WO2018207952A1

WO2018207952A1 - 発毛及び／又は育毛用組成物

Info

Publication number: WO2018207952A1
Application number: PCT/JP2018/019419
Authority: WO
Inventors: 片倉　喜範; 花佳松尾
Original assignee: 国立大学法人九州大学
Priority date: 2017-05-12
Filing date: 2018-05-11
Publication date: 2018-11-15
Also published as: JPWO2018207952A1

Abstract

次式Ｉ：【化１】（式中、Ｒ^１及びＲ^３の一方は水素原子又は水酸基を表し、他方は次式ＩＶ：【化５３】（Ｒ^４ｂは水素原子又は炭素数１〜６のアルキル基を表し、ｎは１〜５の整数を表す。）で示される基を表し、Ｒ^２は水素原子又は酸素原子を表し、Ｒ^４ａはＲ^４ｂと同様であり、【化５４】は二重結合又は単結合を表し、ｍは１〜４の整数を表す。）で示される化合物を含む、発毛及び／又は育毛用組成物。

Description

発毛及び／又は育毛用組成物

　本発明は、フィセチン等を含む、発毛及び／又は育毛用組成物等に関する。

　皮膚は、我々の体の全表面を覆い、周囲の環境から異物の侵入や刺激などを防ぐ保護機能の役割や、触覚や温度覚などの感覚器の役割を持つ器官であると共に、我々の外観にも大きく影響することから、生活の質（ｑｕａｌｉｔｙ　ｏｆ　ｌｉｆｅ（ＱＯＬ））の維持および向上においても重要な器官である。

　皮膚の構造は、外側から外胚由来の表皮（ｅｐｉｄｅｒｍｉｓ）と、中胚由来の真皮（ｄｅｒｍｉｓ）、皮下組織（ｓｕｂｃｕｔａｎｅｏｓ　ｔｉｓｓｕｅ）に分けられる。このような皮膚の付属器官として皮膚外部に露出したケラチン繊維に富む角化した細胞からなる毛の毛幹（ｈａｉｒ　ｓｈａｆｔ）を包む鞘のような毛包（ｈａｉｒ　ｆｏｌｌｉｃｌｅ）、皮脂腺（ｓｅｂａｃｅｏｕｓ　ｇｌａｎｄ）、汗腺（ｓｗｅａｔ　ｇｌａｎｄ）などがある。毛包は、皮膚真皮に埋没した部分のことで、その上部が皮膚表層とつながっている外毛根鞘（ｏｕｔｅｒ　ｒｏｏｔ　ｓｈｅａｔｈ）、その内側にある内毛根鞘（ｉｎｎｎｅｒ　ｒｏｏｔ　ｓｈｅａｔｈ）、毛乳頭細胞（ｄｅｒｍａｌ　ｐａｐｉｌｌａ）や毛母細胞（ｈａｉｒ　ｍａｔｒｉｘ）などで構成されている。このうち間葉系細胞由来の毛乳頭と真皮毛根鞘細胞を除けば毛包の大部分は上皮系細胞で占められている。成長期の毛包の下端には毛幹を作り出す毛球部（ｈａｉｒ　ｂｕｌｂ）が存在し、毛乳頭細胞を取り囲むように毛母細胞が存在する。毛母細胞では、上皮系幹細胞から分化した上皮系前駆細胞が盛んに分化・増殖し、毛が形成される。
毛包での毛の産生は、毛周期（ｈａｉｒ　ｃｙｃｌｅ）のサイクルに依存して行われる。

　毛周期には大きくａｎａｇｅｎと呼ばれる成長期、ｃａｔａｇｅｎと呼ばれる休止期、ｔｅｌｏｇｅｎと呼ばれる退行期に分けられる。ａｎａｇｅｎでは、毛乳頭細胞と結びついた毛母細胞が細胞分裂し、毛を作る。続いてｃａｔａｇｅｎへと移行すると、細胞の分裂が停止し、毛の成長が止まる。ｔｅｌｏｇｅｎでは、毛乳頭組織が不明瞭になり、毛が毛乳頭組織から完全に離れる。ｃａｔａｇｅｎが終わるとまた次の毛髪をつくる準備に入り、再びａｎａｇｅｎとなっていく。毛包は、この毛周期とともに成長と退縮を繰り返すが、バルジと呼ばれる毛包幹細胞が存在する領域から上方の恒常部は毛周期に関わらず維持されており、下方の可変部のみが毛周期に支配される（Ｍｕｌｌｅｒ−Ｒｏｖｅｒ　Ｓ　ｅｔ　ａｌ．，２００１）。なお、毛包を構成する上皮系の細胞は、このバルジ領域に存在する毛包幹細胞から分化すると考えられている（Ｃｏｔｓａｒｅｌｉｓ，２００６；Ｏｓｈｉｍａ　ｅｔ　ａｌ．，２００１；Ｐｅｔｅｒｓｓｏｎ　ｅｔ　ａｌ．，２０１１）。

　前述した通り、我々の体には、自己再生を繰り返す皮膚の付属器官である毛包（毛髪）が存在するが、ヒトの体毛はほとんどが既に退化し、体毛が密集している部分は限られている。そのため、特に頭部の毛髪は、主に外観のための残存理由が大きいが、この毛髪は男性の多くが、加齢とともに減少していく。この毛髪の減少は、生理的な現象であり、自然な加齢現象であるが、近年までこの毛髪に関する基礎研究、及び臨床研究は不十分であった。しかし、ここ十数年で毛髪に関する研究が急速に進み、その中で、テロメラーゼ逆転写酵素ｔｅｌｏｍｅｒａｓｅ　ｒｅｖｅｒｓｅ　ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ（以下ＴＥＲＴ）が毛髪の改善を促す因子として報告された（Ｓａｒｉｎ，Ｋ　ｅｔ　ａｌ．，２００５）。

　テロメラーゼとは、正常細胞で、細胞分裂のたびに短くなるテロメアの反復配列（限界まで短縮すると分裂停止のシグナルが出て細胞は増殖できなくなる。）を維持する機構として機能している、テロメアを合成するリボヌクレオタンパク質酵素である。このテロメラーゼは、鋳型ＲＮＡとしてのｔｅｌｏｍｅｒａｓｅ　ＲＮＡ　ｃｏｍｐｏｎｅｎｔ（ＴＥＲＣ）、逆転写酵素としてのｔｅｌｏｍｅｒａｓｅ　ｒｅｖｅｒｓｅ　ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔａｓｅ（ＴＥＲＴ）からなる複合体であり、ガン化した細胞や不死化した細胞で活性化することが知られている（Ｓｈａｙ　ａｎｄ　Ｂａｃｃｈｅｔｔｉ，１９９７）。

　しかし、その他に、個体の抗老化を実現することが知られているカロリー制限時にテロメラーゼが活性化すること（Ｐｅｎｄｅｒｇｒａｓｓ　ｅｔ　ａｌ．，２００１；Ｖｅｒａ　ｅｔ　ａｌ．，２０１３）、テロメラーゼをノックアウトしたマウスでは、貧血、創傷治癒の遅延、白髪などの老化現象がみられること（Ｈｅｒｒｅｒａ　ｅｔ　ａｌ．，１９９９）、さらにテロメラーゼトランスジェニックマウスでは、皮膚、腸管、筋肉などの組織において抗老化効果が報告されている（Ｔｏｍａｓ　Ｌｏｂａ　ｅｔ　ａｌ．，２００８）。これらの結果は、テロメラーゼの活性化が必ずしもガン化などの個体にとって望ましくない効果を誘導するものではないことを示している。そしてこのテロメラーゼの活性は、現在ではテロメラーゼ触媒サブユニット遺伝子（ＴＥＲＴ）の発現レベルで規定されているものと考えられている（Ｎａｋａｍｕｒａ　ｅｔ　ａｌ．，１９９７）。

　ヒトＴＥＲＴ（ｈＴＥＲＴ）がクローニングされて以来、ｈＴＥＲＴの機能および発現制御について様々な研究が行われている。前述したマウスの表皮におけるＴＥＲＴの強制発現が毛包幹細胞の増殖を刺激し、毛髪を改善するという報告もその一つである（Ｓａｒｉｎ，Ｋ　ｅｔ　ａｌ．，２００５）。ａｎａｇｅｎの始まりは、毛包の表皮細胞で構成される外毛根鞘上のバルジ領域に存在する毛包幹細胞に依存している。毛包幹細胞は活性化されると毛母基に移動し、そこで毛の合成を促進する毛母細胞へと分化し、毛を作る。この際、ａｎａｇｅｎの毛包のみで活性化しているテロメラーゼ（ＴＥＲＴ）を、ｔｅｌｏｇｅｎ期にあるマウスの表皮で過剰に発現させ活性化させると、バルジ中の幹細胞に刺激が加わり、活発に分裂するようになる。つまり、上皮におけるＴＥＲＴの強制発現は、同じ上皮に存在する毛包幹細胞の分裂を引き起こすテロメラーゼ活性を誘導し、ｔｅｌｏｇｅｎからａｎａｇｅｎへの移行を促進することで毛髪の改善を可能にするのである。

　また、毛の太さは毛包の大きさに、毛の長さは主にａｎａｇｅｎの長さに比例して決まるとされているため、毛髪量が多く見えるためには、十分なａｎａｇｅｎ期間を維持することが重要である。ｔｅｌｏｇｅｎからａｎａｇｅｎへの移行には、シグナル伝達兼転写活性化因子ＳＴＡＴ３、４、５や、Ｗｎｔ、ＳＨＨなどのシグナルの他、インシュリン様成長因子（ＩＧＦ）−１、肝細胞増殖因子（ＨＧＦ）や角化細胞成長因子（ＫＧＦ）などが関与すると考えられている（Ｋｒａｕｓｅ　Ｋ　ｅｔ　ａｌ．，２００６；Ｓｔｅｎｎ　ＫＳ　ｅｔ　ａｌ．，２００１；Ｃｏｔｓａｒｅｌｉｓ　Ｇ　ｅｔ　ａｌ．，２００１；Ｐａｕｓ　Ｒ　ｅｔ　ａｌ．，２００４）。なかでも、Ｗｎｔ／β−カテニンシグナルはａｎａｇｅｎ期での上皮細胞から毛乳頭細胞へのシグナルや毛鞘細胞の分化には必要とされること（Ｃｏｔｓａｒｅｌｉｓ　Ｇ　ｅｔ　ａｌ．，２００１）や、転写因子を介して標的遺伝子の転写を活性化して細胞増殖や分化を制御し、皮膚においても毛幹の分化などに関わり、毛周期を動かす主要経路として重要であることが報告されている（Ｓｔｅｎｎ　ａｎｄ　Ｐａｕｓ，２００１；Ｐａｕｓ　ａｎｄ　Ｆｏｉｔｚｉｋ，２００４）。

　このＷｎｔは、胚発生や成体の組織の恒常性維持において、細胞の分化、増殖、極性などを制御する重要な役割を担っている。そもそも、Ｗｎｔとは分泌タンパク質であり、いくつかの段階を経て分泌されることが知られている。まず、小胞体の膜上に局在するＰｏｒｃｕｐｉｎｅ（Ｐｏｒｃ）によりパルミトイル化を受けた後（ＭａｃＤｏｎａｌｄ　ｅｔ　ａｌ．，２００９；Ｐｏｒｔ　ｅｔ　ａｌ．，２０１０）、ゴルジ体に輸送され、さらにＷｎｔｌｅｓｓ（Ｗｌｓ）によって細胞膜へと輸送されて分泌される。Ｗｎｔが細胞表面の受容体に結合することによって活性化されるシグナル経路として、β−カテニンに依存するＷｎｔ／β−カテニン経路が存在する。β−カテニンは、カルシウム依存性の細胞間接着分子であるカドヘリンに結合している蛋白質分子の１つとして発見され（Ｏｚａｗａ　ｅｔ　ａｌ．，１９８９）、カドヘリンを細胞骨格の１つであるアクチンフィラメントにつなぐ働きを持ち、細胞接着活性に不可欠な細胞分子として知られる。

　この経路の活性は、細胞質に存在するβ−カテニンの量によって決定される。通常、細胞質内のβ−カテニンの量はＡｘｉｎ、Ａｄｅｎｏｍａｔｏｕｓ　Ｐｏｌｙｐｏｓｉｓ　Ｃｏｌｉ（ＡＰＣ）、Ｇｌｙｃｏｇｅｎ　Ｓｙｎｔｈａｓｅ　Ｋｉｎａｓｅ−３β（ＧＳＫ−３β）、Ｃａｓｅｉｎ　Ｋｉｎａｓｅ　１α（ＣＫ１α）の４つからなる複合体によって制御されている。通常は、プロテアソーム依存性のタンパク質分解によって，低いレベルに抑えられている。細胞膜表面上にあるＦｒｉｚｚｌｅｄ（Ｆｚｄ）及びＬｏｗ−ｄｅｎｓｉｔｙ　ｌｉｐｏｐｒｏｔｅｉｎ　Ｒｅｃｅｐｔｏｒ−ｒｅｌａｔｅｄ　Ｐｒｏｔｅｉｎ（ＬＲＰ）５／６の複合体にＷｎｔタンパクが結合することで惹起されるシグナルにより、β−カテニンがリン酸化され、ユビキチン化を受けた後、プロテアソームにより分解される。しかし、リン酸化を免れたβ−カテニンは細胞質内に蓄積し、その後、核内へと移行し，転写因子ＴＣＦ（Ｔ　ｃｅｌｌ　ｆａｃｔｏｒ）／ＬＥＦ（ｌｙｍｐｈｏｃｙｔｅ　ｅｎｈａｎｃｅｒ　ｆａｃｔｏｒ　１）と複合体を形成し、Ｗｎｔシグナルの標的遺伝子の転写を制御する。

　最近の研究で、テロメラーゼがβ−カテニン転写複合体の中でコファクターとして働くことによって、Ｗｎｔ／β−カテニンシグナル伝達を直接的に調節していること（Ｐａｒｋ　ＪＩ，２００９：非特許文献１）や、ＴＥＲＴプロモーターにβ−カテニンが結合することでＴＥＲＴの発現を直接的に制御しているという報告がなされている（Ｒｏｌｆ　Ｋｅｍｌｅｒ　ｅｔ　ａｌ．，２０１２：非特許文献２）。以上のことを踏まえると、ＴＥＲＴによる毛髪の合成制御にＷｎｔ／βカテニンシグナルの活性が深く関わっているものと考えることができる。

　他方、長寿遺伝子又は抗老化遺伝子とも呼ばれ、その活性化により生物の寿命が延びるとされるサーチュイン（ＳＩＲＴ）遺伝子が知られている。ＳＩＲＴ遺伝子プロモーターの活性化により合成されるタンパク質（サーチュイン）はヒストン脱アセチル化酵素であるため、ヒストンとＤＮＡの結合に作用し、遺伝的な調節を行うことで寿命を延ばすと考えられている。

　ところで、毛髪改善剤に配合される成分には、毛周期の異常を抑制する成分としてミノキシジルやピラゾール誘導体（特許５５８８１６７号：特許文献１）、男性ホルモンの作用を緩和させる成分としてエストラジオール等の女性ホルモン、細胞を賦活させる成分としてパントテン酸誘導体、血管拡張及び血流を促進させる成分としてトウガラシチンキ、ｌ−メントール、センブリ抽出物等が用いられている。
　しかしながら、多くの毛髪改善剤は、毛乳頭細胞での５αレダクターゼ阻害を機序とする。毛髪改善剤の効果は非常に個人差が大きく，満足するものは見出されていない。

特許５５８８１６７号

Ｐａｒｋ　ＪＩ　ｅｔ　ａｌ．，Ｔｅｌｏｍｅｒａｓｅ　ｍｏｄｕｌａｔｅｓ　Ｗｎｔ　ｓｉｇｎａｌｌｉｎｇ　ｂｙ　ａｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ　ｗｉｔｈ　ｔａｒｇｅｔ　ｇｅｎｅ　ｃｈｒｏｍａｔｉｎ．Ｎａｔｕｒｅ．４６０：６６−７２，２００９Ｒｕｄｌｏｆｆ　Ｓ，Ｋｅｍｌｅｒ　Ｒ．Ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｌ　ｒｅｑｕｉｒｅｍｅｎｔｓ　ｆｏｒ　β−ｃａｔｅｎｉｎ　ｄｕｒｉｎｇ　ｍｏｕｓｅ　ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ．Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ，１３９：３７１１−２１，２０１２

　本発明は、発毛、育毛、又は皮膚改善用の組成物を提供することを目的とする。

　本発明者は、上記課題を解決するために鋭意検討を行った結果、ポリフェノールの一種であるフィセチン又はその誘導体が発毛効果、育毛効果等を奏することを見出し、本発明を完成するに至った。

　すなわち、本発明は以下の通りである。
（１）次式Ｉ：

（式中、Ｒ^１及びＲ^３の一方は水素原子又は水酸基を表し、他方は次式ＩＶ：

（Ｒ^４ｂは水素原子又は炭素数１~６のアルキル基を表し、ｎは１~５の整数を表す。）
で示される基を表し、Ｒ^２は水素原子又は酸素原子を表し、Ｒ^４ａはＲ^４ｂと同様であり、

は二重結合又は単結合を表し、ｍは１~４の整数を表す。）
で示される化合物、
　次式ＩＩ：

（式中、Ｒ^４ａ及びＲ^４ｂは前記と同様であり、ｎ１及びｎ２は、それぞれ独立して１~５の整数を表す。）
で示される化合物、及び次式ＩＩＩ：

（式中、Ｒ^２、Ｒ^４ａ、Ｒ^４ｂ、ｎ１及びｎ２並びに

は前記と同様である。）
で示される化合物からなる群から選ばれるいずれかの化合物を含む、発毛及び／又は育毛用組成物。
（２）次式Ｉ：

（式中、Ｒ^２、Ｒ^４ａ、Ｒ^４ｂ、ｎ１及びｎ２並びに

は前記と同様である。）
で示される化合物からなる群から選ばれるいずれかの化合物を含む、皮膚改善用組成物。
（３）次式Ｉ：

（式中、Ｒ^２、Ｒ^４ａ、Ｒ^４ｂ、ｎ１及びｎ２並びに

は前記と同様である。）
で示される化合物からなる群から選ばれるいずれかの化合物を含む、化粧品用組成物。
（４）式Ｉで示される化合物が、次式Ｉａ又はＩｂ：

（式中、Ｒ^１及びＲ^３は、水素原子又は水酸基を表し、Ｒ^２は水素原子又は酸素原子を表し、Ｒ^４ａ及びＲ^４ｂは、それぞれ独立して水素原子又は炭素数１~６のアルキル基を表し、

は二重結合又は単結合を表し、ｍは１~４の整数を表し、ｎは１~５の整数を表す。）
で示されるものである（１）~（３）のいずれか１項に記載の組成物。
（５）式Ｉで示される化合物が、フィセチン、ケルセチン、カテキン、ノビレチン、アピゲニン、ゲニステイン、ルテオリン、イプリフラボン、エクオール、タンゲレチン、ビオカニンＡ、クリシン、又はバイカレインである（１）~（３）のいずれか１項に記載の組成物。
（６）式ＩＩで示される化合物が、レスベラトロール、ピセアタンノール、ピノスチルベン、イソラポンチゲニン、ラポンチゲニン、グネトール、又はオキシレスベラトロールである（１）~（３）のいずれか１項に記載の組成物。
（７）式ＩＩＩで示される化合物が、イソリキリチゲニン又はブテインである（１）~（３）のいずれか１項に記載の組成物。
（８）皮膚改善が、傷の治療、肌荒れの修復、しみの改善、そばかすの改善、しわ抑制、創傷治癒及び細胞老化抑制からなる群から選ばれる少なくとも１つである（２）に記載の組成物。
（９）（１）に記載の組成物を含む発毛及び／又は育毛剤。
（１０）（２）に記載の組成物を含む皮膚改善剤。
（１１）（３）に記載の組成物を含む化粧品。
（１２）ＴＥＲＴプロモーター若しくはＳＩＲＴ１プロモーターにリポーター遺伝子が連結されたベクターを含む細胞、又は内在性ＴＥＲＴ遺伝子若しくは内在性ＳＩＲＴ１遺伝子を含む細胞に被験物質を接触させ、当該リポーター遺伝子又は内在性ＴＥＲＴ遺伝子若しくは内在性ＳＩＲＴ１遺伝子の発現を指標として、発毛効果、育毛効果及び皮膚改善効果からなる群から選ばれる少なくとも１つの効果を有する物質をスクリーニングする方法。
（１３）細胞が上皮細胞である、（１２）に記載の方法。
（１４）ＴＥＲＴがヒトＴＥＲＴである（１２）又は（１３）に記載の方法。
（１５）ＤＮＡ損傷修復マーカー遺伝子を含む細胞であってＤＮＡ損傷を受けた細胞に被験物質を接触させ、当該遺伝子の発現を指標として、発毛効果、育毛効果及び皮膚改善効果からなる群から選ばれる少なくとも１つの効果を有する物質をスクリーニングする方法。

