CN103687586B - 化妆品 - Google Patents

Abstract

本发明提供了一种组合物，其包含鱼卵蛋白分离物。其中也存在含有不饱和脂肪酸和甾醇类物质的天然产物提取物。还提供了一种乳化剂以形成该分离物和该提取物的混合物。本发明还提供了一种组合物，其包含卵孵化蛋白分离物和至少一种保护分离物活性的抗微生物剂。乳化剂与该分离物形成混合物，该混合物具有一被缓冲至pH值5.6到7.9之间的水相。本发明还提供了一种生产这样的化妆品的方法，该方法包括形成一乳液或一水相，在将分离物添加到乳液之前，乳液或水相被缓冲至pH值在5.5到7.9之间。本发明还提供了一种改善皮肤外观的方法，该方法包括每周至少三次将该化妆品用于皮肤以实现皮肤外观的改善。

Description

化妆品

相关申请的交叉引用

本申请是非临时申请，要求2012年1月23日递交的第61/589,592号美国临时申请的优先权，该临时申请的内容通过引用的方式并入本申请。

技术领域

本发明总的来说涉及化妆品及其组分，且尤其涉及包含了有利于提高皮肤质量（肤质）的卵孵化蛋白质提取物（egg hatching proteinaceous extracts）及其配方的化妆品。

背景技术

传统的化妆品配方包含了在皮肤上形成保护性覆盖层以缓解天气造成的影响的油类物质和多种亲脂性物质。化妆品中含有的防晒霜也能减轻对皮肤造成的与老化和自由基的产生有关的紫外线损伤。化妆品组合物的其他常规成分是可以运送可观数量的水至皮肤的润肤剂（emollients），这些水与油的组合影响从皮肤释放或保留的水分量以掩盖皱纹。遗憾的是，这些传统化妆品的配方不能为肤质提供长期的，化学方面的改善。

鱼苗孵化场的工人的手有特别好的肤质，即使长时间接触冷水，这一观察是分离与鱼卵相关的一类新蛋白质的起因。例如在专利U.S.6,346,245，U.S.6,592,866，U.S.2011/0280882，WO2011/06434和U.S.2009/0274770中对这类蛋白质进行了详细说明。这类分离的蛋白质包括鱼卵的内蛋白酵素（zonase），白细胞凝集素（leukolectin），极酸的酸性蛋白(VAPS)和某种细胞溶解酶(choroelysins)，这些蛋白中至少一些在治疗自身免疫性疾病和炎症性疾病方面与治疗损伤性皮肤一样有效，都有最小的副作用。虽然这种蛋白改善了与风化作用和多种环境压力因素相关的受损的皮肤功能，诸如暴露于空调或空气污染物，这些蛋白质似乎对受损的和老化的皮肤相关的其他属性影响很小或没有影响。另外，虽然人们曾预想过在化妆品中添加这种鱼卵分离蛋白（fish spawn isolate proteins），但是能够在化妆品配方中保持蛋白活性和给予贮存稳定性是一项技术挑战。

因此，现在需要一种可解决多种皮肤老化问题的储存稳定的化妆品，该化妆品整合了卵且特别是鱼卵衍生蛋白的抗炎特性。进一步的，还需要这样的化妆品，其基本上不含对皮肤有意想不到毒害作用和有生物体内积累问题的合成化妆品成分。

发明内容

本发明提供了一种组合物，其包含了对哺乳动物皮肤有抗炎作用的鱼卵蛋白分离物（fish spawn protein isolate）。其中也存在含有不饱和脂肪酸和甾醇类物质（sterols）的天然产物提取物，该天然产物提取物（natural product extract）具有抗氧化活性。本发明提供了乳化剂或增溶剂，或它们的组合以形成分离物和提取物的混合物。本发明还提供了一种组合物，其包含了具有对哺乳动物皮肤的抗炎作用的卵孵化蛋白分离物（egg hatching protein isolate）。其中存在至少一种抗微生物剂（biocide），其保护卵孵化蛋白分离物的活性在20□C达3个月储存期，虽然当所述卵孵化蛋白分离物储存后应用于受试者皮肤时，该活性保持在未经配制的和新鲜的分离蛋白的80%以内。乳化剂与卵孵化蛋白分离物形成混合物，该混合物具有一被缓冲至pH值5.6到7.9之间的水相。本发明提供了包含上述组合物的化妆品套盒，该套盒采用非消毒的多用途包装，随附了其应用于皮肤以促进皮肤更新的说明书。

一种生产含有对哺乳动物皮肤有活性的卵孵化蛋白分离物的化妆品的方法，该方法包括形成至少一水相和至少一疏水相。乳化剂和该至少一种抗微生物剂存在于该至少一水相和该至少一疏水相中的至少一相中。该至少一水相和该至少一疏水相组合以形成一乳液。该乳液或该至少一水相被缓冲至pH值在5.5到7.9之间，在将该卵孵化蛋白分离物添加到该乳液之前。

本发明提供了一种改善皮肤外观的方法，包括将该组合物用于哺乳动物的皮肤，使用量水平为每平方厘米皮肤1×10^-6mg到0.1mg的分离物和2×10^-7mg到0.02mg的不饱和脂肪酸，每周使用至少三次，以实现皮肤外观的改善。

具体实施方式

本发明作为具有皮肤修复特性的化妆品具有实用性。在一个实施例中，一发明的化妆品被配制成能提供多种组分之间的协同作用。在另一个实施例中，一发明的化妆品组合物被配制成不含有合成组分。所有实施例中的发明的化妆品保持蛋白质组分的活性，同时具有在室温下的贮存稳定性，并且应对因非消毒处理和受到使用造成的微生物污染所带来的微生物挑战。本发明提供了配方的生产方法，该方法生产了一种具有在化妆品的使用和储存条件下保持蛋白质的活性和贮存稳定性的这些特性的化妆品配方。

根据本发明，卵孵化活性蛋白,特别是对活的哺乳动物皮肤有抗炎作用的鱼卵分离蛋白（fish spawn isolated protein），其与含有不饱和脂肪酸和至少一种甾醇的天然产物提取物相组合。该提取物同时具有抗氧化活性和胶原酶抑制活性，并且其与能够使含有蛋白分离物和提取物的混合物稳定的乳化剂相组合。可以理解地，本发明中可使用多个提取物以达到成分和活性方面的要求。惊奇地发现，卵孵化蛋白的活性，以及特别是鱼卵蛋白和天然产物提取物协同作用，在一些本发明的实施例中以实现更好的皮肤外观以及在一些实施例中实现皮肤的更新，与对照实施例中单独使用任一成分相比。在其它实施例中，本发明的化妆品在20□C条件下具有至少3个月的储存稳定性，然而当化妆品储存后用于受试者皮肤时，该蛋白质组分的活性仍保持在未经配制的和新鲜的分离蛋白的80%以内。

鱼卵蛋白分离物，例如，包括鱼卵的内蛋白酵素（zonase）、白细胞凝集素（leukolectin）或它们的组合，其所具有的性质在美国专利U.S.6346245，第4栏第15行-第5栏第8行;美国专利U.S.2009/0274770A1中[0321]-[0326]段以及美国专利U.S.2011/0280882中[0157]-[0194]段有详细说明；含有这种蛋白的粗提物；以及它们的组合。适合于蛋白分离的鱼卵的典型来源包括鲟鱼（sturgeon），鲑鱼（salmon），白鲑鱼（whitefish），白鳟鱼（vendace），鳕鱼（cod），毛鳞鱼（capelin）和淡水鳕鱼（burbot）的鱼卵。可以理解的是，本发明中可以使用的卵蛋白的其他来源包括两栖类动物的卵鞘（amphibian egg cases），诸如蝌蚪（tadpoles）和蝾螈（salamanders）的卵鞘，爬行类动物的卵鞘（reptilian eggcases）和禽类动物的卵鞘（fowl egg cases）。通常情况下，一个卵或特别是含有至少一些上述的蛋白质的鱼卵蛋白分离物占本发明的一个化妆品配方的总重量的0.0001%到10%，如果该粗提物的0.01%～10%是活性蛋白。可以理解的是，在本发明的一个化妆品中存在的蛋白质的量取决于例如包括与另一个化妆品的其它组分的混溶性和皮肤损伤的程度在内的因素。

