JP2015178485A - 育毛用組成物 - Google Patents

Abstract

【課題】頭髪のみならずまつ毛、眉毛にも有効な育毛用組成物を提供する。
【解決手段】（Ａ）育毛有効成分（Ｂ）ＤＮＡ損傷抑制剤（Ｃ）表皮幹細胞機能性向上剤
からなる育毛用組成物であり、好ましくは（Ａ）育毛有効成分が水溶性の卵胞ホルモン剤、5-αリダクターゼ阻害剤、リパーゼ阻害剤、末梢血管血流促進剤、局所刺激剤、殺菌剤、毛根賦活剤、抗炎症剤、ビタミン剤、アミノ酸剤から選ばれるものであり、（Ｂ）ＤＮＡ損傷抑制剤の指標が抗γH2AX抗体法、コメットアッセイ法であり（Ｃ）表皮幹細胞機能性向上剤の指標がコロニー試験法である育毛用組成物。
【選択図】なし

Description

本発明は、医薬品、医薬部外品及び化粧品分野において利用される育毛用組成物に関する。

過去、育毛剤としてエストロン、エストラジオール、エチニルエストラジオール等の卵胞ホルモン、フィナステリド等の５-αリダクターゼ阻害剤、ピリドキシン及びその誘導体等のリパーゼ阻害剤、ビタミンＥ及びその誘導体，セファランチン，塩化カルプロニウム、ミノキシジル等の末梢血管血流促進剤、トウガラシチンキ、カンタリスチンキ、ショウキョウチンキ、ハッカ油、l-メントール、カンフル等の局所刺激剤、レゾルシン、サリチル酸、乳酸等の角質溶解剤、ジンクピリチオン、塩化ベンザルコニウム、塩化ベンゼトニウム、クロルヘキシジン、ヒノキチオール等の殺菌剤、パントテン酸及びその誘導体、ビオチン、ペンタデカン酸グリセリド、アデノシン等の毛根賦活剤、グリチルリチン酸及びその誘導体，β-グリチルレチン酸、アラントイン、アズレン、ε-アミノカプロン酸、ヒドロコルチゾン等の抗炎症剤、ビタミンＡ、ビタミンB₁、ビタミンＢ₂、ビタミンB₃、ビタミンB₅、ビタミンＢ₆、ビタミンＢ₁₂、葉酸、ビタミンＤ、ビタミンE等のビタミン剤、アラニン、アルギニン、アスパラギン、アスパラギン酸、システイン，グリシン、ヒスチジン、セリン、プロリン、メチオニン、ロイシン、トリプトファン、テアニン等のアミノ酸剤や作用機序は不明ながらも動物実験などの結果で効果のあるアロエ、ゲットウ、カミツレ、クワ、海藻類、センブリ、ステビア、タイソウ、ニンジン、ニンニク等の各種植物抽出物など多くの成分が開発されてきた。

また、最近では毛髪に加え、まつ毛や眉毛用の育毛料が提案されている。例えば、特許文献１には、育毛成分であるタイソウ抽出物又はステビア抽出物を含むまつ毛用の化粧料が開示されている。特許文献２には、アデニンまたはアデニン塩類を含む毛髪成長促進剤が開示されている。

特開２００６−３０６８５４号公報 特開２０１３−５４０１３５号公報

しかしながら頭髪とまつ毛や眉毛においては休止期や成長期の長さが異なることが知られている。また、まつ毛や眉毛における抜け毛の原因はビューラーなどによる物理的な負荷やマスカラ、アイブロウなどのメイクアップ及びそれらを落とす際の化学的な刺激などが大きく関与しており、頭髪における育毛成分がそのまま、まつ毛や眉毛における育毛効果を発揮するとは限らない。
さらに、単独では有効な成分であっても、複数組み合わせた場合に効果が増強すると単純に言えるものではなく、場合によっては効果が減弱する場合があり、どのような成分を組み合わせて使用したときに作用が増強するのか、あるいは減弱するのかについては全く不明であった。

すなわち、毛髪を太く長く成長させることができる事は知られていても、まつ毛・眉毛に対しても同様に十分有効な育毛剤はないという課題があった。

我々は各種の育毛成分と、それらの効果を相乗的に発揮させるような組合せについて検討を行った。この中で驚くべき事に、毛髪とは直接的に関与していない表皮幹細胞機能性向上剤を組み合わせると毛髪のみならずまつ毛・眉毛に対しても高い効果を発揮することを見出した。さらに、これにDNA損傷抑制剤を組み合わせる事により、本発明を完成した。

