 때 더 많은 양의 사이토카인이 생성된 것을 확인 할 수 있었다. 따라서, 본 발명의 혼합 추출물은 염증성 피부의 보호 효과가 있음이 확인되었다.

< 실험예 5> 본 발명에 따른 화장수의 피부 자극성 및 진정 효과 확인

건강한 20대 내지 30대 성인 남녀 20명(남자 10명, 여자 10명)의 전박부에 제제예 1에서 제조한 화장수를 일정량(10m/5㎠)씩 도포하고, 그 외의 부위를 알루미늄 호일로 차폐하였다. 30분 후에, 자외선 조사기를 이용하여 장파장 자외선을 10.2J/㎠ 의 용량으로 조사하고 24시간 후에, 피부 상태(홍반, 부종, 구진 등)를 관찰하였다. 육안으로 관찰 결과 피부에 홍반 등의 부작용이 발생되지 않아 상기 화장수는 광독성이 없으며, 피부 진정 효과가 있음을 확인할 수 있었다.

< 실험예 6> 본 발명에 따른 영양 로션의 피부 자극성 및 진정 효과 확인

건강한 20대 내지 30대 성인 남녀 20명(남자 10명, 여자 10명)의 전박부에 제제예 2에서 제조한 영양 로션을 일정량(10m/5㎠)씩 도포하고, 그 외의 부위를 알루미늄 호일로 차폐하였다. 30분 후에, 자외선 조사기를 이용하여 장파장 자외선을 10.2J/㎠ 의 용량으로 조사하고 24시간 후에, 피부 상태(홍반, 부종, 구진 등)를 관찰하였다. 육안으로 관찰 결과 피부에 홍반 등의 부작용이 발생되지 않아 상기 화장수는 광독성이 없으며, 피부 진정 효과가 있음을 확인할 수 있었다.

< 실험예 7> 본 발명에 따른 화장수 및 영양 로션의 피부 안전성 확인 시험

건강한 20대 내지 30대 성인 남녀 20명(남자 10명, 여자 10명)의 전박부에 제제예1 및 2에서 제조한 화장수 및 영양 로션을 이용하여 인체 첩포 시험을 실시하였다. 시험대상자의 전박부를 70% 에탄올로 잘 닦은 다음 그 부위에, 통상의 화장료 기제에 제제예1 및 2에서 제조한 화장수 및 영양 로션을 20㎕씩 담은 핀 챔버를 점착 테이프를 이용하여 24시간 폐쇄 부착시켰다. 24시간 후에 점착 테이프와 핀 챔버를 제거하고, 가제로 피부에 잔존된 시료를 가볍게 닦아 제거한 뒤에 피부 상태를 육안으로 관찰하고 다시 24시간 후에 한번 더 육안으로 관찰하였다. 그 결과는 하기 표6과 같았다.

시료	24시간 후(n=20)	48시간 후(n=20)	비고
제제예1(화장수)	0/20	0/20	반응양성자수/총대상자수
제제예2(영양로션)	0/20	0/20

실험 결과 표6에 나타난 바와 같이 본 발명에 따른 화장수 및 영양 로션의 피부 자극성을 확인하기 위한 인체 첩포 시험에서 양성 반응을 보이지 않아 인체 피부에 자극성이 전혀 없는 것으로 확인되었다.

도 1은 본 발명의 혼합 추출물의 농도에 따른 세포 생존율을 나타내는 그래프이다.

도 2는 본 발명의 혼합 추출물의 농도에 따른 리폭시게나아제 저해 활성을 나타내는 그래프이다.

도 3은 본 발명의 혼합 추출물의 농도에 따른 PGE2 저해 활성을 나타내는 그래프이다.

Claims (9)

1. 울금(Curcuma longa Linn), 시호(Bupleurum falcatum L.) 및 버드나무(Salix koreensis Andersson)의 고체 발효 혼합 추출물을 함유하는 화장료 조성물.
2. 제1항에 있어서, 울금, 시호 및 버드나무가 1: 1: 1 중량비(wt/wt/wt)로 혼합된 것인 화장료 조성물.
3. 제1항에 있어서, 상기 고체 발효는 바실러스 속 미생물 통해 발효된 것인 화장료 조성물.
4. 제3항에 있어서, 상기 고체 발효 혼합 추출물이 울금, 시호 및 버드나무를 80 내지 100℃에서 30분 내지 1시간 동안 습식 열처리한 후 바실러스 속 미생물로 발효시킨 혼합물을 추출한 것인 화장료 조성물.
5. 제3항 또는 제4항에 있어서, 바실러스 속 미생물이 바실러스 서브틸리 스(Bacillus subtilis, ATCC), 바실러스 낫토(Bacillus natto, ATCC), , 바실러스 메가테리움 (Bacillus megaterium, ATCC), 바실러스 리케니포미스 (Bacillus licheniformis, ATCC), 바실러스 퍼밀러스 (Baciilus pumilus, ATCC)로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인 화장료 조성물.
6. 제1항에 있어서, 혼합 추출물이 물, C1~C4알코올, 함수 C1~C4알코올, C1~C6글리콜, 함수C1~C6글리콜, 에틸아세테이트, 벤젠, 헥산, 디에틸에테르 또는 디클로로메탄으로 이루어진 그룹 중에서 단일 또는 2종 이상의 용매를 혼합한 것으로 추출된 화장료 조성물.
7. 제6항에 있어서, 혼합 추출물이 에탄올 또는 함수에탄올로 추출된 화장료 조성물.
8. 제1항 내지 제4항, 제6항 또는 제7항 중 어느 한 항에 있어서, 화장료 조성물이 염증 예방 및 완화, 또는 피부 자극완화용인 화장료 조성물.
9. 제1항 내지 제4항, 제6항 또는 제7항 중 어느 한 항에 있어서, 화장료 조성물이 화장수, 영양로션, 영양크림, 맛사지 크림, 에센스 또는 팩 제형인 화장료 조성물.

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