KR20230041193A

KR20230041193A - 보툴리눔 신경독소 대체 신규소재 및 이의 제조방법

Info

Publication number: KR20230041193A
Application number: KR1020210124504A
Authority: KR
Inventors: 윤성준; 권안성; 전수연; 박지성; 박선호; 강상현
Original assignee: 주식회사 인트론바이오테크놀로지
Priority date: 2021-09-17
Filing date: 2021-09-17
Publication date: 2023-03-24
Also published as: CN117915889A; KR102627564B1; WO2023043076A1; KR20230163985A

Abstract

본 발명은 보툴리눔 신경독소 대체 신규소재 및 이의 제조방법에 관한 것으로, 더욱 상세하게는 체내 안정성을 포함한 물질의 안정성이 획기적으로 개선된, SNARE 복합체 형성을 저해하여 결과적으로 아세틸콜린 분비를 저해할 수 있는 능력을 갖는 미리세틴 아세틸 유도체, 및 이의 제조방법에 관한 것이다.

Description

보툴리눔 신경독소 대체 신규소재 및 이의 제조방법{Alternative novel material to botulinum neurotoxin and preparing method thereof}

본 발명은 보툴리눔 신경독소 (Botulinum neurotoxin) 대체 신규소재 및 이의 제조방법에 관한 것으로, 더욱 상세하게는 체내 안정성 (In vivo stability)을 포함한 물질의 안정성이 획기적으로 개선된, 아세틸콜린 (Acetylcholine) 분비를 저해할 수 있는 능력을 갖는 미리세틴 (Myricetin) 아세틸 유도체 (Acetyl derivative), 및 이의 제조방법에 관한 것이다.

보툴리눔 신경독소 (Botulinum neurotoxin)는 신경세포에서 시냅스전막 (Presynaptic membrane)과 시냅스 소포 (Synaptic vesicle)의 결합 (Docking)에 관여하는 SNARE (Soluble N-ethylmaleimide-sensitive factor attachment protein receptor) 단백질 (Protein)을 가수분해하여 결과적으로 아세틸콜린 (Acetylcholine) 분비를 저해하고 궁극적으로는 신경 전달을 차단함으로써, 주름 개선 (Treating wrinkles) 등의 미용적 시술뿐만 아니라 사시 (Crossed eyes), 다한증 (Excessive sweating) 등의 아세틸콜린 과다 분비가 원인인 100여 가지의 질병 치료에 활용될 수 있는 물질이다.

보툴리눔 신경독소는 그 자체가 독소이므로 잘못 처치되었을 시 사망에 이르게 할 수 있을 뿐만 아니라 알러지 반응을 유발하고, 말이 어눌해지거나, 표정이 어색해지고, 눈을 감을 수 없게 되는 등의 부작용을 가지고 있는 것으로 알려져 있다. 일반적으로 사용량 조절 실패와 원치 않는 근육으로 보툴리눔 신경독소가 퍼져나가는 현상 등이 원인이 되며, 이러한 부작용들은 보툴리눔 신경독소가 체내에서 분해되거나 새로운 신경이 형성되어 정상적인 기능을 회복해야 해소될 수 있는 데, 이는 수개월의 기간이 소요되기도 한다. 이러한 이유 때문에 보툴리눔 신경독소는 미용목적이나 의학적 목적으로 사용함에 있어서 상당한 수준의 주의가 요구된다. 보툴리눔 신경독소는 클로스트리디움 보툴리눔 (Clostridium botulinum)이라고 하는 혐기성 미생물의 배양을 통해 생산하는데, 이 균은 매우 치명적이기 때문에 배양 과정에서부터 분리 정제 및 폐기와 살균에 이르기까지 전과정이 엄격히 관리되어야 한다.

이러한 이유 때문에 보툴리눔 신경독소를 대체할 수 있는 다양한 소재들의 개발이 시도되고 있다. 그 예로는 단백질이나 폴리펩티드 (Polypeptide)를 사용하려는 경우 (대한민국 특허공개 제10-2012-0001964호; 대한민국 특허공개 제10-2012-0122999호), 천연의 폴리페놀 (Polyphenol)을 이용하려는 경우 (대한민국 특허공개 제10-2008-0083438호; 대한민국 특허공개 제10-2008-0091735호; 대한민국 특허공개 제10-2011-0017599호; 대한민국 특허공개 제10-2016-0058739호), 미리세틴 (Myricetin) 유도체 (Derivative)를 이용하려는 경우 (대한민국 특허공개 제10-2017-0015845호; 대한민국 특허공개 제10-2017-0091554호) 등이 있었다. 그 중, 해외에서는 펩티드를 활용한 유사 보툴리눔 신경독소 소재가 개발되어 상품화되어 있다. Lipotec사에서 개발한 아지렐린 (Argireline)이 그 예이다. 그러나 보툴리눔 신경독소 대체제의 상업적 성공은 여러 단점들로 인하여 아직 미미한 수준인 실정이다.

이에 따라 기존의 보툴리눔 신경독소 대체소재들의 단점을 극복할 수 있으면서도 보툴리눔 신경독소의 부작용 및 문제점까지도 해결할 수 있는 새로운 소재의 개발이 요구되고 있다.

이에, 본 발명자들은 기존의 보툴리눔 신경독소 대체소재 중에 미리세틴 유도체가 체내 안정성을 포함한 물질의 안정성이 감소되는 점과 이를 해결하면 보다 가치 있는 보툴리눔 신경독소 대체소재를 개발할 수 있다는 점에 착안하여, 기존 미리세틴 유도체의 안정성 문제를 해결하기 위해서 예의 노력한 결과, 기존 공개된 미리세틴 유도체와 비교하여 안정성이 획기적으로 개선된 물질 및 이의 제조방법을 개발함으로써 본 발명을 완성하였다.

따라서, 본 발명의 목적은 보툴리눔 신경독소 대체소재로 활용될 수 있는 안정성이 획기적으로 개선된, SNARE 복합체 형성을 저해하여 결과적으로 아세틸콜린 분비를 저해할 수 있는 능력을 갖는 [화학식 1]의 미리세틴 아세틸 유도체 (3-아세틸-미리세틴; 3-Acetyl-Myricetin)를 제공하는 것이다.

[화학식 1]

본 발명의 다른 목적은 [화학식 1]로 표시되는 미리세틴 아세틸 유도체의 제조방법을 제공하는 것이다.

