CN108174598B - 抑制snare复合物形成的含有杨梅素衍生物的组合物 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及用于抑制SNARE复合物形成的含有杨梅素衍生物的组合物，以及可以提供抑制SNARE复合物形成的组合物，其中杨梅素衍生物由于具有在体内抑制SNARE复合物形成的活性而被用作SNARE靶向前药，所述杨梅素衍生物具有新颖的结构并且通过对杨梅素也可以对作为杨梅素衍生物之一的西伯利亚落叶松黄酮、combretol和丁香亭进行酰化而获得。根据研究结果，认为杨梅素衍生物显示出在细胞中生物转化为杨梅素的作用。杨梅素衍生物没有传统杨梅素的深色，并且其性质已发生改变，使得杨梅素衍生物具有光稳定性和脂溶性。因此，由于稳定形式的杨梅素衍生物被吸收到细胞中，使得显示出由通常杨梅素具有的抑制SNARE复合物形成的活性，因此本发明可以表现出作为可用作SNARE靶向前药的材料的优异的功能以及作为用于抑制SNARE复合物的形成的包含其的组合物优异的功能。

Description

抑制SNARE复合物形成的含有杨梅素衍生物的组合物
技术领域
本发明涉及用于抑制可溶性N-乙基马来酰亚胺敏感因子附着蛋白受体(SNARE)复合物形成的组合物，所述组合物包含杨梅素衍生物。
背景技术
SNARE(可溶性N-乙基马来酰亚胺敏感因子附着蛋白受体；SNAP受体)蛋白质是酵母和哺乳动物细胞中由60个或更多成员组成的大型蛋白质超家族，并且SNARE蛋白质的主要作用是介导囊泡融合。也就是说，SNARE蛋白介导囊泡与它们的结合于诸如溶酶体之类的隔室的靶膜的融合。作为一个具体的例子，SNARE介导突触囊泡与神经元中的突触前膜的对接。
同时，为了调节肌肉的松弛和收缩，在肌肉的上层存在神经肌肉接头，并且突触囊泡装载在该神经末梢中。肌肉通过接收从突触囊泡内部传递的神经递质的信息而收缩，并且释放这种神经递质，SNARE蛋白形成复合物，这使得神经递质与肌肉对接。特别是，为了释放神经递质，需要将含有神经递质的突触囊泡与突触前膜融合，从而可以形成在两个边界之间的通道，并且此时由包含三种蛋白质的SNARE复合物提供用于这种膜融合的基本力。特别地，神经递质的释放通道通过突触囊泡和突触前膜之间的膜融合而开放，并且t-SNARE复合物(为突触融合蛋白-1a蛋白和连接到靶膜的SNAP-25蛋白的复合物)和附着于囊泡的v-SNARE参与该途径，并且这样的SNARE蛋白质以螺旋形状扭曲。
在所述膜融合中，发生了本领域广为人知的脂质双分子层的重排。由于生物膜彼此强烈排斥，因而膜不能自发融合，并且因此需要强大的外力来克服膜之间的排斥力。此时，SNARE蛋白质产生如此强大的力量足以克服膜之间的排斥力。也就是说，SNARE复合物的形成是克服膜间排斥力的力量的来源，并且是包括释放神经递质的细胞外胞外分泌中的主要作用[Weber等，Cell，92,759-772(1998)]。
例如，皮肤毛孔通常分布在面部皮肤中，但特别是可以在鼻和口腔部位视觉识别，并且毛孔的外观根据内在和外在因素如性别、遗传因素、老化、痤疮、慢性紫外线照射等因人而异。毛孔扩大的原因在于，当皮脂过度分泌或皮肤老化开始时，支撑孔壁的胶原纤维和弹性纤维变性并减少，导致皮肤弹性丧失和皮肤松弛。由于附着于毛发上的肌肉(立毛肌)的收缩或松弛处于交感神经和副交感神经的控制下，所以通过神经控制可以减小或扩大毛孔。交感神经距肌肉稍远，使毛孔变窄，而副交感神经位于肌肉附近并使毛孔扩大。当副交感神经被选择性抑制时，交感神经的补偿作用使附着于毛发上的肌肉收缩，从而减少毛孔。
另一方面，如果SNARE的缀合和扭曲没有完全完成，则膜融合失败，因此不会发生神经递质的释放，这最终导致肌肉不运动。这表明，通过这个过程，可以防止由经常使用的肌肉产生的皱纹的产生，并且也可以减少预先形成的皱纹。此外，通过抑制神经递质的释放，可缓解由于释放比需要的更大量的神经递质而刺激汗腺引起的过度出汗的多汗症。
换言之，由于SNARE形成抑制作用，可以抑制由肌肉运动引起的皱纹的产生并且可以减轻形成的皱纹，并且作为由神经递质的过度释放引起的疾病之一的多汗症可以得到治疗、预防和缓解。
此外，在体内肥大细胞特异性SNARE蛋白质复合物的形成被抑制的情况下，肥大细胞脱颗粒被抑制，从而治疗和预防过敏性疾病和自身免疫疾病(Woska J.R.Jr.和Gillespie M.E.,J.Cell Mol.Med.,2012,16(4):649-656)。
靶向SNARE的代表性物质包括引起肉毒中毒食物中毒和破伤风的细菌神经毒素等。例如，来源于肉毒杆菌(Clostridium botulinum)的神经毒素是被称为“肉毒杆菌毒素(Botox)”的药物的主要成分，其已知主要用于例如除皱等美容程序，并且还用于治疗多种神经递质分泌和/或肌肉相关的疾病，例如斜视，眼睑痉挛，声带功能障碍，斜颈，心肌病，溃疡和胃酸反流障碍，食欲减退，胰腺疾病，妊娠纹，膀胱活动过度，肛裂，小儿麻痹症，肌肉疼痛，髋关节畸形，多汗症，背痛，颈痛，慢性头痛，颅神经障碍等。具体而言，已知肉毒杆菌毒素对上述疾病具有治疗效果，因为作为肉毒杆菌毒素的主要成分的神经毒素通过特异性作用于神经元中存在的SNARE而抑制复合物形成，由此抑制膜融合，导致阻断释放神经递质，从而抑制肌肉的运动或交感神经或副交感神经系统。但是，肉毒杆菌毒素成分是有毒物质，因此可能会导致副作用；因此，在确定其剂量或应用部位时需要谨慎。
