CN114366685B - 一种红三叶草异黄酮植物甾醇脂质体的制备方法及其应用 - Google Patents

一种红三叶草异黄酮植物甾醇脂质体的制备方法及其应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种红三叶草异黄酮植物甾醇脂质体的制备方法及其应用，由0.1％‑2.5％的红三叶草异黄酮、1.5％‑15％的卵磷脂、0.2％‑2.5％的植物甾醇的红三叶草异黄酮组合物通过薄膜分散法制备，本发明制备的脂质体改善了红三叶草异黄酮活性成分的溶解性，解决了红三叶草异黄酮在化妆品配方中的相容性问题，同时也提高了红三叶草异黄酮的稳定性，具有良好的稳定性和安全性以及抗光损伤和光老化的效果，在化妆品领域具有广泛的应用前景。

Description

一种红三叶草异黄酮植物甾醇脂质体的制备方法及其应用
技术领域
本发明涉及化妆品技术领域，具体涉及一种红三叶草异黄酮植物甾醇纳米脂质体的制备方法及应用。
背景技术
皮肤老化分为自然老化和光老化两种表现形式。人的皮肤经日光长期照射后，日光中的紫外线会导致皮肤光老化和光损伤。引起皮肤光老化的主要机制为中波紫外线(UVB)导致的皮肤内活性氧(ROS)过量产生，通过氧化应激反应、皮肤细胞的DNA损伤、细胞凋亡、基质金属蛋白酶作用等，引起炎症损伤、色素沉着、胶原蛋白降解、皱纹加深加粗等现象，甚至诱发一系列皮肤病变。人们通过使用防晒剂、抗氧化剂、抗炎成分或医美手段防止或延缓皮肤光老化和光损伤。其中，来自天然豆科植物中的异黄酮类化合物具有与雌激素类似的结构，有植物雌激素之称，具有良好的抗氧化、抗炎、抗衰老、保湿等性能，能够有效缓解紫外线辐射带来的皮肤光老化和光损伤。
红三叶草(红车轴草)异黄酮是自红三叶草中提取的异黄酮化合物的总称，包括鹰嘴豆芽素A、芒柄花素、染料木素和大豆素等50余种异黄酮化合物。异黄酮化合物存在多酚结构，因此稳定性较差。异黄酮化合物一般难溶于水或不溶于水，易溶于乙醇、甲醇、乙酸乙酯等有机溶剂。
乙醇提取法是目前在工业上应用较为广泛的异黄酮化合物提取方法，文献“正交实验优选红车轴草总异黄酮提取工艺”对红三叶草异黄酮的提取工艺做了优化研究和工艺验证。目前对于红三叶草异黄酮活性成分的研究主要集中于提取及纯化分离工艺和医药、食品等领域的应用，在改善其作为护肤品活性成分的溶解性和透皮吸收效率等化妆品领域的应用研究较少。由于红三叶草异黄酮水溶性和油溶性均较差，在化妆中一般以多元醇类作为溶剂，导致配方应用中有诸多限制，且无法保证其多酚结构的稳定性，易使其失去应有功效。为了改善其溶解性，提升红三叶草异黄酮活性成分在化妆品配方中的相容性，提高它的结构稳定性，一些文献选择脂质体作为红三叶草异黄酮的载体。脂质体具有亲水的内腔和疏水性的双分子层结构，具有两亲性、靶向性、缓释性、无毒安全性等特点。
脂质体的形成为磷脂在水中的自组装过程，在制备时通常会加入两亲性分子胆固醇，来增加脂质体双层的力学稳定性，调节脂质体的流动性和通透性。但摄入过量则会引起高脂血、动脉粥样硬化等病症，严重时可引发癌症。所以研究脂质体中胆固醇稳定剂的替代物也是近年来的研究热点，目前已报道的胆固醇替代品有植物甾醇、菌类甾醇、胆固醇衍生物、皂苷等。植物甾醇和胆固醇的结构类似，可以替换脂质体中的胆固醇。文献“植物甾醇与胆固醇对脂质体膜性质的影响”研究表明，加入植物甾醇后的脂质体在粒径分布均匀性和脂质体稳定性方面更优，且有效地降低了脂质体膜的渗透率，从而提升包封率。植物甾醇具有抑制胆固醇吸收、抗炎等功效，避免了动物来源成分在配方中的添加，十分符合现下天然、绿色、健康产品的发展趋势。而使用植物甾醇作为稳定剂制备天然异黄酮类化合物的脂质体目前未有报道。