본 발명의 또 다른 목적은 상기 [화학식 1]로 표시되는 미리세틴 아세틸 유도체를 유효성분으로 포함하는 보툴리눔 신경독소 대체 미용목적의 화장료 조성물을 제공하는 것이다.

또한, 본 발명의 또 다른 목적은 상기 [화학식 1]로 표시되는 미리세틴 아세틸 유도체를 유효성분으로 포함하는, 아세틸콜린 과분비로 인하여 발생하는 질환의 치료용 약학적 조성물을 제공하는 것이다.

따라서, 본 발명의 일 양태에 따르면, 본 발명은 SNARE 복합체 형성을 저해하여 결과적으로 아세틸콜린 분비를 저해할 수 있는 능력을 갖는 [화학식 1]로 표시되는 미리세틴 아세틸 유도체를 제공한다.

물론 상기 [화학식 1]을 기본 골격으로 하면서 추가의 유도체화 (Derivatization)를 적용하여도 본 발명의 효과를 얻을 수 있음은 본 발명 내에서 자명하다.

본 발명의 다른 일 양태에 따르면 본 발명은 [화학식 1]로 표시되는 미리세틴 아세틸 유도체를 유효성분으로 포함하는 미용목적의 화장료 조성물을 제공한다.

상기 미용목적에는 주름 개선, 모공 축소 (Reducing pore size), 피부탄력 증진 (Improving skin elasticity) 등을 제시할 수 있는데, 이에 국한되지 않음은 당연하다. 상기 주름의 예로, 눈썹 처짐 (Brow droop), 눈가 잔주름 (Crow’s-feet), 팔자 주름 (Nasolabial folds), 입가 주름 (Mouth frown), 목 주름 (Neck wrinkles), 이마 주름 (Forehead lines), 미간 주름 (Frown lines), 눈밑 주름 (Tear troughs), 턱 주름 (Jowls) 등을 제시할 수 있는데, 이에 국한되지 않음은 당연하다.

본 발명의 일 측면에 있어서, “화장료 조성물”은 인체의 외관을 아름답게 하는 모든 조성물을 포함하는 개념으로, 본 개시의 미용목적의 화장료 조성물은 생체리듬에 따른 생리적인 현상으로서 피부에서의 악영향을 억제하여 인체의 외관을 아름답게 하는 조성물을 지칭하는 개념이나, 이에 제한되는 것은 아니다.

본 발명의 일 측면에 있어서, 화장료 조성물은 기본적으로 피부에 도포되는 것이므로, 당업계의 화장료 조성물을 참조하여 통상적으로 제조되는 어떠한 제형으로도 제조될 수 있다. 일례로, 용액, 현탁액, 유탁액, 페이스트, 겔, 크림, 로션, 파우더, 오일, 분말 파운데이션, 유탁액 파운데이션, 왁스 파운데이션 및 스프레이 등으로 제형화될 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다. 보다 상세하게는, 유연 화장수, 영양 화장수, 영양크림, 마사지크림, 에센스, 아이크림, 스프레이 또는 파우더의 제형 등으로 제조될 수 있다.

본 발명의 일 측면에 있어서, 본 발명의 제형이 페이스트, 크림 또는 겔인 경우에는, 담체 성분으로 동물성유, 식물성유, 왁스, 파라핀, 전분, 트라가칸트, 셀룰로오스 유도체, 폴리에틸렌 글리콜, 실리콘, 벤토나이트, 실리카, 탈크, 산화아연 등이 포함될 수 있다.

본 발명의 일 측면에 있어서, 본 발명의 제형이 파우더 또는 스프레이인 경우에는, 담체 성분으로 락토스, 탈크, 실리카, 알루미늄 히드록시드, 칼슘 실리케이트, 폴리아미드 파우더 등이 포함될 수 있고, 특히 스프레이인 경우에는 추가적으로 클로로플루오로히드로카본, 프로판/부탄, 디메틸 에테르 등의 추진체를 포함할 수 있다.

본 발명의 일 측면에 있어서, 본 발명의 제형이 용액 또는 유탁액인 경우에는, 담체 성분으로 용매, 용해화제, 유탁화제 등이 포함될 수 있고, 구체적으로 물, 에탄올, 이소프로판올, 에틸 카보네이트, 에틸 아세테이트, 벤질 알코올, 벤질 벤조에이트, 프로필렌글리콜, 1,3-부틸글리콜 오일, 글리세롤 지방족 에스테르, 폴리에틸렌 글리콜, 소르비탄의 지방산 에스테르 등이 포함될 수 있다.

본 발명의 일 측면에 있어서, 본 발명의 제형이 현탁액인 경우에는, 담체 성분으로 물, 에탄올, 프로필렌글리콜 등의 액상 희석제; 에톡실화 이소스테아릴 알코올, 폴리옥시에틸렌 소르비톨 에스테르, 폴리옥시에틸렌 소르비탄 에스테르 등의 현탁제; 미소결정성 셀룰로오스, 알루미늄 메타히드록시드, 벤토나이트, 아가, 트라가칸트 등이 포함될 수 있다.

본 발명의 일 측면에 있어서, 본 발명의 제형이 계면활성제 함유 클린징인 경우에는, 담체 성분으로서 지방족 알코올 설페이트, 지방족 알코올 에테르 설페이트, 설포숙신산 모노에스테르, 이세티오네이트, 이미다졸리늄 유도체, 메틸타우레이트, 사르코시네이트, 지방산 아미드 에테르 설페이트, 알킬아미도베타인, 지방족 알코올, 지방산 글리세리드, 지방산 디에탄올아미드, 식물성 유, 리놀린 유도체 또는 에톡실화 글리세롤 지방산 에스테르 등이 이용될 수 있다.

본 발명의 다른 일 양태에 따르면 본 발명은 [화학식 1]로 표시되는 미리세틴 아세틸 유도체를 유효성분으로 포함하는 아세틸콜린 과분비에 원인한 질환 치료 목적의 약학적 조성물을 제공한다.

상기 아세틸콜린 과분비에 원인한 질환에는 사시, 내이 장애 (Inner ear disorder), 치아 연삭 (Teeth grinding), 켈로이드성 흉터 (Keloid scarring), 다한증, 등과 어깨 통증 (Back pain), 떨림 (Tremors), 치열 (Anal fissure), 둔부 기형 (Buttock deformity), 근 경련 (Muscle injuries, twitching), 만성 편두통 (Chronic migraine), 우울증 (Depression), 안면마비 (Facial nerve disorder), 목 경련 (Neck pain, spasms), 갑상선 장애 (Thyroid disorder), 심근 장애 (Cardiac muscle disorder), 상지 경직 (Upper limb spasticity), 췌장 장애 (Pancreas disorders), 과민성 장증후군 (Irritable bowel syndrome), 튼살 (Stretch marks), 소아 뇌성마비 (Juvenile cerebral palsy) 등이 있으며, 이에 국한되지 않음은 당연하다.