　本発明により、フィセチン等の化合物を発毛及び／又は育毛剤として、あるいは皮膚改善剤として使用することが可能となった。

フローサイトメトリーによるｈＴＥＲＴｐ−ＥＧＦＰ遺伝子導入の確認実験を行った結果を示す図である。フローサイトメトリーを用いて、ＨａＣａＴ細胞（赤線）及びＨａＣａＴ（ｈＴＥＲＴｐ−ＥＧＦＰ）細胞（青線）におけるＥＧＦＰの蛍光強度を測定した。定量ＲＴ−ＰＣＲ法によるｈＴＥＲＴｐ−ＥＧＦＰ遺伝子導入の確認実験を行った結果を示す図である。ＨａＣａＴ細胞及びＨａＣａＴ（ｈＴＥＲＴｐ−ＥＧＦＰ）細胞におけるＥＧＦＰの発現量を定量ＲＴ−ＰＣＲ法により確認した。なお、ＥＧＦＰ遺伝子の相対的発現量は、ＥＧＦＰ遺伝子の測定値をβ−ａｃｔｉｎの測定値で除して求めた。（ｍｅａｎ　±　ＳＥＭ，ｎ＝３，＊＊ｐ＜０．０１　ｖｓ　ＨａＣａＴ，Ｓｔｕｄｅｎｔ’ｓ　ｔ−ｔｅｓｔ）ポリフェノールのｈＴＥＲＴプロモーター活性化効果を示す図である。ＨａＣａＴ（ｈＴＥＲＴｐ−ＥＧＦＰ）細胞を用いて、ポリフェノールサンプルのｈＴＥＲＴプロモーターの増強をＥＧＦＰ蛍光強度を指標に評価した（—：平均値）。コントロールには、ポリフェノールの溶媒であるＤｉｍｅｔｈｙｌ　ｓｕｌｆｏｘｉｄｅを用いた。（ｍｅａｎ　±　ＳＥＭ，ｎ＝３，＊＊ｐ＜０．０１　＊＊＊ｐ＜０．００１　ｖｓ　Ｃｏｎｔｒｏｌ，Ｓｔｕｄｅｎｔ’ｓ　ｔ−ｔｅｓｔ）ポリフェノール添加時のＨａＣａＴ細胞におけるｈＴＥＲＴ遺伝子の発現変化を示す図である。ＨａＣａＴ細胞におけるｈＴＥＲＴ遺伝子の発現量を評価するため定量ＲＴ−ＰＣＲを行った。なお、ｈＴＥＲＴ遺伝子の相対的発現量は、ｈＴＥＲＴ遺伝子の測定値をβ−ａｃｔｉｎの測定値で除して求めた。Ｃｏｎｔｒｏｌには、ポリフェノールの溶媒であるＤｉｍｅｔｈｙｌ　ｓｕｌｆｏｘｉｄｅを用いた。（ｍｅａｎ　±　ＳＥＭ，ｎ＝３，＊＊＊ｐ＜０．００１　ｖｓ　Ｃｏｎｔｒｏｌ，Ｓｔｕｄｅｎｔ’ｓ　ｔ−ｔｅｓｔ）ＷＳＴ−８を用いた細胞増殖促進効果を示す図である。ＨａＣａＴ細胞に、選定した４種類のポリフェノールを終濃度１０μＭで添加し、２４時間ごとに、ＷＳＴ−８を用いて細胞数を測定した。Ｃｏｎｔｒｏｌには、ポリフェノールの溶媒であるＤｉｍｅｔｈｙｌ　ｓｕｌｆｏｘｉｄｅを用いた。（ｍｅａｎ　±　ＳＥＭ，ｎ＝３，＊ｐ＜０．０５　ｖｓ　Ｃｏｎｔｒｏｌ，Ｓｔｕｄｅｎｔ’ｓ　ｔ−ｔｅｓｔ）ポリフェノールのＨａＣａＴ細胞におけるＩＧＦ遺伝子発現に対する効果を示す図である。ＨａＣａＴ細胞におけるＩＧＦ遺伝子の発現量を評価するため、定量ＲＴ−ＰＣＲを行った。なお、ｈＴＥＲＴ遺伝子の相対的発現量は、ｈＴＥＲＴ遺伝子の測定値をβ−ａｃｔｉｎの測定値で除して求めた。コントロールには、ポリフェノールの溶媒であるＤｉｍｅｔｈｙｌ　ｓｕｌｆｏｘｉｄｅを用いた。（ｍｅａｎ　±　ＳＥＭ，ｎ＝３，＊ｐ＜０．０５　＊＊＊ｐ＜０．０１　ｖｓ　Ｃｏｎｔｒｏｌ，Ｓｔｕｄｅｎｔ’ｓ　ｔ−ｔｅｓｔ）ポリフェノールのＨａＣａＴ細胞におけるＫＧＦ遺伝子発現に対する効果を示す図である。ＨａＣａＴ細胞におけるＫＧＦ遺伝子の発現量を評価するため、定量ＲＴ−ＰＣＲを行った。なお、ｈＴＥＲＴ遺伝子の相対的発現量は、ｈＴＥＲＴ遺伝子の測定値をβ−ａｃｔｉｎの測定値で除して求めた。コントロールには、ポリフェノールの溶媒であるＤｉｍｅｔｈｙｌ　ｓｕｌｆｏｘｉｄｅを用いた。（ｍｅａｎ　±　ＳＥＭ，ｎ＝３，＊ｐ＜０．０５　＊＊ｐ＜０．０１　ｖｓ　Ｃｏｎｔｒｏｌ，Ｓｔｕｄｅｎｔ’ｓ　ｔ−ｔｅｓｔ）ポリフェノールのＨａＣａＴ細胞におけるＴＧＦ−β遺伝子発現に対する効果を示す図である。ＨａＣａＴ細胞におけるＴＧＦ−β遺伝子の発現量を評価するため、定量ＲＴ−ＰＣＲを行った。なお、ｈＴＥＲＴ遺伝子の相対的発現量は、ｈＴＥＲＴ遺伝子の測定値をβ−ａｃｔｉｎの測定値で除して求めた。コントロールには、ポリフェノールの溶媒であるＤｉｍｅｔｈｙｌ　ｓｕｌｆｏｘｉｄｅを用いた。（ｍｅａｎ　±　ＳＥＭ，ｎ＝３，＊＊ｐ＜０．０１　＊＊＊ｐ＜０．０１　ｖｓ　Ｃｏｎｔｒｏｌ，Ｓｔｕｄｅｎｔ’ｓ　ｔ−ｔｅｓｔ）ポリフェノールのＨａＣａＴ細胞におけるβ−カテニン活性に対する効果を示す図である。ポリフェノールがＨａＣａＴ細胞におけるβ−カテニン活性に与える影響を検証するために、ＨａＣａＴ細胞にリポータープラスミド（Ｍ５０　Ｓｕｐｅｒ　８ｘ　ＴＯＰ　Ｆｌａｓｈ）をトランスフェクションし、ポリフェノール添加後のβ−カテニン依存的転写活性をルシフェラーゼアッセイにより評価した。（ｍｅａｎ　±　ＳＥＭ，ｎ＝３，＊ｐ＜０．０５　＊＊ｐ＜０．０１　ｖｓ　Ｃｏｎｔｒｏｌ，Ｓｔｕｄｅｎｔ’ｓ　ｔ−ｔｅｓｔ）ポリフェノールのＨａＣａＴ細胞におけるβ−カテニン増強効果を示す図である。ポリフェノールのＨａＣａＴ細胞におけるβ−カテニン増強活性を検証するために、ウエスタンブロッティングを行った。（ｍｅａｎ　±　ＳＥＭ，ｎ＝３，＊ｐ＜０．０５　ｖｓ　Ｃｏｎｔｒｏｌ，Ｓｔｕｄｅｎｔ’ｓ　ｔ−ｔｅｓｔ）ＨａＣａＴ細胞におけるｈＴＥＲＴ発現ノックダウンの確認試験結果を示す図である。ＨａＣａＴ（ｓｈ−ｈＴＥＲＴ）細胞におけるｈＴＥＲＴ遺伝子の発現量を定量ＲＴ−ＰＣＲにより評価した。なお、ｈＴＥＲＴ遺伝子の相対的発現量は、ｈＴＥＲＴ遺伝子の測定値をβ−ａｃｔｉｎの測定値で除して求めた。Ｃｏｎｔｒｏｌとして、スクランブル配列のベクター（ｓｃｒ）を導入した。（ｍｅａｎ　±　ＳＥＭ，ｎ＝３，＊＊＊ｐ＜０．００１　ｖｓ　Ｃｏｎｔｒｏｌ，Ｓｔｕｄｅｎｔ’ｓ　ｔ−ｔｅｓｔ）ＨａＣａＴ（ｓｈ−ｈＴＥＲＴ−１）細胞におけるｈＴＥＲＴ発現を示す図である。ＨａＣａＴ（ｓｈ−ｈＴＥＲＴ−１）細胞におけるｈＴＥＲＴ遺伝子の発現量を評価するため、定量ＲＴ−ＰＣＲを行った。なお、ｈＴＥＲＴ遺伝子の相対的発現量は、ｈＴＥＲＴ遺伝子の測定値をβ−ａｃｔｉｎの測定値で除して求めた。Ｃｏｎｔｒｏｌとしては、スクランブル配列を有するノックダウンベクター（ｓｃｒ−ｓｈＲＮＡ）をを用いた。コントロール処理としては、ポリフェノールの溶媒であるＤｉｍｅｔｈｙｌ　ｓｕｌｆｏｘｉｄｅ処理したものを用いた。（ｍｅａｎ　±　ＳＥＭ，ｎ＝３，＊ｐ＜０．０５　＊＊ｐ＜０．０１　ｖｓ　Ｃｏｎｔｒｏｌ，Ｓｔｕｄｅｎｔ’ｓ　ｔ−ｔｅｓｔ）ＨａＣａＴ（ｓｈ−ｈＴＥＲＴ−２）細胞におけるｈＴＥＲＴ発現を示す図である。ＨａＣａＴ（ｓｈ−ｈＴＥＲＴ−２）細胞におけるｈＴＥＲＴ遺伝子の発現量を評価するため、定量ＲＴ−ＰＣＲを行った。なお、ｈＴＥＲＴ遺伝子の相対的発現量は、ｈＴＥＲＴ遺伝子の測定値をβ−ａｃｔｉｎの測定値で除して求めた。Ｃｏｎｔｒｏｌとしては、スクランブル配列を有するノックダウンベクター（ｓｃｒ−ｓｈＲＮＡ）をを用いた。コントロール処理としては、ポリフェノールの溶媒であるＤｉｍｅｔｈｙｌ　ｓｕｌｆｏｘｉｄｅ処理したものを用いた。。（ｍｅａｎ　±　ＳＥＭ，ｎ＝３，＊ｐ＜０．０５　＊＊ｐ＜０．０１　ｖｓ　Ｃｏｎｔｒｏｌ，Ｓｔｕｄｅｎｔ’ｓ　ｔ−ｔｅｓｔ）ＨａＣａＴ（ｓｃｒ−ｓｈＲＮＡ）における細胞数変化を示す図である。ＨａＣａＴ（ｓｃｒ−ｓｈＲＮＡ）細胞に、選定した２種類のポリフェノールを添加し、２４時間ごとに、ＷＳＴ−８を用いた細胞増殖促進効果の検証を行った。Ｃｏｎｔｒｏｌには、ポリフェノールサンプルの溶媒であるＤｉｍｅｔｈｙｌ　ｓｕｌｆｏｘｉｄｅを用いた。（ｍｅａｎ　±　ＳＥＭ，ｎ＝３，＊ｐ＜０．０５　ｖｓ　Ｃｏｎｔｒｏｌ，Ｓｔｕｄｅｎｔ’ｓ　ｔ−ｔｅｓｔ）ＨａＣａＴ（ｓｈＴＥＲＴ−１）における細胞数変化を示す図である。ＨａＣａＴ（ｓｈＴＥＲＴ−１）細胞に、選定した２種類のポリフェノールを添加し、２４時間ごとに、ＷＳＴ−８を用いた細胞増殖促進効果の検証を行った。Ｃｏｎｔｒｏｌには、ポリフェノールサンプルの溶媒であるＤｉｍｅｔｈｙｌ　ｓｕｌｆｏｘｉｄｅを用いた。（ｍｅａｎ　±　ＳＥＭ，ｎ＝３，＊ｐ＜０．０５　ｖｓ　Ｃｏｎｔｒｏｌ，Ｓｔｕｄｅｎｔ’ｓ　ｔ−ｔｅｓｔ）ＨａＣａＴ（ｓｈＴＥＲＴ−２）における細胞数変化を示す図である。ＨａＣａＴ（ｓｈＴＥＲＴ−２）細胞に、選定した２種類のポリフェノールを添加し、２４時間ごとに、ＷＳＴ−８を用いた細胞増殖促進効果の検証を行った。Ｃｏｎｔｒｏｌには、ポリフェノールサンプルの溶媒であるＤｉｍｅｔｈｙｌ　ｓｕｌｆｏｘｉｄｅを用いた。（ｍｅａｎ　±　ＳＥＭ，ｎ＝３，＊ｐ＜０．０５　ｖｓ　Ｃｏｎｔｒｏｌ，Ｓｔｕｄｅｎｔ’ｓ　ｔ−ｔｅｓｔ）ポリフェノールがＨａＣａＴ細胞におけるＳＩＲＴ１遺伝子発現に与える効果を示す図である。ＨａＣａＴ細胞におけるＳＩＲＴ１遺伝子の発現量を評価するため、定量ＲＴ−ＰＣＲを行った。なお、ＳＩＲＴ１遺伝子の相対的発現量は、ＳＩＲＴ１遺伝子の測定値をβ−ａｃｔｉｎの測定値で除して求めた。Ｃｏｎｔｒｏｌには、ポリフェノールの溶媒であるＤｉｍｅｔｈｙｌ　ｓｕｌｆｏｘｉｄｅを用いた。（ｍｅａｎ　±　ＳＥＭ，ｎ＝３，＊＊ｐ＜０．０１　＊＊＊ｐ＜０．００１　ｖｓ　Ｃｏｎｔｒｏｌ，Ｓｔｕｄｅｎｔ’ｓ　ｔ−ｔｅｓｔ）ＨａＣａＴ細胞におけるＳＩＲＴ１発現ノックダウンの確認試験結果を示す図である。ＨａＣａＴ（ｓｈ−ＳＩＲＴ１）細胞におけるＳＩＲＴ１遺伝子の発現量を定量ＲＴ−ＰＣＲにより検証した。なお、ＳＩＲＴ１遺伝子の相対的発現量は、ＳＩＲＴ１遺伝子の測定値をβ−ａｃｔｉｎの測定値で除して求めた。Ｃｏｎｔｒｏｌとして、スクランブル配列を有するベクター（ｓｃｒ−ｓｈＲＮＡ）を導入した。（ｍｅａｎ　±　ＳＥＭ，ｎ＝３，＊＊＊ｐ＜０．００１　ｖｓ　Ｃｏｎｔｒｏｌ，Ｓｔｕｄｅｎｔ’ｓ　ｔ−ｔｅｓｔ）ＨａＣａＴ（ｓｈ−ＳＩＲＴ１）細胞におけるＳＩＲＴ１発現を示す図である。ＨａＣａＴ（ｓｈ−ＳＩＲＴ１）細胞におけるＳＩＲＴ１遺伝子の発現量を定量ＲＴ−ＰＣＲにより行った。なお、ＳＩＲＴ１遺伝子の相対的発現量は、ＳＩＲＴ１遺伝子の測定値をβ−ａｃｔｉｎの測定値で除して求めた。Ｃｏｎｔｒｏｌとして、スクランブル配列を有するベクター（ｓｃｒ−ｓｈＲＮＡ）を導入したＨａＣａＴを用いるとともに、コントロール処理としてはポリフェノールの溶媒であるＤｉｍｅｔｈｙｌ　ｓｕｌｆｏｘｉｄｅ処理したものを用いた。。（ｍｅａｎ　±　ＳＥＭ，ｎ＝３，＊　＊＊ｐ＜０．００１　ｖｓ　Ｃｏｎｔｒｏｌ，Ｓｔｕｄｅｎｔ’ｓ　ｔ−ｔｅｓｔ）ＨａＣａＴ（ｓｈ−ＳＩＲＴ１）細胞におけるｈＴＥＲＴ発現を示す図である。ＨａＣａＴ（ｓｈ−ＳＩＲＴ１）細胞におけるｈＴＥＲＴ遺伝子の発現量を定量ＲＴ−ＰＣＲにより行った。なお、ｈＴＥＲＴ遺伝子の相対的発現量は、ｈＴＥＲＴ遺伝子の測定値をβ−ａｃｔｉｎの測定値で除して求めた。Ｃｏｎｔｒｏｌとして、スクランブル配列を有するベクター（ｓｃｒ−ｓｈＲＮＡ）を導入したＨａＣａＴを用いるとともに、コントロール処理としてはポリフェノールの溶媒であるＤｉｍｅｔｈｙｌ　ｓｕｌｆｏｘｉｄｅ処理したものを用いた。。（ｍｅａｎ　±　ＳＥＭ，ｎ＝３，＊　＊＊ｐ＜０．００１　ｖｓ　Ｃｏｎｔｒｏｌ，Ｓｔｕｄｅｎｔ’ｓ　ｔ−ｔｅｓｔ）ポリフェノールの育毛に対する効果を示す図である。ポリフェノールサンプルの育毛効果をＣ５７ＢＬ／６マウスを用いて検証した。　左：コントロール群、中：Ｒｅｓｖｅｒａｔｒｏｌ群、右：Ｆｉｓｅｔｉｎ群（除毛約５週間後のマウス）マウスの皮膚におけるｍＴＥＲＴ発現を示す図である。マウスの皮膚におけるｍＴＥＲＴ遺伝子の発現量を評価するため、定量ＲＴ−ＰＣＲを行った。なお、ｍＴＥＲＴ遺伝子の相対的発現量は、ｍＴＥＲＴ遺伝子の測定値をｍ−β−ａｃｔｉｎの測定値で除して求めた。（ｍｅａｎ　±　ＳＥＭ，ｎ＝６，＊ｐ＜０．０５　ｖｓ　Ｃｏｎｔｒｏｌ，Ｓｔｕｄｅｎｔ’ｓ　ｔ−ｔｅｓｔ）マウスの皮膚におけるｍＴＥＲＴ発現を示す図である。マウスの皮膚におけるｍＴＥＲＴ遺伝子の発現量を評価するため、定量ＲＴ−ＰＣＲを行った。なお、ｍＴＥＲＴ遺伝子の相対的発現量は、ｍＴＥＲＴ遺伝子の測定値をｍ−β−ａｃｔｉｎの測定値で除して求めた。（ｍｅａｎ　±　ＳＥＭ，ｎ＝６，＊ｐ＜０．０５　ｖｓ　Ｃｏｎｔｒｏｌ，Ｓｔｕｄｅｎｔ’ｓ　ｔ−ｔｅｓｔ）試験開始５週間後のマウス皮膚におけるＨ＆Ｅ染色結果を示す図である。ポリフェノールサンプルの育毛効果をＣ５７ＢＬ／６マウスを用いて検証し、その皮膚をＨ＆Ｅ染色によって染色を施し、毛包の組織形態と皮膚の厚みを可視化した。なお、スケールバーは１００μＭである。　上：コントロール群、中：Ｒｅｓｖｅｒａｔｒｏｌ群、下：Ｆｉｓｅｔｉｎ群マウスの皮膚の厚みの変化を示す図である。マウスの皮膚の厚みを顕微鏡下で測定した。（ｍｅａｎ　±　ＳＥＭ，ｎ＝９，＊＊ｐ＜０．０１　＊＊＊ｐ＜０．００１　ｖｓ　Ｃｏｎｔｒｏｌ，Ｓｔｕｄｅｎｔ’ｓ　ｔ−ｔｅｓｔ）試験開始４週間後のマウス皮膚における免疫染色を示す図である。ポリフェノールサンプルの育毛効果をＣ５７ＢＬ／６マウスを用いて検証し、その皮膚を免疫染色によって染色を施し、Ｋｉ−６７とＴＥＲＴの発現を検証した。なお、スケールバーは１００μＭである。　上：コントロール群、中：Ｒｅｓｖｅｒａｔｒｏｌ群、下：Ｆｉｓｅｔｉｎ群レスベラトロール構造類似体によるＳＩＲＴ１プロモーター活性化効果を示す図である。レスベラトロール構造類似体によるＳＩＲＴ１発現増強効果を示す図である。フィセチン及びレスベラトロール構造類似体によるｈＴＥＲＴ発現増強効果を示す図である。フィセチン及びレスベラトロール構造類似体によるパラコート誘導性のＤＮＡ損傷修復効果を示す図である。

　本発明は、フィセチン又はその誘導体を含む、発毛及び／又は育毛用組成物に関する。また本発明は、フィセチン又はその誘導体を含む、皮膚改善用組成物に関する。
　現在までに、毛髪の再生のために、皮膚組織内に毛髪の元となる活発な毛母細胞を含む毛包を新しく構築する技術は未だに臨床段階レベルにまで発展しているものはない。本発明では、ＴＥＲＴ又はＳＩＲＴ１に焦点を当て、ＴＥＲＴ又はＳＩＲＴ１を活性化する食品成分の探索を行い、毛周期などの進行に関わるシグナルの活性化を通じた発毛促進、育毛促進及び皮膚改善促進とそのメカニズムをｉｎ　ｖｉｔｒｏ及びｉｎ　ｖｉｖｏ解析から明らかにしようとしたものである。

１．本発明の組成物
　本発明の組成物は、次式Ｉ、次式ＩＩ又は次式ＩＩＩに示されるものである。

　上記式Ｉにおいて、Ｒ^１及びＲ^３の一方は水素原子又は水酸基を表し、他方は次式ＩＶ：

で示される基を表す。
　ここで、Ｒ^２は水素原子又は酸素原子を表し、Ｒ^４ａ及びＲ^４ｂは、水素原子又は炭素数１~６のアルキル基を表す。また、

は二重結合又は単結合を表し、ｍは１~４の整数を表す。
　式ＩＩにおいて、Ｒ^４ａ及びＲ^４ｂは前記と同様であり、ｎ１及びｎ２は、それぞれ独立して１~５の整数を表す。
　式ＩＩＩにおいて、Ｒ^２、Ｒ^４ａ、Ｒ^４ｂ、ｎ１及びｎ２は前記と同様である。

　式Ｉに示す化合物は、例えば次式Ｉａ：

に示す化合物、あるいは次式Ｉｂ：

に示す化合物を挙げることができる。

　本明細書において、「炭素数１~６のアルキル基」（「Ｃ_１−６アルキル基」ともいう）とは、炭素数が１~６個の直鎖状又は分枝鎖状のアルキル基を意味し、例えば、メチル基、エチル基、１−プロピル基（ｎ−プロピル基）、２−プロピル基（ｉ−プロピル基）、２−メチル−１−プロピル基（ｉ−ブチル基）、２−メチル−２−プロピル基（ｔ−ブチル基）、１−ブチル基（ｎ−ブチル基）、２−ブチル基（ｓ−ブチル基）、１−ペンチル基、２−ペンチル基、３−ペンチル基、２−メチル−１−ブチル基、３−メチル−１−ブチル基、２−メチル−２−ブチル基、３−メチル−２−ブチル基などが挙げられる。

　Ｃ_１−６アルキル基としては、メチル基、エチル基、１−プロピル基、２−プロピル基等を挙げることができる。
　ｍ並びにｎ、ｎ１及びｎ２はそれぞれ独立しており、ｍは１~４の整数、ｎ、ｎ１及びｎ２は１~５の整数である。従って、ｍが１~３、ｎ、ｎ１及びｎ２が１~４の場合においてＲ^３及び／又はＲ^４がＣ_１−６アルキル基により置換されているときは、他の置換基の位置には水素原子が結合している。

は単結合又は二重結合を表す。例えば式Ｉにおいて、Ｒ^２が、酸素原子のときは二重結合を表し、水素原子のときは単結合を表す。

　本発明において、式Ｉに含まれる化合物として、フィセチン、ケルセチン、カテキン、ノビレチン、アピゲニン等が挙げられる。これらの化合物の構造式を以下に示す。

　ところで、フィセチンは、ｓｉｒｔｕｉｎ活性化因子として知られている（Ａ．Ｃａｍｉｎｓ　ｅｔ　ａｌ．，Ｂｉｏｃｈｉｍｉｃａ　ｅｔ　Ｂｉｏｐｈｙｓｉｃａ　Ａｃｔａ　１７９９（２０１０）７４０−７４９）。本発明においては、フィセチンと同様に、ｓｉｒｔｕｉｎ活性化因子として機能する化合物も本発明の組成物として使用することができる。そのような化合物として、式ＩＩに含まれる化合物、式ＩＩＩに含まれる化合物を挙げることができる。

　式ＩＩに含まれる化合物：

式ＩＩＩに含まれる化合物：

その他、本発明において使用される化合物として、以下のものを挙げることができる。

　上記化合物は、化学合成により、あるいは市販品として入手することができる。
　本発明の組成物は、上記有効成分以外に、医薬品又は化粧品用として許容可能な担体や公知または周知の他の添加剤を含んでいてもよい。
　本発明において、上記化合物は、単独で、あるいは薬学的に許容される担体と共に投与することができ、その投与は１回又は数回に分けて行うことができる。

　「薬学的に許容され得る担体」とは、一般に医薬又は化粧品等に使用される、賦形剤、結合剤、滑沢剤、希釈剤、懸濁化剤、増量剤、崩壊剤、安定剤、保存剤、緩衝剤、等張化剤、乳化剤、芳香剤、着色剤、甘味剤、粘稠剤、矯味矯臭剤、界面活性剤、溶解補助剤、防腐剤、抗酸化剤、安定化剤、その他の添加剤が挙げられ、これらを適宜組み合わせて使用することができる。
　そのような担体の一つ以上を用いることにより、錠剤、丸剤、散剤、顆粒剤、注射剤、液剤、カプセル剤、トローチ剤、エリキシル剤、懸濁剤、乳剤あるいはシロップ剤等の形態の経口又は非経口用組成物を調製することができる。

　経口投与の場合、微晶質セルロース、クエン酸ナトリウム、炭酸カルシウム、リン酸ジカリウム、グリシン等の種々の賦形剤を、崩壊剤、結合剤等とともに使用することができる。崩壊剤としては、澱粉、アルギン酸、ある種のケイ酸複塩などが挙げられ、結合剤としては、例えばポリビニルピロリドン、蔗糖、ゼラチン、アラビアゴムなどが挙げられる。また、ステアリン酸マグネシウム、ラウリル硫酸ナトリウム、タルク等の滑沢剤は錠剤形成に有効である。
　経口投与用として水性懸濁液又はエリキシルにする場合は、必要により乳化剤、懸濁化剤を併用し、水、エタノール、プロピレングリコール、グリセリン等、およびそれらを組み合わせた希釈剤と共に使用することができる。

　非経口投与のための形態としては、注射剤（静脈内、点滴、筋肉内、腹腔内、皮下）、皮膚外用剤（ローション、クリーム、スプレー、エアロゾル、軟膏、ゲル）などが挙げられる。
　注射剤の場合には、例えば生理食塩水あるいは市販の注射用蒸留水等の薬学的に許容される担体中に所定濃度（例えば１μｇ／ｍｌ~１００ｍｇ／ｍｌ）となるように溶解又は懸濁することにより製造することができる。このようにして製造された注射剤は、被検者又は患者に対し、１回の投与において１ｋｇ体重あたり、例えば１μｇ~１００ｍｇの割合や１００μｇ~１０ｍｇの割合で、１日あたり１回~数回投与することができる。但し、この範囲に限定されるものではなく、投与対象の被検者等の体重、症状、投与経路等によって変動し得る。被検者等の薬物に対する感受性の差異、薬剤の処方の仕方、投与期間及び投与間隔によっても投与量に変動が生じてくるので、場合によっては前記範囲の下限より低い投与量が適当なこともある。

　注射剤は、凍結乾燥法などによって無菌の固体組成物とし、使用前に無菌の注射用蒸留水又は他の溶媒に溶解するなど、用時調製の形態として使用することも可能である。
　皮膚外用剤の場合は、当該剤型に適した担体に有効成分を配合し、成人１日あたり例えば０．００１~１００ｍｇ／ｍ^２や、０．１~１０ｍｇ／ｍ^２の用量で通常１日１~数回に分けて投与することができる。

　本発明の組成物を経口投与する場合、経口用剤型としては、例えば錠剤、散剤、カプセル剤（ハードカプセル剤、ソフトカプセル剤）、顆粒剤、丸剤、液剤、シロップ等の形態としてもよい。これらの製剤は常法に従って調製することができる。
　本発明の組成物は、発毛作用、育毛作用及び皮膚改善作用からなる群から選ばれる少なくとも１つの作用を有する。従って、上記組成物を、発毛剤、育毛剤、又は皮膚改善剤として使用することができる。

　発毛作用とは、上皮系細胞と間葉系細胞との相互作用により毛を生じる作用を意味する。無毛状態から毛が生えるまでの時間が短いほど、発毛効果が高いと言える。
　育毛作用とは、毛が生えている状態を維持する作用を意味し、維持する時間が長いほど育毛効果が高いと言える。育毛効果を高めるには、毛根にある毛母細胞の分裂を活性化することが重要である。
　皮膚改善作用とは、皮膚を回復させる効果・強くする効果を意味する。本発明の組成物は、皮膚に塗布することにより皮膚の厚みを増加させ、また皮膚を滑らかにすることができる。従って、本発明の組成物は、創傷治癒剤、あるいは化粧品として使用することが可能である。
　皮膚改善には、例えば傷の治療、肌荒れの修復、しみの改善、そばかすの改善、及びしわ抑制、創傷治癒、細胞老化抑制などが挙げられ、本発明の組成物は、これらの１つ又は２以上の組合せに対して適用される。本発明の組成物は、例えばＤＮＡ損傷に対する修復効果を有していることから、例えば、紫外線による皮膚の肌荒れやしみなどに対して改善作用を有する。
　さらに、本発明の組成物は本来食品成分由来であることから、医薬品等のほか、機能性食品の成分として含めることが可能である。

