ES2552020T3 - Péptido derivado de WNT10 y su uso - Google Patents

Péptido derivado de WNT10 y su uso Download PDF

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Abstract

Un péptido que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEC ID N.º: 1.

Description

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La Fig. 4 muestra que la expresión de la proteína Ki-67 (un marcador celular para la proliferación) está remarcablemente potenciada en queratinocitos mediante el tratamiento con el péptido de la presente invención.
La Fig. 5 evalúa el crecimiento de queratinocitos (Fig. 5a) y fibroblastos (Fig. 5b) tras el tratamiento con el péptido. Como se muestra en la Fig. 5a y en la Fig. 5b, se pudo demostrar que la proliferación celular en queratinocitos y fibroblastos tratados con complejo de péptido estuvo mucho más potenciada que en aquellos tratados con cada péptido.
Ejemplo experimental 2: Influencia de péptidos sobre la cantidad elevada de β-Catenina
Queratinocitos HaCaT cultivados durante 48 h se incubaron con los péptidos sintetizados en el Ejemplo 1 de preparación durante 5 h. Se examinó el nivel de expresión de la β-catenina, que es una molécula de señalización esencial para promover el crecimiento del cabello como señalización representativa de la proteína WNT. Se midió la cantidad de β-catenina mediante el análisis de transferencia Western utilizando un anticuerpo dirigido contra la βcatenina (SantaCruz, EE.UU.). Además, se ha observado mediante un ensayo inmunohistoquímico que utiliza la misma que la β-catenina se transloca a un núcleo. El péptido de la presente invención elevó significativamente el nivel de expresión de la β-catenina en queratinocitos. En primer lugar, se ha mostrado que se ha observado la actividad de la β-catenina mediante tratamiento con el péptido de la presente invención a pesar de la presencia de DKK-1 como inhibidor de WNT e inhibidor de la señalización de la β-catenina (Fig. 6a). En el ensayo inmunohistoquímico para evaluar si el péptido funciona para transferir la β-catenina al núcleo, se pudo demostrarse que el presente péptido contribuye a la translocación de la β-catenina desde el citosol al núcleo. Además, se han observado también las actividades de la β-catenina en el citosol ya que la β-catenina sigue estando presente en el citosol (Fig. 6b).
La Fig. 6a representa la potenciación de la expresión de la β-catenina añadiendo el presente péptido y muestra el reaumento de la expresión de la β-catenina incluso en el tratamiento con la proteína DKK-1 y el presente péptido.
La Fig. 6b es un resultado observado utilizando un ensayo inmunohistoquímico, que representa la translocación de la β-catenina a un núcleo.
Tal como se muestra en las Figs. 7 y 8, la expresión de la β-catenina por un complejo de péptido se elevó mucho más que por cada péptido.
Tomando en su conjunto los resultados de los Ejemplos experimentales 1 y 2, se pudo apreciar que los péptidos de la presente invención ejercen excelentes efectos sobre la promoción del crecimiento del cabello y la inhibición de la pérdida del cabello, y tienen también una actividad antienvejecimiento.
Ejemplo experimental 3: Influencia de los péptidos sobre la producción de fibronectina
Para verificar si los péptidos sintetizados en el Ejemplo de preparación 1 potencian la expresión de la fibronectina como una proteína diana de WNT, se añadieron fibroblastos NIH3T3 (4 x 103) a cada pocillo de placas de 96 pocillos y se cultivaron con un 5% de CO2 durante 24 h a 37 ºC. Tras 24 h de cultivo, el medio se cambió por un medio reciente sin suero y las células se trataron con una muestra vacía (para la normalización), tres péptidos sintetizados (1 µg/ml) y el complejo de péptido (1 µg/ml) se disolvieron asépticamente en DMSO al 10% durante 3 h, 10 h, 24 h o 48 h en las mismas condiciones que se han descrito anteriormente. Tras 72 h de incubación, se extrajo el cultivo celular y se midió el nivel de expresión de la fibronectina utilizando el kit ELISA de la fibronectina (R&D systems, EE.UU.).