应当理解的是，在提供了数值范围实例中，该数值范围应当不仅包含该范围的端点值，而且包含范围的中间数值，具体来说是被包含在该范围内的和随着该范围的最后有效数值（last significant figure）变化的中间数值。例如，所述的从1至4的数值范围应当包括1-2，1-3，2-4，3-4和1-4。

本发明的组合物还含有一种天然产物提取物。该天然产物提取物包含不饱和脂肪酸和甾醇，其量达到足以提供超出对照10%的抗氧化剂活性和胶原酶抑制活性，这些活性的检测分别采用氧自由基吸收能力（ORAC）测试和在含有1%的天然产物提取物的培养基中的脂质过氧化示踪剂和采用紫外线B辐射，辐射量为每平方厘米150毫焦耳。R.L.Prior,etal.等。血浆及其他生物和食品样品的亲水和亲脂性的抗氧化能力（氧自由基吸收能力（ORAC_FL））测定（J.Agric.Food Chem.）（2003）51:3273-3279。可以理解的是，天然提取物通常含有混合物，其为不饱和脂肪酸，一种或多种甾醇和其他的有不同皮肤病学活性（dermatological activity）成分的混合物。在一个本发明的组合物中使用的产物提取物也能抑制胶原酶活性，在一些实施例中抑制达5%以上，该数值是通过与对照组的比较检测获得，对照组中含有0.1%重量百分比的提取物，该检测采用抗胶原酶的目测操作规程，对与在37℃下培养了3个小时的低温皮肤切片的活组织检查进行检测，该低温皮肤切片与和不与提取物一同培养，随后不与（阴性对照）或与每毫升15微升胶原酶一同在37℃下的培养三个小时，之后是活组织检查样本的漂洗，之后对毛状体染色（trichome of Masson）的目测进行染色和显微镜检查。在一些实施例中，本发明的组合物所使用的天然产物提取物包括ω-3，ω-6和ω-9脂肪酸中的至少一种。在其它实施例中，不饱和脂肪酸在天然产物提取物中存在的量为每100克提取物中至少20毫克。本发明的天然产物提取物还包括至少一种类型的甾醇，例如该甾醇包括胆固醇，菜油甾醇，豆甾醇，谷甾醇，及其羟基化的形式和它们的组合。在一些实施例中，至少一种甾醇存在于天然产物的提取物中的量为每100克提取物中大于50毫克。通常，本发明的组合物中天然产物提取物的重量为组合物总重量的0.01～10%，在一些实施例中为总重量的0.1～3%。决定选择天然产物提取物的量方面的因素，例如包括化妆品的卵孵化蛋白和糖苷在卵孵化蛋白存在下的稳定性，皮肤损害的程度和化妆品的保质期。

根据本发明的天然产物提取物很容易通过常规技术来制备，所述的常规技术例如通过亲水性或疏水性的第一溶剂提取诸如叶、茎、芽、根、果实、或它们的组合的植物的一部分和经与该溶剂接触1-48小时后过滤该混合物，该溶剂的量相对于植物原料通常在1-20的体积比。在降低亲水性的有机溶剂中进行萃取和通过常规技术进行洗脱以获得本发明的天然产物提取物。代表性的脂肪酸/甾醇的提取技术请参见J.S.O’Brien and A.A.Benson,J.Lipid Res.,5,1964,pp.432-436.。该有机溶剂，例如包括醚类ethers，呋喃类furans，石油馏分petroleum distillates，烷烃（alkanes），卤代烷烃（halogenated alkanes），醇类（alcohols），醋酸纤维素（acetates），以及它们的组合。各相之间充分相互作用通常20分钟到48小时后，将有机相分离以获得根据本发明的提取物。提取物的合适来源包括在本文中都统称为“海藻”的红藻，绿藻，褐藻和成簇状的蓝藻细菌（tuft-forming cyanobacteria），以及植物或它们的具有紫色，红色，黑色或橙色的果实或叶的着色的组成部分，叶着色在叶绿素的存在或不存在的条件下进行测量。海藻类代表本发明的具有高含量的不饱和脂肪酸和甾醇类物质的天然产物提取物的共同来源。可以理解地是，不饱和脂肪酸和甾醇类物质的合成和/或动物来源很容易地用于本发明的组合物中。

除了卵孵化蛋白分离物和天然产物提取物，一些实施例中的本发明组合物包含了常用于化妆品中的一个或多个其他成分，前提条件是这些成分维持卵孵化蛋白分离物和天然产物提取物的性质。很容易地配制到本发明的化妆品中的有代表性的传统化妆品成分，例如包括可以构成本发明化妆品的大部分重量的去离子水；诸如石油（petroleum）、羊毛脂（lanolin）、地蜡（ceresin）、微晶蜡（microcrystalline wax）、巴西棕榈蜡（carnuba wax）、C₁₀-C₃₀脂肪酸、C₁₀-C₃₀醇类物质的固体和蜡类物质（solids and waxes）；诸如橄榄油（oliveoil）、霍霍巴油（jojoba oil）、蓖麻油（castor oil）、葵花油（sunflower oil）、榛子油hazelnut oil、乳木果油（shea butter）和红花油（safflower oil）的油类物质；诸如瓜尔豆胶（guar gum）、黄原胶（xanthan gum）、角叉菜胶（carrageenan）、羟乙基纤维素（hydroxyethyl cellulose）、菌类植物胶（sclerotium gum），卡波姆胶（carbomers），聚丙烯酸酯（polyacrylates）和丙烯酸酯-C₁₀-C₃₀烷基丙烯酸酯共聚物（acrylate-C₁₀-C₃₀alkylacrylate copolymers）的粘度调节剂/稳定剂；诸如甘油（glycerin），丙二醇（propanediol），乳酸钠（sodium lactate），PCA钠（sodium PCA）的亲水性保湿剂；诸如二辛基醚（dicaprylyl ether）、肉豆蔻酸肉豆蔻酯（myristyl myristate）、C₁₀-C₃₀的癸酸盐（C₁₀-C₃₀caprates）、含有辛酸和/或癸酸的C₁₀-C₃₀的甘油三酯和C₁₀-C₃₀的甘油酯的润肤剂；诸如十六烷醇（cetyl alcohol）、十八烷醇（stearyl alcohol）、硬脂酸甘油酯glycerylsterate、硬脂酸（stearic acid）、乙二醇甘油酯（glycol sterate）、双硬脂酸甘油酯（glyceryl distearate）的助乳化剂；诸如非离子型表面活性剂和阴离子表面活性剂的乳化剂，所述的阴离子表面活性剂例如含有月桂酰乳酸（lauroyl lactylate）的盐、己酰乳酸（caproyl lactylate）的盐、椰油酰乳酸（cocoyl lactylate）的盐、硬脂酰乳酸（stearoyllactylate）的盐、橄榄油鲸蜡醇酯（cetearyl olivate）的盐、橄榄油山梨糖醇（sorbitanolivate）的盐或甘油油酸酯柠檬酸酯（glyceryl oleate citrate）的盐，这些盐的典型的阳离子包括钠离子、钾离子、铵离子、钙离子和镁离子；硅油类物质；诸如无机辅配物（inorganic accompaniments）和无机染料的着色剂；金属皂化处理或硅处理的无机或有机颜料和有机染料；非离子型表面活性剂；聚硅氧烷（polysiloxanes）；水防腐剂（waterpreservatives）；pH调节剂；诸如维生素E、维生素K或B族维生素复合物的维生素和维生素代谢物；精油（essential oils）；吸收紫外光的化合物（ultraviolet light absorbingcompounds）；芳香剂（fragrances）；湿润剂（humectants）；血流增强剂（blood flowenhancing agents）；诱导冷感的物质（agents inducing a cold sensation）；止汗剂（antiperspirants）；活性物质（actives）和抗微生物剂。

