CN105025906B - 来自鱼孵化液的化妆品组合物 - Google Patents

Abstract

本发明涉及获得或可获得自鱼孵化液的药学或化妆品组合物，其包括多肽或其部分，和所述组合物在各种皮肤医学和化妆品应用中的用途，尤其用于使皮肤增湿和/或用于剥离皮肤的表皮角质层，用于治疗或预防动物的皮肤不适或病况。

Description

来自鱼孵化液的化妆品组合物

本发明涉及产生包括多肽和/或多肽部分的组合物的方法，所述多肽和/或多肽部分可源自鱼孵化液，和其在对皮肤的各种应用中的用途。尤其，包括所述多肽和/或多肽部分的组合物可用于治疗各种医学和美容皮肤不适或病况。

皮肤是身体更容易受伤害的器官之一。尽管很少威胁生命，皮肤不适或病况可能是不舒服的并且可造成慢性障碍。另外，因为皮肤是可见的，皮肤不适和病况可导致心理压力。所以持续需要皮肤病况和不适的有效的疗法。

皮肤形成身体的最大器官，占人体重的约12-16％。其起到许多关键的作用，作为外界和身体内受控的环境之间的屏障和调节影响。

皮肤由3层即表皮、真皮和下皮层组成。表皮是皮肤的最上上皮层。其用作物理屏障，防止水从身体的丧失，和防止物质和生物体进入身体。其厚度根据身体的位点而改变。

表皮由复层鳞状的上皮细胞组成，即其由扁平细胞层组成。皮肤、头发和指甲是角质化的，意思是它们具有由称为角蛋白的蛋白质组成的死的、硬化的疏水表面。表皮是不可渗透的，原因是其与角质细胞关联的细胞外脂质的含量，尤其在表皮的中层(透明层)。粘膜(例如食道粘膜、口腔咽腔粘膜、生殖器官粘膜和其他的粘膜)主要是非角质化的和潮湿的。表皮具有三种主要类型的细胞，即角质细胞(皮肤细胞)、黑色素细胞(产色素细胞)和朗格汉斯细胞(免疫细胞)。默克尔细胞是第四较不流行的表皮细胞。

随着角质细胞向外移动，它们成熟和与角蛋白的积聚一起分化。它们最终脱落或擦掉。它们形成四个或五个不同的层，其从最外至最深是(i)角质层(表皮角质层)，其具有没细胞核的死、干燥的硬细胞，(ii)颗粒层(粒层)，其具有包含嗜碱性颗粒的细胞并且向外通过薄的透明层与角质层分开，(iii)棘层(尖头、刺状或棘细胞层)，其中随着它们向上移动细胞逐渐变成扁平的和(iv)基底层(基层)，其具有柱状(高的)再生细胞。

就在表皮之下是基底膜——位于表皮和真皮之间的专用结构。

真皮是皮肤的纤维结缔组织或支持层。主要纤维是相互编织的胶原纤维和弹性蛋白。

下皮层是就在真皮和表皮之下的脂肪层。其也称为皮下组织，下皮组织或膜。下皮层由脂肪细胞(脂细胞)、神经和血管组成。

新上皮皮肤细胞在皮肤的下层、颗粒层中产生。随着时间的推移，细胞迁移至皮肤的表面并且变得更加酸性。在它们30天的行程期间，它们死亡并且充满角蛋白。角蛋白和相关的脂质是重要的，因为它们保护皮肤避免外侧成分。

疾病、损伤、环境因素、年龄、激素水平、药物、外部施加的或摄入的物质、遗传情况或各种其他因素可导致皮肤的异常机能，产生不规则或异常。一些这样的不规则或异常可能本质上纯粹是美容的，例如干燥皮肤，皱纹或改变的色素沉着，或可更严重导致疼痛或不适，例如湿疹和牛皮癣。

干燥皮肤是一种最常见的皮肤病况或异常。尽管某些个体更容易遭受干燥皮肤，但是该病况可影响任何人，无论年龄、性别或皮肤类型。

当皮肤外层(具有透明层的角质层)缺水时出现干燥皮肤。当该层充分湿润时，使得通过皮肤的水分丧失最小化并且有助于抵抗刺激物、过敏原和细菌。但是，当角质层干燥时，其保护功能降低。这使得更多的水分丧失，使得皮肤更容易遭受环境因素的影响。

在正常情况下，角质层的水含量为10％至30％。该水分赋予皮肤其柔软、平滑和柔性质地。水分来自大气、皮肤的下层和汗液。通过皮肤腺产生的油和通过皮肤细胞产生的脂肪物质用作天然保湿剂，允许角质层密封在水中。

身体持续从皮肤表面通过蒸发丧失水分。在正常情况下，丧失速度缓慢，和水充分被替换。当水分丧失超过水分替换，并且角质层的水含量下降低于10％时，出现干燥皮肤的特征性信号和症状。

非常需要改善或根除干燥皮肤的保湿剂。尽管许多保湿剂是本领域已知的，仍需要有效且温和的天然产物。

另一常见的皮肤异常或病况是皮肤过量的表皮角质层。这可源自待脱落表皮角质层的障碍或通过表皮角质层中过度角蛋白沉积。当皮肤腐蚀的天然过程不均匀时，可出现前者，其产生皮肤干燥和粗特性。良性过度增生不适包括表皮松懈过度角化(或开裂皮肤)和毛囊角化症。一种常见的良性过度增生病况是围绕伤疤的外周肥大和/或瘢痕疙瘩的形成。其他过度增生病况是鸡眼、胼胝、角化过度的疣(尤其寻常疣)、鱼鳞癣和掌跖角化病。

目前的疗法涉及在极端情况下的剥离或外科手术。过度角化通过软化表皮角质层和去除增厚的皮肤来治疗。

剥离也可用于去除受损的表皮细胞，例如来自表皮展示色素沉着不适，例如雀斑的表皮细胞。

剥离去除表皮的外层显示下方更新的皮肤细胞。剥离可通过物理手段(即皮肤的磨损)或通过化学手段实现。化学去角质剂包括擦洗剂，其包含水杨酸、乙醇酸、水果酶、柠檬酸或苹果酸并且可通过皮肤科医生以高浓度施用，或在非处方产物中以低浓度施用。化学剥离可涉及使用包含α羟基酸(AHAs)或β羟基酸(BHAs)的产物，或用于使在细胞连接处将细胞保持在一起的胶样物质松弛的酶，允许它们容易去除。该类型的剥离被推荐用于人们治疗痤疮。

剥离的最大劣势是用于实现剥离的一些产物和方法的昂贵价格。剥离将导致皮肤的一些初始泛红。接近化学剥离结束时，霜冻皮肤，皮肤表面的颜色从亮白色变化为灰色。所以，需要对皮肤温和的更有效的方法。

因此，仍需要适于使皮肤增湿和/或用于剥离皮肤的表皮角质层的疗法。

某些多肽和肽(例如多肽部分)其出现在鱼孵化液中，现在已经令人吃惊地发现是显著有效的保湿剂和去角质剂。通常称为孵化酶的各种酶促进来自卵生脊椎动物生物体例如鱼、两栖动物、鸟和爬行动物的胚胎的孵化，所述酶能够部分或完全降解蛋壳的蛋白质部分。所有脊椎动物的卵母细胞具有特征性细胞外包膜，称为卵黄包膜、蛋壳或绒膜(本文可替换使用)，其通过各种多肽的交联形成。具有不同特异性的蛋白酶作用在绒膜上，软化、腐蚀和/或分解(即降解)蛋壳并且利于胚胎的释放。因此，在孵化过程期间从卵释放的流体和/或孵化胚胎的流体(即孵化液)包括大量的多肽和多肽部分，即降解产物。

本发明人已经确定鱼孵化酶和产生自降解蛋壳的蛋壳多肽(尤其所述蛋壳多肽的部分或片段)的具体组合物，尤其适于使皮肤增湿和/或用于剥离皮肤的表皮角质层。

至少部分通过所谓的孵化酶实现或促进胚胎的孵化。例如，鱼卵壳溶解素通常是孵化液中出现的金属蛋白酶。卵壳溶解素一般以两种形式出现，即高卵壳裂解酶(卵壳溶解素H，HCE)和低卵壳裂解酶(卵壳溶解素L，LCE)，它们的一些结构和催化特征类似并且属于龙虾肽酶家族但是具有明显不同的底物偏好。也已经鉴定和表征了具有其他催化活性的孵化酶，例如丝氨酸蛋白酶。

尽管不希望被理论限制，实施例表明包括孵化酶，金属蛋白酶和丝氨酸蛋白酶二者的组合，和部分来自鲑科孵化液的蛋壳蛋白质的组合物能够使皮肤增湿和/或用于剥离皮肤的表皮角质层。

来自其他鱼的孵化液包含功能上与来自鲑科的孵化液中出现的多肽相同的多肽。

认为本文限定的组合物中孵化酶和多肽降解产物(例如蛋壳多肽和所述多肽的部分)的组合可与皮肤的真皮和表皮中出现的不同类型的蛋白质相互作用。相信多肽和多肽部分的独特组合可协同作用并且这些相互作用可负责组合物治疗各种皮肤不适或病况中的作用。

因此，最宽泛地，本发明可涉及提供通过下文描述的方法源自鱼孵化液的组合物。所述组合物包括金属蛋白酶、丝氨酸蛋白酶和一个或多个蛋壳多肽和/或所述多肽的部分。尤其，组合物通过使皮肤增湿和/或剥离皮肤，用于治疗皮肤的各种异常、不适或病况，或治疗皮肤的各种异常、不适或病况的方法，如下文所描述。换句话说，如本文所描述的组合物用于治疗病况或不适或治疗病况或不适的方法，比如干燥皮肤，其中表皮角质层比期望的更厚的皮肤，例如过度角化病况中，或表皮中具有非期望的色素沉着的皮肤，例如雀斑、老年斑、太阳斑或褐斑。在尤其优选的方面中，本发明可视为提供组合物源自孵化液，如本文所描述，用于美容治疗正常的但是干燥皮肤或增厚的皮肤，或美容治疗正常的但是干燥皮肤或增厚的皮肤的方法(比如胼胝、鸡眼或角化过度的疣)或美容治疗色素沉着不适，比如雀斑。在另一优选的方面中，本发明可视为提供源自孵化液的组合物，如本文所描述用于治疗性治疗皮肤不适或病况，或治疗性治疗皮肤不适或病况的方法，比如产生疼痛的的痤疮、湿疹、牛皮癣或疣。上面提到的组合物本文也称为“孵化液提取物”。除了孵化酶和蛋壳多肽和肽，所述提取物可包括天然非蛋白质材料。

从下面的公开内容可见，源自鱼孵化液的组合物，如本文所描述，可提供为药学或化妆品组合物，其包括一种或多种药学上可接受的赋形剂和/或稀释剂。

因此，在一个方面中，本发明提供了从鱼孵化液制备如本文所描述的药学或化妆品组合物的方法，所述方法包括至少下述步骤：

a)将鱼卵悬浮在最小体积的水中(例如等于或小于卵的体积)；

b)诱导所述卵的同步快速孵化，优选地使得对于大于80％的胚胎在小于6小时内完成孵化；

c)任选地过滤孵化的卵，以获得孵化液；和

d)过滤b)或c)的孵化液，以获得组合物，其中过滤孵化液的步骤包括至少下述步骤：

(i)使用过滤器过滤孵化液，和收集滤液，所述过滤器的孔径大小为至少5μm，优选地5-15μm，和尤其优选地孔径大小为7μm；

(ii)任选地使用过滤器过滤来自步骤(i)的滤液，和收集滤液，所述过滤器的孔径大小为0.30-0.60μm，优选地孔径大小为0.35-0.55μm，尤其优选地0.40-0.50μm，最优选地0.45μm；

(iii)使来自步骤(i)或(ii)的滤液进行离子交换层析，其包括：

(1)将滤液加载至离子交换柱，比如DEAE(二乙氨乙基)柱；

(2)用适当的缓冲液冲洗柱，例如pH为7-9的的缓冲洗液，例如包括20mM Tris-HCl，pH 8.5；

(3)使用第一洗脱缓冲液或溶剂(例如离子强度小于步骤(4)的第二洗脱缓冲液)，比如进一步包括盐，例如浓度为50-100mM的缓冲洗液，例如50mM NaCl，从柱洗脱多肽(尤其白细胞凝集素多肽)；

(4)使用第二洗脱缓冲液或溶剂(例如离子强度大于步骤(3)的第一洗脱缓冲液)，比如包括比第一洗脱缓冲液更高浓度的盐，例如浓度为500mM至2M的缓冲洗液，例如1MNaCl，从柱洗脱剩余多肽；

(5)从步骤(4)收集洗脱液；

e)用药学上(或美容)可接受的缓冲液交换来自步骤(5)的洗脱液中的水；

f)使用过滤器过滤获得自步骤(e)的溶液，和收集滤液，所述过滤器的孔径大小为0.15-0.30μm，优选地孔径大小为0.22μm；和

g)从来自步骤(f)的滤液制备所述药学或化妆品组合物。

如本文所提及，“孵化液”是在孵化过程期间从卵释放的流体并且可以为粗、稀释的或过滤形式。粗孵化液指未稀释的、未处理的流体。稀释孵化液指在孵化期间或之后可能已经与其他流体混合的孵化液，例如当孵化在水中进行时。