(1) 本発明は次の成分（Ａ）〜（Ｃ）
（Ａ）育毛有効成分
（Ｂ）ＤＮＡ損傷抑制剤
（Ｃ）表皮幹細胞機能性向上剤
を含有する育毛用組成物である。
(2)成分（Ａ）育毛有効成分が卵胞ホルモン剤、5-αリダクターゼ阻害剤、リパーゼ阻害剤、末梢血管血流促進剤、局所刺激剤、殺菌剤、毛根賦活剤、抗炎症剤、ビタミン剤、アミノ酸剤の１種または２種以上から選ばれる育毛用組成物である。
(3)成分（Ａ）育毛有効成分が５-αリダクターゼ阻害剤、リパーゼ阻害剤、抹消血管血流促進剤、毛根賦活剤、抗炎症剤、ビタミン剤、アミノ酸剤の１種または２種以上から選ばれる育毛用組成物である。
(4)成分（Ａ）育毛有効成分が水溶性である育毛用組成物である。
(5)成分（Ａ）育毛有効成分がニコチン酸、ニコチン酸アミド、レゾルシン、ピリドキシン塩酸塩、パンテノール、アデノシン、アデニン、アデノシン三リン酸ジナトリウム、ビオチン、グリチルリチン酸、グリチルリチン酸ジカリウム、グリチルリチン酸モノアンモニウム、ビタミンＢ₂、ビタミンB₃、ビタミンＢ₅、ビタミンＢ₆、ビタミンＢ₁₂、アスパラギン、バリン、アラニン、グリシン、グルタミン、グルタミン酸、アルギニン、システイン、セリン、クレアチン、テアニン、及びこれらの薬学的に許容される塩又は誘導体である育毛用組成物である。
(6)成分（Ｂ）ＤＮＡ損傷抑制剤の指標が抗γH2AX抗体法、コメットアッセイ法である育毛用組成物である。
(7)成分（Ｂ）ＤＮＡ損傷抑制剤がビワ、シャクヤク、イラクサ、シダ、トウネズミモチの１種または２種以上から選ばれる植物又はその抽出物である育毛用組成物である。
(8)成分（Ｃ）表皮幹細胞機能性向上剤の指標がコロニー試験法である育毛用組成物である。
(9)成分（Ｃ）表皮幹細胞機能性向上剤がショウブ、リンゴの１種または２種以上から選ばれる植物又はその抽出物である育毛用組成物である。
(10)まつ毛用である育毛用組成物である。
(11)育毛用組成物を皮膚、毛髪、眉毛、まつ毛に適用することを特徴とする、育毛方法である。

育毛有効成分とDNA損傷抑制剤、表皮幹細胞機能性向上剤を組み合わせることで頭髪・まつ毛・眉毛のいずれにも有効な育毛用組成物を得ることができる。これらは医薬品・医薬部外品・化粧品などに用いることができる。

図1はトウネズミモチ抽出物のＤＮＡ損傷抑制試験の結果である。

図2は、まつ毛用美容液の使用前後を示す図である。

以下、本発明について詳細に説明する。なお、本明細書において、「〜」はその前後の数値を含む範囲を意味するものとする。また、%で表記する数値は、特に記載した場合を除き、質量を基準にした値である。

本願における育毛とは脱毛を防止し、毛髪、まつ毛、眉毛の発毛、成長又は正常化を促すことに加え、長さ、太さが増すこと、ハリ・コシが出ることなどを含む概念である。

本発明における成分（Ａ）は育毛有効成分として既に知られているものであればいずれのものでも良く、具体的には卵胞ホルモン剤、5-αリダクターゼ阻害剤、リパーゼ阻害剤、末梢血管血流促進剤、局所刺激剤、殺菌剤、毛根賦活剤、抗炎症剤、ビタミン剤、アミノ酸剤などがあげられ、これらの１種または２種以上を組み合わせて用いることができる。

さらに具体的には卵胞ホルモン剤としてはエストロン、エストラジオール、エチニルエストラジオールなどが上げられる。

５-αリダクターゼ阻害剤としては、ビニフェリン、アマロゲンチン、アマロスウェリン、ビスナフトキノン誘導体、ツユクサエキス、アマモエキス、ヤーコンエキス、ウコンエキス、オレンジエキス、スターフルーツ葉エキス、藤茶エキス、五斂子エキス、イロハモミジエキス、ホウセンカエキス等があげられる。

リパーゼ阻害剤としては、レモングラス、オールスパイス、シナモン、クローブ、阿仙薬、グァバ、メドウスィート、コラ・デ・カバロ、ビワ、ドッカツ、リョウキョウ、ビンロウシ、ヨウバイヒ、サンペンズ、ケツメイシなどがあげられる。