因此有必要发明一种植物甾醇作为稳定剂的红三叶草异黄酮脂质体，提高红三叶草异黄酮的稳定性和溶解性。通过脂质体包埋的作用，可使红三叶草异黄酮更易透过角质层，提高红三叶草异黄酮活性成分在皮肤的吸收率，从而可在化妆品终产品配方中减少活性成分用量，既能够节约成本，又能达到更优异的抗光老化和光损伤效果。
发明内容
针对现有技术的缺陷，本发明的目的是提供一种红三叶草异黄酮植物甾醇纳米脂质体的制备方法及应用，具体采用如下技术方案：
首先，本申请提供了一种红三叶草异黄酮植物甾醇纳米脂质体的制备方法，包括以下步骤：
S1：将红三叶草异黄酮组合物加入茄形瓶中，以适量无水乙醇完全溶解；再用旋转蒸发仪除去乙醇溶剂；旋转蒸发期间保持温度小于40℃，优选30-40℃；
所述红三叶草异黄酮组合物组成如下；以质量百分比计，包括0.1％-2.5％的红三叶草异黄酮、1.5％-15％的卵磷脂、0.2％-2.5％的植物甾醇，以无水乙醇补足余量；
所述的植物甾醇为β-谷甾醇、豆甾醇、混合植物甾醇中的任意一种；所述的混合植物甾醇由以下成分组成：以质量百分比计，β-谷甾醇40％-58％、菜油甾醇20％-30％、菜籽甾醇0％-6％，以豆甾醇补足余量，且豆甾醇的质量百分比>15％；
所述卵磷脂为大豆卵磷脂或蛋黄卵磷脂中的任意一种。
S2：蒸干后，在茄形瓶壁上得到均匀薄膜；若形成的薄膜不均匀，则需要以无水乙醇重新溶解后重复步骤S1。
S3：向步骤S2获得均匀薄膜的茄形瓶中加入pH值为6.85的PBS缓冲液，连接至旋转蒸发仪，旋转蒸发温度优选30-40℃，旋转蒸发时间优选30min；旋转蒸发后再将溶液超声分散 (超声功率150w)，超声分散时间优选30min，得到淡黄色均匀的水溶液。
S4：用0.22μm微孔滤膜过滤步骤S3获得的水溶液，以达到除菌的效果，滤液即为红三叶草异黄酮植物甾醇脂质体水溶液。
优选地，所述的红三叶草异黄酮优选红车轴草(TRIFOLIUM PRATENSE)提取物，其中总异黄酮含量优选20％(质量百分数)。
其次，本申请还提供了上述方法获得的红三叶草异黄酮植物甾醇脂质体在化妆品中的应用，所述化妆品的剂型为固体剂型或液体剂型，包括溶液、凝胶、乳液、膏霜、面膜贴等。
与现有技术相比，本发明具有如下的有益效果：
(1)本发明制备的红三叶草异黄酮植物甾醇脂质体使用对人体健康更加有益的植物甾醇作为脂质体稳定剂，解决了红三叶草异黄酮结构稳定性和溶解性差的问题，使红三叶草异黄酮活性成分更易于透过皮肤角质层，提高了红三叶草异黄酮活性成分在皮肤的吸收率。
(2)本发明的制备方法使用乙醇作为分散溶剂，避免了化妆品禁用的有机溶剂残留问题。本发明制备的红三叶草异黄酮植物甾醇脂质体所使用的稳定剂为植物甾醇，使脂质体具有优异的稳定性和均匀的粒径分布，有效降低了脂质体膜的渗透性，提高红三叶草异黄酮的包封率，避免活性成分的析出。
(3)本发明制备的红三叶草异黄酮植物甾醇脂质体溶液稳定性强，对人体安全无害，无皮肤刺激性，有抗UVB致皮肤成纤维细胞氧化损伤作用，除皱效果人体测试也表明，红三叶草异黄酮植物甾醇脂质体具有一定的抗光老化和光损伤的功效。