这里使用的活性物质被定义为应用于人皮肤来清洁、美容、提高吸引力或改善外观的有机化合物，该有机化合物具有改善皮肤特性的效力，无论该化合物的性质是极性或非极性的。这里使用的该术语，特别地排除卵孵化蛋白、卵孵化蛋白的混合物和天然产物提取物。这里可以使用的活性有机物质，例如包含额外的提取物，例如下列物质的提取物：桑景蘑菇（mushroom mpo Songyi），金合欢（Acacia farnesiana），巴西莓（Euterpeoleracea），亮叶金虎尾（Malpighia glabra），臙脂树（Bixa orellana），甜杏仁（Prunusdulcis），芦荟（Aloe vera），高山玫瑰杜鹃花（Rhododendron ferrugineum），尾穗苋（Amaranthus caudatus），白芷根（Angelica archangelica），茴芹（Pimpinella anisum），苹果（Malus domestica），苹果薄荷（Mentha suaveolens），燕麦（Oat avenanthramide），大扁杏（Prunus armeniaca），蒙大拿山金车（Arnika montana），菜蓟（Cynara scolymus），芦笋（Asparagus officinalis），鳄梨（Persea americana），倒地铃（Cardiospermumhalicacabum），蜜蜂花（Cardiospermum halicacabum），龙头竹（Bambusa vulgaris），粉芭蕉（Musa paradisiaca），猴面包树（Adansonia digitata），刺檗（Berberis vulgaris），罗勒（Ocimum basilicum），月桂（Laurus nobilis），柳兰（Epilobium angustifolium），熊葱（Allium ursinum），欧亚路边青（Geum urbanum），欧洲桦（Betula pubescens），苏林南苦木（Quassia amara），黑种草（Nigella sativa），黑加仑（ribes nigrum），黑桑（Morusnigra），萝卜（Raphanus sativus），野茶树（Camellia sinensis），欧洲黑莓（Rubusfruticosus），变色鸢尾（Iris versicolor），欧洲越橘（Vaccinium myrtillus），琉璃苣（Borago officinalis），蚕豆（Vicia faba），睡菜（Menyanthes trifoliata），荞麦（Fagopyrum esculentum），牛蒡（Arctium lappa），假叶树（Ruscus aculeatus），可可（Theobroma cacao），菖蒲（Acorus calamus），葛缕子（Carum carvi），小豆蔻（Elattariacardamomum），胡萝卜（Daucus carota sativus），卡图巴古柯（Erythroxylum catuaba），百金花（Centaurium erythraea），洋甘菊（Matricaria chamomilla），樱桃（Prunuscerasus），鹰嘴豆（Cicer arietinum），小球藻（Chlorella vulgaris），黑果腺肋花楸（Aronia melanocarpa），金鸡纳树（Cinchona pubescens），锡兰肉桂（Cinnamomum verum），丁香（Syzygium aromaticum），椰子（Cocos nucifera），小果咖啡（Coffea arabica），毛喉鞘蕊花（Plectranthus barbatus），款冬（Tussilago farfara），聚合草（Symphytumofficinale），大车前草（Plantago major），芫荽（Coriandrum sativum），玉米（Zea mays），虞美人（Papaver rhoeas），矢车菊（Centaurea cyanus），草棉（Gossypium herbaceum），越桔（Vaccinium vitis-idaea），黄花九轮草（Primula veris），蔓越莓（Vacciniummacrocarpon），黄瓜（Cucumis sativus），姜黄（Curcuma longa），雏菊（Bellis perennis），大马士革玫瑰（Rosa damascena），特纳草（Turnera diffusa），西洋蒲公英（Taraxacumofficinale），海枣（Phoenix dactylifera），野芝麻（Lamium album），狗蔷薇（Rosacanina），火龙果（Hylocereus undatus），麒麟竭（Daemonorops draco），狭叶松果菊（echinacea angustifolia），高山火绒草（Leontopodium alpinum），西洋接骨木（SambucusNigra），刺五加（Acanthopanax senticosus），余甘子（Phyllanthus emblica），蓝桉（Eucalyptus globulus），月见草（Oenthera biennis），沙生蜡菊（Helichrysumarenarium），小米草（Euphrasia rostkoviana），胡芦巴（Trigonella foenum-graecum），无花果（Ficus carica），亚麻（Linum usitatissimum），鸡蛋花（Plumeria alba），球果紫菫（Fumaria officinalis），酸模（Rumex acetosa），栀子花（Gardenia Yessminoides），黄龙胆（Gentiana lutea），生姜（Zingiber officinale），银杏（Ginkgo biloba），人参（Panaxginseng），毛果一枝黄花（Solidago virgaurea），葡萄（Vitis vinifera），葡萄柚（Citrusparadisi），野茶树（Camellia sinensis），巴西香可可（Paullinia cupana），干草花（Graminis flos），欧洲榛子（Corylus avellana），指甲花（Lawsonia inermis），玫瑰茄（Hibiscus sabdariffa），金银花（Lonicera japonica），啤酒花（Humulus lupulus），欧洲七叶树（Aesculus hippocastanum），问荆（Equisetum arvense），长生花（Sempervivumtectorum），神香草（Hyssopus officinalis），冰岛地衣（Cetraria islandica），赝靛（Baptisia tinctoria），角叉菜（Chondrus crispus），常春藤（Hedera helix），素芳花（Jasminum officinale），霍霍巴（Simmondsia chinensis），欧刺柏（Juniperuscommunis），疗伤绒毛花（Anthyllis vulneraria），非洲吊灯树（Kigelia africana），猕猴桃（Actinidia chinensis），葛根（Pueraria lobata），羽衣草（Alchemilla vulgaris），薰衣草（Lavandula angustifolia），柠檬（Citrus limon），香茅（Cymbopogon cytratus），光果甘草（Glycyrrhiza glabra），圣母百合（Lilium candidum），来檬（Citrusaurantifolia），小叶椴（Tilia cordata），荷花（Nelumbo nucifera），澳洲坚果（Macadamiaternifolia），望春玉兰（Magnolia biondii），冬青叶小檗（Berberis aquifolium），锦葵（Malva sylvestris），芒果（Mangifera indica），金盏花（Calendula officinalis），欧洲栗（Castanea sativa），药蜀葵（Althaea officinalis），旋果蚊子草（Filipendulaulmaria），香瓜（Cucumis melo），水飞蓟（Silybum marianum），黍（Panicum miliaceum），可乐豆（Colophospermum mopane），花楸树（Sorbus aucuparia），毛蕊花（Verbascumthapsus），榆叶梧桐（Guazuma ulmifolia），香桃木（Myrtus communis），旱金莲（Tropaeolum majus），印度苦楝树（Azadirachta indica），大荨麻（Urtica dioica），泡叶藻（Ascophyllum nodosum），肉豆蔻（Myristica fragrans），夏栎（Quercus robur），掌状海带（Laminaria digitata），燕麦（Avena sativa），须松萝（Usnea barbata），油橄榄（Oleaeuropaea），洋葱（Allium cepa），甜橙（Citrus sinensis），柠檬薄荷（Mentha citrata），牛至（Origanum vulgare），三色堇（Viola tricolor），番木瓜（Carica papaya），辣椒（Caricapapaya），香芹（Petroselinum crispum），西番莲（Passiflora incarnata），碧桃（Prunuspersica），西洋梨（Pyrus communis），积雪草（Centella asiatica），芍药（Paeoniaofficinalis），胡椒（Piper nigrum），欧薄荷（Mentha piperita），菠萝（Ananas comosus），樱桃，欧洲李（Prunus domestica），石榴（Punica granatum），疗肺草（Pulmonariaofficinalis），西葫芦（Cucurbita pepo），榅桲（Cydonia oblonga），覆盆子（Rubusidaeus），红车轴草（Trifolium pratense），水稻（Oryza sativa），线状阿司巴拉妥（Aspalathus linearis），洋蔷薇（Rosa centifolia），迷迭香（Rosmarinus officinalis），黑麦（Secale cereale），鼠尾草（Salvia officinalis），五味子（Schisandra chinensis），沙棘（Hippophae rhamnoides），芝麻（Sesamum indicum），荠菜（Capsella bursapastoris），合欢花（Albizia julibrissin），碱蒿（Artemisia abrotanum），留兰香（Menthaspicata），小麦（Triticum aestivum），钝顶螺旋藻（Spirulina platensis），挪威云杉（Picea abies），贯叶连翘（Hypericum perforatum），杨桃（Averrhoa carambola），甜叶菊（Stevia rebaudiana），草莓（Fragaria ananassa），向日葵（Helianthus annuus），草木樨（Melilotus officinalis），除虫菊（Tanacetum cinerariifolium），柑橘（Citrusreticulata），百里香（Thymus vulgaris），山柑藤（Salvadora persica），缬草（Valerianaofficinalis），香草（Vanilla planifolia），马鞭草（Verbena officinalis），香堇菜（Viola odorata），核桃（Juglans regia），豆瓣菜（Nasturtium officinale），西瓜（Citrullus lanatus），小麦（Triticum aestivum），野茶树（Camellia sinensis），山楂（Crataegus rhipidophylla），红花百里香（Thymus serpyllum），白柳（Salix alba），弗吉尼亚州金缕梅（Hamamelis virginia），板蓝根（Isatis tinctoria），宁夏枸杞（Lyciumbarbarum），苦艾（Artemisia absinthium），欧番草（Achillea millefolium），南美红檀（Hymenaea courbaril），依兰香（Cananga odorata），松口蘑（Tricholoma matsutake），或它们的组合。可以理解，这些提取物也具有一定程度的抗菌活性，在某些实施例中增强抗微生物剂的功效。活性的有机化合物通常被用于本发明的配方中，占本发明的配方总重量的0到1%，在一些实施例中高达总重量的5%。虽然这些活性物质往往是更能耐受传统的化妆品加工条件，且在许多情况下，与卵孵化蛋白和天然产物提取物不同，其适合被包含于水相或亲脂相中，可以理解的是，在一些实施例中的这些活性有机化合物，通过一个C相或其他，在乳液形成之后，被单独地加入到乳液中。