末梢血管血流促進剤としては、ビタミンＥ誘導体、ニコチン酸誘導体、アセチルコリン、塩化カルプロニウム、塩酸ジフェンヒドラミン、ヨウ化ニンニクエキス、スピロノラクトン、γ-オリザノール、セファランチン、ニコランジル、ミノキシジル、ジイソプロピルアミンジクロロアセテート、γ−オリザノール、センブリエキス、ニンジンエキス、イチョウエキス、キナエキス、トウヒエキス、ソフォラエキス、等があげられる。ここでビタミンE誘導体としてはDL-α-トコフェロール、D-α-トコフェロール、酢酸DL-α-トコフェロール、酢酸D-α-トコフェロール等、ニコチン酸誘導体としては、ニコチン酸アミド、ニコチン酸ベンジル、ニコチン酸 dl−α−トコフェロール等が挙げられる。

局所刺激剤としてはノニル酸ワニリルアミド、トウガラシチンキ、カンタリスチンキ、ショウキョウチンキ、ハッカ油、l-メントール、カンフル、オランダガラシエキス、ワサビ大根エキス等があげられる。

殺菌剤としてはジンクピリチオン、塩化ベンザルコニウム、塩化ベンゼトニウム、クロルヘキシジン、ヒノキチオール、イソプロピルメチルフェノール、オクトピロックス、感光色素１０１、感光色素２０１、ソルビン酸カリウム、フェノール等が挙げられる。

毛根賦活剤としては、Ｎ−アセチル−Ｌ−メチオニン、アデノシン、アデニン、アデノシン三リン酸ジナトリウム、タマサキツヅラフジ、セファランチン、アスパラギン酸カリウム、感光色素３０１、ペンタデカン酸グリセリド、パントテン酸、パントテン酸エチル、パンテノール、チクセツニンジン、ビオチン、モノニトログアヤコールナトリウム、酵母エキス、ニンニクエキス、真珠蛋白抽出液、タイソウエキス、プラセンタエキス、ローヤルゼリー等が挙げられる。

抗炎症剤としてはカンゾウエキス、グリチルレチン酸及びその誘導体、グリチルレチン酸類、アズレン、グアイアズレン、抗ヒスタミン剤、酢酸ヒドロコルチゾン、プレドニゾロン、オウゴンエキス、カミツレエキス、クマザサエキス、シラカバエキス、ゼニアオイエキス、桃葉エキス、セイヨウノコギリソウエキス、キキョウエキス、ボダイジュエキス等が挙げられ、グリチルリチン酸誘導体としては、例えばグリチルリチン酸ジカリウム、グリチルリチン酸モノアンモニウム等が挙げられ、グリチルレチン酸類としては、例えばグリチルレチン酸（β−グリチルレチン酸）、グリチルレチン酸グリセリン，グリチルレチン酸ステアリル等が挙げられる。

ビタミン剤としてはビタミンＡ、ビタミンＢ₂、ビタミンB₃、ビタミンＢ₅、ビタミンＢ₆、ビタミンＢ₁₂、ビタミンＤ、ビタミンＥ、ビタミンＦ、ビタミンＰやそれらの薬学的に許容される誘導体または塩等があげられる。

アミノ酸剤としてはアスパラギン、グルタミン、リジン、アルギニン、ヒスチジンアルギニン、グリシン、アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、セリン、トレオニン、システイン、プロリン、ヒドロキシプロリン、オルニチン、クレアチン、ガンマアミノ酪酸、テアニン及びこれらのアシル化誘導体または塩があげられる。

この中でもまつ毛や眉毛に塗布することを考えると目に入った場合にも安全で刺激の少ない成分であることが好ましい。このような観点からは５-αリダクターゼ阻害剤、リパーゼ阻害剤、抹消血管血流促進剤、毛根賦活剤、抗炎症剤、ビタミン剤、アミノ酸剤が好ましく、抗炎症剤、ビタミン剤、アミノ酸剤が特に好ましい。

また、別の観点からは塗布時にべたつきがなく、安定な製剤が得られやすい成分が好ましい、このような観点からは水溶性成分や、リン酸エステル、コハク酸エステル、配糖体などの水溶性誘導体およびその塩が好ましい。本発明において水溶性とは、25℃の精製水に１質量％以上溶解するものを指す。具体的にはビタミンB類、ニコチン酸、レゾルシン、ニコチン酸アミド、トウガラシチンキ、カンタリスチンキ、ショウキョウチンキ、サリチル酸、乳酸、パントテン酸、パンテノール、アデノシン、アデニン、アスパラギン、バリン、アラニン、グリシン、グルタミン、グルタミン酸、アルギニン、システイン、セリン、クレアチン、テアニン、グリチルリチン酸、グリチルリチン酸ジカリウム、グリチルリチン酸モノアンモニウムなどが特に好ましい。