附图说明
图1为受试者面部色素斑改善示意图。
图2为受试者面部纹理皱纹改善照片。
具体实施方式
下面结合具体实施例，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
本发明使用的主要实验材料及来源：
Figure BDA0003429547620000031
Figure BDA0003429547620000041
本发明使用的主要实验仪器：
旋转蒸发仪；超声分散仪；恒温培养箱；皮肤斑试器Finn Chamber on Scanpor；紫外- 可见分光光度仪。
实施例红三叶草异黄酮植物甾醇脂质体的制备方法如下：
S1：将不同配比的(表1)红三叶草异黄酮、卵磷脂、植物甾醇加入250mL茄形瓶中，以适量无水乙醇溶解完全，用旋转蒸发仪除去乙醇溶剂；
S2：蒸干后，在茄形瓶壁上得到均匀薄膜；若形成的薄膜不均匀，则需要以无水乙醇重新溶解后重复步骤S1；
S3：向茄形瓶中加入pH值为6.85的PBS缓冲液50mL，连接至旋转蒸发仪，使成膜的组合物与PBS水溶液充分接触并分散，缓慢旋转后再将溶液超声分散(超声功率150w)，得到淡黄色均匀的水溶液；
S4：用0.22μm微孔滤膜过滤除菌，滤液即为制备的红三叶草异黄酮植物甾醇脂质体水溶液。
红三叶草异黄酮植物甾醇脂质体各个实施例和对比例的制备方法如表1所示。
表1红三叶草异黄酮植物甾醇脂质体的制备方法
Figure BDA0003429547620000042
Figure BDA0003429547620000051
试验例1红三叶草异黄酮植物甾醇脂质体的稳定性评价
参考T/SHFCA 002-2021《化妆品稳定性试验指导原则》中的方法对红三叶草异黄酮植物甾醇脂质体进行稳定性评价。
1.测试项目及操作步骤
1.1影响因素试验
1.1.1高温稳定性
将样品放置密封洁净容器中，再置于预先调节至(45℃±2℃)的恒温培养箱内，放置30 天，于第5、10、20、30d取样，测试结束后恢复至室温观察气味、颜色、有无沉淀分层等。
1.1.2变温稳定性
将样品放置密封洁净容器中，再置于预先调节至(45℃±2℃)的恒温培养箱内，存放24h 后取出，移入预先调节至(-5℃±2℃)的冰箱内存放24h后取出，再次移入(40℃±2℃)恒温培养箱中存放24h，又再次取出放入(-5℃±2℃)冰箱中存放24h，依此循环5-7次，测试结束后恢复至室温观察气味、颜色、有无沉淀分层等。
1.2加速稳定性试验
样品置恒温恒湿箱，在40℃±2℃、相对湿度75％±5％条件下进行6个月试验。检测至少4个时间点(如1、2、3、6m)，恢复至室温与0m进行比较，观察气味、颜色、有无沉淀分层等。
1.3长期稳定性试验
样品置恒温恒湿箱，在温度25℃±2℃，相对湿度60％±10％条件下进行24个月试验。分别于3、6、9、12、18、24m取样，恢复至室温与0m进行比较，观察气味、颜色、有无沉淀分层等。
2.试验结果
上述实施例红三叶草异黄酮植物甾醇脂质体的稳定性评价试验结果见下表2。
表2红三叶草异黄酮植物甾醇脂质体的稳定性评价试验结果
样品名称 高温稳定性 变温稳定性 加速稳定性 长期稳定性
实施例1 稳定 浑浊 稳定 稳定
实施例2 浑浊 浑浊 稳定 稳定
实施例3 稳定 稳定 稳定 稳定