본 발명의 약학적 조성물에 포함되는 약제학적으로 허용되는 담체는 제제 시에 통상적으로 이용되는 것으로서, 락토스, 덱스트로스, 수크로스, 솔비톨, 만니톨, 전분, 아카시아 고무, 인산칼슘, 알기네이트, 젤라틴, 규산칼슘, 미세결정성 셀룰로오스, 폴리비닐피롤리돈, 셀룰로오스, 물, 시럽, 메틸 셀룰로스, 메틸히드록시벤조에이트, 프로필히드록시벤조에이트, 활석, 스테아르산 마그네슘 및 미네랄 오일 등을 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다. 본 발명의 약제학적 조성물은 상기 성분들 이외에 윤활제, 습윤제, 감미제, 향미제, 유화제, 현탁제, 보존제 등을 추가로 포함할 수 있다.

본 발명의 [화학식 1]로 표시되는 미리세틴 아세틸 유도체를 유효성분으로 포함하는 약학적 조성물은 경구 투여 또는 비경구 투여를 통해 투여할 수 있으며, 비경구 투여의 경우 정맥 내 투여, 복강 내 투여, 근육 내 투여, 피하 투여, 비강 내 투여 또는 국부 투여를 이용하여 투여할 수 있으나 이에 제한되지는 않는다.

본 발명의 [화학식 1]로 표시되는 미리세틴 아세틸 유도체를 유효성분으로 포함하는 약학적 조성물은 본 발명이 속하는 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자가 용이하게 실시할 수 있는 방법에 따라, 약학적으로 허용되는 담체 및/또는 부형제를 이용하여 제제화 됨으로써 단위 용량 형태로 제조되거나 또는 다용량 용기 내에 내입시켜 제조될 수도 있다. 이때 제형은 오일 또는 수성 매질 중의 용액, 현탁액 또는 유화액 형태이거나 엑스제, 분말제, 과립제, 정제 또는 캡슐제 형태일 수도 있으며, 분산제 또는 안정화제를 추가적으로 포함할 수도 있다.

또한, 상기 약학적 조성물의 적합한 도포, 분무 및 투여량은 제제화 방법, 투여 방식, 연령, 체중, 성, 질병 증상의 정도, 음식, 투여 시간, 투여 경로, 배설 속도 및 반응 감응성과 같은 요인들에 의해 다양하며, 보통으로 숙련된 의사는 소망하는 치료에 효과적인 투여량을 용이하게 결정 및 처방할 수 있다.

본 발명의 다른 일 양태에 따르면 본 발명은 [화학식 1]로 표시되는 미리세틴 아세틸 유도체의 제조방법을 제공한다.

구체적으로는, (A) 외부의 공기와 수분이 첨가되지 않게 한 질소분위기에서 무수 피리딘 (Pyridine anhydrous)에 용해된 미리세틴에 무수 아세트산 (Acetic anhydride)을 첨가하여 반응시키는 단계; (B) 에틸아세테이트 (Ethyl acetate; EA)로 추출하는 단계; (C) 에틸아세테이트 (Ethyl acetate; EA) 추출물을 감압건조 하는 단계; (D) 감압건조한 시료에 디메틸 설폭사이드 (Dimethyl sulfoxide; DMSO)를 첨가하고 이어서 인산완충생리식염수 (Phosphate-buffered saline; PBS; pH 7.0)를 첨가하여 희석하는 단계; (E) 희석한 시료를 반응 (Incubation) 시켜 부산물을 분해하는 단계; 및 (F) 동결건조 하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 [화학식 1]로 표시되는 미리세틴 아세틸 유도체의 제조방법을 제공한다.

본 발명에 따른 [화학식 1]로 표시되는 미리세틴 아세틸 유도체는 개선된 물질 안정성을 제공할 수 있으므로 이를 유효성분으로 포함한 조성물은 보관 및 취급에 있어 보다 용이하며, 더욱 중요하게는 투여 후 높은 체내 안정성도 제공할 수 있어 더욱 개선되고 지속된 효능을 제공할 수 있다.

도 1은 본 발명의 [화학식 1]로 표시되는 3-아세틸-미리세틴의 합성과정을 보여주는 개략도이다.
도 2는 본 발명의 [화학식 1]로 표시되는 3-아세틸-미리세틴 제조과정에 있어, 동결건조 시료에 대한 역상고성능액상크로마토그래피 (Reversed phase-high performance liquid chromatography; RP-HPLC) 분석 결과이다.
도 3은 최종 정제된 [화학식 1]로 표시되는 3-아세틸-미리세틴의 RP-HPLC 분석 결과이다.
도 4는 최종 정제된 [화학식 1]로 표시되는 3-아세틸-미리세틴의 액체 크로마토그래피 질량 분석법 (Liquid chromatography-mass spectrometry; LC/MS) 분석 결과이다.
도 5는 최종 정제된 [화학식 1]로 표시되는 3-아세틸-미리세틴의 핵자기공명분석법 (Nuclear magnetic resonance; NMR) 분석 결과이다.
도 6은 본 발명에 따른 [화학식 1]로 표시되는 3-아세틸-미리세틴의 아세틸콜린 분비 억제 정도를 측정한 결과이다. 1은 대조군 결과이고, 2는 0.5 μM 시료 적용 결과이고, 3은 2 μM 시료 적용 결과이고, 4는 10 μM 시료 적용 결과이고, 5는 20 μM 시료 적용 결과이다.
도 7은 본 발명에 따른 [화학식 1]로 표시되는 3-아세틸-미리세틴, 미리세틴, 및 Myricetin-C4의 안정성 비교 실험 결과이다.
도 8은 효능 비교 실험 결과이다. 1은 대조군 (PBS 처리군; 무처리군)이고, 2는 3-아세틸-미리세틴 처리군, 3은 미리세틴 처리군, 4는 라리시트린 (Laricitrin) 처리군, 5는 콤브레톨 (Combretol) 처리군, 6은 시린제틴 (Syringetin) 처리군, 7은 Myricetin-C4 처리군, 8은 Myricetin-C8 처리군, 9는 Myricetin-C12 처리군, 10은 Myricetin-C16 처리군, 11은 Myricetin-C20 처리군, 12는 Derivative E4-2 처리군, 13은 Derivative E4-4 처리군, 14는 Derivative E4-8 처리군, 15는 Derivative E4-12 처리군, 16은 Derivative E4-16 처리군, 17은 Derivative E4-18 처리군, 18은 Derivative E4-20 처리군이다. 효능 비교 실험은 대조군 (무처리군)의 땀면적 (Sweating area)을 100%로 하여 상대치를 결과로 제시하였다.