本发明也提供了通过本文所述的方法获得或获取的药学或化妆品组合物。

滤液进行离子交换层析的步骤可使用任何适当的方法进行，其产生滤液，其中本发明组合物中在纯化之前(即离子交换层析之前)相对于孵化液提取物存在的至少一种其他多肽的富含多肽(包括其部分，如下面所定义)。例如，离子交换层析可产生终洗脱液(即使用第二洗脱缓冲液获得的洗脱液)，其中孵化液中的孵化酶和蛋壳多肽在该纯化步骤之前富含至少5％相对于孵化液中存在的至少一种其他多肽，优选地孵化液提取物中存在的所有其他多肽。其他多肽可定义为不落在用于如本文定义的本发明方法的组合物中多肽(即孵化酶或蛋壳多肽或其部分)的结构和/或功能定义的多肽。本发明的药学或化妆品组合物(即通过本文所述的方法获得或获取)不包含白细胞凝集素多肽，其在下方进一步定义。优选地，通过该步骤，多肽富集至少10、20、30、40或50％。尤其优选地，相对于孵化液中存在的至少一种其他多肽提取物在纯化之前，例如白细胞凝集素，多肽被纯化至纯度大于50或60％，例如>70、80或90％，优选地大于95或99％纯度的程度。因此，在离子交换层析之前，洗脱液可包括仅仅痕量的其他多肽，比如孵化液中存在的白细胞凝集素，例如小于0.1％、0.01％、0.001％、0.0001％或0.00001％w/w。

离子交换层析是本领域熟知的并且适当的离子交换柱是商业上可得的。在示例性实施方式中，离子交换柱是DEAE(二乙氨乙基)柱，即已经于DEAE偶联的惰性基质，比如纤维素、二氧化硅、琼脂糖等的柱。但是，其他离子交换柱可适于用于上述方法。

将过滤孵化液装载至离子交换柱的步骤包括将孵化液施加至离子交换柱，所述离子交换柱已经被制备或活化使得其能够结合本发明组合物中的多肽。制备或活化离子交换柱通常涉及用缓冲液冲洗柱，例如下方定义的冲洗缓冲液。该预冲洗步骤产生处在最佳条件，例如pH下的离子交换柱，确保多肽结合柱。因此，装载步骤可视为将本发明组合物多肽结合至离子交换柱的步骤。

在将过滤孵化液装载至离子交换柱步骤之后，并且根据标准方案，可用适当的缓冲液冲洗柱，以去除孵化液中存在的未与柱结合的有害组分。冲洗包括施加一定体积的冲洗缓冲液至柱，通常施加至柱的冲洗缓冲液体积至少等于离子交换柱的体积并且可以更多，例如柱体积的至少1.5、2、3、4或5倍。在一些实施方式中，冲洗步骤可重复，例如2、3、4、5或更多次。任何适当的冲洗缓冲液可用在本发明的方法中。适当的冲洗缓冲液是不明显破坏感兴趣的多肽的和离子交换柱之间相互作用的冲洗缓冲液，例如小于10％，例如小于5、4、3、2或1％的本发明组合物的多肽通过每次冲洗步骤从离子交换柱去除。在优选的实施方式中，冲洗缓冲液是范围是10-100mM，优选地10-50mM，例如20-30mM的Tris-HCl的溶液，pH范围是6-10，优选地7-9，例如8.5。可收集来自冲洗步骤的流出物，例如确定是否需要进一步的冲洗步骤(例如测试表示纯化之前孵化液中存在的有害组分多肽、多糖、盐等的存在)和/或丢弃。

从离子交换柱(“第一”洗脱步骤)洗脱白细胞凝集素多肽的步骤可通过任何适当的方式进行并且通常涉及施加溶剂或溶液至柱，以破坏至少白细胞凝集素多肽和离子交换柱之间的相互作用，即第一洗脱溶液(例如缓冲液)或溶剂。但是，第一洗脱溶剂或溶液不足以破坏感兴趣的多肽和离子交换柱之间的相互作用，例如总共小于10％，例如小于5、4、3、2或1％的本发明组合物的多肽通过洗脱步骤从离子交换柱去除，以洗脱白细胞凝集素多肽。通常施加至柱的第一洗脱缓冲液或溶剂的体积至少等于离子交换柱的体积并且可更多，例如至少1.5、2、3、4或5倍柱体积。在一些实施方式中，“第一”洗脱步骤(即使用第一洗脱溶液或溶剂)可重复，例如2、3、4、5或更多次。可从每个洗脱步骤收集包含白细胞凝集素多肽的洗脱液(来自“第一”洗脱步骤的流出物)。可选地或另外，丢弃包含白细胞凝集素多肽的洗脱液。适当的第一洗脱缓冲液或溶剂是破坏白细胞凝集素多肽和离子交换柱之间相互作用的脱缓冲液或溶剂，例如至少70％，优选地至少75、80、85、90、95或99％的与柱结合的白细胞凝集素多肽通过每次洗脱步骤从柱洗脱。

在优选的实施方式中，第一洗脱缓冲液与冲洗缓冲液相同，也包括能够破坏白细胞凝集素多肽和离子交换柱之间相互作用的物质，例如盐，以提供低离子强度(相对于第二洗脱缓冲液)。盐可存在的范围是10-500mM，优选地20-400mM、30-300mM、40-200mM或50-100mM，例如50mM NaCl。因此，在一些实施方式中，洗脱缓冲液的范围是10-100mM，优选地10-50mM，例如20-30mM的Tris-HCl的溶液，pH范围是6-10，优选地7-9，例如8.5，也包括如上述范围的盐，例如NaCl、KCl等。

从离子交换柱洗脱本发明组合物的多肽的步骤(“第二”或“终”洗脱步骤)可通过任何适当的方式进行并且通常涉及施加溶剂或溶液至柱，以破坏感兴趣的多肽的和离子交换柱之间的相互作用。通常，施加至柱的洗脱缓冲液或溶剂的体积至少等于离子交换柱的体积并且可更多，例如至少1.5、2、3、4或5倍柱体积。在一些实施方式中，“第二”洗脱步骤(即使用第二洗脱溶液或溶剂的步骤)可重复，例如2、3、4、5或更多次。可从每次洗脱步骤收集洗脱液并且在交换水步骤之前，在洗脱液中可组合一个或多个洗出液。适当的洗脱缓冲液或溶剂是破坏本发明组合物的多肽和离子交换柱之间相互作用的洗脱缓冲液或溶剂，例如至少70％，优选地至少75、80、85、90、95或99％的与柱结合的本发明组合物的多肽通过每次“第二”洗脱步骤，从柱洗脱。

在优选的实施方式中，第二洗脱缓冲液与冲洗缓冲液相同，也包括能够破坏感兴趣的多肽的和离子交换柱之间的相互作用的物质，例如盐，以提供比第一洗脱缓冲液更高的离子强度。盐可存在的范围是500-2000mM，优选地600-1800mM、700-1700mM、800-1500mM或900-1200mM，例如约1000mM NaCl。因此，在一些实施方式中洗脱缓冲液的范围是10-100mM，优选地10-50mM，例如20-30mM的Tris-HCl的溶液，pH范围是6-10，优选地7-9，例如8.5，也包括盐，例如如上述范围的NaCl、KCl等。

交换滤液中水的步骤可使用本领域已知的任何适当的方法进行，例如渗滤或透析。在尤其优选的实施方式中，该步骤使用渗滤使用过滤器进行，所述过滤器的排阻尺寸小于12kDa，优选地10kDa或更小，例如9、8、7、6、5、4、3kDa或更小。

渗滤使用超滤膜，以从溶液去除例如盐或其他有害的或非期望的微溶质或作为交换溶液的溶剂，例如缓冲液的方式。小分子与溶液分开，而将更大的分子保留在截留物质(不穿过过滤器的材料)中。微溶质和溶剂，例如水，一般容易冲洗通过膜。通常约3体积的渗滤溶剂(例如磷酸缓冲生理盐水)消除95％的微溶质。因此，来自步骤(5)的上述滤液，即洗出液，初始通过渗滤处理和这导致截留物质的浓度与穿过膜的溶液(其包含孵化液的可溶性杂质/有害的组分)成比例。然后用药学上可接受的缓冲液稀释截留物质，例如0.5mM磷酸钠和1mM氯化钠、磷酸缓冲盐溶液等。如果需要，稀释截留物质可进行重复轮的渗滤。典型地，在步骤(f)之前，稀释截留物质使得来自步骤(f)的滤液的酶活性为25000-45000mU/L，优选地25000-35000mU/L和最优选地约30000mU/L。可通过滤液切割因子Xa显色底物(CH₃OCO-D-CHA-Gly-Arg-pNA-AcOH，Sigma aldrich产品编号：F3301-25MG)的能力测量滤液的酶活性。在渗滤步骤之前，孵化液可包括90至1,300,000mU/L范围的酶活性。一单位(1U)可定义为每分钟催化1μmol的底物转化需要的酶量。

孵化液中存在的丝氨酸蛋白酶切割因子Xa显色底物(Sigma-Aldrich)，产生黄色产物，其可使用波长为405nm的分光技术分析方便地测量。典型的试验包括添加100μl获取自上述方法步骤(d)或(e)的孵化液溶液至600μl底物溶液，其包括10μl因子Xa显色底物(milli-q或蒸馏水中10mg/ml)，70μl 0.2M Tris-HCl pH 8.5和520μl dH₂O。便利地，吸光度的改变可测量5-20分钟(或对于低酶活性的样品多达一小时)，通常10分钟。结果乘以适当的系数，例如10(对于10分钟试验)，以获得每1ml样品的酶活性。其他适当的和等同的底物可用于确定孵化液的活性。

如上述，在一些实施方式中使卵孵化的步骤同步可能是有利的，以使获得的孵化液的量最大化，尤其孵化液中期望的多肽或其部分的量最大化，用于纯化。同步的孵化可通本领域已知的任何适当的方法实现。例如，可使用光控制，例如将卵从光(其抑制孵化)转移至没有光的条件下，使一些卵同步。控制卵的温度，例如孵化卵的溶液的温度，孵化环境的脱氧，例如孵化卵的溶液的脱氧(Oppen-Berntsen等1990，Aquacultrue，86，417-430页)，增加孵化环境中二氧化碳的量，和用电刺激卵可也用于产生同步的孵化。在一些实施方式中，同步的孵化可使用信息素实现，例如能够影响，即刺激，胚胎发育和孵化的肽信息素。如上述，卵可悬浮在最小体积的水中，其可等于卵的体积或更少，例如对于每1ml的卵，可使用≤1、0.75、0.5、0.25ml的悬浮液体，例如0.5至1ml。在一些实施方式中，稀释孵化液可能是有利的，利于随后的纯化步骤，例如降低孵化液的粘度。因此，方法可包括稀释孵化液的进一步步骤。优选地滤液可可被稀释的倍数为：至少0.1、0.2、0.5、0.75、1.0、1.5、2、3、4、5、10、15、20、50、100、1000、5000或10000。

在优选的实施方式中，所述卵的同步快速孵化使得对于大于80％的胚胎在小于6小时内完成孵化。在尤其优选的实施方式中，孵化在小于5、4、3或2小时，比如0.5-6小时，1-5小时，1.5-4小时，2-3小时，例如1-2小时内完成。此外，在一些实施方式中，对于大于85％、90％或95％的胚胎，例如大于90、91、92、93、94、95、96、97、98或99％的胚胎，孵化在上述时间内完成。

上述制备药学或化妆品组合物的方法产生富集的制品，其优选地基本上不含源自来源材料或用于分离程序的材料的任何污染组分，例如粗孵化液中包含的多肽或多肽部分之外的组分。其他污染组分包括白细胞凝集素多肽。在优选的实施方式中，通过制备方法的过程，与开始孵化液相比，组合物可富集至多肽和多肽部分大于30、40、50或60％，例如>70、80或90％的纯度的程度，纯度以w/w(干重)计，即90％的纯度指丢失90％的开始材料(污染组分)。但是，可使用具有更低纯度，例如保留大于40、50、60、70、80或90％的开始材料的组合物。但是，甚至更低纯度的组合物不包含白细胞凝集素肽，即小于0.0005％[w/w]，优选地小于0.0001，0.00005或0.00001％[w/w]。

尽管来自步骤(f)的滤液本身可形成药学或化妆品组合物，任选地获得或可获得自上述方法的产物(步骤(f)的滤液)可在步骤(g)中被稀释(或浓缩)至适当的浓度，以产生药学或化妆品组合物和/或然后其用于本发明的方法和用途。因此，方法可包括稀释(或浓缩)组合物的进一步步骤。优选地，滤液可被稀释(或浓缩)的倍数为至少1.5、2、3、4、5、10、15、20、50、100、1000、5000或10000。尤其优选地，终组合物包括0.5-10％，例如0.5-5％，优选地0.5-3％(例如1或3％)的步骤(f)的滤液。在尤其优选的实施方式中，稀释或浓缩来自上述方法的步骤(e)的溶液，以实现酶活性为10000-100000mU/L的溶液，如通过上述方法测量。优选地，溶液，和所以来自步骤(f)的滤液包括的活性为20000-90000、25000-80000、25000-60000、25000-50000、25000-45000或25000-35000mU/L。最优选地溶液包括的活性为约30000mU/L。