发明内容
【技术问题】
作为努力开发具有抑制SNARE复合物形成的作用并因此表现出与肉毒杆菌毒素类似的药理学活性且具有降低的细胞毒性和增加的稳定性的药物的结果，本发明人证实了杨梅素衍生物(其中杨梅素的一个或多个羟基被烷基化或酰化)表现出抑制SNARE复合物形成的效果，并且即使在暴露于UV时由于显著改进的稳定性而不会变色和/或着色，因此可以有效地用于化妆品组合物等中，从而完成了本发明。
【技术方案】
本发明的一个目的是提供适合用作靶向可溶性N-乙基马来酰亚胺-敏感因子附着蛋白受体(SNARE)的前药的物质，其不具有与颜色、反应性、对阳光的强氧化作用等有关的问题，以及提供用于抑制SNARE复合物形成的包含该物质的组合物。
本发明还提供了一种适于用作SNARE-靶向前药的物质，其具有比传统杨梅素更高的抑制SNARE复合物形成的活性，以及提供用于抑制SNARE复合物形成的组合物，所述组合物包含所述物质。
此外，本发明提供用于预防或治疗皮肤皱纹、疼痛、多汗症、毛孔扩大或过敏的药物组合物，其包含上述组合物，以及提供用于缓解皮肤皱纹、过敏症状或毛孔的化妆品组合物。
【有益效果】
本发明的有益之处在于，通过酰化杨梅素以及作为杨梅素衍生物的西伯利亚落叶松黄酮(laricitrin)、combretol和丁香亭(syringetin)而获得的新颖杨梅素衍生物具有体内抑制SNARE复合物形成的活性，但不具有在体外抑制SNARE复合物形成的作用，因此可以作为SNARE靶向前药应用。
附图说明
图1示意性地示出了用于验证根据本发明的前药的效果的筛选系统。
图2示出了西伯利亚落叶松黄酮、combretol和丁香亭的SNARE介导的膜融合抑制活性的验证结果。
图3示出了根据本发明的一个实施方案，在脂肪酶催化剂存在下使用棕榈酸乙烯酯酰化产生的部分酰化杨梅素衍生物混合物的结构和组成的1H NMR分析结果。
图4示出了根据本发明的另一个实施方案，含有通过使用棕榈酸作为脂肪酸进行酰化而产生的其中杨梅素的所有羟基被酰化的杨梅素衍生物的混合物的结构和组成的1HNMR分析结果。
图5示出了根据本发明的一个实施方案，含有通过使用乙酸作为脂肪酸进行酰化而产生的其中杨梅素的所有羟基被酰化的杨梅素衍生物的混合物的结构和组成的1H NMR分析结果。
图6示出了根据本发明的另一个实施方案，含有通过使用硬脂酸作为脂肪酸进行酰化而产生的其中杨梅素的所有羟基都被酰化的杨梅素衍生物的混合物的结构和组成的1H NMR分析结果。
图7示出了根据本发明的又一个实施方案，含有通过使用月桂酸作为脂肪酸进行酰化而产生的其中杨梅素的所有羟基被酰化的杨梅素衍生物的混合物的结构和组成的1HNMR分析结果。
图8示出了响应于丁香亭和西伯利亚落叶松黄酮的神经递质释放速率的检查结果。
图9示出了针对根据本发明的实施方案获得的杨梅素衍生物，神经递质释放速率的检查结果。
图10示出了针对根据本发明的实施方案获得的杨梅素衍生物的神经递质释放速率的检查结果。
图11示出了与杨梅素相比，丁香亭和西伯利亚落叶松黄酮的光稳定性的检查结果。
图12示出了将杨梅素衍生物以1mg/1ml的比例溶解在芥花油(canola oil)和矿物油中的情况下的溶解度观察结果。
图13是显示根据杨梅素的羟基被棕榈酸酰化的程度杨梅素衍生物的颜色变化的一组图像，其中A表示杨梅素的一个羟基被棕榈酸酰化的情况(实施例3)，B表示杨梅素的全部羟基被棕榈酸酰化的情况(实施例4)。
图14示出了根据本发明实施方式获得的杨梅素衍生物的光稳定性的检查结果。
图15示出根据本发明的实施方式获得的杨梅素衍生物的细胞内生物转化率的检查结果。
图16示出了检查根据本发明实施方式获得的杨梅素衍生物是否实际上具有体内抑制多汗症活性的结果。
图17示出了杨梅素、西伯利亚落叶松黄酮和根据本发明的实施方案获得的杨梅素衍生物的细胞存活力的检查结果。
具体实施方式
本发明的一个实施方案提供用于抑制可溶性NSF附着蛋白受体(SNARE)复合物形成的组合物，其包含由下式1表示的化合物或其药学上可接受的盐作为活性成分。
[式1]
Figure BDA0001609555440000051
其中，在上述的式1中，
R1、R2、R3、R4、R5和R6中的每一个独立地为氢、直链或支链C1-4烷基
或直链或支链的饱和或不饱和C1-20酰基，
所述烷基或所述酰基可以彼此相同或不同，并且，
并非所有的R1、R2、R3、R4、R5和R6都是氢。
在下文中，将详细描述本发明。