이하, 실시예에 의거하여 본 발명을 보다 구체적으로 설명하지만, 이들 실시예는 본 발명의 예시일 뿐이며 본 발명의 범위가 이들 실시예에 한정되는 것은 아니다.

실시예 1: 대조물질 및 미리세틴 아세틸 유도체 제조

본 실시예에서는 후속의 비교실험에 사용될 대조물질을 준비하였다. 대조물질로는 미리세틴, 대한민국 특허공개 제10-2017-0015845호 및 대한민국 특허공개 제10-2017-0091554호에 미리세틴 유도체로 실시예에 제시된, [화학식 2]의 라리시트린, [화학식 3]의 콤브레톨, [화학식 4]의 시린제틴, 리파제 촉매 하의 비닐 부티레이트 (Vinyl butyrate)를 이용한 아실화에 의해 제조된 미리세틴 유도체 (Myricetin-C4), 리파제 촉매 하의 비닐 옥타노에이트 (Vinyl octanoate)를 이용한 아실화에 의해 제조된 미리세틴 유도체 (Myricetin-C8), 리파제 촉매 하의 비닐 라우레이트 (Vinyl laurate)를 이용한 아실화에 의해 제조된 미리세틴 유도체 (Myricetin-C12), 리파제 촉매 하의 비닐 팔미테이트 (Vinyl palmitate)를 이용한 아실화에 의해 제조된 미리세틴 유도체 (Myricetin-C16), 리파제 촉매 하의 비닐 에이코사노에이트 (Vinyl eicosanoate)를 이용한 아실화에 의해 제조된 미리세틴 유도체 (Myricetin-C20), 염기 및 염화옥살릴을 사용한 아세트산 (Acetic acid)을 이용한 아실화에 의해 제조된 미리세틴 유도체 (Derivative E4-2), 염기 및 염화옥살릴을 사용한 부티르산 (Butyric acid)을 이용한 아실화에 의해 제조된 미리세틴 유도체 (Derivative E4-4), 염기 및 염화옥살릴을 사용한 옥탄산 (Octanoic acid)을 이용한 아실화에 의해 제조된 미리세틴 유도체 (Derivative E4-8), 염기 및 염화옥살릴을 사용한 라우르산 (Lauric acid)을 이용한 아실화에 의해 제조된 미리세틴 유도체 (Derivative E4-12), 염기 및 염화옥살릴을 사용한 팔미트산 (Palmitic acid)을 이용한 아실화에 의해 제조된 미리세틴 유도체 (Derivative E4-16), 염기 및 염화옥살릴을 사용한 스테아르산 (Stearic acid)을 이용한 아실화에 의해 제조된 미리세틴 유도체 (Derivative E4-18), 염기 및 염화옥살릴을 사용한 아라키딕산 (Arachidic acid)을 이용한 아실화에 의해 제조된 미리세틴 유도체 (Derivative E4-20)를 선정하였다.

[화학식 2]

[화학식 3]

[화학식 4]

미리세틴, 라리시트린, 콤브레톨, 시린제틴은 상업적으로 판매되는 것을 구매하여 사용하였고, 나머지 대조물질로 사용될 유도체들은 대한민국 특허공개 제10-2017-0015845호 및 대한민국 특허공개 제10-2017-0091554호의 실시예에 제시된 방법에 따라 제조하여 준비하였다. 본 발명자들에 의해 개발된 [화학식 1]의 미리세틴 아세틸 유도체 (3-아세틸-미리세틴)는 다음의 방법에 따라 제조하였다. 둥근 바닥 플라스크 (Round bottom flask; RBF)에 교반 막대 (Stirring bar)와 미리세틴 (1 당량)을 넣고 질소로 치환한 다음 외부의 공기와 수분이 첨가되지 않도록 고무마개로 막은 후 RBF에 무수 피리딘 (Pyridine anhydrous; 0.5 당량)을 첨가한 후, 얼음조 (Ice bath)에서 미리세틴을 모두 용해시킨다. 용해된 미리세틴에 주사기를 이용해 1 방울씩 무수 아세트산 (Acetic anhydride)을 첨가한다. 얼음조에서 한밤동안 교반 (Stirring)을 실시한다. 한밤동안 반응시킨 용액에 차가운 증류수를 첨가하여 반응을 종결한다. 반응이 종결된 반응물을 분별깔때기 (Separating funnel)에 모두 넣은 후에 에틸아세테이트 (Ethyl acetate; EA)를 첨가한다. 반응물이 RBF에 남아있지 않도록 EA를 RBF에 첨가한 후 분별깔때기로 옮긴다. 합성된 3-아세틸-미리세틴이 EA에 잘 녹을 수 있도록 분별깔때기를 여러 차례 흔들어준 후, 물과 EA층이 나뉠 수 있도록 스탠드에 정치시킨다. 물과 EA층이 나뉘면 물층만 제거한다 (EA의 밀도가 물보다 낮은 0.9이므로 물층이 아래에 놓임). 분별깔때기에 포화 소금물 (Brine)을 첨가한 후, 합성된 3-아세틸-미리세틴이 EA에 잘 녹을 수 있도록 분별깔때기를 여러 차례 흔들어준 후, 물과 EA층이 나뉠 수 있도록 스탠드에 정치시킨다. 물과 EA층이 나뉘면 물층만 제거한다. 분별깔때기에 증류수를 첨가한 다음에 합성된 3-아세틸-미리세틴이 EA에 잘 녹을 수 있도록 분별깔때기를 여러 차례 흔들어준 후, 물과 EA층이 나뉠 수 있도록 스탠드에 정치하는 과정과 물과 EA층이 나뉜 후에 물층만을 제거하는 과정을 3회 반복하여 실시한다. EA층을 새로운 RBF에 옮긴 다음 감압건조를 실시한다. 이 과정을 통하여 감압건조한 시료에 DMSO를 넣어 10 mg/ml 농도로 용해시킨다. 10 mg/ml의 합성 혼합물에 PBS (pH 7.0)를 첨가하여 1 mg/ml 농도로 희석한다. 이렇게 준비한 시료를 37℃에서 200 rpm으로 교반하면서 한밤동안 반응 (Incubation)시킨다. 이어서 한밤동안 반응시킨 시료를 동결건조 시킨다. 동결건조한 시료는 DMSO를 사용하여 녹인다. 이렇게 준비한 시료에 대하여 표 1의 조건으로 RP-HPLC를 실시하여 16분대 피크 부분 (Peak fraction)만을 취한다.