本发明的化妆品易于配制成水性化妆品（water-based cosmetic），例如包括爽肤水（toner），喷雾（spray mist），精华液（serum），面霜（cream），面膜（mask），防晒霜（sunscreen），清面乳（cleanser），保湿霜（moisturizer），浴用配置品（bathpreparation），粉底液（liquid foundation），收敛剂（astringent），剃须用品（shavingpreparation），护发产品（hair care product），和其他护肤品，或者外用药剂，例如包括消炎药。在本发明的特定实施方式中，提供了一种化妆品，其包含诸如乳酸酯的植物性乳化剂（plant based emulsifier），该植物性乳化剂，基本上不含硅树脂（silicone-free），浴用配置品不含矿物油，不含石蜡油（petrolatum），且不含合成的对羟基苯甲酸酯类防腐剂（parabens）。乳化剂“基本上不含”这些化合物在这里定义为这些化合物总共占不到10%的乳化剂的重量百分比，本发明的配方很容易应用到人的皮肤，特别是且例如包括整张脸的区域，嘴、眼周围的区域，前额、两鬓、面颊或下巴；手；脚；颈部；头皮；肘部；胸部；前臂；肩膀；腿；以及它们的组合。

本发明的化妆品目前存在难以在配制过程中保持蛋白质的活性的困难。一般来说，可以看出加热和高剪切混合，这些化妆品配制的常规技术往往使活性蛋白变性。再者，活性蛋白容易出现微生物降解（microbial degradation），特别是当本发明的化妆品是在非无菌的条件下加工，并在20□C的室温下存储时。本发明的化妆品的配方需要在配制过程中将卵孵化蛋白暴露于有限的范围内的pH值、剪切混合和加热的环境，以保持其中存在的卵孵化蛋白的活性。为了保持卵孵化蛋白活性，化妆品配制过程包括将所有化妆品构成相缓冲至pH值在5.6和8之间，在将卵孵化蛋白加入到那个相之前。缓冲在本领域经常使用，且包括添加酸，碱，酸的盐，或它们的组合以平衡乳液的水溶液或水相至所期望的pH值。可以理解的是，pH测定是常规技术，定量测定可以通过容量滴定法（volumetric titration）或诸如可以从赛默飞世尔科技公司（Thermo Fisher Scientific）（Waltham MA，USA）购买的电位电极（potentiometric electrodes）；定性测量采用石蕊试纸试剂盒。

虽然，为了保持蛋白的活性，将本发明的化妆品的pH值调整到5.6和7.9之间，部分抑制卵孵化蛋白的微生物降解，但抗微生物剂存在于本发明化妆品配方中以保持蛋白质的活性，针对配制过程中带来的微生物并且针对在使用多剂量容器过程中，经受试者局部的和呼吸的接触本发明的化妆品，各种微生物连续不断地在化妆品中接种的情况。因此，本发明的多用途化妆品配方和储存稳定的配方，包含广谱抗微生物剂或抗微生物剂的组合。此处的广谱的抗微生物剂被定义为，其具有抗革兰氏阳性菌，革兰氏阴性菌，以及与健康人体相关的真菌的活性。此处有效的抗微生物剂，例如包括苯甲酸（benzoic acid），对羟基苯甲酸酯类（parabens），水杨酸（salicylic acid），石炭酸（carbolic acid），山梨酸（sorbicacid），烷基p-对羟基苯甲酸酯（alkyl p-hydroxybenzoates），对氯代间甲酚（p-chlorometacresol），六氯酚（hexachlorophene），氯化苯甲烃铵（benzalkoniumchloride），氯化氯己啶（chlorohexidine chloride），三氯对称二苯脲（trichlorocarbanilide），苯氧基乙醇（phenoxyethanol），酰基肌氨酸（acylsarcosines），谷胱甘肽（glutathione），苹果酸（malic acid），酒石酸（tartaric acid），抗坏血酸（ascorbic acid），抗坏血酸盐（ascorbates），必需的植物油，变链素蛋白（mutacinproteins），以及它们的组合。在本发明的一些实施例中，只存在天然来源的抗微生物剂。天然来源的抗微生物剂，例如包括，诸如乳杆菌（Lactobacillus）、变形链球菌（Streptococcus mutans）和明串珠菌（Leuconostoc）的发酵滤液；没药醇（bisabolol）；桉油精（eucalyptol）；百里香酚（thymol）；肌醇（inositol）；皂甙；和诸如日本金银花（Japanese honeysuckle，Lonicera japonica）、羊蹄（yangti(Rumex japonicus)）、苦参（kushen(Sophora flavescens)）、睡莲（candock）、野生牛至（wild oregano）、橙（orange）、鼠尾草（sage）、曼尼佛（manifoil）、锦葵（common mallow）、川芎（chuanxiong(Cnidiiofficinale Makino)）、日本绿龙胆根（Japanese green gentian(Swertia japonicaMakino)），没药醇（bisabolol），百里香（thyme），当归（danguii(Angelica sinensis)），橙皮（orange peel），桦树（birch），问荆（field horsetail），丝瓜（dishcloth gourd），七叶树（horse chestnut tree），虎耳草（creeping saxifrage(Saxifrage stolonifera)），山金车（arnica），百合（lily），艾蒿（mugwort），牡丹（peony），芦荟（aloe），栀子花（gardenia）和那些在文献M.M.Cowan,Clinical Microbiology Reviews,12(4)Oct.1999,p.564 582中详述的植物的天然提取物，或者它们的组合。这些提取物通过临床微生物学评论（ClinicalMicrobiology Reviews,12(4)Oct.1999,pages.573 574）中详述的步骤来制得且通常采用一种诸如C1-C8的醇（C1-C8alcohol）、多羟基醇（polyhydric alcohols）、水和含水酒精（aqueous alcohols）的亲水性有机溶剂。在一个特定的本发明实施例中，采用日本金银花（Japanese honeysuckle），根皮素（phloretin）（苹果），高良姜素（蜡菊（Helichrysumaureonitens））作为天然来源的抗微生物剂，各自单独或组合使用。可以理解地是，除了杀菌性能，天然提取物常常赋予本发明的化妆品一种香味。抗微生物剂在本发明的化妆品的多功能包装中，在特定的实施例中，为总重量的0.1%～5%（重量），可以理解地是，超过总重量的5%的抗微生物剂的量可以很容易地按照要求被列入。