在本发明中，筛选各种候选物质以开发具有与商业上广为人知的肉毒杆菌毒素活性相似的活性的前药，并且先前的研究证实，在这些候选物质中，多酚类(杨梅素，花翠素和花青素)的衍生物(已知其作为SNARE抑制剂起作用)可能被用作前药。具体而言，已知杨梅素中断SNARE复合物的形成，其通过将杨梅素插入其中以阻止SNARE介导的膜融合，从而使该复合物处于半融合状态而实现。但是，在用杨梅素替代肉毒杆菌毒素(主要用于美容目的)之前，还有一些问题需要解决。这些问题主要与化学结构有关，例如颜色、反应性等问题。在本发明中，尽管通过图1的筛选方法(参见实施例1)已经寻求克服这些问题的替代方案，已发现式1表示的化合物(其为杨梅素衍生物)具有体内抑制SNARE复合物形成的能力，因此可用作SNARE靶向前药。本发明以这一发现为基础。
具体而言，在本发明的一个实施方案中，证实了杨梅素的甲基化形式的西伯利亚落叶松黄酮、combretol和丁香亭具有体内抑制SNARE复合物形成的能力，因此可以用作SNARE靶向前药(参见实施例2)。
作为杨梅素天然衍生物的西伯利亚落叶松黄酮、combretol和丁香亭可以分别由式2、3和4表示。
[式2]
Figure BDA0001609555440000061
[式3]
Figure BDA0001609555440000071
[式4]
Figure BDA0001609555440000072
另外，在本发明的一个实施方案中，通过在脂肪酶催化剂存在下使用酰基供体酰化杨梅素制备对应于由式1表示的化合物的新颖杨梅素衍生物，并证实所制备的杨梅素衍生物具有体内抑制SNARE复合物形成的能力，因此可以用作SNARE靶向前药(参见实施例3)。
此外，在本发明的一个实施方案中，通过使杨梅素与作为酰基供体的脂肪酸和草酰氯在碱的存在下发生反应酰化杨梅素来制备其中所有R1、R2、R3、R4、R5和R6均被脂肪酸衍生的酰基酰化的杨梅素衍生物，作为对应于该式1化合物的新颖杨梅素衍生物，并且证实所制备的杨梅素衍生物具有体内抑制SNARE复合物形成的能力，因此可以用作SNARE靶向前药(参见
实施例4)。
根据本发明的用于抑制SNARE复合物形成的组合物可以包含由下式1表示的化合物作为活性成分。
[式1]
Figure BDA0001609555440000081
其中，在上述的式1中，
R1、R2、R3、R4、R5和R6中的每一个独立地为氢、直链或支链C1-4烷基或直链或支链的饱和或不饱和C1-20酰基，
所述烷基或所述酰基可以彼此相同或不同，并且，
并非所有的R1、R2、R3、R4、R5和R6都是氢。
优选地，由式1表示的化合物可以选自由式1a至1d表示的化合物：
[式1a]
Figure BDA0001609555440000082
[式1b]
Figure BDA0001609555440000083
[式1c]
Figure BDA0001609555440000091
[式1d]
Figure BDA0001609555440000092
其中在上述式1a至1d中，
R1'、R2'、R3'、R4'、R5'和R6'中的每一个独立地为直链或支链的饱和或不饱和的C1-20酰基，且
所述酰基可以彼此相同或不同。
所述酰基可以选自由乙酰基，丁酰基，辛酰基，月桂酰基，棕榈酰基，硬脂酰基和二十烷酰基组成的组。
具体而言，适用于抑制SNARE复合物形成的组合物中的由式1表示的化合物可以选自由以下化合物组成的组：
Figure BDA0001609555440000093
Figure BDA0001609555440000101
其中，在上述式中，n是0至18的整数。
根据本发明的用于抑制SNARE复合物形成的组合物可以包括所有的由式1a表示的化合物、由式1b表示的化合物和由式1c表示的化合物。
在一个示例性实施方案中，根据本发明的用于抑制SNARE复合物形成的组合物可以是药物组合物或化妆品组合物。
在本发明中，通过抑制SNARE复合物的形成来治疗、缓解或预防的疾病或症状可以是皮肤皱纹、疼痛、多汗症、毛孔扩大、过敏性疾病或自身免疫性疾病，但是本发明不限于此。本发明的化合物可以像肉毒杆菌毒素一样有效地抑制SNARE复合物的形成，因此可以不受限制地用于可以使用肉毒杆菌毒素减轻或治疗的疾病。
例如，过敏性疾病可以是过敏性反应，过敏性鼻炎，哮喘，荨麻疹，特应性皮炎，接触性皮炎或过敏性皮炎，但是本发明不限于此。
根据本发明的一个实施方案，西伯利亚落叶松黄酮、combretol和丁香亭显示具有抑制SNARE复合物形成的作用(参见实施例2)，并且可以观察到杨梅素衍生物以浓度依赖性方式抑制乙酰胆碱释放(参见实施例4和图4)。与杨梅素相比，杨梅素衍生物显示出优异的抑制乙酰胆碱释放的活性。本发明的杨梅素衍生物通过抑制SNARE复合物的形成和抑制乙酰胆碱释放，可以有效用于治疗、缓解或预防皮肤皱纹，疼痛，多汗症，毛孔扩大或过敏性疾病。
当根据本发明的用于抑制SNARE复合物形成的所述组合物为药物组合物时，所述组合物可进一步包含药学上可接受的载体。
如本文所用的术语“药学上可接受的”是指描述的组合物和分子，其在生理上是可接受的，并且当施用给人时通常不会引起意外的反应。优选地，如本文所用，术语“药学上可接受的”意欲被其它通常已知的药典批准用于哺乳动物，特别是人。