Instrument	Agilent 1260 infinity HPLC system
Column	YMC Triart C18 Column (250× 10 mm)
Column oven temperature	25℃
Injection volume	20 μl
UV detection	360 nm
Mobile phase	Gradient method (30% ACN → 70% ACN)
Analysis time	40 min
Buffer	A: D.W (0.05% TFA), B: ACN
Flow rate	2 ml/min

[화학식 1]로 표시되는 3-아세틸-미리세틴의 합성과정은 도 1에 요약적으로 제시하였고, RP-HPLC 결과는 도 2에 제시되어 있으며, 최종 정제된 [화학식 1]로 표시되는 3-아세틸-미리세틴 (순도 99% 이상)에 대한 RP-HPLC 분석 결과는 도 3에 제시되어 있다. 그리고 구조확인을 위하여 통상의 방법에 따라 LC/MS 분석과 ¹H-NMR 분석을 실시하였는데 [NMR 분석 시에는 미리세틴의 NMR 분석 논문 (Molecules 2014; 19: 13643)을 참조하였음], 그 결과가 도 4와 도 5에 제시되어 있다.

실시예 2: 신경전달 억제 효능 조사

본 실시예에서는 실시예1에서 제조한 [화학식 1]로 표시되는 3-아세틸-미리세틴이 기대한 바대로 신경전달 억제 효능을 제공해 줄 수 있는지를 조사하였다. 조사는 다음과 같이 신경전달물질인 아세틸콜린의 분비를 억제할 수 있는가를 통상의 세포 기반 (Cell-based) 유효성평가법인 아세틸콜린 분비 분석법 (Acetylcholine release assay)으로 실시하였다. 아세틸콜린 분비 분석법은 아세틸콜린성 신경세포 (Acetylcholinergic neuron)에서 분비하는 아세틸콜린을 세포 수준에서 정량 분석하는 시험법으로, 골격근의 수축·이완운동 신호를 전달하는 메신저인 아세틸콜린을 정량 분석함으로써 신경전달물질의 분비 여부를 확인할 수 있는 시험법이다.

구체적으로, 먼저 T75 플라스크 (Flask)를 이용해 3일에 한번씩 완전혈청배지 [Full serum media: 84% Dulbecco’s modified eagle’s media (Hyclone), 10% Horse serum (Gibco), 5% Fetal bovine serum (Gibco), 1% Antibiotic antimycotic solution (Hyclone)]를 이용해 PC12 세포의 계대 배양을 실시하였다. 계대하지 않는 동안에는 매일 새로운 완전혈청배지를 이용해 배지 교체를 실시하였다. 이와 동시에 실험 첫째날에는 콜라겐-코팅 플레이트 (Collagen-coated plate) 제작하였다. 콜라겐-코팅 플레이트의 제작은 다음의 방법으로 실시하였다. 0.2 μm 필터 (Filter)로 여과한 멸균수를 이용해 20 mM의 아세트산 (Acetic acid) 용액을 제조하였다. 이를 이용해 50 μg/ml 농도의 콜라겐 용액 50 ml을 제조하였다. 이렇게 제조한 콜라겐 용액을 웰 (Well) 당 1 ml씩 첨가한 다음에 상온에서 3시간 동안 정치 (Incubation) 시켰다. 정치 후에 조심스럽게 각 웰의 콜라겐 용액을 제거하였다. 그리고는 1 ml의 PBS로 조심스럽게 세척을 실시하였다. 그 후 무균 벤치 (Clean bench) 내에서 자연건조 (Air drying)시켜 콜라겐-코팅 플레이트 제조를 완료하였다. 실험 둘째날에는 앞에서 제조한 콜라겐-코팅 플레이트에 세포를 접종 (Seeding)해 주었다. 세포 접종은 다음의 방법으로 실시하였다. T75 플라스크에서 배양 중인 PC12 세포의 배지를 제거한 다음 2 ml의 무혈청배지 [Serum free media: 99% Dulbecco’s modified eagle’s media (Hyclone), 1% Antibiotic antimycotic solution (Hyclone)]를 첨가해 준 다음에, 가볍게 피펫팅 (Pipetting)하여 세포를 떼어낸 후 15 ml 코니컬 튜브에 옮겨 담아 원심분리 (2,500 rpm, 3분)를 실시하였다. 원심분리 후 상등액을 제거하고, 무혈청배지 1 ml을 사용하여 세포를 재부유 (Resuspension) 시킨 다음에 세포수 계수 (Cell counting)를 실시하였다. 그 다음에 무혈청배지를 사용하여 2× 10⁵ cell/ml의 PC12 세포 부유액을 준비한 후 이를 준비해 둔 콜라겐-코팅 플레이트에 웰당 1 ml 씩을 분주한 다음에 플레이트를 24시간 배양 (CO₂ incubator, 37℃)해 주는 방식으로 세포 접종을 실시하였다. 실험 시작 3일째가 되는 날에는 배양하고 있는 플레이트에서 배지를 제거한 다음에 NGF 배지 [98.6% Dulbecco’s modified eagle’s media (Hyclone), 1% Antibiotic antimycotic solution (Hyclone), 0.4% (25 μg/ml) NGF (Nerve growth factor-2.5S from murine submaxillary gland; Sigma)]로 교체해 주는 방식으로 NGF 처리를 실시하였다. NGF 처리 후 플레이트를 5일 동안 추가 배양하였다 (CO₂ incubator, 37℃). 실험 8일째 되는 날에 다음의 방법으로 시료 처리 및 분석을 실시하였다. 5일간 배양한 PC12 세포의 플레이트에서 배지를 제거하고 무혈청배지 995 μl씩을 첨가해 준 다음에, DMSO를 사용하여 준비한 0.5 μM, 2 μM, 10 μM, 20 μM의 3-아세틸-미리세틴 시료를 각 웰에 5 μl씩을 첨가해 준 다음에 18시간 배양 (CO₂ incubator, 37℃)하였다. 대조군에는 DMSO를 5 μl 첨가해 주었다. 18시간 배양 후 아세틸콜린 분비 분석 키트 (Acetylcholine release assay kit; Cell Biolabs)를 이용하여 제품 설명에 따라 정량 분석을 실시하였다. 그 결과가 도 6에 제시되어 있다.