本发明的化妆品在某些实施例中，pH缓至5.6到7.9之间的任一数值，且在另一些实施例中，缓冲至在6.5到6.8之间，然而在其他实施例中，缓冲至6.8到7.3之间。没有打算要限定到一特定的理论，例如pH值促进诸如鱼卵分离物的卵提取物和天然产物的提取物成分的稳定化和贮存稳定性。通过预先配制至少两个组分，与可选的附加相一同促进本发明化妆品的配方的形成，所述的至少两个组分包括水包油型乳液和油包水型或有机硅乳液的第二相，所述的附加相，例如含有诸如鱼产卵分离物的活性卵提取物和/或天然产物提取物的第三相。或者，可以理解，卵孵化分离物或天然产物提取物其中一种或两者很容易地分散在水包油型乳液、油包水型乳液、硅氧烷包水型乳液或血清制剂中。令人惊讶地发现，在添加活性卵蛋白提取物之前，各种相pH的缓冲对于保证最终的本发明的化妆品的贮存稳定性和蛋白在受试者皮肤上的活性是至关重要的。

水包油型乳液的小部分的相组分，例如包括油、蜡、酯、醚、黄油、甘油酯，或它们的组合物，如上文详述。水包油型乳液的大部分的相组分，例如包括水、水溶性盐（aqueoussalts）、润湿剂和各种水溶性物质，如上文详述。用于该系统的乳化剂包括离子型表面活性剂，非离子表面活性剂，如上文详述，并且还包括卵磷脂，脂质体和油质体（oleosomes）。其他非必要的添加剂按照上文详述可以很容易地给出，其包括粘度调节剂，乳化稳定剂，香料，诸如此类。在具体的实施例中，水包油型乳状液的pH值为5.6至7.9之间。在某些实施例中，水包油型乳液的pH值为6.5和6.8。

油包水型乳液或有机硅包水型乳液的小部分和大部分的相组分的相对量可以变化，并且优选的，依赖于非离子型表面活性剂和有机硅衍生物作为乳化剂。粘度调节剂和/或乳化稳定剂，例如包括水溶性盐，树胶，蜡，以及它们的组合物，如上文详述。在特定的实施例中，内相的pH调节为5.6至7.9之间。在某些实施例中，内相的pH值调节在6.5到6.8之间。可以理解，各种维生素，如维生素E，维生素K，诸如抗坏血酸葡糖苷的抗坏血酸衍生物，可以很容易地加入到上述的乳化相中的一个或两个，或作为一个独立的第三相。

本发明的化妆品可以很容易地通过如上文详述的预混相的组合来形成，或者可选的，所有这些成分按照本领域的常规顺序依次混合形成一个均一的混合物。本发明提供了一种改善皮肤外观的方法，包括将本发明的组合物用于哺乳动物的皮肤，用量为每平方厘米皮肤1x10^-6mg到0.1mg的所述分离物和2x10^-7mg到0.02mg的所述不饱和脂肪酸，每周至少三次，以达到皮肤外观的改善。

本发明化妆品的典型范围总结如表1-3所示。应该理解的是，如在这里详述，其它常规的基础配方，单独的或者与含有不饱和脂肪酸和甾醇的天然产物提取物组合，可以很容易地采用本文详述的方法被调整以稳定卵孵化蛋白。在这里可使用的用于化妆品的各种常规的基础配方参见：“化妆品配方”，第二版，2001年第8卷，诺伊斯出版社（ISBN0-1855-1454-9）（E.W.Flick,“Cosmetic and Toiletry Formulations”,2^nd Ed.,Vol.8;2001,Noyes Publications,Norwich,New York,USA(ISBN0-1855-1454-9).）。

表1.本发明的化妆品的水包油型乳液形式的典型范围，其中百分比是总重量的百分比。在此提供三相或四相的形式。

三相配方

A-1相：

B-1相

C-1相

活性（0.034%的活性的卵孵化蛋白） 0.001～10

活性（天然产物提取物） 0.001～10

四相配方

A-2a相

A-2b相

B-1相

C-1相

活性（0.034%的活性蛋白质） 0.001～10%

活性（天然产物提取物） 0.001～10%

*-pH调节也可以继A相和B相混合之后进行，然而要在加入C-1相之前。

**-需要一些数量的抗微生物剂，通常占总重量0.1-5%的多用途的非消毒的配方。

表2本发明的化妆品的有机硅包水型乳液形式的典型范围，其中的百分比为总重量的百分比。

A相

B相

C相

活性（0.034%的活性蛋白质） 0.001～10%

活性（天然产物提取物） 0.001～10%

表3本发明的化妆品的血清配方的典型范围，其中的百分比为总重量的百分比。

A相

B相

增溶剂 0.1～10%

非极性的活性有机化合物 0～1%

C相

活性（0.034%的活性蛋白质） 0.001～10%

活性（天然产物提取物） 0.001～10%。

实施例1

经配制该三相之后来制备一美容霜（cosmetic cream）。A相经加热至75-80℃，并充分搅拌以形成均匀的混合物。将B相在室温下置于一个独立的容器中进行预混合，并在40℃或以下的温度添加到A相。将相C依次添加到所得到的A相和B相的混合物，并充分搅拌直到形成均匀的霜。得到均匀的且稳定的霜。

实施例2

提供了一种美容霜，其中鱼卵蛋白分离物和天然产品提取物都是A相的组分，而不是像每一个实施例1中鱼卵蛋白分离物和天然产品提取物存在于一个独立的C相。通过在室温下形成A相以避免蛋白变性，得到了一种类似的霜。

比较例

制备与实施例1进行比较的组合物（比较例A），其不含鱼卵蛋白分离物。另一种组合物不含天然产物提取物（比较例B）。也制备了既不含鱼卵蛋白分离物又不含天然产品提取物的对照配方（比较例C）。40个人的研究组被分成4组，每组人每天使用实施例1的霜或比较例A-C的任意一种达12个星期。测量每一个受试者的皮肤的基础弹性，并且测得的研究结论基于以比较例C为对照标准，实施例1组合物与比较例A-C相比显示出优越的紧实度和光滑度。所有的组合物被标准化以达到这样的水平：每次在每平方厘米皮肤上使用1x10^-6毫克的分离物（如有）和2x10^-7毫克的不饱和脂肪酸（如有）。

实施例3

新鲜的，未受精的鲑鱼（安大略鲑鱼（Salmo salar））卵，其获取自处于生殖期（晚秋）的雌性，将其放置于冰上，并且最好是立即制备提取物。在不破坏卵膜的情况下，可以在冷冻保护剂（例如1.5M1,2-丙二醇和0.2M蔗糖）中冷冻干燥的卵。冷冻方式可以是逐渐地（-1 C./min）至-80℃。在整个提取物制备的过程中，卵应当被解冻并置于冰上。