药学上可接受的载体可以包括各种成分如乳糖，右旋糖，蔗糖，山梨醇，甘露醇，木糖醇，赤藓糖醇，麦芽糖醇，淀粉，阿拉伯胶，藻酸盐(alginate)，明胶，磷酸钙，硅酸钙，纤维素，甲基纤维素，微晶纤维素，聚乙烯吡咯烷酮，水，羟基苯甲酸甲酯，羟基苯甲酸丙酯，滑石粉，硬脂酸镁，矿物油等。
本发明的药物组合物可以通过非口服途径给药，可以以常规药物制剂的形式给药，例如用于临床给药的各种非口服制剂中的一种给药，并且可以使用通常使用的稀释剂或赋形剂(如填充剂，增量剂(extender)，粘合剂，润湿剂，崩解剂，表面活性剂等)配制。
用于非口服给药的制剂包括无菌水溶液，非水溶剂，悬浮液，乳液或冷冻干燥制剂。非水溶剂和悬浮液的实例包括丙二醇，聚乙二醇，植物油如橄榄油，可注射酯如油酸乙酯等。
根据本发明的用于抑制SNARE复合物形成的药物组合物当包含有效量的由式1表示的化合物时，可以表现出抑制SNARE复合物形成的效果。如本文所用，术语“有效量“是指足以表现出抑制SNARE复合物形成作用的化合物的量。包含在本发明组合物中的由式1表示的化合物的有效量可根据所述组合物的商品化形式、所述化合物在皮肤上的应用方法、所述化合物在皮肤上的停留时间等而变化。例如，当该组合物要作为药物生产时，该组合物可以包含较高浓度的由式1表示的化合物，其浓度高于其中该组合物生产作为通常应用于皮肤的诸如洗发剂、护发素、发膜等产品的情形。因此，可以确定该组合物的日剂量，使得施用0.01mg/kg至10mg/kg、优选0.1mg/kg至1mg/kg的由式1表示的化合物，并且可以一天施用该组合物一次到六次。另外，剂量可以根据年龄、性别、体重、疾病的严重程度、给药途径等而增加或减少。因此，剂量不以任何方式限制本发明的范围。
本发明的药物组合物可以单独使用或与使用手术、放射疗法、激素疗法、化学疗法和生物反应调节剂的方法组合使用。
本发明还可以提供用于抑制SNARE复合物形成的皮肤外用制剂，其包含式1表示的化合物作为活性成分。
当由式1表示的化合物用作皮肤外用制剂时，所述皮肤外用制剂可进一步包含皮肤病学中常用的助剂，如脂肪物质，有机溶剂，增溶剂，增稠剂，胶凝剂，软化剂，抗氧化剂，悬浮剂，稳定剂，发泡剂，调味剂，表面活性剂，水，离子或非离子乳化剂，填充剂，螯合剂，络合剂，防腐剂，维生素，封阻剂(blocking agent)，润湿剂，精油，染料，色素，亲水或疏水活化剂，脂囊泡或通常用于皮肤外用制剂中的其它成分。另外，可以以皮肤病学通常使用的量包含上述成分。
当由式1表示的化合物以用于皮肤外用的制剂提供时，该制剂可应用于毛发，如凝胶、乳膏、贴剂或气雾剂，但是本发明不限于此。
本发明还可以提供用于抑制SNARE复合物形成的化妆品组合物，其包含由式1表示的化合物作为活性成分。
当由式1表示的化合物用作化妆品时，通过包含由式1表示的化合物作为活性成分而制备的化妆品通常可以是乳化和可溶性制剂。这种制剂的实例包括喷雾剂，发胶，发膜，洗发剂，护发素，头发洗剂(hair lotion)，护发精华素，贴剂和气雾剂。
此外，除了由式1表示的化合物之外，所述化妆品还可以包含通常用于美容学的助剂，如脂肪物质，有机溶剂，增溶剂，增稠剂，胶凝剂，软化剂，抗氧化剂，悬浮剂，稳定剂，发泡剂，调味剂，表面活性剂，水，离子或非离子乳化剂，填充剂，螯合剂，络合剂，防腐剂，维生素，封阻剂(blocking agent)，润湿剂，精油，染料，颜料，亲水或疏水活化剂，脂囊泡或通常用于化妆品中的其它成分。
优选地，本发明的组合物可以制成适用于头皮的任何制剂，例如液体、乳膏、糊剂、固体等，并且可以通过包含额外的常规添加剂来制备成组合物，例如洗发剂、护发素、毛发洗剂、液体型毛发生长洗剂等，以用于抑制SNARE复合物的形成。在这种情况下，该制剂还包括气雾剂。
在本发明组合物中由式1表示的化合物的量，可以相对于所述整体组合物的总重量为0.001重量％至10重量％，优选0.005重量％至5重量％，并且最优选0.01重量％至3重量％。
当由式1表示的化合物的量小于0.001重量％时，可能难以预期将显示SNARE复合物形成抑制效果，并且当由式1表示的化合物的量大于10重量％时，难以将所述组合物制备成合适的制剂或确保长期稳定性。
本发明的另一个实施方案还提供由下式1表示的化合物，包含其的混合物或该化合物的药学上可接受的盐。
[式1]
Figure BDA0001609555440000141
其中，在上述式1中，
R1、R2、R3、R4、R5和R6中的每一个独立地为氢、直链或支链C1-4烷基或直链或支链的饱和或不饱和C1-20酰基，
所述烷基或所述酰基可以彼此相同或不同，并且，
并非所有的R1、R2、R3、R4、R5和R6都是氢。
根据本发明的化合物可以选自由式1a至1d表示的化合物。
[式1a]
Figure BDA0001609555440000142
[式1b]
Figure BDA0001609555440000143
[式1c]
Figure BDA0001609555440000144
[式1d]