任选地，一种或多种药学上可接受的赋形剂和/或稀释剂可添加至组合物获得或可获得自上述方法。因此，从来自步骤(f)的滤液制备药学或化妆品组合物的步骤(g)可包括添加一种或多种药学上可接受的赋形剂和/或稀释剂至组合物或将组合物与一种或多种药学上可接受的赋形剂和/或稀释剂结合的步骤。可选的或另外制备方法步骤包括改变或修饰溶剂，例如pH，离子浓度等。

其他药学上可接受的组分或成分可添加至获得或可获得自上述方法的组合物，例如在步骤(g)期间。一个或多个其他组分可以是活性组分，即组分对皮肤有作用，优选地也用于治疗皮肤的病况或不适，例如本文所述的病况或不适。因此，可选地或另外，方法可包括在步骤(g)中将一种或多种药学上可接受的活性组分添加至组合物或将组合物与一种或多种药学上可接受的活性组分组合的进一步步骤。药学上可接受的活性组分可包括矿物质、维生素、酶、蛋白质、肽、氨基酸、脂质、抗氧化剂、多糖、适合作为防晒剂的物质、化学去角质剂、其提取物和混合物，如下面更详细描述。

获得或可获得自上述方法的药学或化妆品组合物适合用于本发明的方法，如本文其他地方描述。

本发明的药学或化妆品组合物包括孵化酶和蛋壳多肽或多肽部分的组合，所述孵化酶和蛋壳多肽或多肽部分尤其用于治疗各种皮肤病况或不适。

尤其，本发明的组合物包括具有金属蛋白酶活性的孵化酶，具有丝氨酸蛋白酶活性的孵化酶和一个或多个蛋壳多肽或其部分，优选地其中所述部分结构上与通过孵化期间孵化酶蛋白水解切割的聚合和交联蛋壳或绒膜产生的部分等同。多肽在本文可称为感兴趣的多肽。

可存在于本发明的组合物中的示例性金属蛋白酶的序列出现在SEQ ID No.1。

可存在于本发明的组合物中的示例性丝氨酸蛋白酶可定义为分子量为约28kDa的多肽，其具有下述特性：

a)切割chromozym X；

b)通过苄脒抑制；

c)用精氨酸切割肽键；

d)在存在8M尿素、摩尔浓度的盐、蒸馏水和有机溶剂，优选地二恶烷或丙醇的情况下保持活性；和

e)在室温下溶液中保持酶活性50天。优选地通过包括下述步骤的方法以纯化形式获取丝氨酸蛋白酶：

a)将鱼卵，例如鲑鱼卵悬浮在最小体积的水中；

b)诱导所述卵的同步快速孵化；

c)过滤孵化的卵，以获得孵化液；

d)添加固体尿素至所述孵化液，以使得蛋壳片段解离并且使所述流体进行低速离心；

e)通过使离心上清液进行凝胶过滤进一步纯化所述丝氨酸蛋白酶；和

f)通过在苄脒-修饰Superose

柱上的亲和性层析进一步纯化所述丝氨酸蛋白酶，其中通过进行浓缩盐冲洗随后用二恶烷在浓缩盐溶液中洗脱进行所述亲和性层析，以提取具有丝氨酸蛋白酶活性结合至层析基质或大分子结构的多肽。

蛋壳多肽是交联形成绒膜的结构蛋白质。蛋壳多肽和其部分经蛋壳的降解存在于孵化液中。在一些实施方式中，出现在本发明的组合物中的蛋壳多肽优选地是酸性的或非常酸性的，例如pI为3至5.5，优选地3.5至5.2。

蛋壳多肽以各种形式，尤其以全长多肽的部分或片段形式出现在孵化液中。因为全长蛋壳多肽包括存在于孵化液中的部分，设想全长蛋壳多肽和其部分都可用于本发明。此外，已经在孵化液中鉴定了各种亚型的蛋壳多肽和它们的部分。

我们在本文公开了可存在于本发明的组合物中的三种示例性蛋壳多肽。已经根据质谱法测定了孵化液中出现的一些蛋壳多肽的序列并且出现在SEQ ID Nos.2-4中。这些序列表示源自全长蛋壳多肽的多肽的部分或片段，其分别出现在SEQ ID Nos.8、6和7中。因此，SEQ ID Nos.2-4可定义为部分蛋壳多肽，如本文所定义。

如上所讨论，每个蛋壳多肽或其部分可存在各种亚型。

因此，通过上述方法获得或获取的药学或化妆品组合物的组分可定义为：

(i)金属蛋白酶，其包括如SEQ ID No.1中阐释的氨基酸序列或与所述序列至少70％同一性的序列；

(ii)通过上述方法获取的丝氨酸蛋白酶；和

(iii)选自下述任何一种或多种的蛋壳多肽：

(a)蛋壳多肽，其包括如SEQ ID No.2中阐释的氨基酸序列或与所述序列至少70％同一性的序列；

(b)蛋壳多肽，其包括如SEQ ID No.3中阐释的氨基酸序列或与所述序列至少70％同一性的序列；和

(c)蛋壳多肽，其包括如SEQ ID No.4中阐释的氨基酸序列或与所述序列至少70％同一性的序列；或

(iv)如(i)至(iii)中限定的任何多肽的一部分，该部分的长度如下文所描述；

和一种或多种药学上可接受的赋形剂和/或稀释剂。(所述至少70％序列同一性优选地是至少80、90、95、96、97、98或99％同一性。)

如上述，在一些实施方式中，比SEQ ID Nos.2-4中出现的那些更长的序列可存在于组合物中。因此，在上面列举中，SEQ ID Nos.2-4可分别用SEQ ID Nos.5-7替换并且其中SEQ ID NO：2可以可选地用SEQ ID NO：8替换。

如上述，本文所述的药学或化妆品组合物不包括功能白细胞凝集素多肽或其功能部分。白细胞凝集素多肽可定义为包括如SEQ ID Nos.9-12任一个所阐释的氨基酸序列或与所述序列至少50％同一性的序列，或任何所述序列一部分的多肽。

功能白细胞凝集素多肽是能够抑制基质金属蛋白酶(MMP)真皮成纤维细胞释放的多肽，所述基质金属蛋白酶是锌依赖性内肽酶。因此，落入上面限定的白细胞凝集素多肽结构定义的多肽可认为是非功能白细胞凝集素多肽，如果其小于功能白细胞凝集素，例如SEQID Nos.9-12任一条的50、40、30、20、10或5％的活性，如通过多肽在体外细胞培养中抑制MMPs释放的能力所定义。可选地，表达的功能白细胞凝集素多肽必须具有功能白细胞凝集素，例如SEQ ID Nos.9-12任一条的至少50、70或90％的活性，如通过多肽在体外细胞培养中抑制MMPs释放的能力所定义。

本文定义的多肽或其部分在本文定义的组合物中的总浓度可以改变。但是，在优选的实施方式中，每种类型的多肽或多肽组的比例对于所有组合物是一致的，即与总多肽浓度无关。在尤其优选的实施方式中，前文定义的多肽在组合物中以组合物中总多肽百分数计的比例可定义为：

(i)约0.05至约0.20％[w/w]金属蛋白酶，优选地约0.100％至约0.125％，比如约0.108％至约0.112％金属蛋白酶；

(ii)约0.15％至约0.40％[w/w]丝氨酸蛋白酶，优选地约0.255％至约0.310％，比如约0.275％至约0.290％丝氨酸蛋白酶；和

(iii)约99.40％至约99.80％[w/w]总蛋壳多肽或所述多肽部分，优选地约99.575％至约99.645％，比如约99.598％至约99.617％总蛋壳多肽或所述多肽部分。

如本文所提及，所述总蛋壳多肽或其部分包括前文定义的蛋壳多肽和其他非常酸性蛋壳蛋白质，其通过用4倍体积的丙酮沉淀与蛋壳关联的多肽获取并且pI为3至5.5。

因此，本发明组合物中任何一种蛋壳多肽或所述多肽部分可为组合物中约0-99.80％[w/w]的总多肽，比如1-95％、2-90％、3-85％、4-80％、5-75％、10-70％、15-65％、20-55％、25-50％或30-40％，其中组合物中蛋壳多肽或所述多肽部分的总比例不超过组合物中99.80％的总多肽。优选地，组合物中蛋壳多肽或所述多肽部分的总比例不超过组合物中99.617％的总多肽。

提及药学组合物，本文可解释为包括化妆品组合物。

如本文提及的，“多肽”是优选地大于50、100、150、200或250个残基和/或小于500、400、300、200或100个残基或其中选择范围的分子。如本文所提及，“部分”优选地包括其所源自的序列的至少30、40、50、60、70、80、90、100、110、120、130、140、150、160、170、180、190、200、210、220、230、240或更多个氨基酸。所述部分可获得自序列的中心或氮末端或C末端部分。优选地所述部分获得自N-末端，例如获得自多肽的前50、100或150个残基。可选地，优选的是获得自多肽的C末端，例如获得自最后50、100或150个残基。

优选地，本文定义的多肽序列与其比较的序列(SEQ ID Nos 1-12)具有至少55、60、65、70、75、80、85、90、95、96、97、98或99％的同一性。

序列同一性可通过例如使用SWISS-PROT蛋白质序列数据库测定，使用可变pamfactor的FASTA pep-cmp，和缺口产生罚分设置为12.0和缺口延伸罚分设置为4.0，和窗口为2个氨基酸。优选地，所述比较对于序列的全长进行，但是可对更小的窗口比较进行，例如小于200、100或50个连续氨基酸。

优选地，这样的与多肽相关的序列同一性功能上与在叙述的序列Nos中阐释的多肽等同。这样功能上等同的多肽可为如下所阐释衍生物的形式。

此外，如本文所描述的“部分”可以是功能等价物。优选地，这些部分满足本文提到的同一性(相对于比较区域)条件。

如本文所提及，为了实现“功能等价”，多肽相对于母分子(即通过序列同一性相关的分子)，可显示一些降低的进行酶活性和/或药学或美容功能的效力，但是优选地，是一样有效的或更加有效的。因此，功能等价涉及有效治疗如下文所描述的皮肤的不适或病况的多肽。这可通过比较衍生物(即序列相关的)多肽相对于以定性或定量方式相关的多肽的作用，例如通过进行实施例提及的体内分析而测定。当定量结果是可能的情况下，衍生物是至少30、50、70或90％如母多肽有效。可选地或另外，可进行体外测试，例如通过分析孵化酶切割适当的多肽或肽底物，比如因子X，例如金属蛋白酶或丝氨酸蛋白酶底物的能力。

尤其优选的功能等价变体是自然生物变种(例如种内或可选地不同属，例如鱼的等位基因变体或地理变种)。

因此，在优选的实施方式中，从其可获得本发明的组合物的适当的鱼，尤其鱼卵(即从其可获得本发明组合物中包含的多肽和组合物的开始材料)包括真骨鱼(Teleostei)下纲的任何鱼，其是辐鳍鱼(Actinopterygii)纲的三个下纲之一。因此，鱼可选自任何总目的鱼，所述总目选自由下组成的列表：骨舌总目(Osteoglossomorpha)、海鲢总目(Elopomorpha)、鲱形总目(Clupeomorpha)、骨鳔总目(Ostariophysi)、原棘鳍总目(Protacanthopterygii)、巨口鱼总目(Stenopterygii)、圆鳞总目(Cyclosquamata)、灯笼鱼总目(Scopelomorpha)、月鱼总目(Lampridiomorpha)、须鳂总目(Polymyxiomorpha)、副棘鳍总目(Paracanthopterygii)和棘鳍总目(Acanthopterygii)。

在一些实施方式中，鱼可选自任何目的鱼，所述目选自由下组成的列表：骨舌鱼目(Osteoglossiformes)、月眼鱼目(Hiodontiformes)、海鲢目(Elopiformes)、北梭鱼目(Albuliformes)、棘背鱼目(Notacanthiformes)、鳗形目(Anguilliformes)、囊咽鱼目(Saccopharyngiformes)、鲱形目(Clupeiformes)、鼠鱚目(Gonorynchiformes)、鲤目(Cypriniformes)、脂鲤目(Characiformes)、电鳗目(Gymnotiformes)、鲇形目(Siluriformes)、水珍鱼目(Argentiniformes)、鲑目(Salmoniformes)、狗鱼目(Esociformes)、胡瓜鱼目(Osmeriformes)、辫鱼目(Ateleopodiformes)、巨口鱼目(Stomiiformes)、仙女鱼目(Aulopiformes)、灯笼鱼目(Myctophiformes)、月鱼目(Lampriformes)、须鰃目(Polymixiiformes)、鲑鲈目(Percopsiformes)、蟾鱼目(Batrachoidiformes)、鮟鱇目(Lophiiformes)、鳕形目(Gadiformes)、鼬鱼目(Ophidiiformes)、鲻形目(Mugiliformes)、银汉鱼目(Atheriniformes)、颌针鱼目(Beloniformes)、鲸口鱼目(Cetomimiformes)、鳉形目(Cyprinodontiformes)、奇鲷目(Stephanoberyciformes)、金眼鲷目(Beryciformes)、海鲂目(Zeiformes)、喉盘鱼目(Gobiesociformes)、刺鱼目(Gasterosteiformes)、海龙目(Syngnathiformes)、合鳃鱼目(Synbranchiformes)、鲀形目(Tetraodontiformes)、鲽形目(Pleuronectiformes)、鲉形目(Scorpaeniformes)、鲈形目(Perciformes)和鲟形目(Acipenseriformes)。