实施例4 浑浊 浑浊 稳定 稳定
实施例5 稳定 稳定 稳定 稳定
实施例6 稳定 浑浊 稳定 稳定
实施例7 稳定 浑浊 稳定 稳定
实施例8 浑浊 浑浊 稳定 稳定
实施例9 稳定 稳定 稳定 稳定
对比例1 稳定 稳定 稳定 稳定
对比例2 浑浊 浑浊 浑浊 浑浊
对比例3 浑浊 浑浊 浑浊 浑浊
对比例4 浑浊 浑浊 浑浊 浑浊
对比例5 稳定 浑浊 稳定 稳定
对比例6 稳定 浑浊 稳定 稳定
对比例7 浑浊 浑浊 浑浊 浑浊
由上述结果可以看出实施例3、实施例5、实施例9和对比例1(空白)在各个稳定性评价试验中均未发生异常，具有很好的稳定性。
试验例2：红三叶草异黄酮植物甾醇脂质体安全性评价
本试验例皮肤封闭型斑贴试验参考《化妆品安全技术规范》中提供的皮肤封闭型斑贴试验方法来测试红三叶草异黄酮植物甾醇脂质体对人体皮肤的刺激性。
1.材料及试剂
1.1斑试器
本实验选用国际标准Finn-Chamber，铝制材料，直径7mm，加样剂量15μl。
1.2斑试物及浓度
十二烷基硫酸钠是经典的皮肤刺激试验物，使用1％的SLS水溶液作为阳性对照，生理盐水或蒸馏水作为阴性对照。
1.2受试者
共选择30名健康受试者，其中女15例，男15例，年龄20～48岁，平均为(27.07±20.80) 岁。2个月内使用过糖皮质激素、非甾体抗炎药及抗组胺药物者不作为受试者，另外，哺乳或妊娠期妇女、皮肤疾病、晒斑、瘢痕体质或过度文身及遗传过敏体质者均不作为受试者。所有受试者在试验前均签订知情同意书。
2.操作方法
2.1斑试器操作步骤
选择受试者的上臂屈侧为封包斑贴试验部位，在斑试器后面用铅笔按顺序自上到下，自左到右做好标记。除去斑试器上面的铜版纸，将待测样品溶液(15ul)放入小铝室中，涂抹均匀。将已涂好化学试剂的斑试器贴于患者皮肤上，自下而上贴牢，贴平，并用手掌轻轻压几下以便排出空气，24小时后取下斑试器。为避免因斑试器压迫所造成的假象，分别于去除受试物斑试器后30min(待压痕消失后)、24h和48h后观察皮肤反应，并记录观察结果。
2.2结果评价方法
根据皮肤的反应来确定受试物是否为致敏原，按照0-4分五个标准级别进行目测评分，每个等级分数所代表的皮肤反应含义如下：
0分代表阴性反应(—)，对皮肤无刺激性；
1分代表可疑反应(±)，皮肤仅有微弱红斑；
2分代表弱阳性反应(+，红斑反应)，皮肤出现红斑、浸润、水肿、可有丘疹；
3分代表强阳性反应(++，疱疹反应)，皮肤出现红斑、浸润、水肿、丘疹、疱疹，反应可超出受试区；
4分代表极强阳性反应(+++，融合性疱疹反应)，皮肤出现明显红斑、严重浸润、水肿、融合性疱疹，反应超出受试区。
2.3斑试试剂样品
以实施例3、5、9制备方法制备的红三叶草异黄酮植物甾醇脂质体作为斑贴试验的样品，每个实施例样品共设置三个平行样；
以1％的十二烷基硫酸钠作为阳性对照。
以生理盐水或蒸馏水作为阴性对照。
3.试验结果
采用斑试器进行红三叶草异黄酮植物甾醇脂质体皮肤刺激性试验的结果如表3所示。
所有受试者阳性对照为4分，阴性对照为0分。
表3红三叶草异黄酮植物甾醇脂质体皮肤刺激性试验结果
Figure BDA0003429547620000081
Figure BDA0003429547620000091
由上述结果可以看出，实施例3、实施例5、实施例9均为阴性反应，未对皮肤产生刺激性，应用于化妆品中具有良好的安全性能。