両者の観点を備えた特に好ましい成分としてはニコチン酸、ニコチン酸アミド、レゾルシン、ピリドキシン塩酸塩、アデノシン、アデニン、アデノシン三リン酸ジナトリウム、ビオチン、パンテノール、グリチルリチン酸、グリチルリチン酸ジカリウム、グリチルリチン酸モノアンモニウム、ビタミンＢ₂、ビタミンB₃、ビタミンＢ₅、ビタミンＢ₆、ビタミンＢ₁₂、アスパラギン、バリン、アラニン、グリシン、グルタミン、グルタミン酸、アルギニン、システイン、セリン、クレアチン、テアニン、などがあげられる。

成分（Ａ）の含有量は、本発明の組成物中、０．００１〜１０質量％、好ましくは０．０１〜５質量％、より好ましくは０．１〜１質量％であれば育毛効果に優れる。成分（Ａ）は１種または２種以上を組み合わせて用いることができる。

本発明における成分（Ｂ）はＤＮＡ損傷抑制剤である。

近年、毛包の立毛筋の付着部にあるバルジと呼ばれる領域に、毛髪の元となる毛包幹細胞が存在することが明らかとなった。バルジ領域に存在する毛包幹細胞は、毛周期の成長期初期に活性化され、毛母を形成する。そのため、成長期毛の活発に分裂、増殖する毛球部の毛母細胞が障害を受けると成長期が中断され脱毛に至る。これは成長期脱毛と呼ばれる。また、毛球部の毛母細胞が徐々に障害されると、多くの成長期毛が休止期に移行し、脱毛をきたす。これは休止期脱毛と呼ばれる。したがって、毛包幹細胞や毛母細胞のDNAが損傷されると、毛母細胞への分化や増殖に障害を生じてヘアサイクルが乱れ、脱毛や薄毛化が促進される。

また、毛包幹細胞や毛母細胞以外の細胞であってもDNAに重篤な損傷が生じると、アポトーシスの誘導や細胞周期の停止が起き、細胞の正常な分化や増殖が行われなくなる。また、DNAが損傷を受けたが、アポトーシスを誘導するには十分でない場合、損傷を受けた細胞が未修復のDNAを複製し、エラーを生じた遺伝情報が細胞のDNAに残されるため、細胞老化が促進され、細胞の種々の機能が低下することも知られている。

このようなDNA損傷には「活性酸素」が関与していると考えられている。この活性酸素を抑制するために抗酸化剤を使用することがある。しかし、一般的な抗酸化剤を生細胞に添加した場合には活性酸素やその他の生体成分との反応生成物が、細胞やDNAを損傷するなど予期せぬ事態を引き起こすこともある（例えば、参考文献１：Biochemical Pharmacology,66,(2003),1769-1778、参考文献２：Food and Chemical Toxicology,49,(2011),955-962等参照）。参考文献１及び２には、茶に含まれる強力な抗酸化成分であるカテキンやエピガロカテキンガレートが、生体内に存在する銅（II）イオンや鉄（III）イオンと相互作用し、その反応生成物がDNA損傷を引き起こすことが示されている。さらに、DNA損傷は生細胞内で起きているという観点で考えた場合、被験物質がDPPHラジカルスカベンジ反応やESRなどの化学的な抗酸化作用をどの程度示すかの試験が、生細胞内のDNAの損傷抑制を評価する際に有効な手法とは言い難いものがある。

DNA損傷には、酸化修飾や脱アミノ化、チミジン２量体の形成、一本鎖切断、二重鎖切断等の様々な形態がある。これらのなかでも二重らせん構造を構成するDNA二重鎖が同時に切断されるいわゆる二重鎖切断は、修復するための鋳型を持たないことからより深刻な損傷であるといえる。

本願の成分（Ｂ）は活性酸素消去能の有無にかかわらずDNA損傷抑制活性を有するものである。ある対象がDNA損傷抑制活性を有するか否か、又はどの程度その活性を有するかは、当業者であれば、公知の手段を用いて確認・測定することができる。抗γH2AX抗体を用いる方法、コメットアッセイ法（シングルセルゲルアッセイ（SCG）法ということもある。）、小核試験法、DNA unwinding法、8-ヒドロキシデオキシグアノシン（8-OHdG）測定法等により、評価することができる。抗γH2AX抗体を用いる方法は、DNA二重鎖切断が生じた箇所近傍のヒストンH2AXタンパク質のリン酸化を特異的に検出することにより、DNA損傷を評価する手法である。コメットアッセイ法は、スライドグラス上のゲル中に埋め込んだ細胞を電気泳動したときにDNAに損傷がある条件では、核DNAが彗星のように尾を引くことを利用して、DNA損傷を評価する手法である。これらはDNA損傷の中でも最も深刻な二重鎖切断の抑制効果を判別できることから、より深刻な損傷に対して有効なDNA損傷抑制を評価する際に有効な手法と言える。