在优选的实施方式中鱼可选自任何目的鱼，所述目选自由下组成的列表：鲑目(Salmoniformes)、鲤目(Cypriniformes)、鲈形目(Perciformes)、鲇形目(Siluriformes)、鲻形目(Mugiliformes)和鲟形目(Acipenseriformes)。

在尤其优选的实施方式中，鱼可选自任何科的鱼，所述科选自由下组成的列表：鲑科(Salmonidae)、鲤科(Cyprinidae)、慈鲷科(Cichlidae)、巨鲶科(Pangasiidae)、石首鱼科(Sciaenidae)、鮨科(Serranidae)、鲹科(Carangidae)、鲷科(Sparidae)、花鲈科(Lateolabracidae)、狼鲈科(Moronidae)、鲻科(Mugilidae)、尖吻鲈科(Latidae)、塘鳢科(Eleotridae)和鲟科(Acipenseridae)。

因此，在一些实施方式中，鱼可以是多骨舌鱼、月目鱼、金眼鱼、海鲢、大海鲢、北梭鱼、海蜥鱼、针鳗、鲈鳗、囊咽鱼、宽咽鱼、鲱鱼、凤尾鱼、遮目鱼、倒刺鱼、鲢鱼、斑马鱼、金鱼、泥鳅、鲦鱼、波鱼、脂鲤科鱼、铅笔鱼、斧头鱼、水虎鱼、脂鲤、电鳗、长刀鱼、鲶鱼、桶眼鱼、平头鱼、鲑鱼、鳟鱼、梭子鱼、香鱼、南乳鱼、辫鱼、钻光鱼、海斧头鱼、龙头鱼、刺尾鱼、灯鱼、皇带鱼、月鱼、带鱼、须鳂、洞穴鱼、鲑鲈、蟾鱼、华脐鱼、鳕鱼、隐鱼、银龙鱼、胭脂鱼、银河鱼、彩虹鱼、飞鱼、奇鳍鱼、胎生鱼、鳉鱼、大鳞鲷、尖牙鱼、松球鱼、海鲂、喉盘鱼、棘鱼、尖嘴鱼、海马、黄鳝、豚鱼、河豚鱼、比目鱼、鱿鱼、大头鱼、攀鲈鱼、鲈鱼、丽鱼、虾虎鱼、丝足鱼、马鲛鱼、河鲈鱼、金钱鱼(scat)、牙鳕或隆头鱼。

在尤其优选的实施方式中，鱼可以是任何种，所述种选自草鱼(Ctenopharyngodonidella)、银鲤(Hypophthalmichthys molitrix)、卡特拉鱼(Catla catla)、鲤鱼(Cyprinuscarpio)、胖头鱼(Hypophthalmichthys nobilis)、鲫鱼(Carassius carassius)、尼罗罗非鱼(Oreochromis niloticus niloticus)、鲶鱼(Pangasius pangasius)、露斯塔野鲮(Labeo rohita)、大西洋鲑鱼(Salmo salar)、大黄鱼(Larimichthys crocea)、巨石斑鱼(Epinephelus tauvina)、海鳟(Salmo trutta trutta)、鰤鱼(Seriola quinqueradiata)、金头鲷(Sparus aurata)、日本真鲈(Lateolabrax japonicus)、欧洲黑鲈(Dicentrarchuslabrax)、银鲷(Chrysophrys auratus)、乌鲻(Mugil cephalus)、澳洲肺鱼(Latescalcarifer)、笋壳鱼(Oxyeleotris marmorata)、莫桑比克口孵非鲫(Oreochromismossambicus)、欧鳟(Oncorhynchus mykiss)、银鲑(Oncorhynchus kisutch)、奇努克鲑(Oncorhynchus tshawytscha)、粉红色鲑鱼(Oncorhynchus gorbuscha)、马哈鱼(Oncorhynchus keta)、红大马哈鱼(Oncorhynchus nerka)，西伯利亚鲟(Acipenserbaerii)和多瑙河鲟鱼(Acipenser gueldenstaedtii)。

在一些实施方式中，药学或化妆品组合物可获得或可获得自来自多于一种类型的鱼，尤其多于一种类型的鱼卵，即来自上面定义的任何一种或多种鱼的鱼卵。例如，来自两种或更多种类型的鱼卵的孵化液可用于本文所述的方法，以获得本发明的药学或化妆品组合物。因此，本发明的方法可包括将从一个或多个生物体孵化的卵收集的孵化液组合的步骤，例如在过滤之前或之后。

“药学上可接受的”、“生理学上可接受的”或“美容可接受的”意思是成分必须适于治疗性和/或化妆品和组合物。成分也必须与组合物中的其他成分兼容以及对于接受者生理学上可接受的。

活性成分，即通过上述方法获取的用于施用的组合物的多肽组分可被适当修饰用在药学或化妆品组合物中。例如根据本发明使用的组合物可对降解稳定，例如通过使用适当的添加剂比如盐或非电解质、乙酸酯、SDS、EDTA、柠檬酸酯或乙酸酯缓冲液、甘露醇、甘氨酸、HSA或聚山梨醇酯。

通过本文所述的方法获得或获取的多肽组分可作为单一成分存在于组合物中用于治疗性或美容用途，或可结合其他成分，尤其其他活性成分，例如加强治疗性或美容作用(如上述)或制造对消费者更有吸引力的组合物。

本文所述的组合物也可包括杂质，例如在从上述天然来源之一植被上述组合物之后。在如本文所描述的组合物中，源自鱼孵化液的各种多肽或多肽部分(即总多肽组分)可存在(以组合)的范围为根据上述方法制备的组合物的0.001至50％w/w(或如果组合物在步骤(g)中被稀释，10-100倍更低)。优选地，源自鱼孵化液的所述多肽或多肽部分存在(以组合)的范围是组合物的0.0005至10％w/w(或至多10-40％)，例如根据上述方法制备的组合物的0.001至5％、0.001至3％、0.001至2％、0.001至1％、0.001至0.5％、0.001至0.15％w/w(例如0.05-0.5％w/w或0.0005-0.005％w/w，如果在终步骤中稀释)。因此，源自鱼孵化液的各个多肽或多肽部分可存在的范围是组合物的1x10^-5至10％w/w。在一些实施方式中，源自鱼孵化液的所述各个多肽或多肽部分可存在的范围是组合物的1x10^-5至5％w/w，例如药学或化妆品组合物的1x10^-5至4％、1x10^-5至3％、1x10^-5至2％、1x10^-5至1％、1x10^-4至0.5％、1x10^-4至0.15％、1x10^-4至0.1％或1x10^-4至0.01％w/w，如果在步骤(g)中未进一步稀释，或如果在步骤(g)中稀释，降低的倍数为例如10-200，例如30-100。

组合物中源自鱼孵化液的多肽或多肽部分的比例可相对于组合物中的其他溶质，即不包括溶剂，例如水定义。因此，所述组合的多肽或多肽部分可存在的范围是组合物的干重的1-100％w/w。在一些实施方式中，组合的多肽或多肽部分可存在的范围是组合物的干重的1-90％w/w，例如组合物的干重的5-80％，10-75％、20-70％、30-65％w/w，例如约68或69％w/w。因此，各个多肽或多肽部分可存在的范围是组合物的干重的0.001至80％w/w，例如组合物的干重的0.0001至75％、0.001至70％、0.01至60％w/w、0.05至50％w/w。如本文所描述组合物可在步骤(g)被稀释用于根据本发明的用途。

在本发明的进一步方面中，如本文所描述的组合物用于治疗。

如上述，本发明组合物中的多肽或所述多肽部分，通过使皮肤增湿和/或剥离皮肤展示治疗皮肤异常、不适或病况的治疗性特性。

待治疗的优选皮肤异常、病况或不适是干燥皮肤，其中表皮角质层比期望的更厚的皮肤，例如过度角化病况中，或表皮中具有非期望的色素沉着的皮肤，例如雀斑、老年斑、太阳斑或褐斑。治疗可以是美容的，例如治疗正常但是干燥皮肤或增厚的皮肤(比如胼胝、鸡眼或角化过度的疣)或治疗色素沉着不适，比如雀斑，或治疗性的，例如治疗产生疼痛的痤疮、湿疹、牛皮癣或疣。

如本文所提及，“不适”指相对于正常的生物体，在有症状的或无症状的生物体中经历病理学干扰，其可源自例如感染或获取的或先天遗传缺陷。“异常”或“条件”指皮肤中相对于正常最佳皮肤的不规则或缺陷，但是其不是病理学干扰的结果。缺陷/不规则可能来自年龄、损伤、环境因素、激素水平、药物、外部施加的或摄入的物质、遗传情况或各种其他因素，其导致皮肤的异常机能，产生不规则。

不适、异常或病况可仅仅是需要美容或需要非美容的医学治疗，或其组合。

如本文所提及，“美容”旨在指不治愈、治疗或预防疾病或不适的处理，而是用作护肤产品或修饰或改善皮肤的外观，例如皮肤的色泽、质地或湿度。

医学治疗中使用的“非美容”(或医学)成分，如本文所描述，用于治愈、缓解、治疗或预防不适的一个或多个症状，例如疼痛或不适。

本文所述的治疗基础是本文公开的孵化酶和蛋壳多肽的皮肤增湿和剥离作用。这些作用已经显示在本文提供的实施例中。

因此考虑基于包括孵化酶和蛋壳多肽的组合物增湿和/或剥离特性的治疗。

因此，本发明提供了剥离和/或使动物的皮肤增湿的美容或非美容方法，其中如前文所描述的化妆品或药学组合物施用至所述动物。

因此，参考上述，本发明提供了剥离和/或使动物的皮肤增湿的美容或非美容方法，其中化妆品或药学组合物施用至所述动物，其中所述组合物是通过本文所述的方法获得或获取。

如本文所提及，“剥离”指去除上皮细胞表面的表层细胞，其在皮肤中视为表皮的表皮角质层脱屑或脱皮。如本文提及的“增湿”指防止水分从皮肤丧失保湿剂以及当施用至皮肤时吸引和保持水分的保湿剂(湿润剂)和润肤剂(其改善缺陷脱皮)。

可选地认为，本发明提供了如本文所描述的化妆品或药学组合物，用于剥离和/或使动物的皮肤增湿。(组合物可以可选地用于制备用于该目的的药物。)

如上述，这样的剥离和/或增湿特性有利于治疗或预防各种皮肤异常、不适或病况。

在优选的方面中，待治疗或预防的皮肤异常、病况或不适是干燥皮肤。这可通过增湿和/或剥离治疗。

如本文提及的“干燥皮肤”指缺少水分或皮脂的表皮，通常特征在于细线的图案、脱屑，和发痒。干燥皮肤因为本身的条件(例如由于年龄、热/冷/干燥损伤)出现或可以是皮肤不适或病况的症状，比如太阳损伤、湿疹、接触性皮炎、牛皮癣或鱼鳞癣(造成皮肤明显脱落的遗传性病况)。

在进一步优选的方面中，待治疗或预防的异常、病况或不适是增厚的皮肤表皮角质层。这可通过增湿和/或剥离来治疗。

这样增厚的皮肤表皮角质层可出现在病况，比如胼胝或鸡眼中，其是由于区域或疣对皮肤的重复摩擦，由增厚的皮肤上层组成的保护垫。这样的方法也可用于治疗或预防痤疮，其涉及其病理学的角质化。增厚的皮肤表皮角质层可本身是病况或可以是皮肤病况或不适的症状。

在进一步优选的方面中，待治疗或预防的异常、病况或不适是皮肤的色素沉着不适或异常。这可通过剥离治疗。

皮肤的色素沉着不适或异常可由于年龄、激素改变、遗传因素、疾病或太阳损伤或其他损伤而出现。改变的色素沉着可源自局部过多的黑色素细胞或黑素细胞活性的增加，或二者。色素沉着不适包括雀斑、太阳斑或衰老性着色斑(太阳雀斑)和其他瑕疵比如褐黄斑。

可选地认为，本发明因此提供了治疗或预防动物皮肤的病况或不适的美容或非美容方法，其中所述皮肤是异常干燥的，皮肤表皮角质层是异常增厚的或皮肤具有色素沉着不适，其中如前文所描述的化妆品或药学组合物施用至所述动物。所述病况或不适优选地如前文所描述。

如本文所提及，“异常”是相对于正常的最佳皮肤，即健康的、含水正常色素沉着和非老化的皮肤确定。

在进一步可选的陈述中，本发明提供了如本文所描述的化妆品或药学组合物在治疗或预防动物皮肤的病况或不适的美容或非美容方法中的用途，其中所述皮肤是异常干燥的，皮肤表皮角质层是异常增厚的或皮肤具有色素沉着不适。(化合物或组合物可以可选地用于制备用于该目的的药物。)