２．スクリーニング方法
　本発明は、ＴＥＲＴプロモーターにリポーター遺伝子が連結されたベクターを含む細胞、又は内在性ＴＥＲＴ遺伝子を含む細胞に被験物質を接触させ、当該目的遺伝子又は内在性ＴＥＲＴ遺伝子の発現を指標として、発毛効果、育毛効果及び皮膚改善効果からなる群から選ばれる少なくとも１つの効果を有する物質をスクリーニングする方法を提供する。
　また本発明は、ＳＩＲＴ１プロモーターにリポーター遺伝子が連結されたベクターを含む細胞、又は内在性ＳＩＲＴ１遺伝子を含む細胞に被験物質を接触させ、当該リポーター遺伝子又はＳＩＲＴ１遺伝子の発現を指標として、発毛効果、育毛効果及び皮膚改善効果からなる群から選ばれる少なくとも１つの効果を有する物質をスクリーニングする方法を提供する。
　さらに本発明は、ＤＮＡ損傷修復マーカー遺伝子を含む細胞であってＤＮＡ損傷を受けた細胞に被験物質を接触させ、当該遺伝子の発現を指標として、発毛効果、育毛効果及び皮膚改善効果からなる群から選ばれる少なくとも１つの効果を有する物質をスクリーニングする方法を提供する。
　本発明において、候補となる被験物質は特に限定されず、既存の薬剤（例えば既存の発毛剤、育毛剤、その他皮膚改善に作用する各種薬剤）でもよく、その他に、例えばペプチド、低分子化合物、高分子化合物、これらの塩又は前駆体等のあらゆる形態にあってもよい。

　本発明は、具体的には以下の工程を含む。
（ａ）ＴＥＲＴプロモーター若しくはＳＩＲＴ１プロモーターにリポーター遺伝子が連結されたベクターを含む細胞、又は内在性ＴＥＲＴ遺伝子若しくは内在性ＳＩＲＴ１遺伝子を含む細胞に被験物質を接触させる工程
（ｂ）前記目的遺伝子又は内在性ＴＥＲＴ遺伝子の発現を測定する工程
　本発明のスクリーニング方法では、発毛剤、育毛剤、皮膚改善剤などをスクリーニングすることができる。

　ＴＥＲＴプロモーター又はＳＩＲＴ１プロモーターとリポーター遺伝子との連結は、通常の遺伝子工学的手法により行うことができる（例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ　Ｊ．ｅｔ　ａｌ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｃｌｏｎｉｎｇ，Ａ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　Ｍａｎｕａｌ（４ｔｈ　ｅｄｉｔｉｏｎ）（Ｃｏｌｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　Ｐｒｅｓｓ（２０１２））。
　例えばＴＥＲＴプロモーターの場合は、まずＴＥＲＴプロモーターを合成する。当該合成は、例えば、ゲノムＤＮＡを鋳型とし、所望のプロモーター領域を合成し得るように設計したプライマーを用いて、ＰＣＲ法により行うことができる。なお、ＴＥＲＴプロモーターとしては、ヒトＴＥＲＴ（ｈＴＥＲＴ）プロモーターであることが好ましい。
　ＳＩＲＴ１プロモーターとリポーター遺伝子との連結についても、ＴＥＲＴプロモーターと同様に行うことができる。
　また本発明は、ＤＮＡ損傷修復マーカー遺伝子を含む細胞であってＤＮＡ損傷を受けた細胞に被験物質を接触させ、当該遺伝子の発現を指標として、発毛効果、育毛効果及び皮膚改善効果からなる群から選ばれる少なくとも１つの効果を有する物質をスクリーニングする方法を提供する。

　リポーター遺伝子は、リポーター遺伝子発現ベクター内の遺伝子を用い、リポーター遺伝子発現を調節するプロモーター領域は、制限酵素処理等により取り除き、その領域にｈＴＥＲＴプロモーター又はＳＩＲＴ１プロモーターを連結することによって組換えベクターを得て、この組換えベクターを宿主細胞中に導入することによって形質転換体を得る（Ｓａｍｂｒｏｏｋ　Ｊ．ｅｔ　ａｌ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｃｌｏｎｉｎｇ，Ａ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　Ｍａｎｕａｌ（４ｔｈ　ｅｄｉｔｉｏｎ）（Ｃｏｌｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　Ｐｒｅｓｓ（２０１２））。
　リポーター遺伝子としては、例えば各種リポーター遺伝子が挙げられ、ＧＦＰ、ＥＧＦＰ、ルシフェラーゼ、などが挙げられる。これらのリポーター遺伝子の発現が蛍光等で確認できれば、ＴＥＲＴプロモーターが発現していることが分かる。

　ベクターには、宿主微生物で自律的に増殖し得るファージ又はプラスミドが使用される。さらに、動物ウイルス、昆虫ウイルスベクターを用いることもできる。組換えベクターの作製は、精製されたＤＮＡを適当な制限酵素で切断し、適当なベクターＤＮＡの制限酵素部位等に挿入してベクターに連結すればよい。形質転換に使用する宿主としては、目的の遺伝子を発現できるものであれば特に限定されるものではない。例えば、細菌（大腸菌、枯草菌等）、酵母、動物細胞、昆虫細胞又は昆虫が挙げられる。動物細胞にはヒト上皮細胞が含まれ、ヒト上皮細胞にはヒト皮膚表皮由来細胞が含まれる。

　本発明のスクリーニング方法において「接触」とは、被験物質と細胞とを接触させることを意味し、細胞培養培地に被験物質を添加する態様、被験物質の存在下で細胞を培養する態様などがある。
　接触後は、上記プロモーターの下流に連結されたリポーター遺伝子の発現を公知方法によりアッセイする。あるいは、スクリーニングに使用した細胞に内在するＴＥＲＴ遺伝子の発現（遺伝子発現、タンパク質発現等）を、ＲＴ−ＰＣＲ、ノーザンブロッティング、ウエスタンブロッティング等により確認する。
　その結果、候補となる被験物質が、コントロール（例えば被験物質を接触させない細胞）と比べて、目的遺伝子又は内在性ＴＥＲＴ遺伝子若しくは内在性ＳＩＲＴ１遺伝子の発現を促進した場合は、被験物質は、発毛効果、育毛効果若しくは皮膚改善効果、又はこれらの組合せの効果を有するものと判定する。

　また、本発明のスクリーニング方法においてＤＮＡ損傷修復マーカー遺伝子を用いる場合は、天然に当該マーカー遺伝子を有する細胞、又は遺伝子組み換えにより当該マーカー遺伝子が導入された細胞に、物理的又は化学的に遺伝子損傷を与え、これに被験物質を接触させる。その後、ＤＮＡ損傷修復マーカーの発現を指標として被験物質がＤＮＡ損傷を修復する物質であるかを判断する。

　例えば、ＤＮＡ損傷により発現が増加する修復マーカー遺伝子を使用する場合は、当該遺伝子の発現が低下したときは、当該被験物質はＤＮＡ損傷修復物質であると判断し、発毛効果、育毛効果又は皮膚改善効果を有する物質として選択する。また、ＤＮＡ損傷により発現が低下する修復マーカー遺伝子を使用する場合は、遺伝子の発現が増加したときは、当該被験物質はＤＮＡ損傷修復物質であると判断し、発毛効果、育毛効果又は皮膚改善効果を有する物質として選択する。

　本発明においては、ＤＮＡ損傷修復効果は、遺伝子自体の発現のみならず、リン酸化を指標とすることもでき、また、当該遺伝子によりコードされるタンパク質の発現を指標とすることもできる。
　ＤＮＡ損傷を受けたときに発現又はリン酸化が増加するマーカーとして、例えばγＨ２ＡＸ遺伝子、ｐ５３遺伝子が挙げられ、ＤＮＡ損傷を受けたときに発現又はリン酸化が増加するマーカーとして、例えばγＨ２ＡＸ、ｐ５３が挙げられる。

　以下、実施例により本発明をさらに具体的に説明する。但し、本発明の範囲はこれらの実施例により限定されるものではない。

［実験手法］
１．細胞培養
１．１．ＨａＣａＴ細胞
　ヒト皮膚のモデル細胞として、ＨａＣａＴ細胞（ヒト皮膚表皮由来細胞株）を採用した。細胞は１０％　Ｆｅｔａｌ　ｂｏｖｉｎｅ　ｓｅｒｕｍ（ＦＢＳ；Ｌｉｆｅ　Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，ＣＡ，ＵＳＡ）添加ＤＭＥＭ培地（Ｄｕｌｂｅｃｃｏ’ｓ　Ｍｏｄｉｆｉｅｄ　Ｅａｇｌｅ　Ｍｅｄｉｕｍ；Ｎｉｓｓｕｉ，Ｔｏｋｙｏ，Ｊａｐａｎ）を用いて、細胞培養ディッシュ（Ｇｒｅｉｎｅｒ　ｂｉｏ−ｏｎｅ，Ｔｏｋｙｏ，Ｊａｐａｎ）にて、３７℃、５％　ＣＯ_２存在下で継代培養した。ＤＭＥＭ培地としては、１ＬのＭｉｌｌｉ−Ｑ水に対して、ＤＭＥＭ粉末１０．０ｇを溶解し、硫酸ストレプトマイシン０．１ｇ力価（Ｍｅｉｊｉ．Ｔｏｋｙｏ，Ｊａｐａｎ）、ペニシリンＧカリウム１０万Ｕ（Ｍｅｉｊｉ）、１Ｍ　ＨＥＰＥＳ　２．３８ｇ（ＤＯＪＩＮＤＯ，Ｋｕｍａｍｏｔｏ，Ｊａｐａｎ）、１０％　ＮａＨＣＯ_３（Ｗａｋｏ，Ｏｓａｋａ，Ｊａｐａｎ）２．０ｇを添加し、０．２２μｍフィルター滅菌（Ｔｏｙｏ　Ｒｏｓｈｉ　Ｋａｉｓｈａ，Ｔｏｋｙｏ，Ｊａｐａｎ）したものを用いた。

１．２．ＨａＣａＴ（ｈＴＥＲＴｐ−ＥＧＦＰ）細胞
　ＨａＣａＴ細胞に、ｈＴＥＲＴプロモーターにより発現が制御されるＥＧＦＰ発現ベクター（ｈＴＥＲＴｐ−ＥＧＦＰ）を導入した。ＨａＣａＴ（ｈＴＥＲＴｐ−ＥＧＦＰ）細胞は、上記に示したＨａＣａＴ細胞の培養と同様に培養した。

１．３．２９３Ｔ細胞
　２９３Ｔ細胞（ヒト胎児腎臓由来細胞）は高力価なレトロウイルス産生を可能にする細胞株として使用した。２９３Ｔ細胞は、上記に示したＨａＣａＴ細胞の培養と同様に培養した。

１．４．ｈＴＥＲＴおよびＳＩＲＴ１ノックダウン細胞
　ｈＴＥＲＴまたは、ＳＩＲＴ１の発現をノックダウンしたＨａＣａＴ細胞は、上述のＨａＣａＴ細胞の培養と同様に培養した。

２．ＨａＣａＴ（ｈＴＥＲＴｐ−ＥＧＦＰ）細胞の作製
２．１．ＨａＣａＴ細胞への遺伝子導入
　ヒトゲノムからクローニングしたヒトＴＥＲＴ遺伝子（ｈＴＥＲＴ）のプロモーター領域を、ｐＥＧＦＰ−Ｃ３　Ｖｅｃｔｏｒ中のＣＭＶプロモーター領域に挿入したベクター（ｐｈＴＥＲＴｐ−ＥＧＦＰ）（伊藤、２０１０）をＨａＣａＴ細胞へのトランスフェクションを行った。なお、当該ベクターの作製に使用したプライマーを表１に示す。

　トランスフェクションには、Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ　２０００（Ｔｈｅｒｍｏ　Ｆｉｓｈｅｒ　Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ，Ｗａｌｔｈａｍ，ＭＡ，ＵＳＡ）を使用した。ＨａＣａＴ細胞を５ｍＬディッシュ（Ｂｅｃｔｏｎ　Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ，Ｆｒａｎｋｌｉｎ　ｌａｋｅｓ，ＮＪ，ＵＳＡ）に５×１０^５ｃｅｌｌｓ／ｄｉｓｈで播種し、１０％　ＦＢＳ含有ＤＭＥＭ培地で培養した。この際、コントロールの遺伝子未導入細胞も用意した。トランスフェクション当日、１．５ｍＬチューブにｈＴＥＲＴｐ−ＥＧＦＰベクター１０μｇと、１５μＬのＬｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅを、無血清ＯＰＴＩ−ＭＥＭ培地を全量１．５ｍＬになるようにし、室温で５分間インキュベートした。Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅによるトランスフェクション法は、血清非存在下で行うため、この間に播種しておいたＨａＣａＴ細胞の培養培地を除去し、５ｍＬの無血清ＯＰＴＩ−ＭＥＭ培地に置換した。３０分後、ＤＮＡ−Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ　２０００混合液をＨａＣａＴ細胞に全量添加した。添加後、軽く震盪させＤＮＡ−ＬｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅとＯＰＴＩ−ＭＥＭとを混和した。３時間培養後、ＤＮＡ−Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ混合溶液を除去し、血清を含む培養培地に置換した。その後、５％　ＣＯ_２、３７℃で２１時間培養し、新しい１０％　ＦＢＳ含有ＤＭＥＭ培養培地に置換した。

２．２．薬剤選択
　ｈＴＥＲＴｐ−ＥＧＦＰベクターにはＫａｎ^ｒ／Ｎｅｏ^ｒの薬剤耐性遺伝子が含まれている。そこで、トランスフェクションから４８時間後、Ｇ４１８（Ｗａｋｏ，Ｏｓａｋａ，Ｊａｐａｎ）を終濃度７０μｇ／ｍＬになるよう添加し、１週間薬剤選択にかけた。継代や３日毎の培地交換を繰り返しながら、その都度Ｇ４１８を終濃度７０μｇ／ｍｌで添加し、コントロールの遺伝子未導入ＨａＣａＴ細胞が完全に死滅するまで薬剤選択を行った。コントロールのＨａＣａＴ細胞が全滅したのを確認した後、Ｇ４１８の濃度を４０μｇ／ｍＬに下げて継代培養を続けた。

２．３．ＨａＣａＴ（ｈＴＥＲＴｐ−ＥＧＦＰ）の樹立
　ｈＴＥＲＴｐ−ＥＧＦＰベクターがＨａＣａＴ細胞に遺伝子導入され、安定発現株が樹立できているか、フローサイトメーターでＧＦＰの蛍光を測定することで行った。５ｍＬディッシュで７０~８０％　コンフルエントになっているコントロールのＨａＣａＴ細胞と作製したＨａＣａＴ（ｈＴＥＲＴｐ−ＥＧＦＰ）細胞を１０％　ＦＢＳ含有ＤＭＥＭ培地２ｍＬ中に懸濁し、この細胞懸濁液をナイロンメッシュ（Ｋｙｏｓｈｉｎ　Ｒｉｋｏｈ，Ｔｏｋｙｏ，Ｊａｐａｎ）にかけた後、フローサイトメーター（ＥＰＩＣＳ，Ｂｅｃｋｍａｎ　Ｃｏｕｌｔｅｒ，Ｍｉａｍｉ，ＦＬ，ＵＳＡ）に供してＧＦＰ蛍光強度を測定し、コントロールのＨａＣａＴ細胞とＨａＣａＴ（ｈＴＥＲＴｐ−ＥＧＦＰ）細胞のＧＦＰ蛍光のピークを比較した（図１）。また、後述の定量Ｒｅｖｅｒｓｅ　ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔａｓｅ　ＰＣＲ（ＲＴ−ＰＣＲ）に述べるＲＴ−ＰＣＲ法によって、ＨａＣａＴ細胞とＨａＣａＴ（ｈＴＥＲＴｐ−ＥＧＦＰ）のＥＧＦＰの発現量を測定し（図２）、目的の遺伝子が導入されたことが確認した。

３．サンプルとサンプル調整
３．１．ポリフェノール
　１５種類のポリフェノールを用いた（表２）。ポリフェノールは、ＤＭＳＯに１０ｍＭの濃度で調整したものを４°Ｃで保存し、適宜解凍し、ピペッティングを行って用いた。

４．ｈＴＥＲＴプロモーター活性を指標としたスクリーニング
４．１．ＥＧＦＰ蛍光強度の測定
　ｈＴＥＲＴ活性は、ＨａＣａＴ（ｈＴＥＲＴｐ−ＥＧＦＰ）細胞におけるＥＧＦＰ蛍光強度を、ＩＮ　Ｃｅｌｌ　Ａｎａｌｙｚｅｒ　１０００（ＧＥ　Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ，Ａｍｅｒｓｈａｍ　Ｐｌａｃｅ，ＵＫ）を用いて追跡することにより測定した。ＨａＣａＴ（ｈＴＥＲＴｐ−ＥＧＦＰ）細胞を９６−ｗｅｌｌ　ｐｌａｔｅ（Ｇｒｅｉｎｅｒ　Ｂｉｏ−ｏｎｅ，Ｔｏｋｙｏ，Ｊａｐａｎ）に５．０×１０^４ｃｅｌｌｓ／ｗｅｌｌで播種し、１０％　ＦＢＳ血清を含むＤＭＥＭ培地にて培養した。翌日、各種サンプルを添加した。添加濃度は、ポリフェノールサンプルが終濃度１０μＭになるように添加した。コントロールとして、ポリフェノールサンプルにおいてはＤＭＳＯを各種サンプル添加量と同量加えた。

　添加後、１０％ＦＢＳ血清を含むＤＭＥＭ培地にて４８時間培養を行った。４８時間後、培地をアスピレートし、８％パラホルムアルデヒドを終濃度が４％になるように１００μＬ／ｗｅｌｌで添加し、室温で１０分間静置することで固定した。なお、８％パラホルムアルデヒドはＰａｒａｆｏｒｍａｌｄｅｈｙｄｅ（Ｗａｋｏ）を１×ＰＢＳで８％パラホルムアルデヒドになるように希釈し、６０℃のウォーターバスに溶かして作製した。１０分後、固定液を除去し、１×ＰＢＳで２回ウォッシュした。その後、１，０００倍希釈したＣｅｌｌｓｔａｉｎＲ−Ｈｏｅｃｈｓｔ　３３３４２　ｓｏｌｕｔｉｏｎ（Ｄｏｊｉｎｄｏ，Ｋｕｍａｍｏｔｏ，Ｊａｐａｎ）を１００μＬ／ｗｅｌｌで添加して３０分間室温で静置することで核染色をした。３０分後、Ｃｅｌｌｓｔａｉｎ　Ｒ−Ｈｏｅｃｈｓｔ　３３３４２　ｓｏｌｕｔｉｏｎを除去し、１×ＰＢＳで３回ウォッシュし、各ｗｅｌｌに１００μＬのＰＢＳを添加し、ＩＮ　Ｃｅｌｌ　Ａｎａｌｙｚｅｒ　１０００でＥＧＦＰ蛍光強度を測定した。

５．定量Ｒｅｖｅｒｓｅ　ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔａｓｅ−ＰＣＲ（ＲＴ−ＰＣＲ）反応
５．１．全ＲＮＡの調製
　全ＲＮＡの調製にはＨｉｇｈ　Ｐｕｒｅ　ＲＮＡ　Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ　Ｋｉｔ（Ｒｏｃｈｅ　Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ　Ｇｍｂｈ，Ｍａｎｎｈｅｉｍ，Ｇｅｒｍａｎｙ）を使用し、その製品プロトコールに従って行った。また全ＲＮＡ調製から逆転写反応終了まで用いる試薬および器具はＲＮａｓｅ　Ｆｒｅｅのものを使用した。

　まず、５ｍＬの細胞培養ディッシュに５．０×１０^４ｃｅｌｌｓ／ｗｅｌｌで細胞を播種し、１０％ＦＢＳ血清を含むＤＭＥＭ培地にて３７℃で培養した。翌日、各種サンプルを添加した。添加濃度については、前記「実験手法」の「ｈＴＥＲＴプロモーター活性を指標としたスクリーニング」の項に記載のＥＧＦＰ蛍光強度の測定に準じた。添加後、１０％ＦＢＳ血清を含むＤＭＥＭ培地にて３７℃で４８時間培養を行った。４８時間後、培地を完全に除去し、１×ＰＢＳを２００μＬ加えて洗浄し、この上からＨｉｇｈ　Ｐｕｒｅ　ＲＮＡ　Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ　Ｋｉｔに含まれている細胞溶解液４００μＬを添加し、細胞溶解液をよくディッシュ全体に行き渡らせて溶解させ、細胞ライセート全量を１．５ｍＬチューブへ回収した。

　回収したサンプルはボルテックスミキサーで６０秒間よく懸濁し、軽くスピンダウンした。Ｋｉｔ中のＨｉｇｈ　Ｐｕｒｅフィルターチューブと回収用チューブとを組み立て、細胞ライセート溶液をフィルターチューブに加えた。室温、１０，０００×ｇにて１５秒間遠心分離し、回収用チューブに排出された液を捨て、再びフィルターチューブと回収用チューブを組み立てた。
１．５ｍＬチューブに、１チューブ当たり９０μＬのＤＮａｓｅインキュベーションバッファーとＤＮａｓｅ　Ｉ　１０μＬを加え混合した。この混合液を先ほどのフィルターチューブに添加し、室温で１５分間インキュベートした。１５分後、Ｋｉｔ中のＷａｓｈ　Ｂｕｆｆｅｒ　Ｉ　５００μＬをフィルターチューブに加え、室温、１０，０００×ｇにて１５秒間遠心分離した。

　遠心後、回収用チューブに排出された液を捨て、再びフィルターチューブと回収用チューブを組み立てた。Ｗａｓｈ　Ｂｕｆｆｅｒ　ＩＩ　５００μＬをフィルターチューブに加え、室温、１０，０００×ｇにて１５秒間遠心分離した。遠心後、回収用チューブに排出された液を捨て、再びフィルターチューブと回収用チューブを組み立てた。更に、Ｗａｓｈ　Ｂｕｆｆｅｒ　ＩＩ　２００μＬを加え、室温、１５，０００×ｇで２分間遠心分離を行い、フィルターを洗浄した。遠心後、フィルターチューブを新しい１．５ｍＬチューブに差し込み、溶出バッファー１００μＬをフィルターチューブの中心に添加し、室温で３分間静置した。その後、室温、１０，０００×ｇにて１分間遠心分離した。この操作による溶出液をＲＮＡ溶液とした。溶液中のＲＮＡ濃度は、ＮａｎｏＤｒｏｐ２０００／２０００ｃ分光光度計（Ｔｈｅｒｍｏ　Ｆｉｓｈｅｒ　Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ，Ｗａｌｔｈａｍ，ＭＡ）によって、２６０ｎｍでの吸光値を元に算出し、以後の実験に使用した。

５．２．ｃＤＮＡの合成
（１）逆転写酵素ＲｅｖｅｒＴｒａ　Ａｃｅを用いたｃＤＮＡ合成
　細胞から抽出した全ＲＮＡ１．０μｇに対して５ｐｍｏｌのＯｌｉｇｏ（ｄＴ）２０プライマー（ＴＯＹＯＢＯ，Ｏｓａｋａ，Ｊａｐａｎ）を加え、総液量が１３μＬになるようにＲＮａｓｅ　Ｆｒｅｅ水を加えた。Ｔｈｅｒｍａｌ　Ｃｙｃｌｅｒ　ＰＴＣ−２００（ＭＪ　Ｒｅｓｅａｒｃｈ，Ｗａｌｔｈａｍ，ＭＡ，ＵＳＡ）にて６５℃で５分間熱処理反応を行い、直ちに氷中に移して急冷した。その間に、逆転写酵素反応プログラムを４２°Ｃの段階へ進めておき一時停止にした。氷中にて５分間冷却したサンプルへ１サンプル当たり逆転写酵素反応緩衝液４μＬ、１０ｍＭ　ｄＮＴＰｓ（ＧＥ　Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）２μＬ、逆転写酵素ＲｅｖｅｒＴｒａ　Ａｃｅ（１００ｕｎｉｔｓ／μＬ）（ＴＯＹＯＢＯ，Ｏｓａｋａ，Ｊａｐａｎ）０．５μＬを混合した溶液を加え、穏やかに混合した。その後４２°Ｃで２０分間、９９°Ｃで５分間、４°Ｃで５分間の反応させることによりｃＤＮＡを合成した。このｃＤＮＡを定量ＰＣＲに鋳型として用いた。