成分（Ｂ）の含有量は、本発明の組成物中、０．０００１〜１質量％、好ましくは０．００１〜０．５質量％、より好ましくは０．０１〜０．１質量％であれば育毛効果に優れる。成分（Ｂ）は１種または２種以上を組み合わせて用いることができる。

本発明における成分（Ｃ）は表皮幹細胞性機能向上剤である。

本発明で「幹細胞性」というときは、特に記載した場合を除き、自己複製能及び多分化能を有し、増殖性であることをいう。また、本発明で「表皮幹細胞」というときは、特に記載した場合を除き、表皮もしくはその近辺に存在して、自己複製能を有し、かつ表皮に見られる主要な特化細胞に分化する能力を有し、増殖性である細胞をいう。

表皮の幹細胞性が失われると、各種表皮生理機能の低下が生じる。より具体的にはターンオーバーの遅延、それに伴う表皮生細胞層の菲薄化、それに伴うしわの形成が生じうる事が知られていたが、毛髪やまつ毛、眉毛などの成長・維持との関連についてはまったく知られていなかった。

ある成分が、表皮幹細胞性機能向上剤の有効成分たり得るか否かは、表皮の三次元的再構築体を作成し、生細胞層が角化せずに形態が維持されている期間を比較することで評価が可能であるが、より簡易的な方法として表皮細胞を用いたコロニー形成試験により評価し、判断することができる。

なお、本発明で「幹細胞性機能」というときは、特に記載した場合を除き、「コロニー形成能」、「幹細胞分化抑制」などと言い換えることができる。また、表皮幹細胞は、皮膚の表皮の主として基底層に存在することから、本発明の剤を、「基底層処置剤」、「基底層改善剤」と言い換えることができる。

成分（Ｃ）の含有量は、本発明の組成物中、０．０００１〜１質量％、好ましくは０．００１〜０．５質量％、より好ましくは０．０１〜０．１質量％であれば育毛効果に優れる。成分（Ｃ）は１種または２種以上を組み合わせて用いることができる。

本発明の組成物の配合形態としては化粧料、医薬部外品、医薬品、サプリメント、動物用飼料などが上げられ、特に化粧料、医薬部外品に好適に使用できる。
具体的には例えば、基礎化粧料、メイクアップ化粧料、頭髪用化粧料などに適用可能であり、好適には頭髪、眉毛、まつ毛の養毛料、育毛料に適用できる。
また、本発明の形態は分散液、軟膏、液剤、錠剤、エアゾール、リニメント剤等のいずれの形態であってもよい。

本発明の組成物には、さらに目的に応じて、本発明の効果を損なわない量的、質的範囲で、多価アルコール、油分、アニオン性界面活性剤、カチオン性界面活性剤、両性界面活性剤、非イオン性界面活性剤、水溶性高分子、紫外線吸収剤、防腐剤、蛋白質及びその誘導体、多糖類、金属イオン封鎖剤、酸化防止剤、抽出エキス、香料、着色剤、ｐＨ調節剤、消臭剤、各種薬効成分等を配合することができる。本発明の組成物とは、育毛作用、発毛作用、発毛促進作用、養毛作用、脱毛防止作用、ツヤ、ハリ、コシなどの改善等のいずれか１つまたは２つ以上の作用を有する組成物を意味する。

以下、実施例を挙げて本発明を更に具体的に説明するが、本発明の範囲は下記の実施例に限定されることはない。

＜製造例１：ビワ抽出物の調製＞
バラ科ビワ属ビワ（Eriobotrya japonica）の葉100ｇを細切し、これに80体積％エタノール200ｍLを加えて70℃で加熱して3時間抽出を行った。抽出液を濾過後、溶媒を留去して乾固し、固形分であるビワ抽出物2.0ｇを得た。

＜製造例2：シャクヤク抽出物の調製＞
ボタン科ボタン属シャクヤク（Paeonia lactiflora）の根100ｇを細切し、これに50体積％1,3-ブチレングリコール500ｍLを加えて60℃で４時間抽出した後、20℃に冷却してから濾過した。ろ液を5℃で7日間静置して熟成させた後、濾過した。濾液の溶媒を留去して乾固し、固形分であるシャクヤク抽出物5.1ｇを得た。