已经发现，本发明的组合物尤其用于降低皮肤毛孔大小。就此而言，当在孔中积聚死皮肤细胞(过度角质化的皮脂腺)时，部位出现痤疮。已经发现本发明的组合物有助于使毛孔内侧的皮肤细胞脱落正常化并且防止堵塞毛孔，其与油和细菌一起，可产生皮肤损害，例如发炎的损害，比如丘疹和脓疮和非发炎的损害，比如黑头和白斑。因此，本文定义的组合物可用于减小皮肤毛孔大小的美容或非美容方法。

可选地认为，本发明的组合物可用于治疗或预防痤疮的美容或非美容方法，例如发炎的和/或非发炎的皮肤损害，比如丘疹、脓疮、黑头和/或白斑。(化合物或组合物可以可选地用于制备用于该目的的药物。)

在优选的方面中，通过局部施用至皮肤实现医学和/或美容用途。

因此在尤其优选的方面中，本文定义的化妆品或药学组合物可用于治疗其中皮肤是异常干燥、皮肤表皮角质层是异常增厚的或其中存在色素沉着缺陷的不适，例如胼胝、鸡眼、疣、湿疹、接触性皮炎、牛皮癣、鱼鳞癣、痤疮和雀斑。

在进一步尤其优选的方面中，本文定义的化妆品或药学组合物可用于治疗其中皮肤是异常干燥的不适。

如本文所使用，“治疗”指相对于对皮肤不遭受所述病况或不适和不进行所述治疗的所述个体的身体不同部分的症状或影响，或在不进行所述治疗的相应的正常个体中，所述病况或不适的一个或多个症状或影响的减少、缓解或消除，优选地至正常水平，例如干燥或增厚的皮肤的存在和程度、色素沉着的程度和面积，发痒或疼痛等。

“预防”指绝对预防，或减少或缓解症状或影响出现的程度或时机(例如延迟)。例如特点在于干燥、增厚的或异常色素沉着皮肤的病况可通过在出现这样的病况之前经常施用本发明的组合物来预防。

根据本发明的治疗或预防的方法可有利地结合施用一种或多种活性成分，所述活性成分有效治疗或预防不适或病况和/或实现保湿或剥离。因此，本发明的化妆品或药学组合物可另外包含一种或多种这样的活性成分。

根据本发明的又进一步方面，我们提供了如本文定义的化妆品或药学组合物和任选地一种或多种另外的活性成分作为组合的制剂，用于同时、分开或顺序用在人或动物疗法中，优选地如本文所描述。

本发明的组合物可以以常规的方式与一种或多种生理学上可接受的载体、赋形剂和/或稀释剂，根据技术本领域熟知的使用容易可用的成分一起配制。

本文所述的组合物可以以常规的方式，与一种或多种生理学上可接受的载体、赋形剂和/或稀释剂，根据技术本领域熟知的使用容易可用的成分一起配制。组合物可提供为水基、甘油基、醇(至多20％)基、丙烯酸酯基油/水乳液、黄原酸胶基油/水乳液或水/油乳液，例如，pH 3.5-11，优选地pH 5.5-9。

因此，组合物可并入，任选地与作为组合制剂的其他活性物质，以及一种或多种常规的载体、稀释剂和/或赋形剂一起，产生常规的盖仑制剂比如片剂、丸剂、粉末、糖锭、小袋、扁囊剂、酏剂、悬液(作为注射或注入流体)、乳液、溶液、糖浆剂、气溶胶(作为固体或在液体媒介)、药膏、软胶囊和硬胶囊、栓剂、无菌可注射的溶液、无菌包装的粉末等。生物可降解聚合物(比如聚酯、聚酐、聚乳酸或聚乙醇酸)也可用于固体移植物。组合物可通过使用冷冻干燥、过度冷却或Permazyme来稳定。这样的组合物形成本发明的组合物(即根据步骤(g)制备)。

适当的赋形剂，载体或稀释剂是乳糖、右旋糖、蔗糖、山梨糖醇、甘露醇、淀粉、金合欢树胶、磷酸钙、碳酸钙、钙乳糖、玉米淀粉、aglinates、黄蓍胶、明胶、硅酸钙、微晶纤维素、聚乙烯吡咯烷酮、纤维素、水糖浆剂、水、水/乙醇、水/乙二醇、水/聚乙烯、乙二醇、丙二醇、甲基纤维素、甲基羟苯甲酸盐、羟基苯甲酸丙酯、滑石、硬脂酸镁、矿物质油或脂肪物质比如硬脂或其适当的混合物。也可使用用于获得持续释放制剂的试剂，比如聚缩乙烯、缩甲基纤维素、醋酸纤维素邻苯二甲酸酯或聚醋酸乙烯酯。

组合物可另外包括润滑剂、湿润剂、乳化剂、增粘剂、成粒剂、崩解剂、粘合剂、渗透活性剂、悬浮剂、防腐剂、甜味剂、风味剂、吸附增强剂(例如表面渗透剂、例如胆盐、卵磷脂、表面活性剂、脂肪酸、螯合剂)、褐变剂、有机溶剂、抗氧化剂、稳定剂、润肤剂、聚硅氧烷、α-羟基酸、缓和剂、抗发泡剂、增湿剂、维生素、香味剂、离子或非离子增稠剂、表面活性剂、填料、离子或非离子增稠剂、螯合剂、聚合物、推进剂、碱化或酸化试剂、遮光剂、着色剂和脂肪化合物等。下面更详细描述一些这样的组合物。

化妆品或药学组合物中的其他活性成分或组分可选自下述任何一种或多种：矿物质、维生素、酶、蛋白质、肽、氨基酸、脂质、多糖、适合作为防晒剂的物质、化学去角质剂、提取物、皮肤调节剂、抗氧化剂和其混合物。

可包括在本发明的组合物中的另外蛋白质的例子包括胶原蛋白和/或其衍生物(例如如上定义的其部分)、能够促进细胞生长的蛋白质或肽、糖蛋白1、糖蛋白2和层粘连蛋白。

本发明的组合物可提供的酶包括但不限于下述任何一种或多种：水果酶(例如菠萝蛋白酶)、超氧化物歧化酶、过氧化物酶、透明质酸酶和粘多糖。

肽可选自但不限于下述任何一种或多种：D,L-肌肽，D-肌肽，L-肌肽，鹅肌肽和基肽(五肽衍生物)。

氨基酸可选自但不限于下述任何一种或多种：L-丙氨酸、L-精氨酸、L-天冬酰胺、L-天冬氨酸、L-半胱氨酸、L-胱氨酸、甘氨酸、L-谷氨酰胺、L-谷氨酸、L-组氨酸、L-异亮氨酸、L-亮氨酸、L-赖氨酸、L-甲硫氨酸、L-苯丙氨酸、L-脯氨酸、L-丝氨酸、L-苏氨酸、L-色氨酸、L-酪氨酸和L-缬氨酸和其衍生物包括如表1中限定的非天然存在的氨基酸。

表1

尤其优选的作为抗氧化剂的氨基酸可选自下述任何一种或多种：甘氨酸、赖氨酸、精氨酸、半胱氨酸、胱氨酸、组氨酸、酪氨酸和色氨酸。

本发明的组合物可包括一个或多个脂质其包括脂肪、油、蜡等。适当的极性油是例如来自下述的那些：卵磷脂和脂肪酸甘油三酯，即饱和的和/或不饱和的，分支的和/或未分支的链烷羧酸的甘油三酯，链长度为8至24，尤其12至18个碳原子。可例如有利地从下述选择脂肪酸甘油三酯：合成的、半合成的和天然油，比如例如橄榄油、葵花籽油、大豆油、花生油、菜籽油、杏仁油、棕榈油、椰子油、蓖麻油、麦胚油、葡萄籽油、蓟籽油、月见草油、澳洲坚果油等。

可选地或另外油可选自挥发性油、非挥发性油或其混合物。非挥发性油包括油满足下述至少一个定义的油：(a)在25℃和一个大气压下展示大于0.2mm Hg蒸汽压的油；(b)在一个气压下沸点为至少300℃的油。挥发性油包括不是如上定义的“非挥发性”的材料。

非挥发性油可选自非挥发性硅油、非挥发性烃油和其混合物。适当的非挥发性硅油包括线性聚甲基硅氧烷和，优选地，非挥发性硅油是高分子量二甲聚硅氧烷。商业上可得的线性聚甲基硅氧烷的例子包括来自Dow Corning公司的DC 200流体20Cst、DC 200流体100Cst、DC 200流体350Cst。

适当的非挥发性烃油包括双甘油或三甘油的分支的酯或酯或1,2,3,4丁三醇或赤藓糖醇、二赤藓糖醇或三赤藓糖醇。优选地，非挥发性烃油包括赤糖醇基三乙基己酸酯(作为Salacos E-38从Nisshin Oilio可获得)和聚甘油基-2三异硬脂酸酯(作为Cosmol 43V从Nisshin Oilio可获得)，二乙基己基碳酸酯(作为Tegosoft DEC从Degussa可获得)，二辛醚(作为Cetiol OE从Cognis AG可获得)，二辛基碳酸酯(作为Cetiol CC从Cognis AG可获得)，异壬酸异壬酯(作为Lanol 99从Seppic可获得)，十三基新戊酸酯(作为Ceraphyl 55从International Speciality Products提供)，或其混合物。

挥发性油可选自官能化的和非官能化的挥发性硅油二者、挥发性烃油和其混合物。用于本发明的挥发性油可以是饱和的或不饱和的，具有直链或支链或环结构或具有这些特征的任何一种或多种。

挥发性烃油的例子包括聚癸烷比如异十二烷和异癸烷(例如，可获得自PresperseInc.的Permethyl-99A)和C7-C15异链石蜡(比如可获得自ExxonChemicals的Isopar系列)。

挥发性硅油可选自环戊硅氧烷、环己硅氧烷或其混合物。商业上可得的挥发性环硅油的例子包括来自Dow Corning Corp.的DC 244、DC 245、DC 344和DC 345；来自Momentive Performance Materials的SF-1204和SF-1202聚硅氧烷流体；来自GeneralElectric Co.的GE 7207和7158)；和，来自SWS Silicones Corp的SWS-03314。

线性挥发性硅油可以是线性聚甲基硅氧烷。商业上可得的线性聚甲基硅氧烷的例子包括来自Dow Corning Corp的DC 200流体，5Cst。

本发明的组合物可进一步包括选自下述的一种或多种多糖，但不限于下述任何一种或多种：阴离子多糖(例如藻酸、果胶、黄原酸胶、透明质酸、硫酸软骨素、阿拉伯树胶、刺梧桐胶、黄蓍树胶、羧甲基-几丁质、纤维素树胶、糖胺聚糖)、阳离子多糖(例如脱乙酰甲壳质、乙酰化脱乙酰甲壳质、阳离子瓜耳树胶、阳离子羟乙基纤维素(HEC))、非离子多糖(例如淀粉、糊精、瓜耳树胶、纤维素醚比如羟乙基纤维素、甲基纤维素和硝化纤维素)、两性多糖(例如缩甲基甲壳质、N-羟基-二羧乙基-脱乙酰甲壳质、改性的马铃薯淀粉)和疏水的多糖(例如十六烷基羟乙基纤维素、聚季铵盐24)。

组合物可进一步包括适合作为防晒剂的物质比如有机遮光剂，例如肉桂衍生物。有机遮光剂活性物可选自亲水有机遮光剂，疏水的有机遮光剂，或其混合物。遮光剂的适当例子可见CTFA国际化妆品成分词典和手册(International Cosmetic IngredientDictionary and Handbook)，第7版2卷，1672页，Wenning和Mc Ewen编辑(化妆品、化妆用品和香料联合有限公司，Washington，D.C.1997)。

有机遮光剂可选自烷基β,β-二苯基丙烯酸酯衍生物、α-氰基β,β-二苯基丙烯酸酯衍生物、邻氨基苯甲酸酯衍生物、二苯酮衍生物、樟脑衍生物、二苯甲酰甲烷衍生物、对氨基苯甲酸衍生物、水杨酸衍生物、三嗪衍生物、或其混合物。例如疏水的有机遮光剂可选自4-(1,1-二甲基乙基)-4'-甲氧基二苯甲酰甲烷；4-异丙基二苯甲酰甲烷；4-(1,1-二甲基乙基)-4'-甲氧基二苯甲酰甲烷、2-乙基己基-2-氰基-3,3-二苯基丙烯酸酯，或其混合物。

商业上可得的4-(1,1-二甲基乙基)-4'-甲氧基二苯甲酰甲烷，也称为丁基甲氧基二苯甲酰甲烷或阿伏苯宗的例子，包括来自Givaudan Roure S.A.的Parsol TM 1789和来自Merck&Co.，Inc的Eusolex TM 9020。商业上可得的4-异丙基二苯甲酰甲烷，也称为异丙基二苯甲酰甲烷的例子包括来自Merck&Co.，Inc的Eusolex TM 8020。商业上可得的2-乙基己基-2-氰基-3,3-二苯基丙烯酸酯，也称为奥克立林的例子包括来自BASF的UvinulN539SG；和来自Rona/Merck的Eusolex OCR。

在一些实施方式中，亲水有机遮光剂可以是2-苯基苯并咪唑-5-磺酸。商业上可得的2-苯基苯并咪唑-5-磺酸，也称为PBSA的例子包括来自Rona/Merck的Eusolex 232。