（２）逆転写酵素ＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔを用いたｃＤＮＡ合成
　細胞から抽出した全ＲＮＡ０．７μｇまたは２．０μｇに対して５０ｐｍｏｌのＯｌｉｇｏ（ｄＴ）２０プライマー及び１０ｍＭ　ｄＮＴＰｓ１μＬを加え、総液量が１２．７５μＬになるようにＲＮａｓｅ　Ｆｒｅｅ水を加えた。Ｔｈｅｒｍａｌ　Ｃｙｃｌｅｒ　ＰＴＣ−２００にて６５℃で５分間熱処理反応を行い、直ちに氷中に移して急冷した。その間、逆転写酵素反応プログラムを５５℃の段階へ進めておき一時停止にした。氷中にて１分間以上冷却したサンプルへ１サンプル当たり５×逆転写酵素反応緩衝液４μＬ、１００ｍＭ　ＤＴＴ１μＬ、逆転写酵素ＳｕｐｅｒｓｃｉｐｔＩＶ（１００ｕｎｉｔｓ／μＬ）（Ｔｈｅｒｍｏ　Ｆｉｓｈｅｒ　Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）０．２５μＬを混合した溶液を加え穏やかに混合した。その後５５℃で１０分間、８０℃で１０分間反応させることによりｃＤＮＡを合成した。このｃＤＮＡを定量ＰＣＲに鋳型として用いた。

５．３．プライマーの設計
　ＲＴ−ＰＣＲによって発現量を測定する目的遺伝子をＮＣＢＩ（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ｇｅｎｅ／）で検索し、その配列をもとにＰｒｉｍｅｒ３を用いてプライマーの配列を決定し、合成した。プライマーの合成はＳｉｇｍａ社に委託した。内部コントロールであるβ−ａｃｔｉｎと目的遺伝子をそれぞれ検出するためのプライマーを表３に示す。

５．４．定量Ｒｅｖｅｒｓｅ　ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔａｓｅ−ＰＣＲ（ＲＴ−ＰＣＲ）反応
　作製したｃＤＮＡを鋳型として用いた。０．２ｍＬ　ＰＣＲチューブに滅菌水４９μＬ、１０ｐｍｏｌ／ｍＬに希釈したプライマーＦｏｒｗａｒｄ／Ｒｅｖｅｒｓｅ双方を３．５μＬずつ、鋳型ｃＤＮＡ（プライマーは目的遺伝子は１／１０に、β−ａｃｔｉｎは１／５０に希釈した）７．０μＬ、高効率リアルタイムＰＣＲ用マスターミックス（２×濃度）のＴＨＵＮＤＥＲＢＩＲＤ　ＳＹＢＲ　ｑＰＣＲ　Ｍｉｘ（ＴＯＹＯＢＯ）２４．５μＬを入れ、よく懸濁した。その後、９６−ｗｅｌｌ　ｐｌａｔｅに２５μＬずつ３ｗｅｌｌに添加し、Ｔｈｅｒｍａｌ　Ｃｙｃｌｅｒ　Ｄｉｃｅ　Ｒｅａｌ　Ｔｉｍｅ　Ｓｙｓｔｅｍ（ＴＡＫＡＲＡ　ＢＩＯ，Ｓｉｇａ，Ｊａｐａｎ）を用いて、定量Ｒｅａｌ　ｔｉｍｅ−ＰＣＲを行った。ＰＣＲ反応は、変性反応を９５℃で５秒間、アニーリングを６０℃で１０秒間、伸長反応を７２℃で２０秒間行い、これを４５サイクル（３ｓｔｅｐ）繰り返し、ＦＡＭにより検出した。検量線のためのプライマーには、β−ａｃｔｉｎを用いた。また、相対遺伝子発現量は測定した値をβ−ａｃｔｉｎの発現量値で除し求めた。なお、統計解析においては、正規分布と仮定してｎ＝３で、Ｓｔｕｄｅｎｔ’ｓ　ｔ−ｔｅｓｔを行った。

６．細胞増殖曲線
　ＨａＣａＴ細胞を、９６−ｗｅｌｌ　ｐｌａｔｅ（Ｂｅｃｔｏｎ　Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ）に１．０×１０^４ｃｅｌｌｓの細胞数で播種した。６時間後、細胞がプレートに接着した後、サンプル添加を行った。サンプル添加の終濃度は、前記「実験手法」の「ｈＴＥＲＴプロモーター活性を指標としたスクリーニング」の項に記載のＥＧＦＰ蛍光強度の測定に準じた。

　サンプル添加から２４時間ごとにＣｅｌｌ　Ｃｏｕｎｔ　Ｋｉｔ−８溶液（ＤＯＪＩＮＤＯ）を各ｗｅｌｌに１０μＬずつ添加し、３７℃、５％　ＣＯ_２の条件下で２時間呈色反応を行った。その後、マイクロプレートリーダー（Ｓｕｎｒｉｓｅ，ＴＥＣＡＮ　Ａｕｓｔｒｉａ　ＧｍｂＨ，Ｇｒｏｄｉｇ，Ａｕｓｔｒｉａ）を用いて各ｗｅｌｌの４５０ｎｍの吸光度を測定し、測定値とした。Ｃｅｌｌ　Ｃｏｕｎｔｉｎｇ　Ｋｉｔ−８は細胞増殖試験において、細胞数を測定するキットである。高感度水溶性ホルマザンを生成する新規テトラゾリウム塩ＷＳＴ−８は細胞内脱水素酵素により還元され、水溶性のホルマザンを生成する。細胞数と直線的な比例関係にあるホルマザンの色素量を、４５０ｎｍの吸光度で測定することで生細胞数を計測することができる。なお、統計解析においては、正規分布だと仮定してｎ＝３で、Ｓｔｕｄｅｎｔ’ｓ　ｔ−ｔｅｓｔを行った。

７．ルシフェラーゼアッセイ
７．１．リポータープラスミド
　ｈＴＥＲＴプロモーターを持つルシフェラーゼリポーター（ｐＧＬ３ｂ−２８９、ｐＧＬ３ｂ−２８９（Ｅ−ｂｏｘ−ｍｕｔ））（Ｆｕｊｉｋｉ　Ｔ　ｅｔ　ａｌ．，２００７）、及びＴＣＦ／ＬＥＦ結合サイトを持つルシフェラーゼリポーター（Ｍ５０　Ｓｕｐｅｒ　８ｘ　ＴＯＰ　Ｆｌａｓｈ）（Ａｄｄｇｅｎｅ，Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ，ＭＡ）、ＴＣＦ／ＬＥＦ結合サイト変異体を持つルシフェラーゼリポーター（Ｍ５１　Ｓｕｐｅｒ　８ｘ　ＦＯＰ　Ｆｌａｓｈ）（Ａｄｄｇｅｎｅ）を用いた。

７．２．トランスフェクション
　ＨａＣａＴ細胞を回収時にサブコンフルエントになるように２４−ｗｅｌｌ　ｐｌａｔｅ（Ｂｅｃｔｏｎ　Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ）に５．０×１０^４ｃｅｌｌｓ／ｗｅｌｌで５００μＬずつ播種した。翌日、１．５ｍＬチューブに、目的のプロモーター、ウミホタルルシフェラーゼコンストラクト、細胞内標準化コントロールとしてウミシイタケルシフェラーゼコンストラクト（ｐＲＬ−ＴＫ）およびＤＭＥＭ培地を準備した。ＤＮＡの比率及び容量は、最終容量が６２．５μＬになるよう添加した。これに１ｍｇ／ｍＬのＰＥＩ（Ｐｏｌｙｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｉｎｃ．Ｗａｒｒｉｎｇｔｏｎ，ＰＡ）を１．２５μＬ加えて混合した後、室温で１５分間静置した。２４−ｗｅｌｌ　ｐｌａｔｅから培地を完全に除去し、１０％　ＦＢＳ含有培地及び、上記のＤＮＡ−ＰＥＩ混合溶液を全量加えて、３７℃、５％　ＣＯ_２存在下で培養した。

　２４時間後、培養液をアスピレートし、１０％　ＦＢＳ含有ＤＭＥＭ培地に交換した。交換から４８時間後に測定を行った。または、培地を交換する際に、サンプル添加を、１サンプルにつき３ｗｅｌｌ分、前記「実験手法」の「ｈＴＥＲＴプロモーター活性を指標としたスクリーニング」の項に記載のＥＧＦＰ蛍光強度の測定に準じた濃度で行った。トランスフェクションに使用したルシフェラーゼコンストラクトの遺伝子量及び比率を以下に記す。

β−カテニンプロモーター活性測定時の条件
リポーター（Ｍ５０　Ｓｕｐｅｒ　８ｘ　ＴＯＰ　Ｆｌａｓｈ，Ｍ５１　Ｓｕｐｅｒ　８ｘ　ＦＯＰ　Ｆｌａｓｈ　　　３５０ｎｇ
ｐＲＬ−ＴＫ　　１５０ｎｇ
ｈＴＥＲＴプロモーター活性測定時の条件
リポーター（ｐＧＬ３ｂ−２８９、ｐＧＬ３ｂ−２８９（Ｅ−ｂｏｘ−ｍｕｔ））　　　３５０ｎｇ
ｐＲＬ−ＴＫ　　１５０ｎｇ

７．３．ルシフェラーゼアッセイ
　細胞抽出液の調製およびルシフェラーゼ活性の測定は、Ｄｕａｌ　Ｌｕｃｉｆｅｒａｓｅ　Ｒｅｐｏｒｔｅｒ　Ａｓｓａｙ　Ｓｙｓｔｅｍ（Ｐｒｏｍｅｇａ，Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ）の製品プロトコールに従って行った。２４−ｗｅｌｌ　ｐｌａｔｅの培地を完全に除去した後、１×ＰＢＳ　５０μＬ／ｗｅｌｌで１回洗浄し、ＰＢＳを完全に除去した。その後、５×ＰＬＢ（Ｐａｓｓｉｖｅ　Ｌｙｓｉｓ　Ｂｕｆｆｅｒ）を超純水で１×ＰＬＢに希釈したものを５０μＬ／ｗｅｌｌ添加し、プレートを室温で１時間、Ｍｉｃｒｏ　Ｍｉｘｅｒ（ＴＡＩＴＥＣ，Ｓａｉｔａｍａ，Ｊａｐａｎ）で振とうさせて細胞を溶解した。その間に遮光下で、５０×Ｓｔｏｐ　＆　Ｇｌｏ　ＳｕｂｓｔｒａｔｅをＳｔｏｐ　＆　Ｇｌｏ　Ｂｕｆｆｅｒで５０倍希釈した１×Ｓｔｏｐ　＆　Ｇｌｏ　Ｒｅａｇｅｎｔを準備した。また、Ｌｕｃｉｆｅｒａｓｅ　Ａｓｓａｙ　ＳｕｂｓｔｒａｔｅをＬｕｃｉｆｅｒａｓｅ　ａｓｓａｙ　Ｂｕｆｆｅｒ　ＩＩに溶解させたＬＡＲ　ＩＩ（Ｌｕｃｉｆｅｒａｓｅ　Ａｓｓａｙ　Ｒｅａｇｅｎｔ　ＩＩ）を１２×７５ｍｍのガラス製の試験管（ＩＷＡＫＩ，Ｃｈｉｂａ，Ｊａｐａｎ）に５０μＬずつ分注した。

　１０μＬの細胞抽出液をＬＡＲ　ＩＩに加えて混合し、試験管をルミノメーター（Ｌｕｍｉｔ　ＬＢ　９５０７，Ｂｅｒｔｈｏｌｄ　Ｊａｐａｎ　Ｋ．Ｋ．，Ｔｏｋｙｏ，Ｊａｐａｎ）にセットし、ホタルルシフェラーゼ活性の発光量を細胞抽出液添加の１秒後から１０秒間の積算値で測定した。引き続き、同サンプルに対して５０μＬの１×Ｓｔｏｐ　＆　Ｇｌｏ　Ｒｅａｇｅｎｔを加えて混合し、ホタルルシフェラーゼアッセイ活性の測定と同様にウミシイタケルシフェラーゼの発光量を測定した。測定したプロモーター活性値は、ホタルルシフェラーゼ活性測定値をウミシイタケルシフェラーゼ活性測定値で割った値をそのプロモーターの比活性値とし、平均値および標準偏差値を算出して評価した。

８．ウエスタンブロッティング法
８．１．試薬の調整
１：ＮＰ−４０　Ｌｙｓｉｓ　Ｂｕｆｆｅｒ
０．５％　Ｎｏｎｉｄｅｔ　Ｐ−４０（Ｎａｃａｌａｉ　ｔｅｓｑｕｅ，Ｋｙｏｔｏ，Ｊａｐａｎ）
５ｍＭ　ＥＤＴＡ（ＤＯＪＩＮＤＯ）
２ｍＭ　Ｎａ_３ＶＯ_４（Ｗａｋｏ）
１０ｍＭ　Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．６）（ＳＩＧＭＡ，Ｓｔ　Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ，ＵＳＡ）
１５０ｍＭ　ＮａＣｌ（Ｗａｋｏ）
５μｇ／ｍＬ　Ａｐｒｏｔｉｎｉｎ（ＳＩＧＭＡ）
１ｍＭ　ＰＭＳＦ（Ｐｈｅｎｙｌｍｅｔｈｙｌ　ｓｕｌｆｏｎｙｌ　ｆｌｕｏｒｉｄｅ）（ＳＩＧＭＡ）

２：Ｒｅｓｏｌｖｉｎｇ　ｇｅｌ　ｂｕｆｆｅｒ（総量１，０００ｍｌ）
９０．８ｇ　Ｔｒｉｚｍａ−ｂａｓｅ（ＳＩＧＭＡ）
２．０ｇ　Ｓｏｄｉｕｍ　ｄｏｄｅｃｙｌ　ｓｕｌｐｈａｔｅ（ＳＤＳ，Ｗａｋｏ）１２Ｎ　ＨＣｌでｐＨ８．８に調整

３：Ｓｔａｃｋｉｎｇ　ｇｅｌ　ｂｕｆｆｅｒ（総量１０００ｍｌ）
３０．３ｇ　Ｔｒｉｚｍａ−ｂａｓｅ（ＳＩＧＭＡ）
２．０ｇ　ＳＤＳ（Ｗａｋｏ）１２Ｎ　ＨＣｌでｐＨ６．８に調整

４：２×ｓａｍｐｌｅ　ｂｕｆｆｅｒ
５％　Ｓｏｄｉｕｍ　ｄｏｄｅｃｙｌ　ｓｕｌｐｈａｔｅ（Ｗａｋｏ）
２０％　Ｇｌｙｃｅｒｏｌ（Ｗａｋｏ）
６２．５ｍＭ　Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ６．８）
１０％　２−Ｍｅｒｃａｐｔｏｅｔｈａｎｏｌ（Ｗａｋｏ）
０．０１％　Ｂｒｏｍｏｐｈｅｎｏｌ　Ｂｌｕｅ（Ｗａｋｏ）

５：１０×Ｔｒｉｓ　Ｇｌｙｃｉｎｅ　ＳＤＳ　ｂｕｆｆｅｒ（総量１，０００ｍｌ）
３０．１ｇ　Ｔｒｉｓ
１４４ｇ　Ｇｌｙｃｉｎｅ
１０ｇ　ＳＤＳ

６：ＰＴＢ（Ｐｒｏｔｅｉｎ　Ｔｒａｎｓｆｅｒ　Ｂｕｆｆｅｒ）
４８ｍＭ　Ｔｒｉｚｍａ−ｂａｓｅ（ＳＩＧＭＡ）
３８ｍＭ　Ｇｌｙｃｉｎｅ（Ｗａｋｏ）
２０％　Ｍｅｔｈａｎｏｌ（Ｗａｋｏ）

５：ＰＢＳ−Ｔｗｅｅｎ（総量１，０００ｍｌ）
１１．５ｇ　Ｎａ_２ＨＰＯ_４（Ｗａｋｏ）
２．９６ｇ　ＮａＨ_２ＰＯ_４（Ｗａｋｏ）
５．８４ｇ　ＮａＣｌ（Ｗａｋｏ）
０．１％　Ｐｏｌｙｏｘｙｅｔｈｙｌｅｎｅ（２０）Ｓｏｒｂｉｔａｎ　Ｍｏｎｏｌａｕｒａｔｅ（Ｔｗｅｅｎ　２０）（Ｗａｋｏ）

８．２．タンパク質溶液の調製
　ＨａＣａＴ細胞を１０ｍＬ　ｄｉｓｈ（Ｇｒｅｉｎｅｒ　ｂｉｏ−ｏｎｅ）に５．０×１０５ｃｅｌｌｓ／ｄｉｓｈで播種し、１０％ＦＢＳ含有ＤＭＥＭ培地で３７℃、５％ＣＯ_２の条件下で２４時間培養した。２４時間後、サンプルを添加し、３７℃、５％　ＣＯ_２の条件下で２４時間培養した。サンプルは、Ｒｅｓｖｅｒａｔｒｏｌ、Ｆｉｓｅｔｉｎ、Ｓｅｓａｍｏｌを終濃度１０μＭで添加した。サンプル添加から２４時間後、培地をアスピレートし、氷冷１×ＰＢＳ　５ｍＬで３回洗浄を行った。その後、ＮＰ−４０　Ｌｙｓｉｓ　Ｂｕｆｆｅｒを８００μＬ添加して細胞を溶解させ、セルスクレーパー（ＮＩＰＰＯＮ　Ｇｅｎｅｔｉｃｓ，Ｔｏｋｙｏ，Ｊａｐａｎ）で一定方向に摩擦熱が生じないようゆっくりと掻き取り、シリコナイズドスナップキャップ付チューブ（Ｔｈｅｒｍｏ　Ｆｉｓｈｅｒ　Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）に移した。３０分間氷中に置いて静置した後、超音波破砕機（ＴＯＭＹ　ＳＥＩＫＯ，Ｔｏｋｙｏ，Ｊａｐａｎ）でタンパク溶液を懸濁し、２０，０００×ｇ、４℃で１５分間遠心分離し、上清２５μＬをタンパク定量用に、残りの回収液をＷｅｓｔｅｒｎ　Ｂｌｏｔｔｉｎｇ用のサンプルとして数本のシリコナイズドスナップキャップ付チューブに分注し、−８０℃で保存した。

８．３．タンパク定量（Ｂｒａｄｆｏｒｄ法）
　上記８．２．項で抽出したタンパク質溶液１０μＬをＰＢＳで５０、１００、２００、４００倍に段階希釈した。標準曲線のスタンダードには、ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ：Ｂｏｖｉｎｅ　ｓｅｒｕｍ　ａｌｂｕｍｉｎ，Ｗａｋｏ）を０~９０μｇ／ｍＬになるようにＰＢＳで１０段階に希釈した液を使用した。９６−ｗｅｌｌ　ｐｌａｔｅの２ｗｅｌｌを１検定分として、各ｗｅｌｌに１００μＬずつ添加した。次に、滅菌水で２．５倍に希釈したＰｒｏｔｅｉｎ　Ａｓｓａｙ　Ｄｙｅ（ＢＩＯ−ＲＡＤ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｈｅｒｃｕｌｅｓ，ＣＡ，ＵＳＡ）を全てのｗｅｌｌに１００μＬずつ素早く添加して、Ｍｉｃｒｏ　Ｍｉｘｅｒ（ＴＡＩＴＥＣ，Ｓａｉｔａｍａ，Ｊａｐａｎ）で振とう後、１０分間室温で遮光静置した。１０分後、吸光光度計（Ｔｅｃａｎ）を用い、吸光度５９５ｎｍをもとに測定を行った。測定で得られた標準曲線を基に定量を行い、タンパク質濃度を決定した。

８．４．ウエスタンブロッティング
（１）ＳＤＳ−ＰＡＧＥ
　ＳＤＳポリアクリルアミド電気泳動（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）を行った。泳動のゲル板は、１ｍｍ厚を使用した。上層ゲルは濃縮ゲル（ｓｔａｃｋｉｎｇ　ｇｅｌ）、下層ゲルは分離ゲル（ｒｕｎｎｉｎｇ　ｇｅｌ）となっており、各々の組成は以下に記した。分離ゲル注入後は、その上に水飽和ブタノールを充填して空気との接地を遮断した。なお、濃縮ゲルのアクリルアミド濃度は、常時５％であるが、分離ゲルのアクリルアミド濃度は、目的タンパク質の分子量により異なったものを用いた。

・Ｓｔａｃｋｉｎｇ　ｇｅｌ
４０％　Ａｃｒｙｌａｍｉｄｅ／Ｂｉｓ　ｓｏｌｕｔｉｏｎ（３７．５：１）（ＢＩＯ　ＲＡＤ）　１．３５ｍＬ
Ｓｔａｃｋｉｎｇ　ｇｅｌ　ｂｕｆｆｅｒ　　　５．００ｍＬ
滅菌水　４．４５ｍＬ
１０％　ＡＰＳ（Ｗａｋｏ）　　５０μＬ
ＴＥＭＥＤ（Ｗａｋｏ）　　　　１０μＬ

・Ｒｕｎｎｉｎｇ　ｇｅｌ
４０％　Ａｃｒｙｌａｍｉｄｅ／Ｂｉｓ　ｓｏｌｕｔｉｏｎ（３７．５：１）（ＢＩＯ　ＲＡＤ）　５．６ｍＬ
Ｒｅｓｏｌｖｉｎｇ　ｇｅｌ　ｂｕｆｆｅｒ　　　９ｍＬ
滅菌水　３．９ｍＬ
１０％　ＡＰＳ（Ｗａｋｏ　Ｐｕｒｅ　Ｃｈｅｍｉｃａｌ）　　　１８０μＬ
ＴＥＭＥＤ（Ｗａｋｏ　Ｐｕｒｅ　Ｃｈｅｍｉｃａｌ）　　　　１８μＬ

　上記の分離ゲルは、１２％の組成を記した。
　定量したタンパク質サンプル２０μｇを２×Ｓａｍｐｌｅ　ｂｕｆｆｅｒと１：１の割合で混合して、９５℃で５分間加熱して変性させた。変性後、氷上に移して５分間静置してからゲルに注入した。泳動条件は、濃縮ゲルともに２０Ｖ、２００ｍＡので約１~１．５時間泳動を行った。泳動マーカーとして、Ｋａｌｅｉｄｏｓｃｏｐｅ　Ｐｒｅｓｔａｉｎｅｄ　Ｓｔａｎｄａｒｄｓ（１６１０３７５，ＢＩＯ　ＲＡＤ）を使用した。

（２）ブロッティング
　泳動終了後、目的タンパク質に応じて分離ゲルの必要箇所を切り、Ｐｒｏｔｅｉｎ　Ｔｒａｎｓｆｅｒ　Ｂｕｆｆｅｒ（ＰＴＢ液）に浸し３０分間振とうした。その間に、ＰＶＤＦメンブレン（ＧＥ　Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）と濾紙４枚をゲルと同じ面積で切り、ＰＶＤＦメンブレンの前処理として１００％メタノール（Ｗａｋｏ）に２０秒、超純水に５分間浸して振とうし、続いてＰＴＢ液に浸し１５分間振とうした。振とう後、２連式ミニ転写装置（ＮＡ−１５１０Ｂ型，ＮＩＨＯＮ　ＥＩＤＯ，Ｔｏｋｙｏ，Ｊａｐａｎ）を用いてＰＴＢに浸した濾紙２枚、ＰＶＤＦメンブレン、ゲル、濾紙２枚の順で重ね合わせ、１００Ａ、５０Ｖ、６０分の条件でブロッティングを行った。

（３）ブロッキング
　ブロッティング終了後、ＰＶＤＦメンブレンをブロッキング液として、５％スキムミルク（Ｗａｋｏ）／０．１％ＰＢＳ−Ｔｗｅｅｎに浸し、４℃、一晩振とうしながらブロッキングを行った。

（４）一次抗体反応
　ブロッキング後、ＰＶＤＦメンブレンをＰＢＳ−Ｔｗｅｅｎで２回軽く振とうしながらウォッシュした後、新しいＰＢＳ−Ｔｗｅｅｎで１５分間振とうさせながらウォッシュした。ウォッシュ後、ＰＢＳ−ＴｗｅｅｎあるいはＣａｎ　Ｇｅｔ　Ｓｉｇｎａｌ　Ｉｍｍｕｎｏｒｅａｃｔｉｏｎ　Ｅｎｈａｎｃｅｒ　Ｓｏｌｕｔｉｏｎ　Ｓｏｌｕｔｉｏｎ　１（ＴＯＹＯＢＯ）で希釈した１次抗体液を、振とうさせながら室温で１時間反応させ、抗原抗体反応を行った。抗体希釈率は使用した抗体により異なり、以下に記した。

＜一次抗体希釈率＞
・β−ｃａｔｅｎｉｎ　Ａｎｔｉｂｏｄｙ（＃８４８０Ｓ，Ｃｅｌｌ　Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ　Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｄａｎｖｅｒｓ，ＭＡ，ＵＳＡ）　　　　　　１／１５００
・β−ａｃｔｉｎ　Ａｎｔｉｂｏｄｙ（０１３−２４５５３，Ｗａｋｏ）　１／３０００

（５）二次抗体反応
　一次抗体反応後、ＰＢＳ−Ｔｗｅｅｎで２回軽く振とうし、さらに１５分間振とうしながらウォッシュした。続けて、ＰＢＳ−Ｔｗｅｅｎで５分間の振とう洗浄を３回繰り返して、余分な１次抗体を取り除いた。振とう後、ＰＢＳ−ＴｗｅｅｎあるいはＣａｎ　Ｇｅｔ　Ｓｉｇｎａｌ　Ｉｍｍｕｎｏｒｅａｃｔｉｏｎ　Ｅｎｈａｎｃｅｒ　Ｓｏｌｕｔｉｏｎ　Ｓｏｌｕｔｉｏｎ２（ＴＯＹＯＢＯ）で希釈した２次抗体液を、振とうさせながら、室温で１時間反応させ、抗原抗体反応を行った。抗体希釈率を以下に示す。