＜製造例3：イラクサ抽出物の調製＞
イラクサ科イラクサ属セイヨウイラクサ（Urtica dioica）の葉100ｇを細切し、これに50体積％1,3-ブチレングリコール500ｍLを加えて室温で7日間抽出した後、濾過した。ろ液を5℃で7日間静置して熟成させた後、濾過した。濾液の溶媒を留去して乾固し、固形分であるイラクサ抽出物5.0ｇを得た。

＜製造例４：シダ（ブレクナム・ディスカラー種）抽出物の調製＞
シダ目シシガシラ科（Blechnaceae）ヒリュウシダ属（Blechnum）ブレクナム・ディスカラー（Blechnum discolor）の葉１００ｇを細切し、これに８０％エタノール２Ｌを加えて８５℃で加熱して１日間抽出を行った。抽出液を濾過後濃縮し、水とエタノールを添加して、エタノール濃度を２０％、全量を３００ｍLに調整した後に冷所に１週間静置し生じた沈殿を取り除いた。その後、活性炭を用いて濾過を行い、溶媒を留去して乾固し、固形分であるシダ抽出物を得た。収量は３ｇであった。

＜製造例５：トウネズミモチ抽出物の調製＞
トウネズミモチの実及び葉の乾燥物（新和物産株式会社）から、次のようにして抽出物を得た。
原料を適当な大きさに粉砕し、50gを、室温で1週間、10倍量の50体積％エタノールに浸漬し、得られた浸漬液を、ろ過して固形分を除いた後に、エバポレータで濃縮後した。残渣を減圧乾燥して、粉末状の抽出物20gを得た。

＜製造例６：ショウブ抽出物の調製＞
ショウブ科ショウブ属ショウブ（Acorus calamus）の根茎100ｇを細切し、これに90体積％エタノール500ｍLを加えて加熱抽出した後濾過した。残渣を90体積％エタノール500ｍLで同様に抽出し全抽出液を合わせ、50℃で減圧濃縮し濃縮液約300mLを得た。この液にエタノールを加えてエタノール濃度を50体積％、全量450mＬに調製した。この液を8日間冷所に放置して熟成させた後、濾過した。濾液の溶媒を留去して乾固し、固形分であるショウブ抽出物2.0ｇを得た。

＜製造例７：リンゴ抽出物の調製＞
バラ科リンゴ属セイヨウリンゴ（Malus pumil）の、果径20ｍｍ以内であって、落花後1ヶ月以内の幼果（未熟果）に対し、13倍量の20％(w/w)1,3-ブチレングリコール（1,3-Butylene Glycol）水溶液を加え、室温にて2日間抽出した。溶媒を除去した固形分濃度は0.3％であった。

＜試験例１：ＤＮＡ損傷抑制試験1 抗γＨ２ＡＸ抗体法＞
ヒトメラノサイト（クラボウ社製）を増殖因子ＨＭＧＳ添加２５４培地（ライフテクノロジーズ社製）を用いてガラスボトムディッシュに播種した。播種翌日に各種抽出物を添加し、３７℃５％ＣＯ_２存在下で１週間培養した。その後、ＨＡＮＫＳ液に交換した後、過酸化水素を最終濃度０．１mmol／Ｌ、各種抽出物を添加し１時間培養してＤＮＡ損傷を誘導した。また抽出物を添加せずに同様のＤＮＡ損傷誘導を行った細胞をコントロールとした。
ＤＮＡ障害を誘導した細胞を４％パラホルムアルデヒド溶液で細胞の固定を行い、１次抗体として抗γＨ２ＡＸ抗体（Phospho-Histone H2AX, Cell Signaling社製）を添加し４℃で１２時間反応させた。続いて２次抗体（Alexa Flour 546 Anti-rabbit IgG, Molecular Probes社製）を室温で２時間処理した。
ＰＢＳで洗浄した後に封入剤（DAPI-Fluoromount-G, SouthernBiotech社製）で処理し蛍光顕微鏡下で全細胞数及びγＨ２ＡＸ陽性細胞の数を計測した。ＤＮＡ損傷抑制率を下記の式にて計算し、結果を表１に示す。