이 결과로부터 본 발명의 [화학식 1]로 표시되는 미리세틴 유도체 (3-아세틸-미리세틴)도 역시 SNARE 복합체 형성을 저해하여 결과적으로 아세틸콜린 분비를 저해할 수 있음을 확인할 수 있었다. 이는 본 발명의 [화학식 1]로 표시되는 미리세틴 유도체 (3-아세틸-미리세틴)가 신경전달 차단 효과를 제공할 수 있음을 보여준다.

실시예 3: 물질 안정성 비교

본 실시예에서는 안정성 비교 실험을 실시하였다. 극단적인 조건비교를 위하여 하루 방치 조건으로 실시하였다. 참고로 기존의 미리세틴이나 미리세틴 유도체들은 약 2시간 정도만 방치해도 대부분이 분해되어 없어진다. 안정성 실험은 다음과 같이 실시하였다. 10 mg/ml 농도가 되게 DMSO를 사용하여 준비한 시료에 PBS (pH 7.0)를 첨가하여 1 mg/ml 농도로 희석시킨다 (1/10 희석). 이렇게 준비한 시료를 200 rpm으로 교반하면서 37℃에서 1일 동안 방치 (Incubation) 시켰다. 방치한 시료를 동결건조한 다음 이를 DMSO에 녹여 앞에 제시한 조건과 동일한 조건으로 RP-HPLC 분석을 실시하여 안정성을 비교하였다. 그 결과가 표 2에 제시되어 있다.

Compound	Residual amount
3-Acetyl-Myricetin	≒100%
Myricetin	≪10%
Laricitrin	≪10%
Combretol	≪10%
Syringetin	≪10%
Myricetin-C4	≪10%
Myricetin-C8	≪10%
Myricetin-C12	≪10%
Myricetin-C16	≪10%
Myricetin-C20	≪10%
Derivative E4-2	≪10%
Derivative E4-4	≪10%
Derivative E4-8	≪10%
Derivative E4-12	≪10%
Derivative E4-16	≪10%
Derivative E4-18	≪10%
Derivative E4-20	≪10%

이해를 돕기 위하여 대표적 실험 결과 (미리세틴, Myricetin-C4, 및 3-아세틸-미리세틴)를 도 7에 제시하였다.

이상의 결과로 본 발명의 [화학식 1]로 표시되는 미리세틴 유도체 (3-아세틸-미리세틴)가 기존 보고된 미리세틴 유도체들이 제공해 줄 수 없는 정도의 개선된 안정성을 제공해 줄 수 있음을 확인할 수 있었다. 이러한 개선된 안정성은 [화학식 1]로 표시되는 미리세틴 유도체 (3-아세틸-미리세틴)가 적용되어 제조된 최종 제품의 보관 및 유통에 있어 큰 이점으로 작용할 수 있다. 또한, 본 실시예의 실험 조건이 체내의 조건과도 유사하므로 이로부터 본 발명의 [화학식 1]로 표시되는 미리세틴 유도체 (3-아세틸-미리세틴)가 개선된 체내 안정성도 제공해 줄 수 있고 이 결과로 보다 증진된 효능을 제공해 줄 것임도 추정할 수 있다.

실시예 4: 조성물 제조

본 실시예에서는 미리세틴을 포함한 여러 미리세틴 유도체들이 포집된 나노입자 (Nanoparticle)를 제조하였다. 실시예 5의 효능 비교 실험을 대한민국 특허공개 10-2017-0091554의 실시예에서 제시하고 있는 방법으로 실시하고자 하기 때문에 경피 전달 (Transdermal drug delivery)에 사용될 수 있는 나노입자를 제조하였다. 구체적으로 ⑴ 지질층 (Lipid phase) 제조, ⑵ 수용액층 (Water phase) 제조 및 ⑶ 지질-나노입자 제조 (Lipid-nanoparticle formation)의 순서로 실시하였으며, 상세한 제조법은 다음과 같다.

4.1 지질층 제조

먼저 지질층을 다음의 방법으로 제조하였다. 트리스테아린 (Tristearin) 70 mg과 트리카프릴린 (Tricaprylin) 30 mg을 정량하여 유리 반응용기 (Glass reaction vial)에 넣고 혼합한 다음 85℃ 항온조 (Water bath)에서 다음 단계 실시 전까지 보관한다. 2 mg의 미리세틴 또는 미리세틴 유도체를 아세톤 (Acetone) 1 ml에 녹여 준비한 다음, 이를 앞에서 준비하여 보관하고 있던 지질 혼합액 (Lipid mixture)과 섞어서 85℃를 유지하면서 30분 동안 교반 (Stirring)해 준다. 30분 교반이 끝난 다음 혼합되어 있는 아세톤을 제거하기 위해 감압건조 (Evaporation)를 실시하고, 이렇게 준비된 지질층은 85℃ 항온조에 보관한다.

4.2 수용액층 제조

수용액층 제조는 유리 반응용기에 브리지 (Brij^® S 100, 0.9735 g)와 플루로닉 (Pluronic^® P-123, 0.9735 g)을 각각 정량하여 첨가한 다음에 10 ml의 물 (Distilled water)을 첨가해 준 후 85℃를 유지하면서 12시간 동안 교반해 주는 방식으로 실시하였다.

4.3 지질-나노입자 제조

지질층 (부피비로 0.5)과 수용액층 (부피비로 9.5)을 50 ml 코니컬 튜브 (Conical tube)에 넣어 섞어준다. 이때 지질층과 수용액층은 계속 85℃가 유지되게 해 주어야 한다. 이렇게 준비한 혼합액을 85℃를 유지하면서 고속 혼합기 (High speed blender)를 이용하여 8,000 rpm에서 1분 동안 균질화 (Homogenizing)한 다음 10,000 rpm에서 1분 더 균질화 (Homogenizing)해 주었다. 이어서 팁-형태 초음파기 (Tip-type sonicator)를 이용하여 85℃를 유지하면서 1초 작동하고 1초 정지하는 방식으로 4분 동안 60% 세기 (Amplitude)로 초음파 혼합 (Sonication)을 실시한다. 이렇게 준비한 시료가 담긴 코니컬 튜브를 25℃의 물이 채워진 비커에 담가 교반하면서 45℃까지 식힌 후, 팁-형태 초음파기를 사용하여 1초 작동하고 1초 정지하는 방식으로 4분 동안 60% 세기로 초음파 혼합을 실시한다. 제조된 시료는 냉장 (4℃) 보관한다.