Figure BDA0001609555440000151
其中，在上述式1a至1d中，
R1'、R2'、R3'、R4'、R5'和R6'中的每一个独立地为直链或支链的饱和或不饱和的C1-20酰基，且
所述酰基可以彼此相同或不同。
本发明的另一个实施方案还提供了制备由下式1表示的化合物的方法，其包括在脂肪酶催化剂存在下使用酰基供体酰化杨梅素：
[式1]
Figure BDA0001609555440000152
其中，在上式1中，
R1、R2、R3、R4、R5和R6中的每一个独立地为氢、或者直链或支链的饱
和或不饱和的C1-20酰基，
所述酰基可以彼此相同或不同，并且
并非所有的R1、R2、R3、R4、R5和R6都是氢。
在本发明中，脂肪酶催化剂可以来自属于产碱杆菌属(Alcaligenes sp)的细菌菌株。
在该方法中，所述酰基供体可以是乙酸乙烯酯，丁酸乙烯酯，辛酸乙烯酯，月桂酸乙烯酯，棕榈酸乙烯酯，硬脂酸乙烯酯或二十烷酸乙烯酯，但是本发明不限于此。
在该方法中，所述酰基供体可以以相对于反应底物的0.5当量至5当量的量使用。
在该方法中，通过使用水作为培养基，酰化可以在40℃至65℃的温度下进行20小时至60小时。
本发明的另一个实施方案还提供了制备由下式1表示的化合物的方法，其包括通过使杨梅素与作为酰基供体的脂肪酸和草酰氯在碱的存在下发生反应使杨梅素酰化：
[式1]
Figure BDA0001609555440000161
其中，在上式1中，
R1、R2、R3、R4、R5和R6中的每一个独立地为氢、或者直链或支链的饱
和或不饱和的C1-20酰基，
所述酰基可以彼此相同或不同，并且
并非所有的R1、R2、R3、R4、R5和R6都是氢。
在本发明中，所述碱可以是但不限于吡啶。
在该方法中，作为酰基供体的脂肪酸可以是但不限于乙酸，丁酸，辛酸，月桂酸，棕榈酸，硬脂酸或花生酸或二十烷酸。
在该方法中，作为酰基供体的脂肪酸可以以相对于反应底物的5当量至50当量的量使用。
在该方法中，酰化可以在30℃至80℃的温度下进行10小时至30小时。
【发明实施方式】
在下文中，将参考以下实施例更详细地描述本发明的构造和效果。然而，这些实施例仅用于说明的目的，并不意图限制本发明的范围。
实施例1：开发用于验证SNARE抑制剂前药疗效的筛选系统
通过使用荧光现象设计出能够方便地鉴定和快速筛选具有与已知肉毒杆菌神经毒素(Botox)类似功能的前药的功能的系统(参见图1)。进行了两步实验以检查前药在体内但不是体外的功能的特征。在本实施例中，作为荧光蛋白的CFP和YFP分别与作为神经元SNARE蛋白的突触融合蛋白1A(STX1A)和VAMP2的C-末端结合，从而构建了表达这两种蛋白的PC12稳定细胞系(参见图1B)。通过观察荧光蛋白之间的荧光共振能量转移(FRET)现象间接测量这两种荧光蛋白之间距离的变化。用含有神经肽Y(NPY)-RFP基因的质粒转染所述细胞系，并且总共使用三种类型的蛋白质复合物(突触融合蛋白1A-CFP，VAMP2-YFP和NPY-RFP)来验证前药的体内效应(参见图1A)。另外，通过用荧光染料(NBD，罗丹明B)标记人工产生的脂质双层膜，通过FRET现象观察膜融合过程来检查所述前药的体外效应(参见图1C)。
实施例2：西伯利亚落叶松黄酮(laricitrin)、combretol和丁香亭(syringetin)的SNARE介导的膜融合抑制活性的验证
使用作为能够测量SNARE介导的膜融合过程的筛选方法的实施例1(参见图1)的方法验证了西伯利亚落叶松黄酮(laricitrin)、combretol和丁香亭(syringetin)的功能(参见图2)。SNARE蛋白的结合通过作为哺乳动物神经元的PC12细胞中SNARE的C末端的FRET改变(FRET C)来验证，并且同时通过测量神经肽Y-RFP的释放(NPY释放)来验证内容物释放。另外，在验证候选物质的功能时，通过观察体外膜融合变化将体内功能与体外功能区分开(参见图2A)。未用任何物质处理的对照(对照)，用已知为传统SNARE复合物形成抑制剂的杨梅素处理的杨梅素处理组(M)，经过西伯利亚落叶松黄酮(laricitrin)处理的组(L)，combretol处理的组(C)和丁香亭处理的组(S)彼此进行比较。
结果，在杨梅素处理组中，体内和体外功能均降至对照组的40％或更低，这与先前研究报道的结果相符。相比之下，与杨梅素相比，西伯利亚落叶松黄酮(laricitrin)、combretol和丁香亭产生类似的体内结果(对照的40％至45％)，但体外结果显著不同(对照的85％至90％)。这些体内特异性特征表明，可以开发西伯利亚落叶松黄酮(laricitrin)、combretol和丁香亭(syringetin)作为仅在吸收入体内时才有效发挥功能的前药，从而可以有效地解决传统肉毒杆菌毒素或杨梅素的缺点。