Como se ha demostrado en la Fig. 9a, se reveló que los péptidos de la presente invención elevan el nivel de fibronectina en los fibroblastos con el paso del tiempo. Además, una vez tratada la proteína DKK-1 y cultivada en las mismas condiciones, se examinó el nivel de expresión de la fibronectina. Como se muestra en la Fig. 9b, el nivel de expresión de la fibronectina se restauró y potenció incluso mediante el tratamiento con la proteína DKK-1 y el presente péptido.
La Fig. 9a es una gráfica que mide la expresión de la fibronectina mediante tratamiento con el péptido de la presente invención durante un tiempo determinado, demostrando que cada péptido ha elevado la expresión de la fibronectina gradualmente en el tiempo.
La Fig. 9b muestra que la expresión de la fibronectina inhibida por DKK-1 (un inhibidor de WNT y un gen de pérdida del cabello) se recuperó mediante la adición del presente péptido. En consecuencia, se restauró la expresión de la fibronectina con el tratamiento del péptido de la presente invención en las mismas condiciones que se describen en la Fig. 9a.
Como se ilustra en la Fig. 10, el nivel de expresión de la fibronectina en un tratamiento de 72 h con péptidos se elevó en comparación con el grupo del control, respectivamente, y se observó la expresión de la fibronectina más elevada en el grupo tratado con el complejo de péptido.
En su conjunto, estos resultados demuestran que los péptidos de la presente invención inducen la ruta de
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Ejemplo 1 de acuerdo con la siguiente composición:
TABLA 2
Ingredientes
Contenido (% en peso)
Nanosoma con péptido
2,5
1,3-butilenglicol
6,0
Glicerina
4,0
PEG 1500
1,0
Hialuronato de sodio
1,0
Polisorbato 20
0,5
Etanol
8,0
Conservante, pigmento
Cantidad adecuada
Benzofenona-9
0,05
Perfume
Cantidades mínimas
Agua destilada
Cantidad residual
Total
100
Ejemplo de formulación 2: Crema nutritiva
Se formuló una crema nutritiva que comprendía nanosomas que contenían los péptidos preparados en el Ejemplo 1 de acuerdo con la siguiente composición:
TABLA 3
Ingredientes
Contenido (% en peso)
Nanosoma con péptido
2,5
Aceite de hierba de la pradera
3,0
Alcohol cetearílico
1,5
Ácido esteárico
1,5
Estearato de glicerilo
1,5
Parafina líquida
10,0
Cera
2,0
Polisorbato 60
0,6
Sesquioleato de sorbitán
2,5
Escualano
3,0
1,3-butilenglicol
3,0
Glicerina
5,0
Trietanolamina
0,5
Acetato de tocoferilo
0,5
Conservante, pigmentos
Cantidad adecuada
Perfume
Cantidad adecuada
Agua destilada
Cantidad residual
Total
100
Ejemplo de formulación 3: Líquido nutritivo
10 Se formuló un líquido nutritivo que comprendía nanosomas que contenían péptidos preparados en el Ejemplo 1 de acuerdo con la siguiente composición:
TABLA 4
Ingredientes
Contenido (% en peso)
Nanosoma con péptido
2,5
1,3-butilenglicol
4,0
Glicerina
4,0
Alcohol cetearílico
0,8
Estearato de glicerilo
1,0
Trietanolamina
0,13
Acetato de tocoferilo
0,3
Parafina líquida
5,0
Escualano
3,0
Aceite de nuez de macadamia
2,0
11
E09849032
02-11-2015
(continuación)
Ingredientes
Contenido (% en peso)
Polisorbato 60
1,5
Sesquioleato de sorbitán
0,5
Polímero de carboxivinilo
1,0
Conservante, pigmentos
Cantidad adecuada
Perfume
Cantidad adecuada
Agua destilada
Cantidad residual
Total
100
Ejemplo de formulación 4: Esencia
Se formuló una esencia que comprendía nanosomas que contenían péptidos preparados en el Ejemplo 1 de acuerdo con la siguiente composición:
TABLA 5
Ingredientes
Contenido (% en peso)
Nanosoma con péptido
2,5
Glicerina
10,0
1,3-butilenglicol
5,0
PEG 1500
2,0
Alantoína
0,1
DL-pantenol
0,3
EDTA-2Na
0,02
Hidroxietilcelulosa
0,1
Hialuronato de sodio
8,0
Polímero de carboxivinilo
0,2
Trietanolamina
0,18
Octildodeceth-16
0,4
Etanol
6,0
Perfume, conservante, pigmentos
Cantidad adecuada
Agua destilada
Cantidad residual
Total
100
Ejemplo de formulación 5: Suero capilar
Se formuló un suero capilar que comprendía nanosomas que contenían los péptidos preparados en el Ejemplo 1 de 10 acuerdo con la siguiente composición:
TABLA 6
Ingredientes
Contenido (% en peso)
Nanosoma con péptido
1
Glicerina
10,0
1,3-butilenglicol
5,0
PEG 1500
2,0
Alantoína
0,1
DL-pantenol
0,3
EDTA-2Na
0,02
Hidroxietilcelulosa
0,1
Hialuronato de sodio
8,0
Polímero de carboxivinilo
0,2
Trietanolamina
0,18
Octildodeceth-16
0,4
Etanol
6,0
Perfume, conservante, pigmentos
Cantidad adecuada
Agua destilada
Cantidad residual
Total
100
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