试验例3红三叶草异黄酮植物甾醇脂质体的抗光老化能力评价
本试验例采用UVB辐射人皮肤成纤维细胞，研究红三叶草异黄酮植物甾醇脂质体的抗光老化能力。
1.材料及试剂
人皮肤成纤维细胞(ESF-1)(购自ATCC细胞库)；DMEM培养液(购自麦克林公司，DMEM/F-12(1:1)培养基,含L-谷氨酰胺,不含HEPES缓冲液)、胰蛋白酶、PBS缓冲液；维生素E(阳性样品)。
2.试验操作
2.1光照操作
将处于对数生长期的ESF-1用0.25％胰酶消化后接种于96孔板，培养24h。待细胞全部贴壁后移除培养液，每孔加入100μL PBS缓冲液，置于强度为70mJ·cm-2的中波紫外光下照射，用紫外线强度检测仪监测强度，空白组不予照射。各试验组移除PBS缓冲液后，按照试验分组加入相应DMEM培养液或含药DMEM培养液继续培养。
2.2试验分组
将处于对数生长期的ESF-1接种于96孔板，分为空白组、对照组、维生素E组(阳性组)、给药组，各组均设5个复孔。空白组给予DMEM培养48h，对照组、维生素E组、给药组于70mJ cm-2的UVB照射后，分别给予DMEM培养液、含维生素E 500μg mL-1DMEM培养液、含红三叶草异黄酮植物甾醇脂质体(实施例3、实施例5、实施例9)500μg mL-1DMEM培养液继续培养。
2.3指标测定
取各组细胞上清液，按照SOD、MDA、GSH-PX试剂盒说明书进行操作，分别测定其指标变化，以考察红三叶草异黄酮植物甾醇脂质体抗UVB所致细胞氧化损伤。
2.4数据处理
采用SPSS 21.0统计软件进行分析。两组间比较用独立样本t检验，P<0.05说明差异有显著性意义。
3.实验结果
表4红三叶草异黄酮植物甾醇脂质体对皮肤成纤维细胞SOD、MDA、GSH-PX水平的影响
Figure BDA0003429547620000101
由上述结果可以看出，与空白对照组比较，对照组SOD、GSH-PX水平显著下降，MDA水平显著升高(P<0.05)，表明光照有效。与对照组比较，维生素E(阳性对照)组SOD、GSH-PX组水平升高，MDA水平明显下降，说明阳性对照组具有参考价值。实施例3、实施例5、实施例9与阳性对照组的结果类似，SOD、GSH-PX组水平升高，MDA水平明显下降，说明红三叶草异黄酮植物甾醇脂质体有抗UVB致皮肤成纤维细胞氧化损伤作用。
试验例4红三叶草异黄酮植物甾醇脂质体的除皱抗衰功效评价
1.试验方法
1.1人员选取
选取60位年龄在30-50岁之间的女性志愿者，随机分为两组，分别为对照组和实验组，每组30人，分别在脸部使用各组测试样品，每天早晚各使用1次，共使用4周。
对照组志愿者每日在脸部使用正常的保湿功效护肤品，实验组志愿者共30人，分为3小组，10人一组，每日除了使用正常保湿功效护肤品外，分别在面部涂抹使用红三叶草异黄酮植物甾醇脂质体溶液样品(实施例3、实施例5、实施例9)，每人每次使用量为1ml。
1.2观察指标及评价
VISIA皮肤分析评价：受试志愿者面部清洁后采用VISIA面部图像分析仪进行面部拍摄，分析面部色素斑、纹理皱纹的检测数据，数值越高代表色素斑、纹理的现象越明显。一个疗程 (4周)结束后将VISIA面部图像分析仪得到的信息与治疗前的信息进行对比，分析受试志愿者的面部色素斑、纹理和皱纹的改善情况。