＜二次抗体希釈率＞
・Ａｎｔｉ−ｒａｂｂｉｔ　ＩｇＧ，Ｈｏｒｓｅｒａｄｉｓｈ　Ｐｅｒｏｘｉｄａｓｅ　ｌｉｎｋｅｄ　ｗｈｏｌｅ　ａｎｔｉｂｏｄｙ（ＧＥ　Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）　　１／２５００
・Ａｎｔｉ−ｍｏｕｓｅ　ＩｇＧ，Ｈｏｒｓｅｒａｄｉｓｈ　Ｐｅｒｏｘｉｄａｓｅ　ｌｉｎｋｅｄ　ｗｈｏｌｅ　ａｎｔｉｂｏｄｙ（ＧＥ　Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）　　１／２５００

（６）検出
　二次抗体反応終了後、ＰＢＳ−Ｔｗｅｅｎで２回軽く振とうし、さらに１５分間振とうしウォッシュした。続けて、ＰＢＳ−Ｔｗｅｅｎで５分間振とうさせながらの洗浄を３回繰り返して、余分な二次抗体を取り除いた。洗浄後、Ｉｍｍｕｎｏ　Ｓｔａｒ　ＬＤ（Ｗａｋｏ）のＬｕｍｉｎｅｓｃｅｎｃｅ　Ｓｏｌｕｔｉｏｎ　ＡとＬｕｍｉｎｅｓｃｅｎｃｅ　Ｓｏｌｕｔｉｏｎ　Ｂを１：１の割合で混合させ、ＰＶＤＦ膜に添加して、５分間遮光して反応させた。その後、ＬＡＳ−１０００（ＦＵＪＩＦＩＬＭ，Ｔｏｋｙｏ，Ｊａｐａｎ）で検出した。

９．動物実験
９．１．動物及び飼育方法
　Ｃ５７ＢＬ／６Ｊ　Ｊｃｌマウス（♂，６週齢）を日本クレア株式会社（Ｔｏｋｙｏ，Ｊａｐａｎ）から購入した。飼育環境は、マウス用の小型ケージ（ＮＡＴＳＵＭＥ　ＳＥＩＳＡＫＵＳＨＯ，Ｊａｐａｎ）を用いて行い、１ケージに１匹とし、室温２２~２６℃、湿度５０~６０％、１２時間明暗周期にコントロールされたラック（Ｏｒｉｅｎｔａｌ，Ｔｏｋｙｏ，Ｊａｐａｎ）にて飼育した。また、ガンマ線滅菌照射させた飼料（ＣＡ−１　照射線量　３０ｋＧｙ）（ＣＬＥＡ）と水を自由に摂取させた。実験飼育は、コントロール群（９匹）、Ｒｅｓｖｅｒａｔｒｏｌ群（９匹）、Ｆｉｓｅｔｉｎ群（１０匹）の３群に分けて４週間行った。

　全マウスの手順と操作は、九州大学動物実験倫理委員会の承認を得て、同委員会が作成した指針実験動物の飼育と使用のためのガイドに従っており、同委員会の承認を得ている（承認番号：Ａ２８−０７７−０「疾患モデル動物を用いたアンチエイジング活性を有する食品の機能性評価」）

９．２．塗布試験
　１週間予備飼育した後、全身吸入麻酔剤　セボフレン（Ｍａｒｕｉｓｈｉ　Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ，Ｏｓａｋａ，Ｊａｐａｎ）麻酔下でマウスの背部体毛を約２．５ｃｍ×２．５ｃｍの大きさになるように電気バリカン（ＴＨＲＩＶＥ　ＭＯＤＥＬ　２１００，Ｄａｉｔｏ　Ｅｌｅｃｔｒｉｃ　Ｍａｃｈｉｎｅ　Ｉｎｄｕｓｔｒｙ，Ｏｓａｋａ，Ｊａｐａｎ）で刈毛した後、電気シェーバー（Ｐａｎａｓｏｎｉｃ，Ｏｓａｋａ，Ｊａｐａｎ）で剃毛処理し、翌日より実験に使用した。コントロール群は５０％エタノールを、Ｒｅｓｖｅｒａｔｒｏｌ群及び、Ｆｉｓｅｔｉｎ群は５０％エタノールに０．１％の濃度で溶解させたものを使用し、マウスの被験部に１週間のうち６日間、それぞれ５０μＬ塗布した。試験開始から４週間後の実験終了時に、頚椎脱臼によりマウスを安楽死させた後、被験部の皮膚を採取した。

９．３．マウスの皮膚におけるＴＥＲＴ発現の検証
マウス皮膚組織からのＲＮＡ抽出は、ＲＮｅａｓｙ　Ｆｉｂｒｏｕｓ　Ｔｉｓｓｕｅ　Ｍｉｎｉ　Ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ，Ｈｉｌｄｅｎ，Ｇｅｒｍａｎｙ）の製品プロトコールに従って行った。
　１．皮膚破砕
　マウスから採取した皮膚サンプルの一部を、約３ｍｍ×３ｍｍの大きさで切り取り、バイオマッシャーＩＩ（Ｎｉｐｐｉ，Ｔｏｋｙｏ，Ｊａｐａｎ）の内側がディンプル加工された１．５ｍＬチューブに入れた。ＫｉｔのＢｕｆｆｅｒ　ＲＬＴ　１ｍＬに対して、あらかじめβ−メルカプトエタノール（Ｗａｋｏ）１０μＬ添加しておいたものを、組織の上に３００μＬ添加し、付属の攪拌棒を回転させて、素早く皮膚組織を破砕した。この際、皮膚組織の塊が肉眼で見えなくなるまでホモジナイゼーションした。

　２．ＲＮＡ抽出
　ホモジナイゼーションした組織溶解液を、室温、１８，０００×ｇで５分間遠心した後、ライセートをペレットが混入しないように、新しい１．５ｍＬチューブに移した。Ｋｉｔに含まれるＲＮａｓｅフリー水５９０μＬ及びＰｒｏｔｅｉｎａｓｅ　Ｋ溶液１０μＬを、ライセートに添加し、ピペッティングにより完全に混合した。その後、５５°Ｃで１０分間インキュベートさせ、室温、１０，０００×ｇで３分間遠心操作した。上清（約９００μＬ）を、新しい１．５ｍＬチューブにピペットで移した。０．５倍容量（今回は約４５０μＬ）の９９％エタノール（Ｗａｋｏ）を清澄化ライセートに添加し、ピペッティングにより混和した。７００μＬのサンプルを、Ｋｉｔの２ｍＬコレクションチューブの中にセットしたＲＮｅａｓｙ　Ｍｉｎｉ　Ｓｐｉｎ　Ｃｏｌｕｍｎにアプライし、室温、８，０００×ｇ以上で１５秒間遠心操作した。回収用チューブに排出されたろ液を棄て、サンプルの残りを用いて同じ操作を繰り返した。３５０μＬのＢｕｆｆｅｒ　ＲＷ１をＲＮｅａｓｙ　Ｓｐｉｎ　Ｃｏｌｕｍｎに添加し、室温、８，０００×ｇ以上で１５秒間遠心操作し、メンブレン洗浄した。

　ＤＮａｓｅ　Ｉ（１，５００　Ｋｎｉｔｚ　ｕｎｉｔｓ）を５５０μＬのＲＮａｓｅフリー水で溶解させたＤＮａｓｅ　Ｉストック溶液１０μＬを７０μＬのＢｕｆｆｅｒ　ＲＤＤに添加した。ＤＮａｓｅ　Ｉは物理的変性に敏感なため、混和はチューブを静かに上下に転倒させて静かにミックスした。チューブの壁に残っている溶液を集めるために、軽く遠心操作を行った。

　１サンプルにつき８０μＬのＤＮａｓｅ　Ｉインキュベーション溶液をＲＮｅａｓｙ　Ｓｐｉｎ　Ｃｏｌｕｍｎメンブレンにピペットで直接アプライし、室温で１５分間インキュベートした。この際、ＤＮａｓｅ分解が不完全になるのを避けるため、ＤＮａｓｅ　Ｉインキュベーション反応液が、スピンカラムの壁につかないように、直接ＲＮｅａｓｙ　Ｓｐｉｎ　Ｃｏｌｕｍｎメンブレンに添加した。１５分後、３５０μＬのＢｕｆｆｅｒ　ＲＷ１をＲＮｅａｓｙ　Ｓｐｉｎ　Ｃｏｌｕｍｎに添加し、室温、８，０００×ｇ以上で１５秒間遠心した。次に、４×Ｂｕｆｆｅｒ　ＲＰＥを９９％エタノール（Ｗａｋｏ）で１×Ｂｕｆｆｅｒ　ＲＰＥにしたものを５００μＬずつＲＮｅａｓｙ　Ｓｐｉｎ　Ｃｏｌｕｍｎに添加。室温、８，０００×ｇ以上で１５秒間遠心操作することでメンブレンを洗浄した。更に、ＲＮＡ溶出中にエタノールがキャリーオーバーしないように、もう一度、５００μＬの１×Ｂｕｆｆｅｒ　ＲＰＥをＲＮｅａｓｙ　Ｓｐｉｎ　Ｃｏｌｕｍｎに添加し、室温、８，０００×ｇ以上で２分間遠心操作することでスピンカラム及びメンブレンを洗浄した。遠心操作後、ＲＮｅａｓｙ　Ｓｐｉｎ　Ｃｏｌｕｍｎがろ液と接触しないように、注意深くカラムをコレクションチューブから取り除きＲＮｅａｓｙ　Ｓｐｉｎ　Ｃｏｌｕｍｎを新しい２ｍＬコレクションチューブに移し、最高スピードで１分間遠心操作を行なった。その後ＲＮｅａｓｙ　Ｓｐｉｎ　Ｃｏｌｕｍｎを新しい１．５ｍｌコレクションチューブ（添付）にセットし、５０μＬのＲＮａｓｅフリー水をＲＮｅａｓｙ　Ｓｐｉｎ　Ｃｏｌｕｍｎメンブレンに直接添加した。蓋を閉め、室温、８，０００×ｇ以上で１分間遠心操作を行い、この操作による溶出液をＲＮＡ溶液とした。溶液中のＲＮＡ濃度は、ＮａｎｏＤｒｏｐ　２０００／２０００ｃ分光光度計で、２６０ｎｍでの吸光値を元に算出し、定量リアルタイムＰＣＲの実験に使用した。尚、ｃＤＮＡ合成及び、定量リアルタイムＰＣＲ法の方法については、前述の通りである。

９．４．パラフィン包埋切片の作製
パラフィン包埋切片の作製及びＨＥ染色は常法により行った。

免疫染色
　１．脱パラフィン及び親水
　パラフィン包埋切片を貼り付けたスライドガラスを、染色用バスケットに入れ、計３回、５分間おきに新しい染色バットに入れたキシレンへの浸漬を行った。次に、計２回、５分間おきに新しい染色バットに入れた９９％エタノールへの浸漬を行った。更に、９０％エタノール、８０％エタノール、７０％エタノールにそれぞれ５分間ずつ浸漬した。スライドガラスを新しい染色バットに移動させる際、キャリーオーバーがなるべく少なくように、余分な液をよくきってから新しい液に移した。その後、０．１％Ｔｗｅｅｎ　２０／ＴＢＳに５分間浸して洗浄した。以下に０．１％ＴＢＳ−Ｔの組成を示した。

・１０×ＴＢＳ（総量５００ｍＬ）
１２．１ｇ　Ｔｒｉｓ
４０ｇ　ＮａＣｌ
１２Ｎ　ＨＣｌでｐＨ７．６に調製
・０．１％Ｔｗｅｅｎ　２０／ＴＢＳ
１０×ＴＢＳを超純水で１×ＴＢＳにし、Ｔｗｅｅｎ−２０を０．５ｍｌ／５００ｍｌ添加

　２．抗原賦活化処理（湯浴法）
　抗原賦活液１０×ＨｉｓｔｏＶＴ　Ｏｎｅ（ＮＡＣＡＬＡＩ　ＴＥＳＱＵＥ）をイオン交換水で１×ＨｉｓｔｏＶＴ　Ｏｎｅに希釈し、ポリプロピレン製の染色バットに入れ、９０°Ｃに設定したポットの中であらかじめ温めておいた。この中に脱パラフィン及び親水させた検体をスライドガラスのまま入れ、２０分間賦活化を行った。２０分後、スライドガラスを取り出し、組織が乾かないように注意しながら、スライドガラスが室温に下がるまで待ち、３分間おきに新しい０．１％Ｔｗｅｅｎ　２０／ＴＢＳで３回洗浄を行った。

　３．ブロッキング
　洗浄後、キムワイプ等で、スライドガラス上の検体周辺の余分な液体をふき取り、スーパーパップペン　リキッドブロッカー（Ｄａｉｄｏ　Ｓａｎｇｙｏ，Ｊａｐａｎ）で検体を囲み、撥水性サークルを作った。次に、ブロッキングバッファー、Ｂｏｌｃｋｉｎｇ　Ｏｎｅ　Ｈｉｓｔｏ（ＮＡＣＡＬＡＩ　ＴＥＳＱＵＥ）または、５％　Ｎｏｒｍａｌ　Ｇｏａｔ　Ｓｅｒｕｍ（Ｗａｋｏ）／０．１％Ｔｗｅｅｎ　２０／ＴＢＳを検体に直接かからないように注意しながら、撥水性サークルの中に１滴（約１００μＬ）落とし、湿潤箱（ＡＳ　ＯＮＥ）の中で、１時間室温でインキュベートし、ブロッキングした。ブロッキング後、０．１％Ｔｗｅｅｎ　２０／ＴＢＳで５分間洗浄した。

　４．一次抗体反応
　ブロッキングバッファー（Ｂｌｏｃｋｉｎｇ　Ｏｎｅ　Ｈｉｓｔｏまたは、５％　Ｎｏｒｍａｌ　Ｇｏａｔ　Ｓｅｒｕｍ（Ｗａｋｏ）／０．１％Ｔｗｅｅｎ　２０／ＴＢＳ）で、一次抗体を希釈し、検体に直接かからないように注意しながら、撥水性サークルの中に約１００μＬ落とし、湿潤箱（ＡＳ　ＯＮＥ）の中で、４℃、一晩インキュベートした。一次抗体反応後、５分間おきに新しい０．１％Ｔｗｅｅｎ　２０／ＴＢＳでスライドガラスごと３回洗浄を行った。一次抗体の希釈率は以下に示した。

＜一次抗体希釈率＞
・Ｋｉ−６７（＃１２２０２，Ｃｅｌｌ　Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ　Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）　　　　１／４００
・ＴＥＲＴ（ＮＢ１００−３１７，Ｎｏｖｕｓ　Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌｓ，Ｌｉｔｔｌｅｔｏｎ，ＣＯ，ＵＳＡ）　　　　　１／５０

　５．二次抗体反応
　ブロッキングバッファー（Ｂｌｏｃｋｉｎｇ　Ｏｎｅ　Ｈｉｓｔｏまたは、５％　Ｎｏｒｍａｌ　Ｇｏａｔ　Ｓｅｒｕｍ（Ｗａｋｏ）／０．１％Ｔｗｅｅｎ　２０／ＴＢＳ）で、二次抗体を希釈し、検体に直接かからないように注意しながら、撥水性サークルの中に約１００μＬ落とし、遮光にした湿潤箱（ＡＳ　ＯＮＥ）の中で、室温、１．５時間~２時間インキュベートし、二次抗体を反応させた。二次抗体の希釈率は以下に示した。

＜二次抗体希釈率＞
・ＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ　５５５　ａｎｔｉ−ｒａｂｂｉｔ　ＩｇＧ（Ｔｈｅｒｍｏ　Ｆｉｓｈｅｒ　Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）　　　１／１００
・ＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ　４８８　ａｎｔｉ−ｍｏｕｓｅ　ＩｇＧ（Ｊａｃｋｓｏｎ　Ｉｍｍｕｎｏ　Ｒｅｓｅａｒｃｈ，Ｗｅｓｔ　Ｇｒｏｖｅ，ＰＡ，ＵＳＡ）　　１／１００

　６．封入
　余分な二次抗体を０．１％Ｔｗｅｅｎ　２０／ＴＢＳで５分間おきに新しい０．１％Ｔｗｅｅｎ　２０／ＴＢＳで３回洗浄を行った。次に、ＤＡＰＩ入りの蛍光染色用封入剤ＶＥＣＴＡＳＨＩＥＬＤ　Ｍｏｕｎｔｉｎｇ　Ｍｅｄｉｕｍ（ＶＥＣＴＯＲ　ＬＡＢＯＲＡＴＯＲＩＥＳ，Ｂｕｒｌｉｎｇａｍｅ，ＣＡ，ＵＳＡ）を標本組織の左端の方１滴落とし、カバーガラス（２４ｍｍ×３６ｍｍ）を左端からゆっくりと倒し、気泡が入らないようにしながら封入した。封入後、スライドガラスはマッペの上で乾燥させた。

　７．検出
　蛍光顕微鏡（ＩＸ５０，ＯＬＹＭＰＵＳ，Ｔｏｋｙｏ，Ｊａｐａｎ）で組織と核を観察することで、皮膚全体の厚さ（表皮、真皮、皮下組織を含んだ厚さ）を観察した。また、共焦点レーザー走査型顕微鏡（ＦＶ１０００，ＯＬＹＭＰＵＳ）で二次抗体の蛍光を観察することで、各タンパク質の局在と発現量を観察した。

１０．レトロウイルス発現系を用いた遺伝子導入
１０．１．２９３Ｔ細胞への遺伝子導入
　２９３Ｔ細胞を５ｍＬディッシュに３０~４０％コンフルエントになるように播種し、１０％ＦＢＳ含有ＤＭＥＭ培地で培養した。２４時間後、トランスフェクション試薬であるＨｉｌｙｍａｘ　４０μＬ、Ｇａｇ−ｐｏｌプラスミド１．５μｇ、ＶＳＶＧプラスミド１．５μｇ、目的遺伝子を２．０μｇを３００μＬのＤＭＥＭ培地に添加し、１５分間室温でインキュベートした。その後、全量をそれぞれ２９３Ｔ細胞へ添加し３７℃、５％ＣＯ_２条件下で６時間後培養した。６時間後、１０％ＦＢＳ含有ＤＭＥＭで培地交換した。また、翌日のインフェクション用にターゲットとなるＨａＣａＴ細胞を１０ｍＬディッシュ（Ｇｒｅｉｎｅｒ　ｂｉｏ−ｏｎｅ）に３０~４０％コンフルエントとなるように播種し、３７℃、５％ＣＯ_２存在下で一晩培養した。

１０．２．ＨａＣａＴ細胞へのウイルス感染
　２９３Ｔ細胞への遺伝子導入から２４時間後に、上清５ｍＬを０．４５μｍ×３３ｍｍフィルター（Ｍｅｒｃｋ）により滅菌処理して１５ｍＬ遠心管に回収し、１０ｍｇ／ｍｌポリブレン４．０μＬ（Ｍｅｒｃｋ）を添加してウイルス溶液とした。次回のウイルス溶液作製のために２９３Ｔ細胞に１０％ＦＢＳ含有ＤＭＥＭ培地を５ｍＬ加えた。回収したウイルス溶液は培地を除いたＨａＣａＴ細胞へ添加した。この感染作業を、午前と午後３日間、計６回行った。

１０．３．薬剤選択
　６回目のウイルス感染作業から２４時間後ウイルスを感染させた細胞５．０×１０^５ｃｅｌｌｓを１０ｍＬディッシュに播種した。その際、コントロールとして無処理のＨａＣａＴ細胞を同じ密度で播種した。ここにＰｕｒｏｍｙｃｉｎ（ＳＩＧＭＡ−Ａｌｄｒｉｃｈ）を２．０μｇ／ｍＬで培地に添加した。コントロールの無処理ＨａＣａＴ細胞が全滅したのを確認した後に、Ｐｕｒｏｍｙｃｉｎ濃度を０．５μｇ／ｍＬに下げて継代培養を続け、実験に用いた。
［実施例１］
　ｈＴＥＲＴ活性化食品成分の探索

１．１．ＨａＣａＴ（ｈＴＥＲＴｐ−ＥＧＦＰ）の樹立
　ｈＴＥＲＴｐ−ＥＧＦＰベクターがＨａＣａＴ細胞に遺伝子導入され、安定発現株が樹立できているか、フローサイトメーターを用いてＧＦＰの蛍光強度を測定することで確認した。測定した全細胞集団に対して、細胞の大きさを示す前方拡散ＦＳ（Ｆｏｒｗａｒｄ　Ｓｃａｔｔｅｒ）の値が大きく、かつ細胞内の複雑さを示す側方拡散ＳＳ（Ｓｉｄｅ　Ｓｃａｔｔｅｒ）の値が小さい細胞集団を生細胞とみなし、この細胞の部分集団について解析ソフトのＦｌｏｗＪｏ（Ｔｒｅｅ　Ｓｔａｒ，Ａｓｈｌａｎｄ　ＯＲ，ＵＳＡ）を利用してＧＦＰの蛍光強度をヒストグラム化した。その結果、コントロールのＨａＣａＴ細胞と比較してＨａＣａＴ（ｈＴＥＲＴｐ−ＥＧＦＰ）細胞のＧＦＰ蛍光のピークが、僅かながら高強度側にあることを確認した（図１）。

　ＨａＣａＴ（ｈＴＥＲＴｐ−ＥＧＦＰ）細胞の安定発現株の樹立を、定量ＲＴ−ＰＣＲ法においても確認した（図２）。その結果、コントロールのＨａＣａＴ細胞と比較して、ＨａＣａＴ（ｈＴＥＲＴｐ−ＥＧＦＰ）細胞においてＥＧＦＰの発現が増強していることが明らかとなり、ｈＴＥＲＴｐ−ＥＧＦＰが導入されていることが確認された。

１．２．ＩＮ　Ｃｅｌｌ　Ａｎａｌｙｚｅｒ　１０００を用いたｈＴＥＲＴプロモーター増強食品の探索
　ｈＴＥＲＴｐ−ＥＧＦＰを組み込んだＨａＣａＴ細胞を用い、様々な食品成分を添加した際のｈＴＥＲＴプロモーター活性をＥＧＦＰの蛍光強度により評価した。ポリフェノールサンプルは終濃度１０μＭとなるように添加し、４８時間後にＩＮ　Ｃｅｌｌ　Ａｎａｌｙｚｅｒ　１０００を用いてＥＧＦＰ蛍光強度を測定した。本実施例においては、３回の測定においてコントロールサンプル添加よりも有意に高いＥＧＦＰ蛍光強度を示した食品成分を選択した。

　その結果、ポリフェノールサンプルにおいては、Ｒｅｓｖｅｒａｔｒｏｌ（赤ブドウ由来ポリフェノール）、Ｅｕｇｅｎｉｉｎ（バラ由来ポリフェノール）、Ｕｒｏｌｉｔｈｉｎ　Ａ（ザクロプリフェノールの腸内細菌代謝産物）、Ｆｉｓｅｔｉｎ（イチゴ由来ポリフェノール）、Ｓｅｓａｍｏｌ（ゴマ由来ポリフェノール）の５種類において、コントロールよりも有意に高いｈＴＥＲＴプロモーター活性を示した（図３）。
　以上のｈＴＥＲＴｐ−ＥＧＦＰを導入したＨａＣａＴ細胞を用いた一次スクリーニングの結果より、ｈＴＥＲＴプロモーター活性化食品として５種類の食品成分を選定した。

１．３．定量ＲＴ−ＰＣＲによる内在性ｈＴＥＲＴ遺伝子発現量の評価
　１．２．項よりＨａＣａＴ（ｈＴＥＲＴｐ−ＥＧＦＰ）細胞を用いたｈＴＥＲＴプロモーター活性化成分の探索の結果から選定した５種類の食品成分について、ＨａＣａＴ細胞における内在性ｈＴＥＲＴ遺伝子発現に対する効果を定量ＲＴ−ＰＣＲにより評価した。ポリフェノールサンプルは終濃度１０μＭとなるように添加し、４８時間後にＲＮＡ回収、ｃＤＮＡ合成を行い、定量ＲＴ−ＰＣＲにより評価した。本実施例においては、コントロールサンプル添加よりも有意に高いｈＴＥＲＴ遺伝子の発現量を示した食品成分を選定した。

　その結果、ポリフェノールにおいては、Ｒｅｓｖｅｒａｔｒｏｌ（赤ブドウ由来ポリフェノール）、Ｕｒｏｌｉｔｈｉｎ　Ａ（ザクロプリフェノールの腸内細菌代謝産物）、Ｆｉｓｅｔｉｎ（イチゴ由来ポリフェノール）、Ｓｅｓａｍｏｌ（ゴマ由来ポリフェノール）の４種類において、コントロールよりも有意に高いｈＴＥＲＴ遺伝子の発現を示した（図４）。

　上記１．２．項の結果及び、本結果をふまえて、ｈＴＥＲＴプロモーターを活性化する食品成分として４種類を選定した。以降は、この４種類のポリフェノールサンプルに関して、その機能性と分子基盤の解明を目的として解析を進めた。
［実施例２］
　ＴＥＲＴ増強食品成分の機能性