肉桂衍生物遮光剂的适当例子可见CTFA国际化妆品成分词典和手册，第7版2卷，1672页，Wenning和Mc Ewen编辑(化妆品、化妆用品和香料联合有限公司，Washington，D.C.1997)。肉桂衍生物可选自2-乙基己基-p-甲氧基肉桂酸酯、二乙醇胺甲氧基肉桂酸酯、2-乙氧基乙基-p-甲氧基肉桂酸酯，或其混合物。例如，肉桂衍生物可以是2-乙基己基-p-甲氧基肉桂酸酯。

组合物可包含化学去角质剂选自但不限于下述任何一种或多种：α羟基酸(AHAs)、β羟基酸(BHAs)或聚羟基酸，比如水杨酸、乙醇酸、柠檬酸和苹果酸。

可并入组合物的提取物包括但不限于植物提取物，其可包括酚类化合物比如例如类黄酮(例如，糖基芸香甙、阿魏酸、咖啡酸)、亚糠基葡萄糖醇、丁基化羟基甲苯、丁基化羟基苯甲醚、去甲二氢愈创木树脂酸、去甲二氢愈创木酸、三氢氧苯丁酮和其衍生物。在本发明的组合物中使用的具体植物提取物包括芦荟提取物、人参提取物和马尾提取物。

通过用亲水溶剂(尤其，水、乙醇、乙二醇，或其任何混合物)提取人参的根获得人参提取物。提取物包含皂苷、甾醇、碳水化合物、果胶、维生素、矿物质和脂质。

通过用亲水溶剂(例如，水、乙醇、乙二醇，或其任何混合物)提取马尾草的整个植株而获取马尾提取物。提取物包含硅酸盐、黄酮、皂苷、咖啡酸和阿魏酸。

组合物可进一步包括皮肤调节剂。皮肤调节剂可选自保湿剂、去角质剂、润肤剂或其混合物。保湿剂包括多元醇比如丙三醇、丙二醇、双丙甘醇、聚丙二醇、聚乙二醇、山梨糖醇、羟丙基山梨糖醇、己二醇、1,3-丁二醇、1,2,6-己三醇、乙氧基化甘油、丙氧基化丙三醇或其混合物。

本发明的组合物中可提供的抗氧化剂的例子包括但不限于氨基酸、维生素、矿物质、类胡萝卜素、肽、硫醇、亚砜亚胺化合物、螯合剂、不饱和脂肪酸、酚类化合物、植物提取物、芪类、尿酸、甘露糖、绿原酸、咪唑类(例如咪唑丙烯酸)、亚糠基山梨糖醇、辅酶、泛醌、质体醌、植物甾醇和其衍生物(例如盐、酯、醚、糖、核苷、核苷、肽和/或脂质衍生物)，上面描述了其中的一些。

维生素可选自但不限于下述任何一种或多种：维生素A和其衍生物(例如类维生素A或视黄醇或它们的衍生物比如视黄基棕榈酸酯或视黄基丙酸盐)、生物素、叶酸、泛酸钙、烟酰胺、吡哆醇HCl、吡哆醛HCl、核黄素、硫胺素HCl、胸苷、维生素B12、维生素B3(例如烟酰胺)、维生素B5(例如泛醇)、维生素C和其衍生物(例如，抗坏血酸基棕榈酸酯、抗坏血酸基磷酸镁、抗坏血酸基乙酸酯)、生育酚和衍生物(例如维生素E乙酸酯)。

矿物质可选自但不限于任何一种或多种盐：钼酸盐(例如(NH₄)OMo₇O₂₄)铝(例如AlCl₃)、钙(例如CaCl₂)、钴(例如CoCl₂)、铬(例如CrK(SO₄))、铜(例如CuSO₄)、铁(例如Fe(NO₃)₃、FeSO₄)、钾(例如KCl)、镁(例如MgCl₂)、锰(例如MnCI₂、MnSO₄)、磷酸盐(例如Na₂HPO₄、NaH₂PO₄)、碳酸盐(例如NaHCO₃)、硅酸盐(例如Na₂SiO₃)、钠(例如NaCl)、钒酸盐(例如NH₄VO₃)、镍(例如NiCl₂)、锡(例如SnCl₂)、锌(例如，ZnO、ZnSO₄)、硒(例如硒代甲硫氨酸、依布硒啉、H₂SeO₃、Na₂SeO₃)、硫酸盐和硝酸盐。

类胡萝卜素可选自但不限于下述任何一种或多种：胡萝卜素，例如α-胡萝卜素、β-胡萝卜素、ψ-番茄红素、茄红素等和其衍生物。

硫醇可选自但不限于下述任何一种或多种：金硫葡糖、丙基硫脲嘧啶、硫氧还蛋白、硫辛酸、谷胱甘肽、半胱氨酸、胱氨酸、胱胺和它们的糖基、N-乙酰基、甲基、乙基、丙基、戊基、丁基和月桂基、棕榈酰基、油烯基、γ-亚油基、胆甾醇基和甘油基酯和其盐、二月桂基硫代二丙酸酯、二硬脂酰基硫代二丙酸酯、硫代二丙酸酯和其衍生物。

亚砜亚胺化合物可选自但不限于下述任何一种或多种：高半胱氨酸亚砜亚胺、丁胱砜、五-、六-、七胱亚砜亚胺，其可包括在组合物中，使得它们以非常低的剂量提供(例如pmol至μmol/kg)。

螯合剂可选自但不限于下述任何一种或多种：去铁铁蛋白、去铁胺、乳铁蛋白、α-羟基脂肪酸、棕榈酸、肌醇六磷酸、α-羟基酸(例如柠檬酸、乳酸、苹果酸)、腐植酸、胆酸、胆提取物、胆红素、胆绿素、EDTA、EGTA和其衍生物。

不饱和脂肪酸可选自但不限于下述任何一种或多种：γ-亚麻酸、亚麻油酸、油酸和其衍生物。

芪类和其衍生物包括，例如，芪氧化物和反式芪氧化物。

各种另外任选的活性成分可并入本发明的组合物。这些另外成分的非限制性例子包括另外的护肤活性物比如法尼醇、没药醇、植烷三醇、尿素、胍(例如氨基胍)；己脒定化合物、其盐或衍生物；糖胺；自晒黑试剂(例如二羟基丙酮)；结构试剂；亲水凝胶剂；抗痤疮药物(间苯二酚、水杨酸等)；皮肤抚慰剂和愈合试剂比如尿囊素等；和试剂适于美学目的比如香精油、香料、皮肤感觉剂、遮光剂、芳族化合物(例如丁香油、薄荷醇、樟脑、桉叶油和定子香酚)。可配制本文所述的组合物以便在通过本领域熟知的技术施用至身体之后提供快速、持续或延迟释放的活性成分。

组合物可以为任何适当的给药形式，以使得递送或靶向具体的细胞或组织，例如作为乳液或在脂质体、类脂质体、微球、纳米颗粒等中，利用其活性成分可被吸收、吸附、并入或结合。这可有效将产物转化成不溶解的形式。这些具体的形式可克服稳定性(例如降解)和递送问题。

溶液、悬液、凝胶和乳液的使用是优选的，例如活性成分可携带在水、气体、水基液体、油、凝胶、乳液、水包油或油包水乳液、分散体或其混合物中。

乳化剂可选自非离子乳化剂、阴离子乳化剂、阳离子乳化剂、两性离子乳化剂、两性乳化剂或其混合物。乳化剂是本领域已知的。见，例如，McCutcheon's，去污剂和乳化剂(Detergents and Emulsifiers)，North American Edition(1986)，由AlluredPublishing Corporation公开。

当化妆品或药学上可接受的载体是聚硅氧烷包水乳液时，乳化剂优选地选自聚氧化烯共聚物、聚甘油基共聚物或其混合物。聚氧化烯共聚物，也称为聚硅氧烷聚醚，详细描述在US 4,268,499中。商业上可得的聚氧化烯共聚物的例子包括来自Dow Corning Corp.的DC5225C或DC2-5185C(PEG/PPG-18/18二甲硅油，其作为与环戊硅氧烷的掺混物可获得)；和，来自Shin-Etsu Inc的KF6017或KF6028(PEG-9二甲硅油)。商业上可得的聚甘油基乳化剂的例子包括来自Shin-Etsu Inc的KF6100和KF6104。

组合物优选地用于局部(即至皮肤)施用。

局部组合物包括凝胶、乳剂、药膏、喷雾、洗液、药膏、药棒、肥皂、粉末、薄膜、气溶胶、液滴、泡沫、溶液、乳液、悬液、分散体例如非离子膜泡分散体、牛奶和现有技术任何其他常规的化妆品或药学形式。

药膏、凝胶和乳剂可，例如，与水性或油性基质一起配制，添加适当的增厚和/或凝胶剂。洗液可与水性或油性基质一起配制，并且一般而言，也包含一个或多个乳化、分散、悬浮、增厚或着色剂。可在任何适当的粉末基的帮助下形成粉末。液滴和溶液可与水性或非水性基一起配制，也包括一个或多个分散、溶解或悬浮剂。气溶胶喷雾便利地使用适当的推进剂从加压包装递送。

在一些实施方式中，本文所述的组合物可经已经施加、浸渍或化学结合多肽或组合物的产物、设备或材料局部施用至皮肤。为了该目的，绷带，膏药(例如粘合贴片)，纱布，外科胶带、棉花棉签或其他吸收材料，例如粉扑、起绒布或海绵，或支持基质可涂布，浸渍或化学结合如本文所描述的组合物。例如，许多组合物可施用至皮肤，其使用在现有技术中充分描述的皮肤贴片，例如US 2008/0038300、US 2009/0043236、WO 2005/067499和WO 2009/085302，其通过引用并入本文。在一些实施方式中，包括如本文所描述的组合物的材料可为设备的形式，其可，例如被待治疗的受试者穿着。例如，如本文所描述的组合物可施用、浸渍或化学结合在形成所有或部分尿片、手套，袜子等的材料或支持基质上。

因此，本发明的进一步方面包括提供涂布、浸渍或化学结合如本文所描述的组合物的产物、材料或设备。本发明也涉及这样的产物、材料或设备用于如本文所描述的用途。优选地，所述产物是绷带、石膏(例如粘合贴片)、纱布、外科胶带或棉花棉签或所述设备是尿片、手套或袜子。

化妆品或药学组合物与施用的说明书一起包括在容器、包装或分配器中。

在一些实施方式中，组合物可提供为适合口服或肠胃外施用的形式。可选的药学形式因此包括普通片剂或涂布片剂、胶囊、悬液和包含活性组分的溶液任选地与一种或多中惰性常规的载体和/或稀释剂一起，例如与玉米淀粉、乳糖、蔗糖、微晶纤维素、硬脂酸镁、聚乙烯吡咯烷酮、柠檬酸、酒石酸、水、水/乙醇、水/丙三醇、水/山梨糖醇、水/聚乙二醇、丙二醇、硬脂醇、羧甲基纤维素或脂肪物质比如硬脂或其适当的混合物一起。

本文所述的组合物中可取决于组合物的来源(即上述方法的开始材料)、施用的模式、治疗的过程、患者的年龄和体重、美容或治疗性指示、待治疗的身体或身体区域并且可根据选择而改变或调整。但是，一般而言，根据本发明的方法在过滤步骤(f)之后制备的组合物在步骤(g)中被稀释至0.001、0.005、0.01或0.1至50％，例如0.005-40％，例如0.1至25％，比如0.1或0.5至5，例如1-5％(w/w或v/v)，以提供用于施用，尤其用于局部施用的终制剂，例如步骤(f)之后1％或3％组合物溶液。

当另外的组分添加至通过上述方法制备的组合物时，例如如本文所描述的另外的增湿剂，另外的组分可存在的量为0.0001，0.0005，0.001或0.01至50％，例如0.0005-40％，例如0.01至25％，比如0.1或0.5至5，例如1-5％(w/w的用于施用，尤其用于局部施用的终制剂)。当局部施用时，组合物的有效的单个剂量的范围是0.0001-100mg/cm²/天(组合物中的总蛋白质)，例如0.1-100mg/cm²/天，优选地0.0001-10mg/cm²/天，例如0.1-10mg/cm²/天，这取决于待治疗的哺乳动物，作为单个剂量服用。

施用可通过医药领域已知的任何适当的方法，包括例如口服、肠道、经皮、含服、直肠或局部施用或通过吸入施用。优选的施用形式是口服施用，或最优选地局部施用。如认识到，如果活性成分是易消化的，那么口服施用具有其局限性。为了克服这样的问题，可如先前提到使成分稳定。

优选地采用液体溶液、乳剂或悬液用于局部施用。

可施加或施用组合物的动物限于哺乳动物。优选地哺乳动物是灵长类，家养动物、牲畜和实验室动物。因此优选的哺乳动物包括小鼠、大鼠、兔子、豚鼠、猫、狗、猴子、猪、母牛、山羊、绵羊和马。尤其优选地，组合物施加，或施用至人。

仅仅通过图解的方式给出下述实施例，其中参考的图如下：

图1显示条状图，其描绘与未治疗皮肤相比，在用凝胶(凝胶B)每天两次治疗4周之后皮肤毛孔直径的(A)平均降低和(B)相关降低，所述凝胶(凝胶B)包括在本发明的方法步骤(f)中制备的1％的孵化液组合物。