2.试验结果
受试者面部色素斑改善示意图如图1所示，其中(a)为受试者使用实施例样品9前面部纹理皱纹分布，(b)为使用实施例样品9四周后面部纹理皱纹分布。
受试者面部纹理皱纹改善照片如图2所示，其中，(a)为使用实施例样品9前面部色素斑分布，(b)为使用实施例样品9四周后面部色素斑分布。
受试者面部色素斑及纹理皱纹改善情况的统计数据如表5所示。
表5受试者面部色素斑及纹理皱纹改善情况
Figure BDA0003429547620000111
由图1、2以及表5结果可知，实施例3、实施例5、实施例9实验组受试者使用期间无不良反应发生。与对照组相比，实施例3、实施例5、实施例9的受试者皮肤色素斑明显减少，面部皮肤皱纹减少量显著，疗效评价为有效。说明本发明所制备的红三叶草异黄酮植物甾醇脂质体具有一定的除皱抗衰功效，能够解决皮肤光老化和光损伤带来的皮肤衰老问题。
对于本领域技术人员而言，显然本发明不限于上述示范性实施例的细节，而且在不背离本发明的精神或基本特征的情况下，能够以其他的具体形式实现本发明。因此，无论从哪一点来看，均应将实施例看作是示范性的，而且是非限制性的，本发明的范围由所附权利要求而不是上述说明限定，因此旨在将落在权利要求的等同要件的含义和范围内的所有变化囊括在本发明内。
此外，应当理解，虽然本说明书按照实施方式加以描述，但并非每个实施方式仅包含一个独立的技术方案，说明书的这种叙述方式仅仅是为清楚起见，本领域技术人员应当将说明书作为一个整体，各实施例中的技术方案也可以经适当组合，形成本领域技术人员可以理解的其他实施方式。

Claims (5)

1.一种红三叶草异黄酮植物甾醇脂质体的制备方法，其特征在于，具体步骤如下：
S1：将红三叶草异黄酮组合物加入茄形瓶中，以无水乙醇完全溶解，再旋转蒸发除去无水乙醇；
所述红三叶草异黄酮组合物加入所述无水乙醇后的组成如下；以质量百分比计，0.1%-0.15%的红三叶草异黄酮、1.5%的卵磷脂、0.2%-0.25%的植物甾醇，以无水乙醇补足余量；
所述的植物甾醇为β-谷甾醇、豆甾醇、混合植物甾醇中的任意一种；
所述的混合植物甾醇由以下成分组成：以质量百分比计，β-谷甾醇40%-58%、菜油甾醇20%-30%、菜籽甾醇0%-6%，以豆甾醇补足余量，且豆甾醇的质量百分比>15%；
所述旋转蒸发温度为30-35℃；
S2：步骤S1旋转蒸发后，茄形瓶壁上得到均匀薄膜；
S3：向步骤S2获得均匀薄膜的茄形瓶中加入PBS缓冲液，旋转蒸发后超声分散，超声功率150w，得到水溶液；旋转蒸发时间为30min，温度为30-35℃；超声分散时间为30min；
S4：过滤步骤S3获得的水溶液，滤液即为红三叶草异黄酮植物甾醇脂质体。
2.根据权利要求1红三叶草异黄酮植物甾醇脂质体的制备方法，其特征在于，所述红三叶草异黄酮为红车轴草提取物。
3.根据权利要求1红三叶草异黄酮植物甾醇脂质体的制备方法，其特征在于，所述卵磷脂为大豆卵磷脂或蛋黄卵磷脂中的任意一种。
4.根据权利要求1红三叶草异黄酮植物甾醇脂质体的制备方法，其特征在于，步骤S4所述过滤是指，以0.22μm微孔滤膜过滤步骤S3获得的水溶液。
5.如权利要求1-4任一方法获得的红三叶草异黄酮植物甾醇脂质体在制备化妆品中的应用。
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