２．１．細胞増殖に対する効果の検証
　発毛とは、上皮系細胞と間葉系細胞との相互作用により、毛を生じる現象である。すなわち、毛の発生や成長には表皮成分と真皮成分の細胞増殖が必要不可欠である（Ｈａｃｈｉｙａ　Ａ　ｅｔ　ａｌ．，２００９，Ｏｌｉｖｅｒ，Ｒ．Ｆ．．ｅｔ　ａｌ．，１９８８）。
　そこで本項では、実施例１の結果より選定した４種類の食品成分の、上皮細胞のモデル細胞であるＨａＣａＴ細胞の細胞増殖に与える影響を評価した。細胞数を測定する試薬としては、Ｃｅｌｌ　Ｃｏｕｎｔ　Ｋｉｔ−８溶液（ＤＯＪＩＮＤＯ）を採用した。

　ＨａＣａＴ細胞を１．０×１０^４で播種してから６時間後に、選定した４種類のポリフェノールサンプルを終濃度５．０μＭとなるように添加した。３７℃、５％　ＣＯ_２存在下で２４時間培養ごとに、Ｃｅｌｌ　Ｃｏｕｎｔ　Ｋｉｔ−８溶液によって生成される、細胞数と直線的な比例関係にあるホルマザンの色素量を、４５０ｎｍの吸光度で測定し評価した。この操作を４日間続けた（図５−（Ａ））。その結果、細胞数が最大となる培養開始３日目において、４種類のポリフェノールサンプルのうち、Ｒｅｓｖｅｒａｔｒｏｌ、Ｆｉｓｅｔｉｎ、Ｓｅｓａｍｏｌの３種類において、Ｃｏｎｔｒｏｌと比べて有為に細胞増殖を増強していることが明らかとなった（図５−（Ｂ））。

２．２．毛包細胞活性化因子に対する効果の検証
　上記２．１．項に示した通り、毛髪の成長には、上皮細胞の活性化も重要である。そこで本項では、上皮細胞の活性化遺伝子の発現量を定量ＲＴ−ＰＣＲを用いて評価した。上皮細胞の活性化因子とは、上皮細胞の活性化に関与する成長因子であり、本項においては、上皮細胞を活性化する働きがあるＩＧＦ−１（Ｉｎｓｕｌｉｎ−ｌｉｋｅ　ｇｒｏｗｔｈ　ｆａｃｔｏｒ（インスリン様成長因子））及びＫＧＦ（Ｋｅｒａｔｉｎｏｃｙｔｅ　Ｇｒｏｗｔｈ　Ｆａｃｔｏｒ（角化細胞増殖因子））、さらに退行期誘導因子として、細胞の活動を抑制する因子であるＴＧＦ−β１（Ｔｒａｎｓｆｏｒｍｉｎｇ　ｇｒｏｗｔｈ　ｆａｃｔｏｒ（トランスフォーミング増殖因子））の３種の遺伝子の発現量の変化を検証した。

　ＨａＣａＴ細胞における内在性の各種成長因子の遺伝子の発現量を定量ＲＴ−ＰＣＲにより評価した。ポリフェノールは終濃度１０μＭとなるように添加し、４８時間後にＲＮＡ回収、ｃＤＮＡ合成を行い、定量ＲＴ−ＰＣＲによって評価した。
　その結果、コントロールと比較して、Ｒｅｓｖｅｒａｔｒｏｌ、Ｆｉｓｅｔｉｎ、Ｓｅｓａｍｏｌの３種類においてＩＧＦ−１（図６）、ＫＧＦ（図７）の有為な発現増強を、ＴＧＦ−β（図８）の有為な発現減少を確認することが出来た。一方、ＵｒｏｌｉｔｈｉｎではＫＧＦにおいて有為な発現増強を確認することが出来なかった。

　上記２．１．項の結果及び、本結果をふまえて、上皮細胞のモデルＨａＣａＴ細胞における細胞増殖に与える影響の高いポリフェノール成分Ｒｅｓｖｅｒａｔｒｏｌ、Ｆｉｓｅｔｉｎ、Ｓｅｓａｍｏｌの３種類を選定した。以降は、この３種類のポリフェノールサンプルに関して、その機能性と分子基盤の解明を目的とし解析を進めた。

２．３．Ｗｎｔ／β−ｃａｔｅｎｉｎ経路の活性化
　β−カテニンは毛周期及び、Ｗｎｔシグナル経路に関わるの転写因子であり、このＷｎｔ／β−カテニンシグナルは毛髪の成長や毛周期を促進することが報告されており（Ｎａｒｈｉ　ｅｔ　ａｌ．，２００８）、マウスの皮膚においてもＷｎｔ／β−カテニンシグナルを活性化することで毛の成長を促すことが報告されている（Ｊｉｎｋｕｋ　ｅｔ　ａｌ．，２００８）。また、このβ−カテニンがＴＥＲＴプロモーターに結合すると、ＴＥＲＴの発現を制御することも報告されている（Ｒｏｌｆ　ｅｔ　ａｌ．，２０１２）。そこで、選定しているｈＴＥＲＴを活性化する３種類のポリフェノールが、ＨａＣａＴ細胞におけるβ−カテニン活性に与える効果を検証した。

　β−カテニンは核内でＴＣＦ／ＬＥＦ転写因子（Ｔ−Ｃｅｌｌ　Ｆａｃｔｏｒ／Ｌｙｍｐｈｏｉｄ−Ｅｎｈａｎｃｅｒ　Ｆａｃｔｏｒ）を介してＷｎｔ標的遺伝子の発現を制御するため、まずβ−カテニン結合サイトを有するリポーターベクターを用いたルシフェラーゼアッセイにより、β−カテニン活性を検証した（図９）。細胞を播種した翌日、リポータープラスミド（Ｍ５０　Ｓｕｐｅｒ　８ｘ　ＴＯＰ　Ｆｌａｓｈ）をトランスフェクションし、３時間後１０％　ＦＢＳ含有ＤＭＥＭ培地に交換後、ポリフェノールを終濃度１０μＭで添加し、４８時間後ルシフェラーゼアッセイを行った。その結果、Ｒｅｓｖｅｒａｔｒｏｌ、Ｆｉｓｅｔｉｎ、Ｓｅｓａｍｏｌの３種のポリフェノールがβ−カテニン依存的転写活性を活性化することが分かった。

　次に、同条件においてβ−カテニンタンパク質に対する効果をウエスタンブロッティング法により検証した（図１０−（Ａ））。その結果、ＨａＣａＴ細胞において、Ｒｅｓｖｅｒａｔｒｏｌ、Ｆｉｓｅｔｉｎの２種のポリフェノールが、β−カテニンタンパク質量を有意に増加させることが明らかとなった（図１０−（Ｂ））。
　以上より、Ｒｅｓｖｅｒａｔｒｏｌ、Ｆｉｓｅｔｉｎの２種のポリフェノールは、毛髪合成や成長促進に関わる成長因子の発現制御、あるいは、毛周期や毛髪の成長を促進するＷｎｔ／β−カテニンシグナルの活性化を通じて、発毛効果を有する可能性があると考えられた。
［実施例３］
　ｈＴＥＲＴをノックダウンしたＨａＣａＴ細胞（ＨａＣａＴ（ｓｈ−ｈＴＥＲＴ））における表現型解析

３．１．ＨａＣａＴ（ｓｈ−ｈＴＥＲＴ）を用いたｈＴＥＲＴ増強食品の特異性検証
実施例１及び実施例２で評価したポリフェノール、Ｒｅｓｖｅｒａｔｒｏｌ及びＦｉｓｅｔｉｎによるｈＴＥＲＴ増強効果が、ｈＴＥＲＴ依存であることを検証するために、ｈＴＥＲＴをノックダウンしたＨａＣａＴ細胞を作製した。

　まず、ＨａＣａＴ細胞において、ｈＴＥＲＴをノックダウンした２種類のＨａＣａＴ細胞（（ＨａＣａＴ（ｓｈ−ｈＴＥＲＴ−１）、ＨａＣａＴ（ｓｈ−ｈＴＥＲＴ−２））を作製した。この２種類の細胞におけるｈＴＥＲＴ発現を定量ＲＴ−ＰＣＲによって評価した（図１１）。その結果、２種類のＨａＣａＴ（ｓｈ−ｈＴＥＲＴ）においてｈＴＥＲＴがノックダウンできていることを確認した。

　次に、この２種類のＨａＣａＴ（ｓｈ−ｈＴＥＲＴ）にポリフェノールを終濃度１０μＭとなるように添加し、３７℃、５％　ＣＯ_２存在下で４８時間培養後にＲＮＡ回収、ｃＤＮＡ合成を行い、定量ＲＴ−ＰＣＲによって評価した（図１２、図１３）。Ｃｏｎｔｒｏｌとしてはスクランブル配列を有するノックダウンベクター（ｓｃｒ−ｓｈＲＮＡ）を導入した。その結果、ｓｃｒ−ｓｈＲＮＡを導入したＨａＣａＴ（ｓｃｒ）細胞では、ＲｅｓｖｅｒａｔｒｏｌとＦｉｓｅｔｉｎのサンプル処理によって、ｈＴＥＲＴ発現が有意に増加したのに対し、ＨａＣａＴ（ｓｈ−ｈＴＥＲＴ）では、有意なＴＥＲＴ発現を確認することができなかった。つまり、Ｒｅｓｖｅｒａｔｒｏｌ及びＦｉｓｅｔｉｎは、ｈＴＥＲＴ依存的にｈＴＥＲＴの発現を増強していることが明らかになった。

３．２．ＨａＣａＴ（ｓｈ−ｈＴＥＲＴ）を用いたポリフェノールの細胞増殖増強に対するｈＴＥＲＴの寄与の検証
　実施例２で見いだした、Ｒｅｓｖｅｒａｔｒｏｌ及びＦｉｓｅｔｉｎによる細胞増殖促進効果が、ｈＴＥＲＴ依存であることを検証するために、ＨａＣａＴ（ｓｈ−ｈＴＥＲＴ）を用い、その効果を検証した。細胞数の測定は実施例２、２．１項と同様に４日間連続で行った。

　その結果、ＨａＣａＴ（ｓｃｒ−ｓｈＲＮＡ）（図１４−（Ａ））では、細胞数が最大となる培養開始３日目（図１４−（Ｂ））において、２種類のポリフェノールにおいて、Ｃｏｎｔｒｏｌと比べて有為な細胞増殖増強効果を確認できたのに対して、ＨａＣａＴ（ｓｈ−ｈＴＥＲＴ−１）（図１５−（Ａ））では、細胞数が最大となる培養開始３日目（図１５−（Ｂ））において、２種類のポリフェノールサンプルの両方において、Ｃｏｎｔｒｏｌと比べて有為な細胞増殖に与える影響を確認することが出来なかった。更に、ＨａＣａＴ（ｓｈ−ｈＴＥＲＴ−２）での結果（図１６−（Ａ）、図１６−（Ｂ））でも同様の結果となった。
　以上より、Ｒｅｓｖｅｒａｔｒｏｌ及びＦｉｓｅｔｉｎは、ｈＴＥＲＴ依存的に細胞の増殖を増殖することが明らかとなった。
［実施例４］
　ｈＴＥＲＴ活性化食品成分のＳＩＲＴ１依存性検証

４．１．ｈＴＥＲＴ活性化食品成分のＳＩＲＴ１増強効果
　ｈＴＥＲＴ転写制御の上流に位置することが報告されているＳＩＲＴ１（Ｙａｍａｓｈｉｔａ　Ｓ　ｅｔ　ａｌ．，２０１１、Ｓｈｕｎｔａｒｏ　Ｙ　ｅｔ　ａｌ．，２０１４）に着目し、ＨａＣａＴ細胞において内在性のｈＴＥＲＴ遺伝子を増強するポリフェノール２種類において、ＨａＣａＴ細胞の内在性ＳＩＲＴ１遺伝子発現に対する効果を定量ＲＴ−ＰＣＲにより評価した。ポリフェノールを終濃度１０μＭとなるように添加し、４８時間後にＲＮＡ回収、ｃＤＮＡ合成を行い、定量ＲＴ−ＰＣＲによって評価した。その結果、Ｒｅｓｖｅｒａｔｒｏｌ、Ｆｉｓｅｔｉｎの双方とも、ＳＩＲＴ１遺伝子の発現量がコントロールよりも有意に高いことが明らかとなった（図１７）。

４．２．ＨａＣａＴ（ｓｈ−ＳＩＲＴ１）を用いたｈＴＥＲＴ増強食品のＳＩＲＴ１依存性検証
　ポリフェノールによるｈＴＥＲＴの活性化が、ｈＴＥＲＴの上流に位置することが報告されているＳＩＲＴ１を介しているかどうか検証を行った。
　まず、ＳＩＲＴ１をノックダウンしたＨａＣａＴ（ｓｈ−ＳＩＲＴ１）細胞を作製した。Ｃｏｎｔｒｏｌとして、スクランブル配列を有するノックダウンベクター（ｓｃｒ−ｓｈＲＮＡ）を導入したＨａＣａＴ（ｓｃｒ−ｓｈＲＮＡ）細胞を作製した。ＨａＣａＴ（ｓｈ−ＳＩＲＴ１）細胞において、ＳＩＲＴ１のノックダウンは、定量ＲＴ−ＰＣＲによって評価した（図１８）。

　次に、ＨａＣａＴ（ｓｃｒ−ｓｈＲＮＡ）細胞及びＨａＣａＴ（ｓｈ−ＳＩＲＴ１）細胞に、ＲｅｓｖｅｒａｔｒｏｌおよびＦｉｓｅｔｉｎを終濃度１０μＭとなるように添加し、３７℃、５％　ＣＯ_２存在下で４８時間培養後、ＲＮＡを回収し、ｃＤＮＡ合成後、ＳＩＲＴ１及びｈＴＥＲＴの発現量に及ぼす影響を定量ＲＴ−ＰＣＲにより評価した。
　その結果、ＨａＣａＴ（ｓｃｒ−ｓｈＲＮＡ）細胞においては、ＲｅｓｖｅｒａｔｒｏｌとＦｉｓｅｔｉｎの処理によって、ＳＩＲＴ１発現が有意に増加したのに対し、ＨａＣａＴ（ｓｈ−ＳＩＲＴ１）細胞では、有意なＳＩＲＴ１発現を確認することができなかった（図１９）。

　一方、ＨａＣａＴ（ｓｃｒ−ｓｈＲＮＡ）細胞において、ＲｅｓｖｅｒａｔｒｏｌとＦｉｓｅｔｉｎ処理によって発現が有意に増加したｈＴＥＲＴは、ＨａＣａＴ（ｓｈ−ＳＩＲＴ１）細胞においてはＲｅｓｖｅｒａｔｒｏｌ処理でその発現がキャンセルされたものの、Ｆｉｓｅｔｉｎ処理ではその発現増強を解除することができなかった（図２０）。また、ＨａＣａＴ（ｓｈ−ＳＩＲＴ１）細胞のコントロールサンプル処理におけるｈＴＥＲＴ発現は、ＨａＣａＴ（ｓｃｒ−ｓｈＲＮＡ）細胞でのコントロールサンプル処理における発現と変化はなかった。
　以上の結果より、ＦｉｓｅｔｉｎによるｈＴＥＲＴの増強には、ＳＩＲＴ１は関与していないことが明らかとなった。
［実施例５］
　ＴＥＲＴ１活性化食品成分の育毛効果

５．１．マウス塗布試験
　実施例４までに同定しているｈＴＥＲＴ活性化ポリフェノールであるＲｅｓｖｅｒａｔｒｏｌ及びＦｉｓｅｔｉｎの発毛に対する効果をマウスを用いて検証した。
　皮膚は毛周期に伴い、その機能や性質が大きく変化するため、一般に発毛に関する動物実験においては、毛周期をコントロールすることが重要であるとされている。そこで、均一な毛周期を得るために、除毛ワックスや電気シェーバーなどを用いてｔｅｌｏｇｅｎ期の一定範囲の毛を同時に脱毛し、刺激を加えることで均一なａｎａｇｅｎ期を誘導する手法が古くから知られており（Ｃｈａｓｅ，ｅｔ　ａｌ．，１９５４）、特にＣ５７ＢＬ／６マウスで良く用いられている。Ｃ５７ＢＬ／６マウスは皮膚の色が黒っぽい色の場合はａｎａｇｅｎ期であること、そして、ピンク色の場合はｔｅｌｏｇｅｎ期であることを容易に肉眼で判断できるからである（Ｍｕｌｌｅｒ−Ｒｏｖｅｒ，ｅｔ　ａｌ．，２００１）。

　一般にマウスでは、生後７週間で起こる最初の２サイクルの毛周期は、均一に同調して起こるが、成熟するにつれて毛周期のパターンが複雑になり、均一に同調しなくなるため（Ｍｕｌｌｅｒ−Ｒｏｖｅｒ，ｅｔ　ａｌ．，２００１、Ｌｉｎ，ｅｔ　ａｌ．，２００４、Ｐｌｉｋｕｓ　ａｎｄ　Ｃｈｕｏｎｇ，ｅｔ　ａｌ．，２００８）、成熟したマウスで均一に同調した毛周期を得るのは困難である。そのため、発毛に関する動物実験は幼若期に実施されることが多い。

　本実施例では、毛周期に対する影響のない電気バリカンによる除毛後に、さらに電気シェーバーによる除毛処理を行い、ｔｅｌｏｇｅｎ期にある毛周期をａｎａｇｅｎ期に誘導した。そして、除毛後の皮膚状態が目視でピンク色であることを確認し、毛周期が休止期にあるマウスを使用した。試験溶液には、５０％エタノールで希釈して作製した０．１％　Ｒｅｓｖｅｒａｔｒｏｌ溶液、及び０．１％　Ｆｉｓｅｔｉｎ溶液を用いた。コントロール溶液として試験溶液の溶媒である５０％エタノールを使用した。

　試験開始前日に背部を除毛したマウスの試験被部に１週間の内６日間、試験溶液を５０μＬずつ塗布して飼育し、試験被部の毛が成長する様子を約５週間観察した（図２１）。その結果、Ｃｏｎｔｒｏｌ群（１／９匹で発毛）と比較してＲｅｓｖｅｒａｔｒｏｌ群（４／９匹で発毛）で、さらにＲｅｓｖｅｒａｔｒｏｌ群に比べてＦｉｓｅｔｉｎ群（９／１０匹で発毛）で、発毛効果を確認することができた。

５．２．マウスの皮膚におけるｍＴＥＲＴ発現の検証
　塗布試験が終了したマウスを頚椎脱臼により安楽死させた後、マウス背部の被検部を採取し、ＲＮｅａｓｙ　Ｆｉｂｒｏｕｓ　Ｔｉｓｓｕｅ　Ｍｉｎｉ　Ｋｉｔを使用してＲＮＡを抽出後、ｃＤＮＡを合成し、定量ＲＴ−ＰＣＲ法でマウスの皮膚におけるｍＴＥＲＴの発現量を検証した。その結果、Ｒｅｓｖｅｒａｔｒｏｌ群（図２２）及びＦｉｓｅｔｉｎ群（図２３）の両群においてコントロールよりも高いｍＴＥＲＴ遺伝子の発現量を示した。

５．３．Ｈ＆Ｅ染色
　毛周期の推移は、毛包の深さに伴う皮膚の厚みの変化と良く対応している（Ｍｕｌｌｅｒ−Ｒｏｖｅｒ　ｅｔ　ａｌ．，２００１）。つまり、毛包の深さはａｎａｇｅｎには深く、ｃａｔａｇｅｎに向かって浅くなりｔｅｌｏｇｅｎの間は浅いため、皮膚の厚みもａｎａｇｅｎでは厚く、ｔｅｌｏｇｅｎでは薄くなる。また、毛包の組織形態から、毛周期のどのステージにあるか判断することもできる（Ｍｕｌｌｅｒ−Ｒｏｖｅｒ　ｅｔ　ａｌ．，２００１。

　本実施例では、塗布試験が終了したマウスを頚椎脱臼により安楽死させた後、マウス背部の被検部を採取し、１０％中性緩衝ホルマリンで固定し、体軸に平行な５μｍのパラフィン切片を作製し、ヘマトキシリン・エオジン染色（Ｈ＆Ｅ染色）を行い（図２４）、組織学的検査に供することで、マウスの皮膚において毛周期のどの段階にあるか判断を行うと共に、表皮、真皮、皮下組織を含む皮膚全体の厚さを測定し、皮膚の厚みを測定した（図２５）。

　その結果、Ｃｏｎｔｒｏｌ群では多くのマウスがｔｅｌｏｇｅｎ期のままであったのに対し、Ｒｅｓｖｅｒａｔｒｏｌ群では、約半数のマウスがａｎａｇｅｎ期に突入しており、Ｆｉｓｅｔｉｎ群ではほぼ全てのマウスがａｎａｇｅｎ期であった。さらに、皮膚の厚みを計測した結果、Ｃｏｎｔｒｏｌ群のマウスの皮膚に比べ、Ｒｅｓｖｅｒａｔｒｏｌ群及びＦｉｓｅｔｉｎ群のマウスの皮膚の厚みが有意に増していたことが明らかとなった。

５．４．免疫染色（蛍光抗体法）
　塗布試験が終了したマウスを頚椎脱臼により安楽死させた後、マウス背部の被検部を採取し、１０％中性緩衝ホルマリンで固定し、体軸に平行な５μｍのパラフィン切片を作製し、免疫染色を行った。一次抗体としては、増殖性細胞の核小体及び核分裂期の染色体上に発現する増殖細胞マーカーであるＫｉ−６７とＴＥＲＴを使用した。

　その結果、Ｃｏｎｔｒｏｌ群ではほぼすべてのマウスの皮膚においてＫｉ−６７陰性であり、全てのマウスの皮膚においてＴＥＲＴ陽性細胞を確認することができなかった（図２６−（Ａ））。一方、Ｒｅｓｖｅｒａｔｒｏｌ群では、約半数のマウスの皮膚の毛球部を構成する毛母細胞においてＫｉ−６７陽性細胞を確認することができ、一部のマウスの皮膚においてＴＥＲＴ陽性細胞を確認することができた（図２６−（Ｂ））。また、Ｆｉｓｅｔｉｎ群では、ほぼすべてのマウスの皮膚において毛球部毛母細胞においてＫｉ−６７陽性であり、一部のマウスの皮膚においてＴＥＲＴ陽性細胞を確認することができた（図２６−（Ｃ））。
　本実施例において、マウスを用いた動物試験により、ＲｅｓｖｅｒａｔｒｏｌとＦｉｓｅｔｉｎは発毛・育毛効果を有することが明らかとなった。
［実施例６］
　レスベラトロール構造類似体によるＳＩＲＴ１活性化

１．実験材料および方法
（１）細胞培養
　本研究では、ＳＩＲＴ１プロモーター活性化効果を有するレスベラトロール類似体のスクリーニングにはヒト表皮角化細胞株ＨａＣａＴ細胞にベクターを導入したＨａＣａＴ（ＳＩＲＴ１ｐ−ＥＧＦＰ）細胞を、ＳＩＲＴ１発現増強効果の検証にはＨａＣａＴ細胞を用いた。また、ＴＥＲＴプロモーター活性化効果を有する成分のスクリーニングにはヒト表皮角化細胞株ＨａＣａＴ細胞にベクターを導入したＨａＣａＴ（ｈＴＥＲＴｐ−ＥＧＦＰ）細胞を用いた。どの細胞も共に、通常培地としてダルベッコ変法イーグル培地「ニッスイ」（１）［ＤＭＥＭ］（日水製薬、東京）に、最終濃度１００Ｕ／ｍＬのペニシリン（Ｍｅｉｊｉ、東京）、０．１ｍｇ／ｍＬのストレプトマイシン（Ｍｅｉｊｉ、東京）、１０％ＦＢＳを混合したものを使用した。

（２）ＩＮ　Ｃｅｌｌ　Ａｎａｌｙｚｅｒ　１０００を用いた一次スクリーニング
　ＳＩＲＴ１プロモーター活性化能はＨａＣａＴ（ＳＩＲＴ１ｐ−ＥＧＦＰ）細胞を対象に、ＴＥＲＴプロモーター活性化能はＨａＣａＴ（ｈＴＥＲＴｐ−ＥＧＦＰ）細胞を対象に、ＩＮ　Ｃｅｌｌ　Ａｎａｌｙｚｅｒ　１０００（ＧＥ　Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ，Ａｍｅｒｓｈａｍ　Ｐｌａｃｅ，ＵＫ）を用いてサンプルを添加した細胞のＥＧＦＰ蛍光強度を測定することで評価した。ＨａＣａＴ（ＳＩＲＴ１ｐ−ＥＧＦＰ）細胞、ＨａＣａＴ（ｈＴＥＲＴｐ−ＥＧＦＰ）細胞をそれぞれ０．６×１０^５ｃｅｌｌｓ／ｍＬとなるよう９６ｗｅｌｌ−ｐｌａｔｅ（６５５９０，Ｇｒｅｉｎｅｒ　Ｂｉｏ−ｏｎｅ）に播種し、１０％　ＦＢＳ含有ＤＭＥＭ培地にて２４時間培養した。その後、レスベラトロール類似体を終濃度が１０μＭとなるようＨａＣａＴ（ＳＩＲＴ１ｐ−ＥＧＦＰ）細胞に添加、また、別途用意したサンプルを終濃度０．１μｇ／ｍＬ、１μｇ／ｍＬ、１０μｇ／ｍＬとなるようＨａＣａＴ（ｈＴＥＲＴｐ−ＥＧＦＰ）細胞に添加した。