通过SNARE复合物的免疫印迹可以清楚地证实上述特征(参见图2B)。已知SNARE复合物具有SDS抗性，并且基于这些特征，使用SDS-PAGE的免疫印迹通常用来鉴定SNARE复合物的形成。类似于图2所示的实验结果，杨梅素表现出在体内和体外均降低的SNARE复合物形成的趋势，而西伯利亚落叶松黄酮(laricitrin)、combretol和丁香亭(syringetin)仅在体内显示出降低的趋势(参见图2B)。总之，上述结果表明，作为杨梅素衍生物的西伯利亚落叶松黄酮(laricitrin)、combretol和丁香亭(syringetin)表现出体内特异性效应，因此可以通过使用这些特性被开发为前药的试剂。
实施例3：在脂肪酶催化剂的存在下通过酰化制备杨梅素衍生物
杨梅素在化学反应性、皮肤渗透性等方面具有缺点。在本实施例中，证实了这些缺点可以通过使杨梅素与有机化合物反应来解决。该反应是脂肪酶催化的酰化反应，其中与芳族烃的碳原子键合的氢被酰基(RCO-)取代。如在下面的反应方案中，上述缺点可通过杨梅素的脂肪酶催化酰化来解决。
Figure BDA0001609555440000181
使用丁酸乙烯酯，辛酸乙烯酯，月桂酸乙烯酯，棕榈酸乙烯酯或二十烷酸乙烯酯，作为用于杨梅素的所述反应的酯化合物，即酰基供体底物。用作底物的酯化合物是具有4、8、12、16或20个碳原子的烷基链的化合物。
具体而言，首先，将318.24mg杨梅素、1当量的多种酰基供体底物中的每一种以及属于产碱杆菌属(Algaligenes sp)(购自Meito Sangyo Co.，Ltd)的细菌与50ml水混合作为培养基。所得混合物在56℃温育40小时以进行酶促反应。
接下来，所述反应溶液在薄层色谱中显影以鉴定对应于该化合物的斑点。此后，进行柱层析(产品名称：“M.S.GEL”，AGC Si-Tech CO.,INC.)以除去未反应的酰基供体。
作为通过对有机化合物(即，在脂肪酶催化剂存在下用各种酰基供体酰化产生的一系列杨梅素衍生物)进行1H NMR分析的结果(参见图3)，获得具有如下表1所示组成的混合物。每个化合物名称中的C#表示与其连接的酰基中的碳原子数。
[表格1]
Figure BDA0001609555440000191
实施例4：通过使用碱和草酰氯的酰化制备杨梅素衍生物
如下面的反应方案所示，通过使用碱和草酰氯，使用脂肪酸对杨梅素进行酰化来制备杨梅素衍生物。
Figure BDA0001609555440000192
使用乙酸，丁酸，辛酸，月桂酸，棕榈酸，硬脂酸或十八酸或二十酸作为用作酰基供体的脂肪酸。用作酰基供体的脂肪酸是具有2、4、8、12、16、18或20个碳原子的烷基链的脂肪酸。
具体而言，首先使多种酰基供体(2844.8mg硬脂酸，2564.2mg棕榈酸，2003.1mg月桂酸)的每一种与草酰氯反应，制备高反应性脂肪酸。随后，将318.24mg杨梅素与由所述反应获得的反应产物和50ml吡啶碱混合。将所得混合溶液缓慢加热至等于室温或高于室温(40℃)的温度以使反应发生并持续16小时。
接下来，所述反应溶液在薄层色谱中显影以鉴定对应于该化合物的斑点。此后，进行柱层析(产品名称：“M.S.GEL”，AGC Si-Tech CO.,INC.)以除去未反应的杨梅素。之后，将相应的化合物溶于水中，然后用氯仿萃取，并且该过程重复数次以获得高纯度的化合物。
如上所述，获得了有机化合物，即通过使用脂肪酸和草酰氯在碱催化剂的存在下酰化而制备的杨梅素衍生物。使用棕榈酸作为脂肪酸获得的杨梅素衍生物的1H NMR分析结果示于图4中。另外，使用乙酸、硬脂酸和月桂酸作为脂肪酸代替棕榈酸获得的杨梅素衍生物的1H NMR分析结果分别示于图5、6和7。
实验实施例1：杨梅素衍生物对神经递质释放抑制的实验
使用以下两种方法检测响应于实施例3中获得的改性杨梅素衍生物的神经递质的释放速率。具体的实验方法如下所述。
第一种方法如下。具体而言，培养PC12细胞以在培养皿中获得70％至80％的汇合度。随后，用具有高K+的Krebs缓冲液(56mM NaCl，1.2mM MgSO4，2.5mM CaCl2，68mM KCl，24mM NaHCO3，2mM KH2PO4和11mM葡萄糖，pH 7.4)处理PC12细胞，在5％CO2培养箱中于37℃温育5分钟。然后，用Krebs缓冲液(118mM NaCl，1.2mM MgSO4，2.5mM CaCl2，5mM KCl，24mMNaHCO3，2mM KH2PO4和11mM葡萄糖，pH 7.4)洗涤PC12细胞两次，每次1分钟，然后将各杨梅素衍生物(西伯利亚落叶松黄酮：L，combretol：C，丁香亭：S，各20μM)和[3H]去甲肾上腺素(1μCi/ml)混合到培养基中，然后更换培养基。将PC12细胞在5％CO2培养箱中于37℃温育2小时，然后用Krebs缓冲液洗涤两次，每次1分钟。彻底洗涤后，将PC12细胞用所述培养基洗涤四次，每次15分钟。去除剩余的培养基后，用Krebs缓冲液将PC12细胞洗涤两次，每次1分钟，以收集基础水平(basal level)的样品。将所述培养基替换为具有高K+的Krebs缓冲液，然后培养10分钟以收集样品。使用液体闪烁计数器对收集的样品进行辐射测量。
其结果在图8和图9中示出。