将卵放在含有蛋白酶抑制剂（10μg/ml）HBSS或海水中洗两次。去除清洗溶液，将卵溶解并在一个预冷冻的杜恩斯玻璃-玻璃匀浆器（Dounce glass-glass homogenator）进行匀浆。将溶解产物转移到贝克曼超纯聚合物离心管（Beckman Ultra Clear polymercentrifuge tubes）（5ml），同时避免转入卵壳，然后在采用SW55T1转子的贝克曼离心机中，4℃以15,000g的转速离心15min。由此得到3个部分，上层部分脂质，中间部分细胞质和包含了卵壳和核碎片的底层部分。中间部分细胞质是待收集的提取物。该提取物预计将含有最多的胞内的细胞器，包括线粒体、溶酶体和过氧化物酶体，该提取物应当是清澈的和粘稠的，并且有橙色的色彩。添加蛋白酶抑制剂（10μg/ml贮存物），并且提取物保持在-80C。收集斑马鱼的胚胎的中囊胚，去除液体，并且冷冻至-20℃。为制备该提取物，将胚胎放置于冰上解冻，将其溶解，并采用杜恩斯玻璃-玻璃匀浆器（Dounce glass-glass homogenator）在少量的HBSS或海水（最好小于50%液体v/v）中进行匀浆。该溶解产物经一个无菌的亚麻布过滤，并且在采用了SX4250转子的贝克曼X-22R离心机中，4℃，以5,000的转速离心20min。收集该细胞质提取物（上清液），且添加蛋白酶抑制剂（10μg/ml）。该提取物可以被微孔过滤（0.22微米的MilliQ除菌过滤器）。该提取物被置于-80℃。该提取物的pH采用石蕊试纸来检测，其蛋白浓度通过Bradford检测法来测定，渗透度通过渗压计来测定。

该通用程序适用于制备来源于海胆、虾、鱼蛋/卵或青蛙卵的提取物。简略地讲，妊娠的雌鱼刚产下卵不久，通常在黎明（2-4AM），收集它们的卵，该妊娠的雌鱼处于产卵程序中，在产卵之前的6-8小时注射hCG激素（1ml/kg），或者来自妊娠的青蛙。将卵/蛋冷冻干燥或冷冻至-20℃或新鲜使用。从不同种类的鱼收集卵。对于海胆，0.5M KCl注射到嘴巴周边以引发卵的脱落。通过将蛋/卵破碎（细胞破碎仪或dounce-匀质器）来制备该提取物或在不同的速度离心以分离全部含量的细胞质，带有/不带有卵壳（透明带），带有/不带有核/胞液，带有/不带有细胞器，带有/不带有脂质。可以进行进一步的分馏来分离一个或多个mRNA、蛋白质、小肽、碳水化合物和脂质。卵中的脂肪酸的主要成分是油酸、亚油酸和ω-3脂肪酸。

采用上述的操作程序来获得鲑鱼卵提取物，该鲑鱼卵提取物具有非常高的蛋白质含量，该蛋白质含量范围100-380mg/ml，pH在6.4-6.8之间，并且渗透度大约为350mOsm。该提取物应当是清澈的和粘稠的，并且不可过滤的（通过0.45微米的MilliQ过滤器）。该提取物中的蛋白质，因其高蛋白含量和低pH，其可以通过添加水或具有低缓冲容量的含水的溶液被沉淀下来。提取物可以通过添加碱性物（每ml提取物种添加1-3μl1M NaOH）来调节pH值至7.0，因此，其在水或含水溶液中稀释是可以的。斑马鱼提取物的蛋白质浓度范围23-26mg/ml，pH在6.4-6.8之间，并且渗透度在80-150mOsm。该提取物是清澈的和不粘稠的，可过滤的且在水中能容易地以各种稀释比例被稀释。

实施例4

凝胶过滤-纯化加上亲和性-纯化得到的鲑鱼的鱼卵的内蛋白酵素（zonase）通过一个最终的色谱分析程序可以被进一步纯化达到序列级的纯度。该程序用的是PBE94柱子，Tris-醋酸缓冲液（10mM,pH9.0），随后的洗脱液是具有盐梯度（高达1M NaCl盐）的该缓冲液。该步骤增加了鱼卵的内蛋白酵素（zonase）的催化活性达高出7.6倍，714倍的整体纯化，和起始材料的28%的产率。该纯化步骤使得鱼卵的内蛋白酵素（zonase）的蛋白特性保持完整，作为一个28kDa的半族（moiety）。因此，该步骤不从该鱼卵的内蛋白酵素（zonase）制备中去除无关的、主要蛋白污染物。对于存在于孵化液和“鱼卵的内蛋白酵素（zonase）粗产品”中的鱼卵的内蛋白酵素（zonase）半族，纯化的鱼卵的内蛋白酵素（zonase）的分子量与通过Western blotting技术检测得到的相同。

显然，在第三次和最后的色谱分析程序中发生的是小的、污染的多肽被去除了。这些多肽似乎是周围带有很多残基的寡肽，最可能来源于卵壳和/或来源于鲑鱼胚胎。这些多肽污染物似乎在鱼卵的内蛋白酵素（zonase）的催化中发挥了抑制性作用，因为他们的去除增加了鱼卵的内蛋白酵素（zonase）的催化活性。并且，他们的存在干扰了该鱼卵的内蛋白酵素（zonase）产品的Edman-测序的第一步。在这第三个纯化步骤中，两种形式的鱼卵的内蛋白酵素（zonase）结合到柱子基质上的方式似乎有一些不同。然而，两种形式在它们的N-末端都有相似的氨基酸序列。

来源于CNBr-产生的多肽的部分氨基酸序列确定了鱼卵的内蛋白酵素（zonase）作为独立的蛋白。从结构分析获得的启示：鱼卵的内蛋白酵素（zonase）可能具有明显的催化和底物结合域，这些能解释它们对钙-螯合剂的敏感性，当其作用于大分子（生理学的）底物（结合到被抑制的，因此催化被间接地抑制），也解释了它们对于丝氨酸蛋白抑制剂的敏感性，当其作用于小的底物（催化被直接抑制）。

实施例5

鱼卵的内蛋白酵素（zonase）和白细胞凝集素（leukolectin）都从鲑鱼孵化液中纯化得到。为了提高孵化液的蛋白浓度，鲑鱼卵在孵化之前被转移到最少量的水中。可以通过提高（室）温度或者通过脱氧作用（Oppen-Berntsen et al.1990,Aquaculture,86,pp.417-430）来诱导高度同步的孵化，其产生了粗制鱼卵的内蛋白酵素（zonase）和相关蛋白高度浓缩的配制品。

鱼卵的内蛋白酵素（zonase）的初始纯化涉及通过纱布（cheese cloth）过滤孵化的鲑鱼卵。该滤液在被解冻和应用于进一步的蛋白纯化之前，可以被冷冻数年，且不会有鱼卵的内蛋白酵素（zonase）显著的降解。这一事实大大地简化了起始材料的生产，该起始材料用于纯化鲑鱼的鱼卵的内蛋白酵素（zonase）和相关蛋白，包括白细胞凝集素（leukolectin）。

下一个、任选的步骤涉及到将蛋白过滤物加入到4M尿素进行调节，以分离鲑鱼卵壳的碎片，这使得可以通过低速度离心（15,000g的转速，两次，离心15min）将鲑鱼卵壳的碎片连同外源的碎片一起去除。该材料没有显示出堵塞柱子的现象，这是经与上述的不同的方法制备得到的粗产品的特性。该粗制的蛋白配制品适用于通过传统的色谱技术来纯化。

孵化液体中的白细胞凝集素（leukolectin）可以连同鱼卵的内蛋白酵素（zonase）被分离。从被部分纯化的鱼卵的内蛋白酵素（zonase）配制品（如上述），白细胞凝集素（leukolectin）可以通过排阻色谱法（exclusion chromatography）被分离出来，因为鱼卵的内蛋白酵素（zonase）的天然形式远大于白细胞凝集素（leukolectin）。第一次分离，使用了Superdex16/60柱子，随后，可以通过亲和色谱法过苄脒-琼脂糖柱子（Benzamidine-Sepharose columns）来去除鱼卵的内蛋白酵素（zonase）。

对于大批量的制备，使用超滤也是适用的，因为鱼卵的内蛋白酵素（zonase）的天然形式不像白细胞凝集素（leukolectin）基本上不穿过体积排阻为100kDa的超滤膜。