图2显示条状图，描绘与未治疗皮肤相比，在用凝胶(凝胶B)每天两次治疗4周之后发炎的皮肤损害的数量的(A)平均降低和(B)相关降低，所述凝胶(凝胶B)包括本发明的方法步骤(f)中制备的1％的孵化液组合物。

图3显示条状图，描绘与未治疗皮肤相比，在用凝胶(凝胶B)每天两次治疗4周之后非发炎的皮肤损害的数量(A)平均降低和(B)相关降低，所述凝胶(凝胶B)包括本发明的方法步骤(f)中制备的1％的孵化液组合物。

图4显示条状图(A)，其使用D-Squame检验比较包括本发明的方法中步骤(f)的3％的孵化液组合物制备的凝胶(活性凝胶)和3％乙醇酸溶液的剥离作用。更低的分数指示更少的鳞，即增加的剥离。(B)显示在t0和5分钟之后用活性凝胶治疗的测试区域的照片。

图5显示条状图，其描绘与未治疗的皮肤相比，在在用凝胶(凝胶B)每天两次治疗3周之后皮肤水化的(A)平均增加和(B)相关增加，所述凝胶(凝胶B)包括本发明的方法步骤(f)中制备的3％的孵化液组合物。

图6显示条状图，其描绘与未治疗的皮肤相比用凝胶每天两次治疗3周之后，湿疹或痤疮的严重程度的(A)平均视觉评估和(B)相关视觉评估，所述凝胶包括本发明的方法步骤(f)中制备的3％的孵化组合物。

图7显示条状图，其描绘与未治疗的皮肤相比，用凝胶每天两次治疗3周之后，发炎的和非发炎的皮肤损害的数量的(A)平均降低和(B)相关降低，所述凝胶包括本发明的方法步骤(f)中制备的3％的孵化组合物。

实施例

实施例1：制备组合物

由鲑鱼孵化液制备组合物。为了改善孵化液的蛋白质浓度，鲑鱼卵转移至最小体积的水中然后孵化。可通过升高(室)温，或通过脱氧诱导高度同步的孵化(Oppen-Berntsen等1990，Aquacultrue，86，417-430页)，其产生小体积的高度浓缩的粗多肽和多肽部分的制剂。对于大于95％的胚胎，孵化应在2小时内完成。

使用7μm孔径大小的标准过滤器过滤孵化液，以去除在随后过滤步骤中可能堵塞过滤器的材料。该滤液，处理的孵化液，可被冷冻数年而不明显降解，然后被融解并且用于进一步蛋白质纯化。该事实大大简化了产生用于制备孵化液组合物的开始材料。

根据制造商的指导，将处理的孵化液装载至二乙氨乙基(DEAE)离子交换柱并且用20mM Tris HCl(pH 8.50)溶液冲洗。丢弃流出物。从柱用包含50mM NaCl的洗液洗脱白细胞凝集素蛋白质。收集洗脱液用于其他用途。从柱用包含1M NaCl的洗液洗脱感兴趣的多肽(即金属蛋白酶、丝氨酸蛋白酶和蛋壳多肽)。收集洗脱液并且然后用排阻尺寸为8kDa的过滤器透析过滤，用缓冲液替换孵化液的水。在该情况下，缓冲液是磷酸缓冲生理盐水，但是其他缓冲液是同样合适的。例如，包含毫摩尔Tris(例如10mM)，pH大概为中性或稍微碱性(pH 7.5-8.5)，包含5mM NaCl的缓冲液包含0.5mM磷酸和1mM NaCl或缓冲液是合适的。收集来自渗滤步骤的截留物质并且通过添加缓冲液稀释。

最后，通过孔径大小为0.22μm的过滤器滤液进行过滤并且收集终滤液。该滤液是高度富集的粗孵化液中出现的金属蛋白酶、丝氨酸蛋白酶和蛋壳多肽和多肽部分的制剂，不包括或仅仅痕量的来自孵化液的白细胞凝集素多肽。

实施例2：组合物对皮肤毛孔大小的体内作用

如实施例1中描述制备孵化液组合物。组合物制备为1％凝胶[v/v](每单位体积的凝胶组合物的总体积)并且与不包括活性组分，即孵化液组合物的对照凝胶的比较(图1中的凝胶B)。凝胶包括水中的防腐剂(0.8％)/双甘油(3.00％)和黄多醣树胶(0.8％)。

对23名女性自愿受试者进行双盲、安慰剂对照临床试验。23名受试者的年龄在22.4和58.7年之间(39.3±13.6年)。

试验使用分离-面部设计。施用位点是面部的右边或左边。活性凝胶随机分配至测试位点(右/左)。对鼻唇沟上方的面额区域的毛孔进行孔径大小分析。

受试者在家每天施加活性凝胶两次持续4周。以一些通常实践将凝胶施加至面部的一半，另一不处理(随机分配)。

为了使孔径大小可视化，包含氧化锌的乳霜

施加至测量区域从而乳霜并入毛孔。用纸巾小心地去除剩余的。通过Canon PowerShot G9数字照相机使用D-scopeII附件(40x放大率的镜头)微成像并且通过

2007mediscope软件记录。D-Scope具有棱镜反射环和集成的LED灯，保证了视野中的平衡照明。每个测试位点照相一次。完成研究之后，软件lmageJ用于测量每个测试位点的三个选择毛孔的尺寸(直径)。在t0和t1测量相同毛孔。

在开始第一凝胶施用之前(t0)和治疗4周之后(t1)成像用于孔径大小分析。所有的评估在21.5℃(±1℃)和50％(±5％)相对湿度的气候控制室中进行。在最后产品治疗10-20小时之后的t1时间点进行评估。

为了评估在t0时测试位点之间的差异，分析原始数据。为了评估治疗之后(t1)的测试位点之间的差异，分析相对于t0和未处理情况的数据。双重相对数据(相对于t0和未处理情况的数据)计算如下：(在t1的处理情况/在t0的处理情况)/(在t1未处理的情况/在t0未处理的情况)。这些数据反映考虑未处理情况(对照)的改变和它们进行不同处理之前测试位点之间的差异(包括对照的测试位点)的参数的变化。

结果

t0情况是均匀的。用活性凝胶处理的测试位点在t0评估之后与未处理的测试位点的孔径大小没有显著区别(p＝0.3811)。在t0，对于未处理的测试位点孔径大小平均是0.60(±0.19)mm和对于活性凝胶处理的测试位点是0.65(±0.22)mm。

未处理的测试位点的孔径大小在研究期间是均匀的(p＝0.5084)。考虑相对于t0和未处理的t1的数据，用活性凝胶(即包括步骤(f)1％的孵化液组合物)处理的皮肤在每天处理的四周之后，与未处理的情况相比显示孔径大小统计学上显著下降约22％(p＝0.0005)(图1)。没有记录不良皮肤反应。

实施例3：组合物对皮肤损害(痤疮)的体内作用

如实施例2中描述制备包括步骤(f)的孵化液组合物凝胶(图2中的凝胶B)。

对21名合格的女性自愿受试者进行双盲、安慰剂对照临床试验。受试者年龄在18.2和34.5年之间(26.3±5.0年)。受试者在它们的前额、面颊和/或下巴具有斑点参与研究是合格的。

试验使用分离-面部设计。施用位点是右半或左半面部，包括前额、面颊和下巴。活性凝胶随机分配至测试位点(右/左)。

受试者在家每天两次施加活性凝胶持续4周时间。以一些常规实践施加产品至一半面部，另一半不处理(随机分配)。

在开始第一次凝胶施用之前(t0)和4周处理之后(t1)，在测试位点视觉计数发炎的(丘疹、脓疮)和非发炎的(黑头、白斑)损害的数量。所有的评估在21.5℃(±1℃)和50％(±5％)相对湿度的气候控制室中进行。在评估在最后产品处理之后的10-20小时的t1时间点进行。

对于任何给定的受试者，通过相同的评估人员在两个评估时，进行损伤计数评估。在标准光照条件下进行所有的损伤计数。在前额、面颊和下巴(但是没有鼻子区域)对于每个黑头(黑头粉刺)、白斑(白头粉刺)、丘疹和脓疮进行计数。

结果

发炎的损伤计数

t0情况是不均匀的。基线评估之后用活性凝胶处理的测试位点的发炎的损害的数量与未处理的测试位点的发炎的损害显著不同(p＝0.0217)。在t0，对于未处理的测试位点，发炎的损害的数量平均是8.4(±7.4)和对于活性凝胶处理的测试位点是7.0(±6.5)。未处理的测试位点的发炎的损害的数量在研究期间是均匀的(p＝0.0815)。

与未处理的情况相比，用活性凝胶处理的皮肤在每天处理的四周之后，显示发炎的损害数量统计学上显著的下降(p＝0.0086)(图2)。没有报告不良皮肤反应。

非发炎的损伤计数

t0情况是均匀的。在基线评估之后，用活性凝胶处理的测试位点与未处理的测试位点的非发炎的损害的数量没显著差异(p＝0.8753)。在t0，对于未处理的测试位点非发炎的损害的数量平均是3.2(±5.3)和对于凝胶B处理的测试位点是2.8(±3.2)。未处理的测试位点的非发炎的损害的数量在研究期间是均匀的(p＝0.9057)。

与未处理的情况相比，用活性凝胶处理的皮肤，每天处理四周之后，显示非发炎的损害的数量统计学上显著的下降(p＝0.0215)(图3)。没有报告不良皮肤反应。

实施例4：组合物对剥离的体内作用

如实施例2中描绘制备包括3％步骤(f)的孵化液组合物的凝胶。

对于在两半具有可见的干燥和鳞状皮肤信号的3名女性受试者进行双盲、安慰剂对照临床试验。3名受试者年龄在38.4和57.8年之间(平均48.1±9.7年)。

研究用于分析与乙醇酸(3％)相比，包括孵化液组合物的凝胶对剥离的作用。在两半上有8个测试区域，即4个在每半上用于用活性凝胶或乙醇酸处理。对测试区域的产品处理的分配是变化的。在四个测试位点中，一个是未处理的而其他三个是产品处理5min、10min或15min。

就在测试产品处理之前(t0)，从每一半取

样品(在四个测试位点的重叠区域)。活性凝胶和乙醇酸(3％)由技师在一半的各自的测试位点上施用一次。使产品在皮肤上作用5min、10min和15min，一个测试不被处理(“0min”)。然后，所有的4个测试位点用水冲洗并且使得风干，然后从所有4个测试位点

取样。所有的

片转移至黑色储存卡并且使用下述分数视觉评估鳞的程度：

分数0：没有

分数1：轻微

分数2：中等

分数3：严重

分数4：极度

没有不适不良反应。

结果

使用

对3名受试者的剥离的评估揭示与乙醇酸相比，在5min、10min或15min的处理方案之后，对于活性凝胶的更大的平均鳞下降(图4)。

实施例5：组合物对皮肤水化的体内作用

如实施例2中描述制备包括步骤(f)的3％的孵化液组合物的凝胶。

对4名受试者进行双盲、安慰剂对照临床试验。应在前臂上具有干燥皮肤受试者参与研究合格。4名受试者年龄在56.3和70.9岁之间(平均64.3±6.3岁)。

待分析皮肤水化的测试位点都是前臂。前臂上有四个测试区域，即两个在前臂的每个内侧。两个区域用包括孵化液组合物的活性凝胶处理，一个用丙三醇(对照)处理和第四个不处理。

受试者在家进行处理每天两次持续三周的时间。产品以一些约2mg/cm²施加至相应的前臂测试位点(随机的，一个测试位点未处理并且另一个用作为对照的丙三醇处理)。

在开始第一次产品施用之间(t0)和处理三周之后(t1)，测量对于前臂的皮肤水化(Corneometer

10次重复测量)。

在受试者已经适应她们未覆盖的测试区域这些室内气候条件至少30min之后，所有的测量在21.5℃(±1℃)和50％(±5％)相对湿度的气候控制室中进行。在t1时间的测量和处理发生在最后产品处理的10-20小时之后。

结果

用包括3％v/v的步骤(f)的孵化液组合物的活性凝胶(凝胶B)处理的皮肤显示与未处理的情况相比，3周每天两次产品处理之后，对4名受试者皮肤水化的平均增加约21％(图5)。

实施例6：组合物对湿疹和痤疮的体内作用

如实施例2中描述制备包括3％步骤(f)的孵化液组合物的凝胶。

对4名受试者进行双盲、安慰剂对照临床试验，2名湿疹和2名痤疮。具有湿疹或痤疮(由专家视觉评估)受试者参与研究合格。在选择的问题区域，即在手部或手臂(湿疹)或面部(痤疮)，分析活性凝胶对湿疹或痤疮的分级的作用。

受试者在家每天早上和晚上施加活性凝胶两次，持续三周，使用对应实际实践的产品量。

就在开始第一次产品施用之前(t0)和处理三周之后(t1)，通过客观皮肤病学生命评分和受试者本身的主观评估，视觉评估湿疹或痤疮的级别。损伤计数(皮肤病学评估非发炎的(白斑和黑头)和发炎的损害(丘疹和脓疮)的数量和质量(仅仅对于患面部痤疮的2名受试者))。