从图8的结果可以看出，证实了天然存在的杨梅素衍生物显示出抑制神经递质[3H]去甲肾上腺素的释放的作用，并且在这些杨梅素衍生物中西伯利亚落叶松黄酮具有最高反应性，显示出与传统杨梅素相比至少两倍改善的活性。
另外，通过图9的结果，证实杨梅素以浓度依赖性方式显示抑制神经递质释放的效果，并且通过使杨梅素与乙酸反应获得的衍生物(MA)与杨梅素相比表现出相当的或略微更好的活性。
第二种方法如下。具体而言，培养PC12细胞以在培养皿中获得70％至80％的汇合度。随后，将PC12细胞用具有高K+的Krebs缓冲液处理，并在5％CO2培养箱中在37℃温育15分钟。将PC12细胞用Krebs缓冲液洗涤两次，每次1分钟，将每种杨梅素衍生物混合在培养基中，然后更换培养基。将PC12细胞在5％CO2培养箱中在37℃下温育2小时，然后用Krebs缓冲液洗涤1分钟。彻底清洗后，允许PC12细胞将神经递质分泌到具有高K+的Krebs缓冲液中。含有分泌型神经递质的缓冲液使用去甲肾上腺素ELISA试剂盒(IBL国际公司)定量，其结果示于图10。
根据图10的结果，证实了通过西伯利亚落叶松黄酮与乙酸反应制备的杨梅素衍生物显示与传统杨梅素类似的神经递质释放抑制活性。
实验实施例2：杨梅素衍生物的光稳定性的考察
观察到根据实施例4使用乙酸作为脂肪酸制备的杨梅素衍生物(西伯利亚落叶松黄酮和丁香亭)显示出与杨梅素相比各种性质的变化，并且检查了化合物是否特别在暴露于UV时变性。
首先，将1mg杨梅素和杨梅素衍生物中的每一种溶于1ml二甲基亚砜(DMSO)中，随后与对杨梅素的羟基具有高反应性的氧化锌混合。将所得混合溶液以100μl滴剂施加在3M纸上，并使用UV灯用强度为253.7nM的UV光照射2小时。作为阴性对照，使用未处理的DMSO以及未处理的DMSO和氧化锌的混合溶液。
其结果在图11中示出。通过图11中的结果，证实了杨梅素(M)随着时间的推移显示颜色变化，而杨梅素衍生物没有颜色变化。
实验实施例3：检测杨梅素衍生物的颜色变化
在本实验实施例中，检测了通过使用根据本发明的杨梅素衍生物来改变性质，是否可以解决杨梅素的过深的固有颜色导致皮肤沾污的缺点。
结果观察到，与传统杨梅素不同，随着杨梅素的羟基被棕榈酸酰化的程度增加，即酰化程度增加，杨梅素衍生物的颜色改变。具体而言，观察到在实施例3中得到的杨梅素衍生物(其中杨梅素的一个羟基被棕榈酸酰化)具有黄色的颜色，其是杨梅素的固有颜色(参见图12A)，而实施例4中获得的杨梅素衍生物(其中杨梅素的所有羟基都被棕榈酸酰化)具有白色的颜色(参见图12B)。
实验实施例4：检测杨梅素衍生物的脂溶性变化
在本实验实施例中，鉴于在实施例4中，杨梅素在合成杨梅素衍生物时经历了各种性质的变化，其中杨梅素的所有羟基都被棕榈酸酰化，测定杨梅素衍生物在有机溶剂、或在市售的脂溶性化妆品、食品等中的溶解度。
具体而言，将杨梅素衍生物以1mg/1ml的比例溶解在芥花油和矿物油中。其结果在图13中示出。
传统杨梅素被认为不溶于芥花油和矿物油。但是，如图13所示，证实了根据本发明的杨梅素衍生物(其中，杨梅素的羟基被具有较长链长的棕榈酸取代)在芥花油(参见图13A)和矿物油(参见图13B)中是脂溶性的。
这种脂溶性使得杨梅素衍生物容易溶解在其他基于化妆品的物质中，并且是杨梅素用作化妆品物质的重要变化。
实验实施例5：检测丁香亭和西伯利亚落叶松黄酮的光稳定性
研究了当暴露于紫外线时，杨梅素以及西伯利亚落叶松黄酮和丁香亭(它们是天然存在的杨梅素衍生物)是否变性。首先，将通过使杨梅素(M，1mg/1.34g)和棕榈酸反应制备的每种杨梅素衍生物(MP，1mg/1.34g)均匀混合在市售的防晒霜(Kolmar Korea，NoTS UV防晒霜，1.34g)中，并将该混合物涂布在盖玻片上，然后使用UV灯用强度为253.7nM的UV照射24小时。
在UV照射完成后，用肉眼观察样品的颜色，并且其结果在图14中示出。
从图14的结果可以看出，在紫外线照射后5分钟杨梅素的颜色从固有的黄色变成棕色，表明紫外线引起的变性，并且在紫外线照射后30分钟变成深褐色，表明完全氧化。相比之下，由于甲氧基化羟基，氧化变性减少，因此丁香亭和西伯利亚落叶松黄酮与杨梅素相比未显示明显的颜色变化。在紫外线照射后60分钟时，西伯利亚落叶松黄酮沉淀并变成棕色，以及丁香亭在UV照射后240分钟时沉淀并变成棕色。
实验实施例6：通过与乙酸反应获得的杨梅素衍生物的生物转化实验
测定了用乙酸酰化制备的杨梅素衍生物体内生物转化为杨梅素的速率。
具体而言，培养PC12细胞以在培养皿中获得70％至80％的汇合度。随后，将PC12细胞用具有高K+的Krebs缓冲液处理，并在5％CO2培养箱中在37℃温育15分钟。用Krebs缓冲液将PC12细胞洗涤两次，每次1分钟，将通过乙酸酰化制备的杨梅素衍生物混合到所述培养基中，然后更换培养基。将PC12细胞在5％CO2培养箱中在37℃下温育2小时，然后用Krebs缓冲液洗涤1分钟。细胞完全洗涤后，将细胞用胰蛋白酶处理以收集胰蛋白酶附着的细胞，并从中除去胰蛋白酶以仅获得纯细胞。将细胞悬浮于100μl四氢呋喃中，然后通过超声处理破碎，然后仅收集裂解所述细胞中的物质的四氢呋喃。随后，通过高效液相色谱(HPLC)仅分析回收的纯化液体中的杨梅素，以检查通过使用乙酸酰化制备的杨梅素衍生物是否转化为杨梅素，并且其结果在图15中示出。