使用的缓冲液是毫克分子（millimolar）的Tris，其pH大约为中性或弱碱性（pH7.5-8.5），其含有5mM NaCl。白细胞凝集素（leukolectin）被发现与鱼卵的内蛋白酵素（zonase）一同共-纯化。该新蛋白质的体积，在天然条件下经过色谱法估算，仅不足30kDa。

该凝集素的MW估计在25-30kDa左右。类似的鲑鱼的凝集素的pH估计大约为6.5。观察到的pIs（Riste,未出版），其在鲑鱼的卵周凝集素（salmon perivitelline lectins）的pH值范围为6.5-6.9，其在鲑鱼白细胞的凝集素（salmon leukocytic lectins）（该凝集素通过Western blotting的技术被识别）中的pH值范围在6.4-6.6。

实施例6

评价采用了上述的配方的日霜和眼霜形式的化妆品的安全性和有效性的研究历时12个星期。总共挑选了40个女性受试者，年龄范围在37-60岁。这40个参与者全部完成了该研究。

在该研究的条件下，测试材料以日霜和眼霜的方式被识别，显示其改善面部细线、皱纹、色素沉着、肤色均匀、皮肤透明度、皮肤松弛度和粗糙的触感，经过12个星期的使用期。另外，该测试材料能很好地被接受，当应用到皮肤上，其没有显示出导致明显真皮刺激的可能性。

每天使用两次，在随后的第2、6和12周进行观测，采用Packman和Gans计分来测定面部的表面线条在统计上显著的改善，采用直观类比标度（Visual Analog Scale（VAS））计分来测定面部色素沉着，肤色均匀，皮肤透明度、皮肤松弛度和粗糙的触感在统计上显著的改善。

在任何后处理期间，从统计学显著性来说，没有观测到刺激（红斑、水肿、干燥、刺痛、燃烧的和紧绷/干的感觉）的增加。

实施例7

评价抗微生物防腐剂抵抗在采用了上述公开的配方的日霜和眼霜形式的化妆产品中的微生物污染的有效性的研究，在2个4周的研究周期中进行。研究方法采用了CTFA微生物指南，第20部分，M-3，水溶性个人护理产品的保藏测试方法和USP34，第61部分，中和/去除抗菌活性。试验菌包括金黄色葡萄球菌（Staphylococcus aureus），大肠杆菌（Escherichia coli），绿脓杆菌（Pseudomonas aeruginosa），白色念珠菌（Candidaalbicans）和黑曲霉（Aspergillus niger）。对于第2类产品，该防腐剂被认为在受试样品中是有效的，如果a）活菌含量在第7天显示出不低于3.0log级数（99.9%）的降低，相对于初始计数，并且在整段测试期没有增加，和b）活菌和霉菌的含量在第7天不低于1.0log级数的降低（90%），相对于初始计数，并且在整段测试期没有增加。

研究结果显示，该日霜和眼霜符合第2类别产品的接受标准。

实施例8

进行了一项研究以确定采用上述公开的配方的日霜和眼霜形式的测试材料的导致黑头粉刺的能力，通过评价该测试材料是否导致黑头粉刺，经过四周的在闭合的贴剂条件下重复地应用，相对于阴性对照（未涂覆的区域）。为了验证本研究，乙酰化的羊毛脂醇用作阳性对照。该测试在4周的研究周期过程中进行。总共15个受试者，年龄介于22到45岁之间，被选中参加本研究。15个受试者都完成了本研究。毛囊的活检标本从测试位置收集的的评价表明，测试材料和对照材料被引出0.5的整体评价分数（1-24%小角质）。测试材料和阴性对照的每个毛囊的微黑头粉刺的平均比率是1%，阳性对照的是6%。测试材料和阴性对照的毛囊的微黑头粉刺的比例没有显著性差异，然而阳性对照相对于阴性对照显示出显著的更高比率。

该研究表明在研究期间没有报道负面的体验。测试材料没有展示出导致黑头粉刺的能力。用每一种测试材料处理的位点和未经处理的阴性对照的贴剂所应用的位点，每一个毛囊的微黑头粉刺的比率没有统计差异。

实施例9

进行了一项研究以确定采用上述公开的配方的日霜和眼霜形式的测试材料的真皮刺激和敏感的可能性。测试在8周的研究期内进行。该研究启用了225位受试者。11位受试者没有完成研究，未完成的原因与测试材料无关。总共215位受试者完成了该研究。

通过将带有测试材料的贴剂应用到经异丙醇擦拭且被允许进行干燥的测试区域来进行测试。该测试材料被应用于上背（肩胛骨之间）且使其保持直接的皮肤接触达24小时。在周一、周三和周五，贴剂被应用于同样的位点，在诱导期间总9次使用。这个时间安排可以被修改以允许错过的拜访或假期。如果受试者不能在指定的测试日期汇报，该测试材料在诱导期间连续两天使用和/或在诱导期间的最后增加一个化妆日。这些位点的真皮敏感程度受到监督技术人员的打分，在周二和周四受试者去除了贴剂后的24小时，和在周日去除贴剂后48小时，除非如上述的贴剂的时间安排被改变。

根据下述的计分系统对这些位点进行打分：

真皮计分量表

0 没有明显的皮肤反应

+ 勉强察觉红斑

1+ 温和的红斑

2+ 清晰的红斑

3+ 严重的红斑和水肿

4+ 带有起泡的红斑和水肿

如果“2+”反应或更强的发生了，那么将该测试材料应用于临近的未使用过的位置。如果在新的位置发生了“2+”反应或更强的，那么受试者在该诱导期间不会被再次贴涂，但是在该研究的适当时候会被挑战。贴涂位置的得分低于“2+”可能已经被改变，任凭研究主管处理。

之后约2周的测试期间，挑战的贴剂被应用于背上的之前未处理的测试位点。24小时后，贴剂被CRL技术人员去除且评价测试位点的真皮反应。24小时和48小时，测试位点被重新评价。在该研究的挑战期间，显示了反应的受试者可能被召回，观察96小时。

基于214受试者的测试人群且在该研究的条件下，眼霜测试材料没有显示出引发真皮刺激或敏感的能力。

实施例10

进行了一系列的研究以确定采用上述公开的配方且在该配方中添加了额外的防晒指数（SPF）成分的日霜和眼霜形式的测试材料的真皮刺激和敏感的能力。SPF被定义为在被防护的皮肤上产生最小红疹所需要的能量数量与在未处理的皮肤上产生最小红疹所需的能量数量的比例，计算式如下：

I.进行了一项研究以评价组合了采用上述方法配制的日霜的防晒产品的效率，通过采用国际防晒指数（SPF）测试方法（2006年5月）在统计学条件下来确定防晒指数（SPF）。一个标准的防晒配方与测试材料同时被检测。标准是二甲胺基苯甲酸戊酯氧/氧苯酮SPF标准（Padimate O/Oxybenzone SPF Standard(COLIPA P2)）(COLIPA P2)。测试/对照材料应用的位点是在背部，且被随机设置以使得接受到单独的测试材料的治疗背部区域对于所有受试者来说是不同的。总共10位男性和女性受试者，年龄在25岁到57岁之间且基本上身体健康，被选中参与这项研究。在整个研究期间，没有不良事件的报道。

II.进行了一项研究以评价组合了采用上述方法配制的日霜的SPF30的防晒产品的效率，根据日本化妆品行业协会（JCIA）的UVA防护的检测标准（01/01196），在统计学条件下，确定紫外线A（UVA）防晒因子（PFA）。总共10位成年受试者参与了这项研究。一个疝气弧多端口阳光模拟器（Xenon Arc Multi-Port Solar Simulator）（150w,Model15S,SolarLight Company,Philadelphia,PA），具有UVA和UVB波段（290-400nm）的紫外线连续的放射波谱，其被用于紫外线辐射的来源并且被过滤以提供一个基本的像阳光一样的波谱。采用了下面的过滤器以保证合适的波谱输出：Schott WG33513mm and UG1111mm。光输出（lampoutput）在每一个受试者受到UV强度仪表（UV Intensity Meter）（Model PMA2100,SolarLight Company,Philadelphia,PA）测试之前被及时测量。阳光模拟器的光输出的波谱分布每年校正一次。