＜試験例2：DNA損傷抑制試験2 コメットアッセイ＞
ヒト皮膚繊維芽細胞を、1×10cells/mlの密度で懸濁してφ10cmディッシュに10ml接種した後、2日間培養した。その後、培地を0.1ｍMの過酸化水素を含むHANKS液に置換し、次いで直ちに抽出物を添加した。約1時間インキュベーションした後、トリプシン処理により細胞を集め、0.5％低融点アガロース中に細胞を包埋し（スライドグラス上に薄いゲル層を形成）、Lysis溶液（2.5MNaCl、100mMEDTA-2Na、1%N-laurylsarcosine、1%TritonX-100、10%DMSO、NaOHでpHを10に調整）で処理した後、0.5Ａ、25Ｖにて20分間電気泳動を行った。陰性コントロールとして、過酸化水素を加えないもの、陽性コントロールとして、過酸化水素を添加するが、抽出物の代わりにPBSを添加したものを用いた。

電気泳動後、400ｍＭ Tris・HCl(pH7.5)に浸して中和した後、2μg／mlエチジウムブロマイド溶液で染色し、蛍光顕微鏡にて観察し、また写真撮影を行った。

コメットアッセイにおいては、ＤＮＡ損傷（断片化）の程度によって細胞から漏れ出すＤＮＡの泳動距離が異なり、損傷の程度が大きいものほど流星が長く「尾」を引いたような泳動像を示す。したがって、「尾」を引かない（あるいは短い）細胞の割合が多いほどＤＮＡの損傷が抑制されたことになる。撮影した写真を用いて、下記の分類基準に従い、個々の細胞を「尾」の長さによって分類し評価を行った。

[分類基準]
Type 1：尾がない
Type 2：尾が頭部直径の1／4未満
Type 3：尾が頭部直径の1／4以上1未満
Type 4：尾が頭部直径の1以上
Type 5：尾のみ（頭部が不明瞭又は小さいもの）

各コントロール、抽出物についてのDNA損傷抑制活性を示すグラフを図1に示した。これらの結果より、トウネズミモチ抽出物の実抽出物及び葉抽出物は、ＤＮＡ損傷抑制活性を有することが認められた。

＜試験例３：表皮幹細胞機能性向上試験＞
下記の手順で、コロニー形成試験を実施した。表皮幹細胞を用いたコロニー形成試験は、典型的には、下記の方法及び判断基準によるがこれに限定されるものではない。
(1)ヒト由来ケラチノサイト前駆細胞を、60 mmの細胞培養用ディッシュに播種する。
・使用細胞：ヒト由来ケラチノサイト前駆細胞（CELLnTEC Advanced Cell Systems AG (Bern, Switzerland)）
・使用培地：CnT-57 growth medium (CELLnTEC)
・播種量： 1×10⁵ cells／60 mm dish (21.3 cm²)
(2) 培養一日後より、サンプルを添加する。CnT-57 growth medium (CELLnTEC)
(3) 2日置きに培養液交換する。同時にサンプルも添加する。
(4)培養8日後にディッシュを回収し、フォルマリン固定後クリスタルバイオレットにて染色する。
(5)観察及び／又は写真撮影する。

〔判断基準〕
対照として、同じ表皮細胞について試験対象成分を含まない培地を用いた系を準備する。
そして、コロニーの数をカウントし、対照より増加し、かつ濃度依存的に増加した場合に、幹細胞性を維持させるために適した成分であると判断する。コロニー数は、小さいものと大きいものに分けてカウントしてもよく、大きいコロニー数が増えているものほど幹細胞性機能向上効果が高いと判断する。
試験結果を表2に示す。

実施例 まつ毛用養毛剤
表3に示す組成の養毛剤を調製した。20〜40代の女性に片目ずつ実施品と比較品をランダムに割付（１サンプル10眼）、1日2回以上、2週間使用してもらい、アンケート調査を行った。アンケートの各項目に対し「効果があった」と答えた人数を含め表3に示す。