根据下述分数进行视觉专家评估和主观评估：

分数0：没有

分数1：轻微

分数2：中等

分数3：严重

分数4：极度

视觉专家评估以及主观评估(数据未显示)显示3周活性凝胶的处理方案之后2名受试者平均湿疹和痤疮级别下降(图6)。损伤计数揭示3周活性凝胶的处理方案之后2名受试者平均发炎的和非发炎的损害的下降(图7)。

序列：

SEQ ID No.1：金属蛋白酶-大西洋鲑鱼

MDHRPTLSLL LLLLLLGLSQ ASGNEFHDEP DHVSITSVIL KSNNGTNELL LDGDILAPRTRNAMKCFSSQ YSCLWKKSSD GLVYVPYILS AVYSSLEVET IETAMKYFQG KTCIRFIPRK TQTAYLDIQSSGGCFGTVGT VGDRQTLSLA QFGCVQHGII QHELLHALGF HEHNRSDRE QYIRINWQYI YDYAVGNFQKEDTNNLHTAY DYSSVMHYDR TAYTNDYGKE TITPIPDPSV AIGQRLGMSD IDVLKVNKLY QC

SEQ ID No.2：蛋壳多肽I片段-大西洋鲑鱼

TVTVQCTKDG QFVVVVSRDATLPNLELDSI SLLGANGAHC TPVGTTSAFA IYQFKVTECGTVVTEEPDTI VYENRMSSSY VVGIGPFGDI TRDSHYDLVF QCRYTGTSVE TLVIEVK

SEQ ID No.3：蛋壳多肽II片段-鲑鱼

AVTVQCTKDG QFVVVVARDA TLPSLELDSI SLLGTNGPHC HAIGTTSVFA IYQFKVTECGTVMTEETDTI IYENRMSSSY QVGVGPFGSI TRDSQYDLTF QCRYKGSTIV AVVIDVKPVP PPNPDIAPGPLTVELRLGSG TCLTKGCNEE EVAYTSYYTE ADYPVTKVLR DPVYTEVRIL ARTDPNIVLT LGRCWATTNPNPLSLPQWDL LIDGCPYQDD RYLTTPINVG PSSGLSFPTH YRRFVLKMFT FVDPMSMTPL R

SEQ ID No.4：蛋壳多肽III片段-鲑鱼

AECRENMVHV EAKHDLLGIG QLIQLEDLTL GDCPMSGFDN INQVLIFESP LQSCGSQLRMTTNSLIYIFT LYYKPKPLAN TPLIRTNDAM INIECHYPRK HNVSSLALIP TWTPFSAAKY AEELLYFSMRLMTADWQYER AGNMYVLGDM VNIEASVMQY FHVPLRIFVD SCVATLEPNI NANPRYAFIE NHGCLIDAKMTGSHSQFMPR SADYKLYFQV EAFR

SEQ ID No.5：全长zr-蛋白质-大西洋鲑鱼

MKWSAVCLVA VATLGWLCDA QNFLEKPGWP PIQTPPSWPP QTPQRPVQPL PQRPAQPFLQKPAQPIPQRI PYTEDDTKQT CEVVDKDKVS CGLSGITAAQ CQAISCCFDG RMCFYGKTVT VQCTKDGQFVVVVSRDATLP NLELDSISLL GANGAHCTPV GTTSAFAIYQ FKVTECGTVV TEEPDTIVYE NRMSSSYVVGIGPFGDITRD SHYDLVFQCR YTGTSVETLV IEVKTYPNPN PVVTVDAVLN VELRLANGRC LSKGCDEMQEAYTSYYTVAD YPVTKVLRDP VYAEVRILGM TDPNVVLTLE QCWATIDPTG DRLPRWDLLV NGCPYQDDRYLTVPIASDSS YIPPGEFLSH YKRFVFKMFT FVDPTSMVPL QENVYIHCRA TVCHALAGSC EQRCNRQRRDLSAQGQKKTK GDVVVSSQKV IMIDPSLYA

SEQ ID No.6：全长卵壳蛋白H-太平洋鲑鱼

MKWSAVCLVA VATLGWLCDA QIYLEKPGWP PIQTPASWPA QPPEKPVQPP QRPAQPPQWPAQPPQWPAQP PQRPAQPPQR PAQTQQWPGQ PPQRPAQPPQ WPAQPPQRPA QPPQRPAQPP QRPAQPPPRPAQPPQWPVHP PQWPVQPGTP LQRPKFPSDP GSKQSCDVDS QHKVQCGLPD ITAAHCDAIN CCFDGRMCFYGKAVTVQCTK DGQFVVVVAR DATLPSLELD SISLLGTNGP HCHAIGTTSV FAIYQFKVTE CGTVMTEETDTIIYENRMSS SYQVGVGPFG SITRDSQYDLTFQCRYKGST IVAVVIDVKP VPPPNPDIAP GPLTVELRLGSGTCLTKGCN EEEVAYTSYY TEADYPVTKV LRDPVYTEVR ILARTDPNIV LTLGRCWATT NPNPLSLPQWDLLIDGCPYQ DDRYLTTPIN VGPSSGLSFP THYRRFVLKM FTFVDPMSMT PLRETVFIHC NTAVCLPSHGDSCEPRCYRK RRDIPAAVQK TTRIKSNLVS SGELILTDPR ELTN

SEQ ID No.7：全长卵壳蛋白L-太平洋鲑鱼

MAMKWSVVCL VAVAMLGCLC VAQIWPPSIK PVQQPFRPNR PPPQQPQQPP YQKPRIPPKDQTQAKQKFET PLDWTYPLDP KPEPKIIGGS EARTPVAANS VRAECRENMV HVEAKHDLLG IGQLIQLEDLTLGDCPMSGF DNINQVLIFE SPLQSCGSQL RMTTNSLIYI FTLYYKPKPL ANTPLIRTND AMINIECHYPRKHNVSSLAL IPTWTPFSAA KYAEELLYFS MRLMTADWQY ERAGNMYVLG DMVNIEASVM QYFHVPLRIFVDSCVATLEP NINANPRYAF IENHGCLIDA KMTGSHSQFM PRSADYKLYF QVEAFRFQSQ RGSDPIIPQKTKIPFQPAAD YPATLDMIFL TCHLKATTIA FPIDFEYKAC SFINTWREAG GNDGVCGCCD STCSNRKGRDTTTHQKPANI WEGDVQLGPI FISEKVEQ

SEQ ID No.8：可选的zr-蛋白质-大西洋鲑鱼

KWSYQLPQKL AQPLPQKPAQ PLPQWPVQPL PQRPAEPLPQ RPAQPLPQWP VQPLPQRPAEPLPQRPAQPL PQRPVQPLPQ RPAQPFLQKP AQPIPQRIPY TKDDTKQTCE VVDKDKVSCG LSGITAAQCQAISCCFDGRM CFYGKTVTFQ CTKDGQFVVV VSRDATLPNL ELDSISLLGA NGAHCTPVGT TSAFAIYQFKVTECGTVVTE EPDTIVYENR MSSSYVVGIG PFGDITRDSH YDLVFQCRYT GTSVETLVIE VKTYPNPNPVVTVDAVLNVE LRLANGRCLS KGCDEMQEAY TSYYTVADYP VTKVLRDPVY AEVRILGMTD PNVVLTLEQCWATTDPTGDR LPRWDLLVNG CPYQDDRYLT VPIASDSSYI PPGEFLSHYK RFVFKMFTFV DPTSMVPLQENVYIHCRATV CHALAGSCEQ RCNRQRRDLS AQGQKKTKGD VVVSSQKVIM IDPSLYA

SEQ ID No.9：来自鲑鱼胚胎的白细胞凝集素多肽：

MRTTAAFLLVLCLLAISHAWDCQEVVNIKNLMQIDAGLGQVVATDTSQIPYYLVGDKWIRLPGSLKHITVGPAGIWGVNKDYAIYKYVAGNWVQAAGLLKQLDAGGEQFIVGANMNDTPYCLTSSATVGYKGPGSPLPWTGLPGAVKYYSCGPFGCWAVNKNDDIYLMSLNQDCQNKGWSHIEGKLSMIEVATDGSVFGVNSAGSVYTRDGITASKPEGTGWSNIPMGMLMGHVTYDLGRLWVVSKSAVTMVCTH

SEQ ID No.10：来自鲑鱼白细胞的白细胞凝集素多肽：

SIPYYLVGDKWIRLPGSLKHITVGPAGIWGVNKDYAIYKYVAGNWVQAAGLPKQLDAGGEQFIVGANMDDTPYCLTSSATVGYKGPGSPLPWTGLPGAVKYYSCGPFGCWAVNKNDDIYLMSLNQDCQNNGWSHIEGKLSMIEVATDGSVFGVNSAGSVYTRDGITASKPEGTGWSNIPMCMLMGHVTYDLGRLWVVSKSAVTMVCTH

SEQ ID No.11：来自鲑鱼的白细胞凝集素-2多肽：

MRTTAAFLLVLCLLAISHAWDCQEVVNIKNLMQIDAGLGQVVATDTSQIPYYLVGDKWIRLPGSLKHITVGPAGIWGVNKDYAIYKYVAGNWVQAAGLLKQLDAGGNQFVVGANMDDTPFCLTSSATVGYKGPGSPLPWTGLPGAVKYYSCGHFGCWAVNKNDDIFLMSLNQDCQNNGWSHIDGKLSMIEVATDGSVFGVNSAGSVYTRDGITASKPEGTGWSNIPMGMLMGHVTYDLGRLWVVSKSGGTMVCTH

SEQ ID No.12：来自鲑鱼的白细胞凝集素-3多肽：

MGTTAAFLLVLCLLAISHAWDCQEVVNIKNLMQIDAGLGQVVATDTSQIPYYLVGDKWIRLPGSLKHITVGPAGIWGVNKDYAIYKYVAGNWVQAAGLLKQLDAGGEQFIVGANMNDTPYCLTSSATVGYKGPGSPLPWTGLPGAVKYYSCGPFGCWAVNKNDDIYLMSLNQDCQNKGWSHIEGKLSMIEVATDGSVFGVNSAGSVYTRDGITASKPEGTGWSNIPMGMLMGHVTYDLGRLWVVYKSAVTMVCTH

Claims (9)

1.从鲑鱼孵化液制备化妆品组合物的方法，其包括至少下述步骤：

a)将鲑鱼卵悬浮在最小体积的水中；

b)诱导所述卵的同步快速孵化，使得对于多于95％的胚胎在小于2小时内完成孵化；

c)任选地过滤孵化的卵，以获得孵化液；和

d)过滤b)或c)的孵化液，以获得组合物，其中过滤孵化液的步骤包括至少下述步骤：

(i)使用孔径大小为7μm的过滤器过滤孵化液和收集滤液；

(ii)使来自步骤(i)的滤液进行离子交换层析，包括：

(1)将滤液加载至DEAE(二乙氨乙基)柱离子交换柱；

(2)用pH为8.5的20mM Tris HCl缓冲洗液冲洗柱；

(3)从柱使用第一洗脱缓冲液洗脱白细胞凝集素多肽，所述第一洗脱缓冲液包括缓冲洗液，其包括浓度为50mM的NaCl；

(4)从柱使用第二洗脱缓冲液洗脱剩余多肽，所述第二洗脱缓冲液包括缓冲洗液，其包括浓度为1M的NaCl；

(5)从步骤(4)收集洗脱液；

e)通过使用具有8kDa的排阻尺寸的过滤器进行渗滤，用美容可接受的缓冲液交换来自步骤(5)的洗脱液中的水；

f)使用孔径大小为0.22μm的过滤器过滤获得自步骤(e)的溶液和收集滤液；和

g)从来自步骤(f)的滤液制备所述化妆品组合物，其中，所述组合物包括金属蛋白酶、丝氨酸蛋白酶和一个或多个蛋壳多肽和/或所述多肽的部分。

2.权利要求1所述的方法，包括使用孔径大小为0.30-0.60μm的过滤器过滤来自步骤(i)的滤液的另外步骤和收集滤液。

3.权利要求2所述的方法，其中所述过滤器的孔径大小是0.35-0.55μm。

4.权利要求3所述的方法，其中所述过滤器的孔径大小是0.45μm。

5.权利要求1所述的方法，其中各多肽在所述组合物中以所述组合物中总多肽质量百分数计的比例为：

(i)0.05％至0.20％的金属蛋白酶；

(ii)0.15％至0.40％的丝氨酸蛋白酶；和

(iii)99.40％至99.80％的总蛋壳多肽或所述多肽部分。

6.权利要求5所述的方法，其中所述金属蛋白酶在所述组合物中的比例为0.100％至0.125％。

7.权利要求5所述的方法，其中所述丝氨酸蛋白酶在所述组合物中的比例为0.255％至0.310％。

8.权利要求5所述的方法，其中所述总蛋壳多肽或所述多肽部分在所述组合物中的比例为99.575％至99.645％。

9.权利要求1-8任一项所述的方法，其中所述步骤e)中，所述缓冲液：(I)为磷酸缓冲生理盐水，(II)包含0.5mM磷酸和1mM NaCl，或(III)包含10mM Tris，所述Tris的pH为7.5-8.5且包含5mM NaCl。

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