黑化是暴露于UVA后在皮肤上观察到的棕灰色（brown-gray）到棕黑色的反应，是因为光-氧化反应，在该反应中无色黑色素前体被氧化以形成着色的黑色素。最小的持久的黑化（MPPD）被定义为在未处理的皮肤上诱发这样的反应所必须的UVA光辐射剂量。在测试阶段之前，每个受试者的MPPD是通过UV光曝露的渐进的等比数的确定。UVA辐射的剂量的增加倍数为1.25.辐射后2到4小时，根据下面的计分系统来评价这些位点的黑化情况。

0 阴性，没有明显的反应；

± 勉强察觉（最小）黑化；

1+ 明确的（中等的）黑化；

2+ 显著的或界限清楚的黑化。

用手术记号笔在受试者肩胛骨和腰围之间、中线两侧的后背上画出尺寸为5*10cm的测试位点的轮廓。这些区域被指定为测试材料或防晒标准。邻近的位点被指定为在未处理的皮肤上同时进行MPPD测定。经产品应用后，每个测试区域被再分为大约1平方厘米位点，用于确定连续的UVA光曝露。

测试材料或标准的一个0.1ml份被应用于合适的测试位点且使用指套使其平均地延伸到整个位点（相当于2μl/cm²）。使用后，15分钟到30分钟之间开始对位点进行辐射。基于之前确定的未受保护的皮肤的测定的MPPD和测试材料或标准的预期PFA，为每一个处理位点选择曝露时间。在曝光后2到4小时对所有的测试位点进行评价以测定最小的持久黑化反应。

UVA的保护因子（PFA）被定义为在受防护的皮肤上产生一个MPPD所需要的时间量除以在未处理的皮肤上产生一个MPPD所需要的时间量的比率，计算式如下：

标准误差需要在测试值的10%以内。

被辐射处理的位点的PFA值的整数值确定了UVA的防护级别。由于所有PFA值都大于或等于2，采用下面的分类方法来确定保护级别：

递交的测试材料SPF30的日霜在10个受试者中表现出的平均UVA防护值为PFA6.5。

III.进行了一项研究以评价采用上述配方配制而成的含有广谱防晒功能的防晒活性物日霜测试材料，通过按照FDA（联邦公报/Vol76,No117/星期五,6月17日，2011年/规则和规定）给出的方法测定其关键的波长。

防晒产品的吸光度是从290nm开始跨越整个UV波长的总和，直到总和数达到90%的该防晒产品在紫外波长范围（290-400nm）的总吸光度。吸光度的总和达到总吸光度的90%时的波长被定义为关键波长（critical wavelength）并且被认为是防晒保护的宽幅的度量衡。当关键波长大于370nm时，具有它们在UVA中的吸光度的一个重要部分的防晒产品被归类为广谱（broad spectrum）的防晒产品。

测定每一个波长在整个UV光谱区（290-400纳米）的光谱透射率（Spectraltransmittance）。每间隔1nm测量一次透射率的值。

测试材料带有SPF的日霜的关键的波长是371.00nm，该波长满足了“广谱”标签所要求的最低370nm的关键波长标准。

进行了一项相似的测试研究以评价采用上述配方配制而成的含有广谱防晒功能的防晒活性物日霜测试材料，通过按照COLIPA的2011年的指南来测定其体外UVA防护因子（UVA-PF）、SPF/UVA-PF比率和该日霜的关键波长。

本说明书中提及的任何发明文献或出版物都在此通过引用的方式并入，并入的程度如同任何一个单独的出版物被特定地和单独地说明以通过引用的方式被并入。

上述的说明书是本发明特定实施方式的举例说明，它不应当成为实施本发明的限制。

Claims (18)

1.一种化妆品组合物，其包含：

鱼卵孵化得到的并包括活性蛋白为内蛋白酵素的蛋白分离物，所述的蛋白分离物占化妆品组合物总重量的0.0001％到10％；

一乳化剂或增溶剂，或它们的组合；

含有不饱和脂肪酸和甾醇类物质的天然产物提取物，

生产所述的化妆品组合物的方法包括：

形成至少一水相和至少一疏水相，其中至少一相包括所述的乳化剂或增溶剂、或其组合物，以及至少一相包括所述的天然产物提取物；

组合所有的相以形成一乳液；及

在乳液形成后，在5.5～7.9的pH和40℃或更低的温度以及不存在高剪切混合下加入蛋白分离物至乳液中。

2.根据权利要求1所述的化妆品组合物，其中，所述的化妆品组合物为水包油形式乳液。

3.根据权利要求1所述的化妆品组合物，其中，所述的天然产物提取物为藻类提取物。

4.根据权利要求1所述的化妆品组合物，其中，所述的天然产物提取物为褐藻提取物。

5.根据权利要求1所述的化妆品组合物，其中，所述的天然产物提取物来源于植物的叶、茎、芽、根、或它们的组合物。

6.根据权利要求3～5任一项所述的化妆品组合物，其中，所述的化妆品组合物以水包油乳液的形式存在。

7.根据权利要求1～5任一项所述的化妆品组合物，其中，所述的蛋白分离物还包括白细胞凝集素。

8.根据权利要求1～5任一项所述的化妆品组合物，其中，所述的化妆品组合物还包括抗坏血酸葡糖苷。

9.根据权利要求1～5任一项所述的化妆品组合物，其中，所述的化妆品组合物应用于皮肤时，提高皮肤紧实度、光滑度或两者均有提高。

10.根据权利要求7所述的化妆品组合物，其中，所述的化妆品组合物应用于皮肤时，提高皮肤紧实度、光滑度或两者均有提高。

11.根据权利要求1～5任一项所述的化妆品组合物，其中，所述的鱼卵为鲑鱼卵。

12.根据权利要求7所述的化妆品组合物，其中，所述的鱼卵为鲑鱼卵。

13.一种用于改善皮肤外观的化妆品组合物，其中，所述的化妆品组合物为水包油形式乳液，包括：

鱼卵孵化得到的蛋白分离物，所述的蛋白分离物包括内蛋白酵素作为活性蛋白，所述的蛋白分离物占化妆品组合物总重量的0.0001％到10％；

含有不饱和脂肪酸和甾醇类物质的天然产物提取物；

乳液；以及

抗微生物剂，

生产所述的化妆品组合物的方法包括：

形成至少一水相和至少一疏水相，其中至少一相包括所述的乳化剂，以及至少一相包括所述的天然产物提取物；

组合所有的相以形成一乳液；及

在乳液形成后，在5.5～7.9的pH和40℃或更低的温度以及不存在高剪切混合下加入蛋白分离物至乳液中。

14.根据权利要求13所述的化妆品组合物，其中，所述的鱼卵为鲑鱼卵。

15.根据权利要求13所述的化妆品组合物，其中，所述的化妆品组合物包括抗坏血酸葡糖苷。

16.根据权利要求13所述的化妆品组合物，其中，所述的天然产物提取物来源于红藻、褐藻或成簇状的蓝藻细菌。

17.根据权利要求13～16任一项所述的化妆品组合物，其中，所述的化妆品组合物应用于皮肤时，提高皮肤紧实度、光滑度或两者均有提高。

18.一种生产权利要求1～17任一项所述的化妆品组合物的方法，该方法包括：

形成至少一水相和至少一疏水相，其中至少一相包含乳化剂，至少一相包含抗微生物剂，至少一相包含抗坏血酸葡萄糖苷，以及至少一个所述的相中包含为海藻提取物的天然产物提取物；

组合所有的相以形成一乳液；及

在乳液形成后，在5.5～7.9的pH和40℃或更低的温度以及不存在高剪切混合下加入蛋白分离物至乳液中。