실시예 5: 효능 비교 실험 1

실시예 4에서 제조한 조성물을 이용하여 효능 비교 실험을 수행하였다. 효능 비교 실험은 대한민국 특허공개 제10-2017-0091554호의 실시예에 제시된 방법에 따라 다한증에 대한 효과를 측정하는 방식으로 실시하였다. 구체적으로, 실시예 4에서 준비한 조성물들을 시판 자외선 차단 크림 1 ml에 1 mg 농도로 섞어주어 시험시료를 준비하였다. 대조군 (무처리군)은 조성물을 불포함하는 자외선 차단 크림만을 처리하였으며, 처리군은 각각의 조성물을 포함하는 자외선 차단 크림을 처리하였다. 양손에 시험시료를 처리한 다음에 피실험자들에게 무게를 측정한 화장솜을 5분 동안 양손에 쥐고 있게 한 후 회수하여 다시 화장솜의 무게를 측정하여 증가된 무게를 계산하였다. 처리군당 10명의 평균치를 결과로 표 3에 제시하였다. 대조군 (무처리군)의 평균 땀의 무게를 100%로 하여 그 비례치를 결과로 제시하였다.

Group	Sweat weight
No-treatment	100%
3-Acetyl-Myricetin-treatment	28%
Myricetin-treatment	55%
Laricitrin-treatment	52%
Combretol-treatment	56%
Syringetin-treatment	53%
Myricetin-C4-treatment	52%
Myricetin-C8-treatment	55%
Myricetin-C12-treatment	64%
Myricetin-C16-treatment	58%
Myricetin-C20-treatment	66%
Derivative E4-2-treatment	53%
Derivative E4-4-treatment	54%
Derivative E4-8-treatment	58%
Derivative E4-12-treatment	63%
Derivative E4-16-treatment	65%
Derivative E4-18-treatment	66%
Derivative E4-20-treatment	68%

이상의 결과로 본 발명의 [화학식 1]로 표시되는 미리세틴 유도체 (3-아세틸-미리세틴)가 기존 보고된 미리세틴 유도체들이 제공해 줄 수 없는 정도의 개선된 효과를 제공해 줄 수 있음을 알 수 있다. 이는 개선된 체내 안정성에 의한 것으로 해석할 수 있다.

실시예 6: 효능 비교 실험 2

마우스를 이용한 추가 효능 비교 실험을 실시하였다. 역시 실시예 4에서 제조한 조성물을 이용하였다. 구체적 실험 방법을 제시하면 다음과 같다. 6주령의 수컷 ICR 마우스 (체중: 25-35 g) 180마리를 무작위로 18개의 그룹으로 나눈 다음 (그룹당 10마리의 마우스), 피부 도포의 방법으로 처치하였다. 구체적으로, 80 mg/kg의 알팍산 (Alfaxan) 및 10 mg/kg의 럼푼 (Rompun)이 혼합된 용액을 복강내 주사하여 마우스를 1시간 이상 마취시켰다. 그런 다음, 마취된 마우스의 오른쪽 뒷발 바닥에 시료를 도포하였다. 음성 대조군은 0.8 ml/kg의 용량으로 PBS (pH 7.4)를 도포하였고, 처치군은 실시예 4에서 제조한 각 조성물 (PBS에 부유하여 제조)을 0.8 mg/kg의 용량으로 도포하였다. 도포한 시료가 충분히 흡수되도록 시료를 도포한 마우스를 30분 동안 그대로 유지시켰다. 그 후 발바닥의 시료를 닦아내었고 이어서 에탄올에 녹아져 있는 3.5% 요오드 용액 (w/v)을 다시 도포하였다. 1분 동안 건조시킨 다음, 파마자유 (Castor oil)에 녹아져 있는 10% 전분 용액 (w/v)을 추가로 도포해 주었다. 전분 용액을 도포한 직후에 1200만 화소의 디지털 카메라를 이용하여 동일한 조건 (거리, 배율 및 노출)으로 모든 마우스의 발바닥을 사진 촬영하였다. 그리고 촬영한 사진에 대하여 이미지 분석을 통하여 땀 면적 (Sweating area)을 분석하였다. 그 결과가 도 8에 제시되어 있다.

이 결과로부터도 본 발명의 [화학식 1]로 표시되는 미리세틴 유도체 (3-아세틸-미리세틴)가 기존 보고된 미리세틴 유도체들이 제공해 줄 수 없는 정도의 개선된 효과를 제공해 줄 수 있음을 확인할 수 있었다. 이 역시도 개선된 체내 안정성 때문으로 해석할 수 있다.

실시예 7: 효능 비교 실험 3

피부 주름 개선에 대한 효능 비교 실험을 실시하였다. 30~50세의 여성 72명을 4명씩 1개의 군으로 구분하여 실험을 실시하였다. 실험이 시작되기 전 눈 밑의 레플리카 (Replica)를 통상의 방법으로 채취하고, 레플리카 채취 후 1시간 경과 시점에 실시예 4에서 준비한 조성물을 PBS를 사용하여 1 mg/ml의 농도가 되게 준비한 시험시료 (5 ml)를 각 실험군별로 구분하여 안면부에 도포하게 하였다. 대조군은 PBS를 도포하였다. 도포 후 6시간 경과 시점에 눈 밑의 동일 부위에서 레플리카를 다시 채취하였다. 채취한 레플리카에 대한 영상분석을 통해 피부 주름의 2차원적 분석을 실시하는 방식으로 피부 주름의 밀도 (Dermal density of skin wrinkle)를 비교 측정하였다. 영상분석에 의한 피부 주름 밀도의 측정 결과는 시험시료 도포 전 피부 주름 밀도에 대한 도포 후의 피부 주름 밀도의 비를 평균하여 그 결과를 하기 [표 4]에 나타내었다.

Group	Reduction of skin wrinkle dermal density (%)
PBS	5
3-Acetyl-Myricetin-treatment	78
Myricetin-treatment	48
Laricitrin-treatment	38
Combretol-treatment	36
Syringetin-treatment	37
Myricetin-C4-treatment	52
Myricetin-C8-treatment	43
Myricetin-C12-treatment	44
Myricetin-C16-treatment	39
Myricetin-C20-treatment	40
Derivative E4-2-treatment	51
Derivative E4-4-treatment	52
Derivative E4-8-treatment	46
Derivative E4-12-treatment	47
Derivative E4-16-treatment	43
Derivative E4-18-treatment	42
Derivative E4-20-treatment	41

이 결과로부터도 본 발명의 [화학식 1]로 표시되는 미리세틴 유도체 (3-아세틸-미리세틴)가 기존 보고된 미리세틴 유도체들이 제공해 줄 수 없는 정도의 개선된 효과를 제공해 줄 수 있음을 확인할 수 있었다.