　添加後１０％ＦＢＳ含有ＤＭＥＭ培地にて４８時間培養後、培養液の上から８％パラホルムアルデヒド（Ｗａｋｏ、大阪）を等量添加し、室温で１５分間静置して固定した。固定後、固定液を捨ててＰＢＳで２回洗浄し、ＰＢＳで５００倍希釈したＣｅｌｌｓｔｒａｉｎＲ−Ｈｏｅｃｈｓｔ　３３３４２　ｓｏｌｕｔｉｏｎ（Ｄｏｊｉｎｄｏ、熊本）を添加して２０分間室温で静置して遮光染色した。染色後このＨｏｅｃｈｓｔ溶液を捨て、ＰＢＳで２回洗浄し、ＰＢＳを添加してＩＮ　Ｃｅｌｌ　Ａｎａｌｙｚｅｒ　１０００に供し、ＥＧＦＰ蛍光強度を測定した。

[規則26に基づく補充 10.07.2018]　
　ＳＩＲＴ１プロモーター活性化効果の検証に使用したレスベラトロール構造類似体を表４に、ＴＥＲＴプロモーター活性化効果を有する成分のスクリーニングに使用したサンプルを表５に示した。

（３）ｔｏｔａｌ　ＲＮＡの調製
ＨａＣａＴ細胞を１．０×１０^５ｃｅｌｌｓ／ｍＬとなるよう１２ｗｅｌｌ−ｐｌａｔｅに播種した。２４時間培養後、終濃度１０μＭとなるようレスベラトロール構造類似体サンプルを添加し、さらに４８時間培養した。本実施例ではポジティブコントロールとしてＲｅｓｖｅｒａｔｒｏｌを用い、終濃度１０μＭとなるよう添加した。

　次に、ＲＮＡ抽出を行った。培地を完全に除き、ＴＲＩｚｏｌ　Ｒｅａｇｅｎｔ（コスモ・バイオ、東京）を１００μＬ添加し、液体が全体に行き渡るようにｐｌａｔｅを回し続けた。液体の粘性がなくなったら細胞ライセートを０．５ｍＬチューブに回収し、クロロホルム（Ｗａｋｏ、大阪）を２０μＬ添加し、ボルテックスミキサーで１０秒間混合した。室温で５分間静置した後、４℃、１５０００ｇで５分間遠心分離し、上清を新しい１．５ｍＬチューブに移した。回収した上清の０．５５倍量に相当する９９％エタノール（Ｗａｋｏ、大阪）を加え、軽くピペッティングをした後、この細胞ライセートをＥｃｏｎｏ　ＳｐｉｎＴＭ　ｆｏｒ　ＲＮＡカラム（Ｅｐｏｃｈ　Ｌｉｆｅ　Ｓｃｉｅｎｃｅ　Ｉｎｃ，Ｍｉｓｓｏｕｒｉ，ＵＳＡ）に添加し、４℃、１００００ｒｐｍで１分間遠心分離した。

　回収用チューブに排出された液を捨て、ＲＮＡ　ｗａｓｈ　Ｓｏｌｕｔｉｏｎ（Ｐｒｏｍｅｇａ，Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ，ＵＳＡ）を２００μＬ添加し、１００００ｒｐｍで１分間遠心分離した。回収用チューブに排出された液を捨て、再びＲＮＡ　ｗａｓｈ　Ｓｏｌｕｔｉｏｎを１００μＬ添加し、１００００ｒｐｍで１分間遠心分離した。回収用チューブに排出された液を捨て、４℃、１５０００ｇで遠心分離した後、新しい１．５ｍＬチューブにカラムをセットした。
　そして溶出バッファー（Ｒｏｃｈｅ，Ｂａｓｅｌ，Ｓｃｈｗｅｉｚ）を４０μＬ添加し、室温で３分間静置した後１５０００ｇで１分間遠心分離し、ｔｏｔａｌ　ＲＮＡを溶出した。溶出したｔｏｔａｌ　ＲＮＡの濃度はＮａｎｏ　Ｄｒｏｐ　２０００／２０００ｃ　分光光度計（Ｔｈｅｒｍｏ　Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ，Ｗａｌｔｈａｍ，ＭＡ，ＵＳＡ）を用いて測定した。

（４）ｃＤＮＡ合成
　０．２ｍＬチューブ（正晃）にＲＮＡ　１μｇ、ｏｌｉｇｏ　ｄＴ　０．５μＬにＲＮａｓｅフリーの滅菌水を加え、全量を１３．５μＬに調製した。次いで、サーマルサイクラー（Ｐｅｌｔｉｅｒ　Ｔｈｅｒｍａｌ　Ｃｙｃｌｅｒ　ＰＴＣ−２００，ＭＪ　Ｒｅｓｅａｒｃｈ，Ｗａｔｅｒｔｏｗｎ，ＭＡ，ＵＳＡ）を用いて６５℃で５分間アニーリングさせた後、直ちに５分間氷上に静置した。５×Ｒｅａｃｔｉｏｎ　Ｂｕｆｆｅｒ（ＴＯＹＯＢＯ、大阪）４μＬ、１０ｍＭ　ｄＮＴＰ（ＧＥヘルスケア）２μＬ、ＲｅｖｅｒＴｒａ　Ａｃｅ（ＴＯＹＯＢＯ、大阪）０．５μＬを加え、４２℃で２０分間、９９℃で５分間反応させ、ｃＤＮＡ合成を行った。

（５）リアルタイムＰＣＲ
　作製したｃＤＮＡを鋳型として用いた。０．２ｍＬチューブに滅菌水４９μＬ、１０μＭとなるよう希釈したプライマーＦｏｒｗａｒｄ／Ｒｅｖｅｒｓｅ双方を３．５μＬずつ、鋳型ｃＤＮＡ（ｃＤＮＡはＳＩＲＴ１用は１０倍希釈、β−ａｃｔｉｎ用は５０倍希釈した）７．０μＬ、ＴＨＵＮＤＥＲＢＩＲＤ　ＳＹＢＲ　ｑＰＣＲ　Ｍｉｘ（ＴＯＹＯＢＯ、大阪）２４．５μＬを入れ、よく懸濁した。

使用したプライマーの塩基配列を以下に示す。
ＳＩＲＴ１

β−ａｃｔｉｎ

　その後、９６ｗｅｌｌ−ｐｌａｔｅに２５μＬずつ３ｗｅｌｌに添加し、Ｔｈｅｒｍａｌ　Ｃｙｃｌｅ　Ｄｉｃｅｒ　Ｒｅａｌ　Ｔｉｍｅ　Ｓｙｓｔｅｍ（タカラバイオ、滋賀）を用いて定量リアルタイムＰＣＲを行った。
　反応条件は、９５℃　３０秒を１サイクル、９５℃　５秒→５５℃　１０秒→７２℃　２０秒を４５サイクル、９５℃　１５秒→６０℃　３０秒→９５℃　１５秒を１サイクルとし、ＦＡＭにより検出した。検量線のためのプライマーにはβ−ａｃｔｉｎを用いた。また、相対遺伝子発現量は測定した値をβ−ａｃｔｉｎの発現量値で除し求めた。

２．結果
（１）レスベラトロール構造類似体によるＳＩＲＴ１プロモーター活性化効果の検証
　ＨａＣａＴ（ＳＩＲＴ１ｐ−ＥＧＦＰ）細胞にレスベラトロール構造類似体を添加して４８時間培養した後、ＩＮ　Ｃｅｌｌ　Ａｎａｌｙｚｅｒ　１０００によってＨａＣａＴ（ＳＩＲＴ１ｐ−ＥＧＦＰ）細胞におけるＥＧＦＰ蛍光強度の変化を追跡した。その結果、９種類のレスベラトロール構造類似体のうちＰｉｎｏｓｔｉｌｂｅｎｅ、Ｉｓｏｒｈａｐｏｎｔｉｇｅｎｉｎ、Ｒｈａｐｏｎｔｉｇｅｎｉｎ、Ｐｉｃｅａｔａｎｎｏｌ、Ｇｎｅｔｏｌ、Ｉｓｏｌｉｑｕｉｒｉｔｉｇｅｎｉｎ、ＢｕｔｅｉｎにおいてＳＩＲＴ１プロモーター活性化能が見られた（図２７）。

（２）レスベラトロール構造類似体によるＳＩＲＴ１発現増強効果の検証
　一次スクリーニングでＳＩＲＴ１プロモーター活性化能が確認されたレスベラトロール構造類似体のＰｉｎｏｓｔｉｌｂｅｎｅ、Ｉｓｏｒｈａｐｏｎｔｉｇｅｎｉｎ、Ｒｈａｐｏｎｔｉｇｅｎｉｎ、Ｐｉｃｅａｔａｎｎｏｌ、Ｇｎｅｔｏｌ、Ｉｓｏｌｉｑｕｉｒｉｔｉｇｅｎｉｎ、Ｂｕｔｅｉｎに対して、リアルタイムＰＣＲ法により、これらのレスベラトロール類似体を添加したＨａＣａＴ細胞におけるＳＩＲＴ１　ｍＲＮＡ量を測定した。
　本実施例では、ＳＩＲＴ１活性のポジティブコントロールとしてＲｅｓｖｅｒａｔｒｏｌを用いて測定した結果、ＤＭＳＯを基準としてＧｎｅｔｏｌ、Ｉｓｏｌｉｑｕｉｒｉｔｉｇｅｎｉｎ、Ｂｕｔｅｉｎにおいて有意な発現増強が確認された（図２８）。

３．考察
　本実施例では、イメージングサイトメーターを用いてのスクリーニングにより、レスベラトロール構造類似体のＰｉｎｏｓｔｉｌｂｅｎｅ、Ｉｓｏｒｈａｐｏｎｔｉｇｅｎｉｎ、Ｒｈａｐｏｎｔｉｇｅｎｉｎ、Ｐｉｃｅａｔａｎｎｏｌ、Ｇｎｅｔｏｌ、Ｉｓｏｌｉｑｕｉｒｉｔｉｇｅｎｉｎ、Ｂｕｔｅｉｎが抗老化因子であるＳＩＲＴ１のプロモーターを活性化することが明らかとなった。また、この７種に対してリアルタイムＰＣＲ法によりＳＩＲＴ１　ｍＲＮＡ量を測定した。この実施例においては、ＳＩＲＴ１研究において広く用いられているブドウ由来のポリフェノールであるＲｅｓｖｅｒａｔｒｏｌをポジティブコントロールとして用いた。
　その結果、Ｇｎｅｔｏｌ、Ｉｓｏｌｉｑｕｉｒｉｔｉｇｅｎｉｎ、Ｂｕｔｅｉｎの３種がＨａＣａＴ細胞においてＳＩＲＴ１　ｍＲＮＡ発現を増強することが明らかとなった。この結果から、同定された３種のレスベラトロール構造類似体はＳＩＲＴ１を活性化する可能性があると考えられる。また、ＩｓｏｌｉｑｕｉｒｉｔｉｇｅｎｉｎとＢｕｔｅｉｎは類似した構造を持っており、この構造がＳＩＲＴ１活性化に関与すると考えられる。

　また、本実施例では、イメージングサイトメーターを用いてのスクリーニングにより、エクトイン（０．１μｇ／ｍＬ）、（アスコルビル／トコフェリル）リン酸Ｋ（０．１，１０μｇ／ｍＬ）、タンニン酸（１０μｇ／ｍＬ）、トラネキサム酸（０．１μｇ／ｍＬ）、α−Ｇヘスペリジン（１，１０μｇ／ｍＬ）が、育毛を促す因子であるＴＥＲＴのプロモーターを活性化することが明らかとなった。
［実施例７］
　Ｆｉｓｅｔｉｎ，Ｒｅｓｖｅｒａｔｒｏｌ類似体によるｈＴＥＲＴ増強効果

方法：下記のＦｉｓｅｔｉｎ，Ｒｅｓｖｅｒａｔｒｏｌ類似体を、ＨａＣａＴ細胞に添加後、培養し、ｈＴＥＲＴ発現をｑＰＣＲ法により検証した。サンプルとして用いたポリフェノール以外は、実施例１に記載の方法と同様の方法で行った。
　結果を図２９に示す。

　図２９より、Ｒｅｓｖｅｒａｔｒｏｌ、Ｆｉｓｅｔｉｎ、Ａｐｉｇｅｎｉｎ、Ｌｕｔｅｏｌｉｎ、Ｉｐｒｉｆｌａｖｏｎｅ、Ｎｏｂｉｌｅｔｉｎ、（±）−Ｅｑｕｏｌ、Ｇｅｎｉｓｔｅｉｎ、Ｒｅｓｖｅｒａｔｒｏｌ、Ｔａｎｇｅｒｅｔｉｎ、ＢｉｏｃｈａｎｉｎＡ、Ｃｈｒｙｓｉｎ、Ｐｉｎｏｓｔｉｌｂｅｎｅ、Ｂｕｔｅｉｎ，Ｑｕｅｒｃｅｔｉｎ及びＰｉｃｅａｔａｎｎｏｌがｈＴＥＲＴ発現を増強することが示され、中でもＱｕｅｒｃｅｔｉｎは特に増強効果が高かった。
［実施例８］
Ｆｉｓｅｔｉｎ，Ｒｅｓｖｅｒａｔｒｏｌ類似体によるパラコート誘導性のＤＮＡ損傷修復効果

＜材料及び方法＞
１．細胞培養
本研究では、ヒト結腸がん由来株化細胞Ｃａｃｏ−２細胞を用いた。Ｃａｃｏ−２細胞は、１０％　Ｆｅｔａｌ　ｂｏｖｉｎｅ　ｓｅｒｕｍ（ＦＢＳ）添加ＤＭＥＭ培地（Ｄｕｌｂｅｃｃｏ’ｓ　Ｍｏｄｉｆｉｅｄ　Ｅａｇｌｅ　Ｍｅｄｉｕｍ；Ｎｉｓｓｕｉ，Ｔｏｋｙｏ，Ｊａｐａｎ）、細胞培養ディッシュ（Ｇｒｅｉｎｅｒ　ｂｉｏ−ｏｎｅ）を用いて３７℃、５％　ＣＯ_２存在下で継代培養した。

２．γＨ２ＡＸを指標としたＤＳＢｓ修復促進能の評価
ＳＩＲＴ６活性化食品成分によるＤＮＡ二本鎖切断（ＤＮＡ　Ｄｏｕｂｌｅ−Ｓｔｒａｎｄ　Ｂｒｅａｋｓ；ＤＳＢｓ）の修復促進能を評価するため、ＤＮＡ損傷修復マーカーの一つであるγＨ２ＡＸを指標とした免疫染色を行い、パラコート処理で誘導されたＣａｃｏ−２細胞内のＤＳＢｓ修復がＳＩＲＴ６活性化食品成分によって促進されるかどうかを検証した。

（１）パラコート溶液の調製
パラコート溶液は、Ｐａｒａｑｕａｔ　ｄｉｃｈｌｏｒｉｄｅ　ｈｙｄｒａｔｅ（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ，Ｏｓａｋａ，Ｊａｐａｎ）を滅菌水で１Ｍに調製したものを−２０℃で保存し、適宜解凍して使用した。使用時は最終濃度が１ｍＭになるように添加した。

（２）Ｃａｃｏ−２細胞へのパラコート処理方法
パラコート処理する前日に、９６−ｗｅｌｌ　ｐｌａｔｅ（μ　Ｃｌｅａｒ　Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ　Ｂｌａｃｋ　Ｐｌａｔｅ；Ｇｒｅｉｎｅｒ　ｂｉｏ−ｏｎｅ）にＣａｃｏ−２細胞を２．０×１０^５ｃｅｌｌｓ／ｍＬで播種し、細胞をディッシュ底面に接着させた。翌日、最終濃度が１ｍＭとなるようにパラコート溶液を添加し、３７℃、５％　ＣＯ_２存在下で２時間培養した。

（３）細胞固定液の調製
Ｐａｒａｆｏｒｍａｌｄｅｈｙｄｅ（Ｗａｋｏ）を１×ＰＢＳで４％　Ｐａｒａｆｏｒｍａｌｄｅｈｙｄｅ細胞固定液になるように希釈し、６０℃の湯浴で溶かして作製した。

（４）ブロッキングバッファーの調製
１０×ＰＢＳ　１．０ｍＬ、正常ヤギ血清５００μＬ（Ｗａｋｏ）、滅菌水８．５ｍＬを混合し、さらにＴｒｉｔｏｎ　Ｘ−１００（１００％）３０μＬ（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）を添加してよく撹拌した。

（５）抗体希釈バッファーの調製
１０×ＰＢＳ　１．０ｍＬを滅菌水９．０ｍＬに加えて混ぜ、ＢＳＡ（Ｂｏｖｉｎｅ　Ｓｅｒｕｍ　Ａｌｂｕｍｉｎ　Ｆｒａｃｔｉｏｎ　Ｖ）０．１ｇ（Ｗａｋｏ）を加え溶解した。その後Ｔｒｉｔｏｎ　Ｘ−１００（１００％）３０μＬ（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）を添加してよく撹拌した。

（６）免疫染色・ＩＮ　Ｃｅｌｌ　Ａｎａｌｙｚｅｒ　１０００による測定および解析
２時間のパラコート処理をしたＣａｃｏ−２細胞の培地を１０％　ＦＢＳ含有ＤＭＥＭ培地と交換し、そこに１０μＭとなるように各食品成分サンプルを添加して３７℃、５％　ＣＯ_２存在下で４時間培養した。その後、食品成分を含む培地を除去し、Ｃａｃｏ−２細胞を１×ＰＢＳ　１００μＬ／ｗｅｌｌで洗浄して、細胞固定液８０μＬ／ｗｅｌｌで室温で１５分間放置し固定した。細胞固定液を除去し、１×ＰＢＳで５分間、３回洗浄した。そして、ブロッキングバッファーで細胞を１時間ブロッキングした。

バッファーを除去し、抗体希釈バッファーで希釈した一次抗体（Ｐ−Ｈｉｓｔｏｎｅ　Ｈ２Ａ．Ｘ；Ｃｅｌｌ　Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ　Ｔｅｃｈ．，Ｄａｎｖｅｒｓ，ＭＡ，ＵＳＡ：１０００倍希釈）を５０μＬ／ｗｅｌｌで細胞に添加し、４℃で一晩インキュベートした。そして１×ＰＢＳで５分間３回洗浄した。以下の操作は遮光状態で行った。抗体希釈バッファーで１，０００倍に希釈した二次抗体（ＡｌｅｘａＦｌｏｕｒ　５５５　ａｎｔｉ−ｒａｂｂｉｔ　ＩｇＧ；Ｌｉｆｅ　Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｇａｉｔｈｅｒｂｕｒｇ，ＭＤ，ＵＳＡ）を５０μＬ／ｗｅｌｌで細胞に添加し、室温で１．５時間インキュベートした。ＰＢＳで５分間３回の洗浄後、細胞核染色液Ｈｏｅｃｈｓｔ３３３４２（ＤＯＪＩＮＤＯ）１μＬ／１×ＰＢＳ　１ｍＬを１００μＬ／ｗｅｌｌで添加し２０分間室温にて放置し染色した。

染色後、細胞核染色液を除去し、１×ＰＢＳ１００μＬ／ｗｅｌｌで１回洗浄した。その後１×ＰＢＳ　１００μＬ／ｗｅｌｌに置き換え、ＩＮ　Ｃｅｌｌ　Ａｎａｌｙｚｅｒ　１０００（ＧＥ　Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）にて画像を取得した。画像はＩＮ　Ｃｅｌｌ　Ａｎａｌｙｚｅｒ　１０００　Ｗｏｒｋｓｔａｔｉｏｎ（ＧＥ　Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）で解析し、二次抗体の蛍光量を測定することで細胞内のγＨ２ＡＸの発現量を調べた。その後、Ｓｐｏｔｆｉｒｅ　ＤｅｃｉｓｉｏｎＳｉｔｅ　Ｃｌｉｅｎｔ　８．２　ｓｏｆｔｗａｒｅ（ＴＯＢＣＯ　Ｓｐｏｔｆｉｒｅ　Ｊａｐａｎ）によりグラフ化した。

＜結果＞
パラコート処理を２ｈ、サンプル処理４ｈで免疫染色を行った結果を図３０に示す。Ｇｅｎｉｓｔｅｉｎ，Ｔａｎｇｅｒｅｔｉｎ，Ｂａｉｃａｌｅｉｎ，ＩｓｏｌｉｑｕｉｒｉｔｉｇｅｎｉｎにおいてγＨ２ＡＸの減少効果、すなわちＤＮＡ損傷修復効果が見られた。