从图15的结果，确认了通过使用乙酸酰化制备的杨梅素衍生物的3％在1小时内生物转化为杨梅素并具有活性。
实施例7：杨梅素衍生物的多汗症抑制作用
研究了本发明的杨梅素衍生物是否实际上表现出抑制手掌汗液分泌的作用。
具体地，将1mg根据实施例4使用乙酸酰化制备的杨梅素衍生物与1ml的与实验实施例5中使用的相同的市售防晒霜混合。在环境条件下和受试者在运动中产生大量汗液的炎热室内条件下，将得到的防晒霜和杨梅素衍生物混合物施用在受试者的双手上。选择了被认为通常患有多汗症的二十多岁的两名男性作为受试者。在头两天，仅用不含所述杨梅素衍生物的防晒霜治疗所述受试者，并且在接下来的两天中，用含有杨梅素衍生物的防晒霜治疗所述受试者。要求受试者将手中已称重的化妆棉垫保持5分钟，回收化妆棉垫并再次称重，并计算其增加的重量。
其结果在图16中示出。
从图16的结果，确认了在环境条件下在施加了含有杨梅素衍生物的防晒霜的所述受试者手中分泌的汗量下降约48％。运动诱发出汗时分泌汗液的量也减少了，但是减少的程度降低到约20％。

Claims (10)

1.由下式1表示的化合物或其药学上可接受的盐作为活性成分在制备用于预防或治疗多汗症、毛孔扩大或过敏症的药物组合物中的用途：
[式1]
Figure FDA0003331289470000011
其中，在上述的式1中，
R1、R2、R3、R4、R5和R6中的每一个独立地为氢、或直链或支链的饱和或不饱和C1-20酰基，
所述酰基彼此相同或不同，并且，
并非所有的R1、R2、R3、R4、R5和R6都是氢。
2.如权利要求1所述的用途，其中由式1表示的化合物是选自由下式1a至1d表示的化合物的一种或多种化合物或其药学上可接受的盐：
[式1a]
Figure FDA0003331289470000012
[式1b]
Figure FDA0003331289470000013
[式1c]
Figure FDA0003331289470000021
[式1d]
Figure FDA0003331289470000022
其中，在上述式1a至1d中，
R1'、R2'、R3'、R4'、R5'和R6'中的每一个独立地为直链或支链的饱和或不饱和的C1-20酰基，和
所述酰基彼此相同或不同。
3.如权利要求1所述的用途，其中所述酰基选自乙酰基，丁酰基，辛酰基，月桂酰基，棕榈酰基，硬脂酰基和二十烷酰基。
4.如权利要求1所述的用途，其中由式1表示的化合物是选自由下列化合物组成的组中的一种或多种化合物或其药学上可接受的盐：
Figure FDA0003331289470000023
Figure FDA0003331289470000031
其中，在上述式中，n是0至18的整数。
5.如权利要求2所述的用途，其中所述组合物包含所有的由式1a表示的化合物、由式1b表示的化合物和由式1c表示的化合物。
6.由下式1表示的化合物或其药学上可接受的盐作为活性成分在制备用于缓解过敏症状或皮肤毛孔的化妆品组合物中的用途：
[式1]
Figure FDA0003331289470000032
其中，在上述的式1中，
R1、R2、R3、R4、R5和R6中的每一个独立地为氢、或直链或支链的饱和或不饱和C1-20酰基，
所述酰基彼此相同或不同，并且，
并非所有的R1、R2、R3、R4、R5和R6都是氢。
7.如权利要求6所述的用途，其中由式1表示的化合物是选自由下式1a至1d表示的化合物中的一种或多种化合物或其药学上可接受的盐：
[式1a]
Figure FDA0003331289470000041
[式1b]
Figure FDA0003331289470000042
[式1c]
Figure FDA0003331289470000043
[式1d]
Figure FDA0003331289470000051
其中，在上述式1a至1d中，
R1'、R2'、R3'、R4'、R5'和R6'中的每一个独立地为直链或支链的饱和或不饱和的C1-20酰基，和
所述酰基彼此相同或不同。
8.如权利要求6所述的用途，其中所述酰基选自乙酰基，丁酰基，辛酰基，月桂酰基，棕榈酰基，硬脂酰基和二十烷酰基。
9.如权利要求6所述的用途，其中由式1表示的化合物是选自由下列化合物组成的组中的一种或多种化合物或其药学上可接受的盐：
Figure FDA0003331289470000052
Figure FDA0003331289470000061
其中，在上述式中，n是0至18的整数。
10.如权利要求7所述的用途，其中所述化妆品组合物包含所有的由式1a表示的化合物、由式1b表示的化合物和由式1c表示的化合物。
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