〔製造方法〕
（Ａ）Ｎｏ．２〜８をＮｏ．１の一部に均一に分散する。
（Ｂ）ＡにＮｏ.9〜２０とＮｏ．１の残部を加えまつ毛用養毛剤を得た。

実施例 養毛料
表４の養毛料を作成した。各サンプルを40〜50代の男性5名づつに1ヶ月使用してもらい、アンケートを行った。結果を含め表４に示す。

〔製造方法〕
Ｎｏ.1〜１７を均一に溶解し養毛料を得た。

実施例 まつ毛用美容液
20代の女性10名を２群に分け、表5の実施例、又は比較例を片目だけに８週間使用してもらい使用前後を撮影した。結果を図２に示す。

〔製造方法〕
（Ａ）Ｎｏ.2〜7をＮｏ.1に均一分散する。
（Ｂ）（Ａ）にＮｏ.8〜13を加え、まつ毛用美容液を得た。

実施例21 眉毛用美容液
（成分） （質量％）
１．ポリオキシプロピレンブチルエーテルリン酸（３５Ｐ．Ｏ．） １．０
２．ポリオキシプロピレンモノブチルエーテル（６０Ｐ．Ｏ．） １．０
３．ニコチン酸トコフェロール ０．５
４．グリチルリチン酸ジカリウム ０．５
５．製造例３のイラクサ抽出物 ０．０１
６．製造例７のリンゴ抽出物 ０．０１
７．エチルアルコール ５．０
８．１，３ブチレングリコール １０．０
９．黒色酸化鉄 ０．１
１０．黄色酸化鉄 ０．５
１１．赤色酸化鉄 ０．３
１２．香料 適量
１３．精製水 残量

〔製造方法〕
Ａ ８〜１１を分散する。
Ｂ 1〜７、１２、１３を均一に混合する。
Ｃ ＢにＡを分散し、眉毛用美容液を得た。

実施例22 エアゾール型養毛料
（成分） （質量％）
１．センブリエキス １．０
２．製造例４のシダ抽出物 ０．０１
３．製造例７のリンゴ抽出物 ０．０１
４．ｌ−メントール ０．３
５．エチルアルコール ５０．０
６．精製水 残量

〔製造方法〕
Ａ １〜６を均一に混合し原液を得る。
Ｂ 缶に原液を充填し、バルブ装着する。
Ｃ 原液／炭酸ガス＝９５／５になるよう炭酸ガスを充填し、養毛料を得た。

本発明によれば、頭髪のみならずまつ毛、眉毛にも有効な育毛用組成物を提供する。本発明の剤又は組成物は、化粧品、医薬部外品、医薬品として用いることができる。

Claims (11)

1. 次の成分（Ａ）〜（Ｃ）
   （Ａ）育毛有効成分
   （Ｂ）ＤＮＡ損傷抑制剤
   （Ｃ）表皮幹細胞機能性向上剤
   を含有する育毛用組成物。
2. 成分（Ａ）育毛有効成分が卵胞ホルモン剤、5-αリダクターゼ阻害剤、リパーゼ阻害剤、末梢血管血流促進剤、局所刺激剤、殺菌剤、毛根賦活剤、抗炎症剤、ビタミン剤、アミノ酸剤の１種または２種以上から選ばれる請求項1記載の育毛用組成物。
3. 成分（Ａ）育毛有効成分が５-αリダクターゼ阻害剤、リパーゼ阻害剤、抹消血管血流促進剤、毛根賦活剤、抗炎症剤、ビタミン剤、アミノ酸剤の１種または２種以上から選ばれる請求項1又は２記載の育毛用組成物。
4. 成分（Ａ）育毛有効成分が水溶性である請求項1〜３のいずれかに記載の育毛用組成物。
5. 成分（Ａ）育毛有効成分がニコチン酸、ニコチン酸アミド、レゾルシン、ピリドキシン塩酸塩、パンテノール、アデノシン、アデニン、アデノシン三リン酸ジナトリウム、ビオチン、グリチルリチン酸、グリチルリチン酸ジカリウム、グリチルリチン酸モノアンモニウム、ビタミンＢ₂、ビタミンB₃、ビタミンＢ₅、ビタミンＢ₆、ビタミンＢ₁₂、アスパラギン、バリン、アラニン、グリシン、グルタミン、グルタミン酸、アルギニン、システイン、セリン、クレアチン、テアニン、及びこれらの薬学的に許容される塩又は誘導体である請求項１〜４のいずれかに記載の育毛用組成物。
6. 成分（Ｂ）ＤＮＡ損傷抑制剤の指標が抗γH2AX抗体法、コメットアッセイ法である請求項１〜５のいずれかに記載の育毛用組成物。
7. 成分（Ｂ）ＤＮＡ損傷抑制剤がビワ、シャクヤク、イラクサ、シダ、トウネズミモチの１種または２種以上から選ばれる植物又はその抽出物である請求項１〜６のいずれかに記載の育毛用組成物。
8. 成分（Ｃ）表皮幹細胞機能性向上剤の指標がコロニー試験法である請求項１〜７のいずれかに記載の育毛用組成物。
9. 成分（Ｃ）表皮幹細胞機能性向上剤がショウブ、リンゴの１種または２種以上から選ばれる植物又はその抽出物である請求項１〜8のいずれかに記載の育毛用組成物。
10. まつ毛用である請求項１〜９のいずれかに記載の育毛用組成物。
11. 請求項１〜１０のいずれかに記載の組成物を皮膚、毛髪、眉毛、まつ毛に適用することを特徴とする、育毛方法。