하기에 본 발명의 화장료 조성물을 위한 제형예 및 제제예를 예시한다. 단, 하기 제형예 및 제제예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐, 본 발명의 내용이 하기 제형예 및 제제예에 의해 한정되는 것은 아니다.

제형예 1: 유연 화장수 ( 스킨 )의 제조

[화학식 1]로 표시되는 미리세틴 유도체 (3-아세틸-미리세틴) 포집 나노입자 0.1중량%, 1,3-부틸렌글리콜 5.2중량%, 올레일알코올 1.5중량%, 에탄올 3.2중량%, 폴리솔베이트 20 3.2중량%, 벤조페논-9 2.0중량%, 카르복실비닐폴리머 1.0중량%, 글리세린 3.5중량%, 미량의 향, 미량의 방부제 및 잔량의 정제수를 혼합하여 통상의 방법으로 유연 화장수를 제조한다.

제형예 2: 밀크로션의 제조

[화학식 1]로 표시되는 미리세틴 유도체 (3-아세틸-미리세틴) 포집 나노입자 0.1중량%, 글리세린 5.1중량%, 프로필렌글리콜 4.2중량%, 토코페릴아세테이트 3.0중량%, 유동파라핀 4.6중량%, 트리에탄올아민 1.0중량%, 스쿠알란 3.1중량%, 마카다미아너트오일 2.5중량%, 폴리솔베이트 60 1.6중량%, 솔비탄세스퀴롤레이트 1.6중량%, 프로필파라벤 0.6중량%, 카르복실비닐폴리머 1.5중량%, 미량의 향, 미량의 방부제, 잔량의 정제수를 혼합하여 통상의 방법으로 밀크로션을 제조한다.

제형예 3: 영양크림의 제조

[화학식 1]로 표시되는 미리세틴 유도체 (3-아세틸-미리세틴) 포집 나노입자 0.5중량%, 글리세린 4.0중량%, 바셀린 3.5중량%, 트리에탄올아민 2.1중량%, 유동파라핀 5.3중량%, 스쿠알란 3.0중량%, 밀납 2.6중량%, 토코페릴아세테이트 5.4중량%, 폴리솔베이트 60 3.2중량%, 카르복실비닐폴리머 1.0중량%, 솔비탄세스퀴올레이트 3.1중량%, 미량의 향, 미량의 방부제 및 잔량의 정제수를 혼합하여 통상의 방법으로 영양크림을 제조한다.

이상으로 본 발명의 특정한 부분을 상세히 기술하였는바, 당업계의 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 이러한 구체적인 기술은 단지 바람직한 구현 예일 뿐이며, 이에 본 발명의 범위가 제한되는 것이 아닌 점은 명백하다. 따라서 본 발명의 실질적인 범위는 첨부된 청구항과 그의 등가물에 의하여 정의된다고 할 것이다.

Claims

하기 [화학식 1]로 표시되는 미리세틴 유도체인 3-아세틸-미리세틴 (3-Acetyl-Myricetin)을 유효성분으로 포함하는, 아세틸콜린 (Acetylcholine) 분비 저해 효과를 제공하는 조성물.
[화학식 1]
제1항에 있어서, 상기 조성물은 미용 목적의 화장료 조성물 또는 아세틸콜린 과다 분비에 원인한 질환 치료 목적의 약학적 조성물인 것을 특징으로 하는, 아세틸콜린 (Acetylcholine) 분비 저해 효과를 제공하는 조성물.
제2항에 있어서, 상기 미용 목적은 주름 개선 (Treating wrinkles), 모공 축소 (Reducing pore size) 및 피부탄력 증진 (Improving skin elasticity)을 포함하는 군에서 선택된 어느 하나인 것을 특징으로 하는, 아세틸콜린 (Acetylcholine) 분비 효과를 제공하는 조성물.
제2항에 있어서, 상기 아세틸콜린 과다 분비에 원인한 질환은 사시 (Crossed eyes), 내이 장애 (Inner ear disorder), 치아 연삭 (Teeth grinding), 켈로이드성 흉터 (Keloid scarring), 다한증 (Excessive sweating), 등과 어깨 통증 (Back pain), 떨림 (Tremors), 치열 (Anal fissure), 둔부 기형 (Buttock deformity), 근 경련 (Muscle injuries, twitching), 만성 편두통 (Chronic migraine), 우울증 (Depression), 안면마비 (Facial nerve disorder), 목 경련 (Neck pain, spasms), 갑상선 장애 (Thyroid disorder), 심근 장애 (Cardiac muscle disorder), 상지 경직 (Upper limb spasticity), 췌장 장애 (Pancreas disorders), 과민성 장증후군 (Irritable bowel syndrome), 튼살 (Stretch marks), 소아 뇌성마비 (Juvenile cerebral palsy)를 포함하는 군에서 선택된 어느 하나인 것을 특징으로 하는, 아세틸콜린 (Acetylcholine) 분비 저해 효과를 제공하는 조성물.
(A) 외부의 공기와 수분이 첨가되지 않게 한 질소분위기에서 무수 피리딘 (Pyridine anhydrous)에 용해된 미리세틴에 무수 아세트산 (Acetic anhydride)을 첨가하여 반응시키는 단계;
(B) 에틸아세테이트 (Ethyl acetate; EA)로 추출하는 단계;
(C) 에틸아세테이트 (Ethyl acetate; EA) 추출물을 감압건조 하는 단계;
(D) 감압건조한 시료에 디메틸 설폭사이드 (Dimethyl sulfoxide; DMSO)를 첨가하고 이어서 인산완충생리식염수 (Phosphate-buffered saline; PBS; pH 7.0)를 첨가하여 희석하는 단계;
(E) 희석한 시료를 반응 (Incubation) 시켜 부산물을 분해하는 단계; 및
(F) 동결건조 하는 단계;
를 포함하는 것을 특징으로 하는, [화학식 1]로 표시되는 미리세틴 유도체 3-아세틸-미리세틴 (3-Acetyl-Myricetin)의 제조방법.