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Ｄｅｖ　Ｃｅｌｌ，１７：９−２６，２００９
・Ｐｏｒｔ　Ｆ，Ｂａｓｌｅｒ　Ｋ．
Ｗｎｔ　ｔｒａｆｆｉｃｋｉｎｇ：ｎｅｗ　ｉｎｓｉｇｈｔｓ　ｉｎｔｏ　Ｗｎｔ　ｍａｔｕｒａｔｉｏｎ，ｓｅｃｒｅｔｉｏｎ　ａｎｄ
ｓｐｒｅａｄｉｎｇ．
Ｔｒａｆｆｉｃ，１１：１２６５−７１，２０１０
・Ｋｏｍｅｋａｄｏ　Ｈ１，Ｙａｍａｍｏｔｏ　Ｈ，Ｃｈｉｂａ　Ｔ，Ｋｉｋｕｃｈｉ　Ａ．
Ｇｌｙｃｏｓｙｌａｔｉｏｎ　ａｎｄ　ｐａｌｍｉｔｏｙｌａｔｉｏｎ　ｏｆ　Ｗｎｔ−３ａ　ａｒｅ　ｃｏｕｐｌｅｄ　ｔｏ　ｐｒｏｄｕｃｅ　ａｎ
ａｃｔｉｖｅ　ｆｏｒｍ　ｏｆ　Ｗｎｔ−３ａ．
Ｇｅｎｅｓ　Ｃｅｌｌｓ，１２：５２１−３４，２００７
・Ｋｕｒａｙｏｓｈｉ　Ｍ，Ｙａｍａｍｏｔｏ　Ｈ，Ｉｚｕｍｉ　Ｓ，Ｋｉｋｕｃｈｉ　Ａ．
Ｐｏｓｔ−ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎａｌ　ｐａｌｍｉｔｏｙｌａｔｉｏｎ　ａｎｄ　ｇｌｙｃｏｓｙｌａｔｉｏｎ　ｏｆ　Ｗｎｔ−５ａ　ａｒｅ
ｎｅｃｅｓｓａｒｙ　ｆｏｒ　ｉｔｓ　ｓｉｇｎａｌｌｉｎｇ．
Ｂｉｏｃｈｅｍ　Ｊ，４０２：５１５−２３，２００７
・Ｏｚａｗａ　Ｍ，Ｂａｒｉｂａｕｌｔ　Ｈ，Ｋｅｍｌｅｒ　Ｒ．
Ｔｈｅ　ｃｙｔｏｐｌａｓｍｉｃ　ｄｏｍａｉｎ　ｏｆ　ｔｈｅ　ｃｅｌｌ　ａｄｈｅｓｉｏｎ　ｍｏｌｅｃｕｌｅ　ｕｖｏｍｏｒｕｌｉｎ
ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ　ｗｉｔｈ　ｔｈｒｅｅ　ｉｎｄｅｐｅｎｄｅｎｔ　ｐｒｏｔｅｉｎｓ　ｓｔｒｕｃｔｕｒａｌｌｙ　ｒｅｌａｔｅｄ　ｉｎ
ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ　ｓｐｅｃｉｅｓ．
ＥＭＢＯ　Ｊ，８：１７１１−７，１９８９
・Ｐａｒｋ　ＪＩ，Ｖｅｎｔｅｉｃｈｅｒ　ＡＳ，Ｈｏｎｇ　ＪＹ，Ｃｈｏｉ　Ｊ，Ｊｕｎ　Ｓ，Ｓｈｋｒｅｌｉ　Ｍ，Ｃｈａｎｇ　Ｗ，
Ｍｅｎｇ　Ｚ，Ｃｈｅｕｎｇ　Ｐ，Ｊｉ　Ｈ，ＭｃＬａｕｇｈｌｉｎ　Ｍ，Ｖｅｅｎｓｔｒａ　ＴＤ，Ｎｕｓｓｅ　Ｒ，ＭｃＣｒｅａ　ＰＤ，
Ａｒｔａｎｄｉ　ＳＥ
Ｔｅｌｏｍｅｒａｓｅ　ｍｏｄｕｌａｔｅｓ　Ｗｎｔ　ｓｉｇｎａｌｌｉｎｇ　ｂｙ　ａｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ　ｗｉｔｈ　ｔａｒｇｅｔ　ｇｅｎｅ
ｃｈｒｏｍａｔｉｎ．
Ｎａｔｕｒｅ．４６０：６６−７２，２００９
・Ｈｏｆｆｍｅｙｅｒ　Ｋ，Ｒａｇｇｉｏｌｉ　Ａ，Ｒｕｄｌｏｆｆ　Ｓ，Ａｎｔｏｎ　Ｒ，Ｈｉｅｒｈｏｌｚｅｒ　Ａ，Ｄｅｌ　Ｖａｌｌｅ
Ｉ，Ｈｅｉｎ　Ｋ，Ｖｏｇｔ　Ｒ，Ｋｅｍｌｅｒ　Ｒ
Ｗｎｔ／β−ｃａｔｅｎｉｎ　ｓｉｇｎａｌｉｎｇ　ｒｅｇｕｌａｔｅｓ　ｔｅｌｏｍｅｒａｓｅ　ｉｎ　ｓｔｅｍ　ｃｅｌｌｓ　ａｎｄ　ｃａｎｃｅｒ
ｃｅｌｌｓ．
・Ｈａｃｈｉｙａ　Ａ，Ｓｒｉｗｉｒｉｙａｎｏｎｔ　Ｐ，Ｋｏｂａｙａｓｈｉ　Ｔ，Ｎａｇａｓａｗａ　Ａ，Ｙｏｓｈｉｄａ　Ｈ，
Ｏｈｕｃｈｉ　Ａ，Ｋｉｔａｈａｒａ　Ｔ，Ｖｉｓｓｃｈｅｒ　ＭＯ，Ｔａｋｅｍａ　Ｙ，Ｔｓｕｂｏｉ　Ｒ，Ｂｏｉｓｓｙ　ＲＥ．
Ｓｔｅｍ　ｃｅｌｌ　ｆａｃｔｏｒ−ＫＩＴ　ｓｉｇｎａｌｌｉｎｇ　ｐｌａｙｓ　ａ　ｐｉｖｏｔａｌ　ｒｏｌｅ　ｉｎ　ｒｅｇｕｌａｔｉｎｇ
ｐｉｇｍｅｎｔａｔｉｏｎ　ｉｎ　ｍａｍｍａｌｉａｎ　ｈａｉｒ．
Ｊ　Ｐａｔｈｏｌ，２１８：３０−９，２００９
・Ｏｌｉｖｅｒ　ＲＦ１，Ｊａｈｏｄａ　ＣＡ．
Ｄｅｒｍａｌ−ｅｐｉｄｅｒｍａｌ　ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎｓ．
Ｃｌｉｎ　Ｄｅｒｍａｔｏｌ，６：７４−８，１９８８
・Ｎａｒｈｉ　Ｋ１，Ｊａｒｖｉｎｅｎ　Ｅ，Ｂｉｒｃｈｍｅｉｅｒ　Ｗ，Ｔａｋｅｔｏ　ＭＭ，Ｍｉｋｋｏｌａ　ＭＬ，Ｔｈｅｓｌｅｆｆ
Ｉ．
Ｓｕｓｔａｉｎｅｄ　ｅｐｉｔｈｅｌｉａｌ　ｂｅｔａ−ｃａｔｅｎｉｎ　ａｃｔｉｖｉｔｙ　ｉｎｄｕｃｅｓ　ｐｒｅｃｏｃｉｏｕｓ　ｈａｉｒ
ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ　ｂｕｔ　ｄｉｓｒｕｐｔｓ　ｈａｉｒ　ｆｏｌｌｉｃｌｅ　ｄｏｗｎ−ｇｒｏｗｔｈ　ａｎｄ　ｈａｉｒ　ｓｈａｆｔ
ｆｏｒｍａｔｉｏｎ．
Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ，１３５：１０１９−２８，２００８
・Ｊｉｎｋｕｋ　Ｃｈｏｉ，Ｌｕｃｉｎｄａ　Ｋ　Ｓｏｕｔｈｗｏｒｔｈ，Ｋａｖｉｔａ　Ｙ　Ｓａｒｉｎ，Ａｎｄｒｅｗ　Ｓ
Ｖｅｎｔｅｉｃｈｅｒ，Ｗｅｎｘｉｕ　Ｍａ，Ｗｏｏｄｙ　Ｃｈａｎｇ，Ｐｅｇｇｉｅ　Ｃｈｅｕｎｇ，Ｓｏｈｅｅ　Ｊｕｎ，Ｍａｊａ　Ｋ
Ａｒｔａｎｄｉ，Ｎａｍａｎ　Ｓｈａｈ，Ｓｔｕａｒｔ　Ｋ　Ｋｉｍ，Ｓｔｅｖｅｎ　Ｅ　Ａｒｔａｎｄｉ
ＴＥＲＴ　Ｐｒｏｍｏｔｅｓ　Ｅｐｉｔｈｅｌｉａｌ　Ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎ　ｔｈｒｏｕｇｈ　Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎａｌ　Ｃｏｎｔｒｏｌ
ｏｆ　ａ　Ｍｙｃ−ａｎｄ　Ｗｎｔ−Ｒｅｌａｔｅｄ　Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔａｌ　Ｐｒｏｇｒａｍ
ＰＬｏＳ　Ｇｅｎｅ，４：ｅ１０，２００８
・Ｒｕｄｌｏｆｆ　Ｓ，Ｋｅｍｌｅｒ　Ｒ．
Ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｌ　ｒｅｑｕｉｒｅｍｅｎｔｓ　ｆｏｒ　β−ｃａｔｅｎｉｎ　ｄｕｒｉｎｇ　ｍｏｕｓｅ　ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ．
Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ，１３９：３７１１−２１，２０１２
・Ｙａｍａｓｈｉｔａ　Ｓ，Ｏｇａｗａ　Ｋ，Ｉｋｅｉ　Ｔ，Ｕｄｏｎｏ　Ｍ，Ｆｕｊｉｋｉ　Ｔ，Ｋａｔａｋｕｒａ　Ｙ．
ＳＩＲＴ１　ｐｒｅｖｅｎｔｓ　ｒｅｐｌｉｃａｔｉｖｅ　ｓｅｎｅｓｃｅｎｃｅ　ｏｆ　ｎｏｒｍａｌ　ｈｕｍａｎ　ｕｍｂｉｌｉｃａｌ　ｃｏｒｄ
ｆｉｂｒｏｂｌａｓｔ　ｔｈｒｏｕｇｈ　ｐｏｔｅｎｔｉａｔｉｎｇ　ｔｈｅ　ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ　ｏｆ　ｈｕｍａｎ　ｔｅｌｏｍｅｒａｓｅ
ｒｅｖｅｒｓｅ　ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔａｓｅ　ｇｅｎｅ．
Ｂｉｏｃｈｅｍ　Ｂｉｏｐｈｙｓ　Ｒｅｓ　Ｃｏｍｍｕｎ，４１７：６３０−４，２０１２
・Ｙａｍａｓｈｉｔａ　Ｓ，Ｏｇａｗａ　Ｋ，Ｉｋｅｉ　Ｔ，Ｆｕｊｉｋｉ　Ｔ，Ｋａｔａｋｕｒａ　Ｙ．
ＦＯＸＯ３ａ　ｐｏｔｅｎｔｉａｔｅｓ　ｈＴＥＲＴ　ｇｅｎｅ　ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ　ｂｙ　ａｃｔｉｖａｔｉｎｇ　ｃ−ＭＹＣ　ａｎｄ
ｅｘｔｅｎｄｓ　ｔｈｅ　ｒｅｐｌｉｃａｔｉｖｅ　ｌｉｆｅ−ｓｐａｎ　ｏｆ　ｈｕｍａｎ　ｆｉｂｒｏｂｌａｓｔ．
ＰＬｏＳ　Ｏｎｅ，９：ｅ１０１８６４，２０１４
・Ｃｈａｓｅ　Ｈ．Ｂ．
Ｇｒｏｗｔｈ　ｏｆ　ｈａｉｒ．
　Ｐｈｙｓｉｏｌ．Ｒｅｖ，３４：１１３−１２６，１９５４
・Ｌｉｎ　Ｋ．Ｋ．，Ｃｈｕｄｏｖａ　Ｄ．，Ｈａｔｆｉｅｌｄ　Ｇ．Ｗ．，Ｓｍｙｔｈ　Ｐ．ａｎｄ　Ａｎｄｅｒｓｏｎ　Ｂ．
Ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ　ｏｆ　ｈａｉｒ　ｃｙｃｌｅ−ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ　ｇｅｎｅｓ　ｆｒｏｍ　ｔｉｍｅ−ｃｏｕｒｓｅ　ｇｅｎｅ
ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ　ｐｒｏｆｉｌｅ　ｄａｔａ　ｂｙ　ｕｓｉｎｇ　ｒｅｐｌｉｃａｔｅ　ｖａｒｉａｎｃｅ
Ｐｒｏｃ　Ｎａｔｌ　Ａｃａｄ　Ｓｃｉ　Ｕ　Ｓ　Ａ，１０１：１５９５５−１５９６０，２００４
・Ｍａｋｓｉｍ　Ｖ．Ｐｌｉｋｕｓ　ａｎｄ　Ｃｈｅｎｇ−Ｍｉｎｇ　Ｃｈｕｏｎｇ
Ｃｏｍｐｌｅｘ　ｈａｉｒ　ｃｙｃｌｅ　ｄｏｍａｉｎ　ｐａｔｔｅｒｎｓ　ａｎｄ　ｒｅｇｅｎｅｒａｔｉｖｅ　ｈａｉｒ　ｗａｖｅｓ　ｉｎ
ｌｉｖｉｎｇ　ｒｏｄｅｎｔｓ
Ｊ　Ｉｎｖｅｓｔ　Ｄｅｒｍａｔｏｌ，１２８：１０７１−１０８０，２００８
・Ｃｈｅｎ　ＭＬ，Ｌｉ　Ｊ，Ｘｉａｏ　ＷＲ，Ｓｕｎ　Ｌ，Ｔａｎｇ　Ｈ，Ｗａｎｇ　Ｌ，Ｗｕ　ＬＹ，Ｃｈｅｎ　Ｘ，Ｘｉｅ　ＨＦ．
Ｐｒｏｔｅｃｔｉｖｅ　ｅｆｆｅｃｔ　ｏｆ　ｒｅｓｖｅｒａｔｒｏｌ　ａｇａｉｎｓｔ　ｏｘｉｄａｔｉｖｅ　ｄａｍａｇｅ　ｏｆ　ＵＶＡ
ｉｒｒａｄｉａｔｅｄ　ＨａＣａＴ　ｃｅｌｌｓ．
Ｚｈｏｎｇ　Ｎａｎ　Ｄａ　Ｘｕｅ　Ｘｕｅ　Ｂａｏ　Ｙｉ　Ｘｕｅ　Ｂａｎ，３１：６３５−９，２００６
・Ｐａｒｋ　Ｋ，Ｌｅｅ　ＪＨ．
Ｐｒｏｔｅｃｔｉｖｅ　ｅｆｆｅｃｔｓ　ｏｆ　ｒｅｓｖｅｒａｔｒｏｌ　ｏｎ　ＵＶＢ−ｉｒｒａｄｉａｔｅｄ　ＨａＣａＴ　ｃｅｌｌｓ
ｔｈｒｏｕｇｈ　ａｔｔｅｎｕａｔｉｏｎ　ｏｆ　ｔｈｅ　ｃａｓｐａｓｅ　ｐａｔｈｗａｙ．
Ｏｎｃｏｌ　Ｒｅｐ，１９（２）：４１３−７，２００８
・Ｓｅｏ　ＳＨ，Ｊｅｏｎｇ　ＧＳ．
Ｆｉｓｅｔｉｎ　ｉｎｈｉｂｉｔｓ　ＴＮＦ−α−ｉｎｄｕｃｅｄ　ｉｎｆｌａｍｍａｔｏｒｙ　ａｃｔｉｏｎ　ａｎｄ　ｈｙｄｒｏｇｅｎ
ｐｅｒｏｘｉｄｅ−ｉｎｄｕｃｅｄ　ｏｘｉｄａｔｉｖｅ　ｄａｍａｇｅ　ｉｎ　ｈｕｍａｎ　ｋｅｒａｔｉｎｏｃｙｔｅ　ＨａＣａＴ　ｃｅｌｌｓ
ｔｈｒｏｕｇｈ　ＰＩ３Ｋ／ＡＫＴ／Ｎｒｆ−２−ｍｅｄｉａｔｅｄ　ｈｅｍｅ　ｏｘｙｇｅｎａｓｅ−１　ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ．
Ｉｎｔ　Ｉｍｍｕｎｏｐｈａｒｍａｃｏｌ，２９：２４６−５３，２０１５
・Ｐｈｉｌｐｏｔｔ　Ｍ．Ｐ．，Ｓａｎｄｅｒｓ　Ｄ．Ａ．ａｎｄ　Ｋｅａｌｅｙ　Ｔ．
Ｅｆｆｅｃｔｓ　ｏｆ　ｉｎｓｕｌｉｎ　ａｎｄ　ｉｎｓｕｌｉｎ−ｌｉｋｅ　ｇｒｏｗｔｈ　ｆａｃｔｏｒｓ　ｏｎ　ｃｕｌｔｕｒｅｄ　ｈｕｍａｎ
ｈａｉｒ　ｆｏｌｌｉｃｌｅｓ，ＩＧＦ−Ｉ　ａｔ　ｐｈｙｓｉｏｌｏｇｉｃ　ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎｓ　ｉｓ　ａｎ　ｉｍｐｏｒｔａｎｔ
ｒｅｇｕｌａｔｏｒ　ｏｆ　ｈａｉｒ　ｆｏｌｌｉｃｌｅ　ｇｒｏｗｔｈ　ｉｎ　ｖｉｔｒｏ．
Ｉｎｖｅｓｔ．Ｄｅｒｍａｔｏｌ，１０２：８５７−８６１，１９９４
・Ｂａｔｃｈ　Ｊ．Ａ．，Ｍｅｒｃｕｒｉ　Ｆ．Ａ．ａｎｄ　Ｗｅｒｔｈｅｒ　Ｇ．Ａ．
Ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ　ａｎｄ　ｌｏｃａｌｉｚａｔｉｏｎ　ｏｆ　ｉｎｓｕｌｉｎ−ｌｉｋｅ　ｇｒｏｗｔｈ　ｆａｃｔｏｒ−ｂｉｎｄｉｎｇ
ｐｒｏｔｅｉｎ（ＩＧＦＢＰ）ｍｅｓｓｅｎｇｅｒ　ＲＮＡｓ　ｉｎ　ｈｕｍａｎ　ｈａｉｒ　ｆｏｌｌｉｃｌｅ　ｄｅｒｍａｌ　ｐａｐｉｌｌａ．
Ｉｎｖｅｓｔ．Ｄｅｒｍａｔｏｌ，１０６：４７１−４７５，１９９６
・Ｒｉｓｔｏｗ　Ｈ．Ｊ．ａｎｄ　Ｍｅｓｓｍｅｒ　Ｔ．Ｏ．
Ｂａｓｉｃ　ｆｉｂｒｏｂｌａｓｔ　ｇｒｏｗｔｈ　ｆａｃｔｏｒ　ａｎｄ　ｉｎｓｕｌｉｎ−ｌｉｋｅ　ｇｒｏｗｔｈ　ｆａｃｔｏｒ　Ｉ　ａｒｅ
ｓｔｒｏｎｇ　ｍｉｔｏｇｅｎｓ　ｆｏｒ　ｃｕｌｔｕｒｅｄ　ｍｏｕｓｅ　ｋｅｒａｔｉｎｏｃｙｔｅｓ．
Ｃｅｌｌ．Ｐｈｙｓｉｏｌ，１３７：２７７−２８４，１９８８
・Ｗｅｒｔｈｅｉｍｅｒ　Ｅ．，Ｔｒｅｂｉｃｚ　Ｍ．，Ｅｌｄａｒ　Ｔ．，Ｇａｒｔｓｂｅｉｎ　Ｍ．，Ｎｏｆｅｈ−Ｍｏｓｅｓ　Ｓ．
ａｎｄ　Ｔｅｎｎｅｎｂａｕｍ　Ｔ．
Ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｌ　ｒｏｌｅｓ　ｏｆ　ｉｎｓｕｌｉｎ　ｒｅｃｅｐｔｏｒ　ａｎｄ　ｉｎｓｕｌｉｎ−ｌｉｋｅ　ｇｒｏｗｔｈ　ｆａｃｔｏｒ−
１　ｒｅｃｅｐｔｏｒ　ｉｎ　ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ　ｏｆ　ｍｕｒｉｎｅ　ｓｋｉｎ　ｋｅｒａｔｉｎｏｃｙｔｅｓ．
Ｊ．Ｉｎｖｅｓｔ．Ｄｅｒｍａｔｏｌ，１１５：２４−２９，２０００
・Ｇａｔ　Ｕ，ＤａｓＧｕｐｔａ　Ｒ，Ｄｅｇｅｎｓｔｅｉｎ　Ｌ，Ｆｕｃｈｓ　Ｅ．
Ｄｅ　Ｎｏｖｏ　ｈａｉｒ　ｆｏｌｌｉｃｌｅ　ｍｏｒｐｈｏｇｅｎｅｓｉｓ　ａｎｄ　ｈａｉｒ　ｔｕｍｏｒｓ　ｉｎ　ｍｉｃｅ　ｅｘｐｒｅｓｓｉｎｇ
ａ　ｔｒｕｎｃａｔｅｄ　ｂｅｔａ−ｃａｔｅｎｉｎ　ｉｎ　ｓｋｉｎ．
Ｃｅｌｌ，９５：６０５−１４，１９９８
・Ｍａｓｏｒｏ　ＥＪ．
Ｔｈｅ　ｒｏｌｅ　ｏｆ　ｈｏｒｍｅｓｉｓ　ｉｎ　ｌｉｆｅ　ｅｘｔｅｎｓｉｏｎ　ｂｙ　ｄｉｅｔａｒｙ　ｒｅｓｔｒｉｃｔｉｏｎ．
Ｉｎｔｅｒｄｉｓｃｉｐ　Ｔｏｐ　Ｇｅｒｏｎｔｏｌ，３５：１−１７．２００７
・Ｃｏｌｍａｎ　ＲＪ，Ａｎｄｅｒｓｏｎ　ＲＭ，Ｊｏｈｎｓｏｎ　ＳＣ，Ｋａｓｔｍａｎ　ＥＫ，Ｋｏｓｍａｔｋａ　ＫＪ，Ｂｅａｓｌｅｙ
ＴＭ，Ａｌｌｉｓｏｎ　ＤＢ，Ｃｒｕｚｅｎ　Ｃ，Ｓｉｍｍｏｎｓ　ＨＡ，Ｋｅｍｎｉｔｚ　ＪＷ，Ｗｅｉｎｄｒｕｃｈ　Ｒ．
Ｃａｌｏｒｉｃ　ｒｅｓｔｒｉｃｔｉｏｎ　ｄｅｌａｙｓ　ｄｉｓｅａｓｅ　ｏｎｓｅｔ　ａｎｄ　ｍｏｒｔａｌｉｔｙ　ｉｎ　ｒｈｅｓｕｓ
ｍｏｎｋｅｙｓ．
Ｓｃｉｅｎｃｅ，３２５：２０１−２０４，２００９
・Ｋｉｍ　ＳＣ，Ｋｉｍ　ＹＨ，Ｓｏｎ　ＳＷ，Ｍｏｏｎ　ＥＹ，Ｐｙｏ　Ｓ，Ｕｍ　ＳＨ．
Ｆｉｓｅｔｉｎ　ｉｎｄｕｃｅｓ　Ｓｉｒｔ１　ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ　ｗｈｉｌｅ　ｉｎｈｉｂｉｔｉｎｇ　ｅａｒｌｙ　ａｄｉｐｏｇｅｎｅｓｉｓ
ｉｎ　３Ｔ３−Ｌ１　ｃｅｌｌｓ．
Ｂｉｏｃｈｅｍ　Ｂｉｏｐｈｙｓ　Ｒｅｓ　Ｃｏｍｍｕｎ，４６７：６３８−４４，２０１５

配列番号１~２０：合成ＤＮＡ

Claims

次式Ｉ：

（式中、Ｒ^１及びＲ^３の一方は水素原子又は水酸基を表し、他方は次式ＩＶ：

（Ｒ^４ｂは水素原子又は炭素数１~６のアルキル基を表し、ｎは１~５の整数を表す。）
で示される基を表し、Ｒ^２は水素原子又は酸素原子を表し、Ｒ^４ａはＲ^４ｂと同様であり、

は二重結合又は単結合を表し、ｍは１~４の整数を表す。）
で示される化合物、
　次式ＩＩ：

（式中、Ｒ^４ａ及びＲ^４ｂは前記と同様であり、ｎ１及びｎ２は、それぞれ独立して１~５の整数を表す。）
で示される化合物、及び次式ＩＩＩ：

（式中、Ｒ^２、Ｒ^４ａ、Ｒ^４ｂ、ｎ１及びｎ２並びに

は前記と同様である。）
で示される化合物からなる群から選ばれるいずれかの化合物を含む、発毛及び／又は育毛用組成物。
次式Ｉ：

（式中、Ｒ^１及びＲ^３の一方は水素原子又は水酸基を表し、他方は次式ＩＶ：

（Ｒ^４ｂは水素原子又は炭素数１~６のアルキル基を表し、ｎは１~５の整数を表す。）
で示される基を表し、Ｒ^２は水素原子又は酸素原子を表し、Ｒ^４ａはＲ^４ｂと同様であり、

は二重結合又は単結合を表し、ｍは１~４の整数を表す。）
で示される化合物、
　次式ＩＩ：

（式中、Ｒ^４ａ及びＲ^４ｂは前記と同様であり、ｎ１及びｎ２は、それぞれ独立して１~５の整数を表す。）
で示される化合物、及び次式ＩＩＩ：

（式中、Ｒ^２、Ｒ^４ａ、Ｒ^４ｂ、ｎ１及びｎ２並びに

は前記と同様である。）
で示される化合物からなる群から選ばれるいずれかの化合物を含む、皮膚改善用組成物。
次式Ｉ：

（式中、Ｒ^１及びＲ^３の一方は水素原子又は水酸基を表し、他方は次式ＩＶ：

（Ｒ^４ｂは水素原子又は炭素数１~６のアルキル基を表し、ｎは１~５の整数を表す。）
で示される基を表し、Ｒ^２は水素原子又は酸素原子を表し、Ｒ^４ａはＲ^４ｂと同様であり、

は二重結合又は単結合を表し、ｍは１~４の整数を表す。）
で示される化合物、
　次式ＩＩ：

（式中、Ｒ^４ａ及びＲ^４ｂは前記と同様であり、ｎ１及びｎ２は、それぞれ独立して１~５の整数を表す。）
で示される化合物、及び次式ＩＩＩ：

（式中、Ｒ^２、Ｒ^４ａ、Ｒ^４ｂ、ｎ１及びｎ２並びに

は前記と同様である。）
で示される化合物からなる群から選ばれるいずれかの化合物を含む、化粧品用組成物。
式Ｉで示される化合物が、次式Ｉａ又はＩｂ：

（式中、Ｒ^１及びＲ^３は、水素原子又は水酸基を表し、Ｒ^２は水素原子又は酸素原子を表し、Ｒ^４ａ及びＲ^４ｂは、それぞれ独立して水素原子又は炭素数１~６のアルキル基を表し、

は二重結合又は単結合を表し、ｍは１~４の整数を表し、ｎは１~５の整数を表す。）
で示されるものである請求項１~３のいずれか１項に記載の組成物。
式Ｉで示される化合物が、フィセチン、ケルセチン、カテキン、ノビレチン、アピゲニン、ゲニステイン、ルテオリン、イプリフラボン、エクオール、タンゲレチン、ビオカニンＡ、クリシン、又はバイカレインである請求項１~３のいずれか１項に記載の組成物。
式ＩＩで示される化合物が、レスベラトロール、ピセアタンノール、ピノスチルベン、イソラポンチゲニン、ラポンチゲニン、グネトール、又はオキシレスベラトロールである請求項１~３のいずれか１項に記載の組成物。
式ＩＩＩで示される化合物が、イソリキリチゲニン又はブテインである請求項１~３のいずれか１項に記載の組成物。
皮膚改善が、傷の治療、肌荒れの修復、しみの改善、そばかすの改善、しわ抑制、創傷治癒及び細胞老化抑制からなる群から選ばれる少なくとも１つである請求項２に記載の組成物。
請求項１に記載の組成物を含む発毛及び／又は育毛剤。
請求項２に記載の組成物を含む皮膚改善剤。
請求項３に記載の組成物を含む化粧品。
ＴＥＲＴプロモーター若しくはＳＩＲＴ１プロモーターにリポーター遺伝子が連結されたベクターを含む細胞、又は内在性ＴＥＲＴ遺伝子若しくは内在性ＳＩＲＴ１遺伝子を含む細胞に被験物質を接触させ、当該リポーター遺伝子又は内在性ＴＥＲＴ遺伝子若しくは内在性ＳＩＲＴ１遺伝子の発現を指標として、発毛効果、育毛効果及び皮膚改善効果からなる群から選ばれる少なくとも１つの効果を有する物質をスクリーニングする方法。
細胞が上皮細胞である、請求項１２に記載の方法。
ＴＥＲＴがヒトＴＥＲＴである請求項１２又は１３に記載の方法。
ＤＮＡ損傷修復マーカー遺伝子を含む細胞であってＤＮＡ損傷を受けた細胞に被験物質を接触させ、当該遺伝子の発現を指標として、発毛効果、育毛効果及び皮膚改善効果からなる群から選ばれる少なくとも１つの効果を有する物質をスクリーニングする方法。