JP5783648B2 - 乳酸菌を利用したメラニン産生抑制用又は育毛・発毛用皮膚外用剤 - Google Patents
乳酸菌を利用したメラニン産生抑制用又は育毛・発毛用皮膚外用剤 Download PDFInfo
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本発明は、特定の乳酸菌を含有する皮膚外用剤に関し、詳しくは、ラクトコッカス属乳酸菌を有効成分とするメラニン産生抑制剤または育毛・発毛剤に関する。
乳酸菌によるヒトの健康や美容に対する効果は広く知られ、食品や飲料として食生活の中に取り込まれて活用されてきている。ラクトコッカス属乳酸菌は、乳製品製造において古くから利用されており、乳酸菌の中でも高い安全性を有するグループとして広く関心を集めている。ラクトコッカス属乳酸菌の生理的効用としては、経口投与による整腸効果、免疫賦活効果、老化抑制効果等が知られている（例えば特許文献１、２参照）。
外用での乳酸菌の効用としては、例えばロイコノストック属乳酸菌がメラニン生成抑制作用を有すること（例えば特許文献３参照）や、ラクトバチルス属、ペディオコッカス属、ロイコノストック属の乳酸菌が養毛・育毛作用を有すること（例えば特許文献４参照）が知られている。また、乳酸菌成分を使用した化粧品が複数上市されている。
しかしながら、ラクトコッカス属乳酸菌の外用における生理的効用はこれまで報告されていない。
しかしながら、ラクトコッカス属乳酸菌の外用における生理的効用はこれまで報告されていない。
本発明の課題は、乳酸菌の中でも安全性が高いラクトコッカス属乳酸菌を利用した皮膚外用剤を初めて提供することであり、特にメラニン産生抑制剤および育毛・発毛剤を提供することである。
本発明者は、ラクトコッカス属乳酸菌の中から外用での優れた生理活性を有する菌株を鋭意探索した結果、ラクトコッカス・ラクティス・サブスピーシーズ クレモリス（Lactococcus lactis subsp. cremoris） H61株およびラクトコッカス・ラクティス・サブスピーシーズ ラクティス（Lactococcus lactis subsp. lactis） G50株が特に優れた美白作用および育毛・発毛作用を有することを見出し、本発明に到達した。
すなわち、請求項１に係る本発明は、ラクトコッカス・ラクティス・サブスピーシーズ クレモリス（Lactococcus lactis subsp. cremoris） Ｈ６１株（ＮＩＴＥ Ｐ−９２）の抽出物を有効成分として含有することを特徴とするメラニン産生抑制用皮膚外用剤である。
請求項２に係る本発明は、ラクトコッカス・ラクティス・サブスピーシーズ クレモリス（Lactococcus lactis subsp. cremoris） Ｈ６１株（ＮＩＴＥ Ｐ−９２）及びラクトコッカス・ラクティス・サブスピーシーズ ラクティス（Lactococcus lactis subsp. lactis） Ｇ５０株（ＦＥＲＭ Ｐ−１８４１５）の抽出物を有効成分として含有することを特徴とする育毛・発毛・脱毛抑制用皮膚外用剤である。
請求項２に係る本発明は、ラクトコッカス・ラクティス・サブスピーシーズ クレモリス（Lactococcus lactis subsp. cremoris） Ｈ６１株（ＮＩＴＥ Ｐ−９２）及びラクトコッカス・ラクティス・サブスピーシーズ ラクティス（Lactococcus lactis subsp. lactis） Ｇ５０株（ＦＥＲＭ Ｐ−１８４１５）の抽出物を有効成分として含有することを特徴とする育毛・発毛・脱毛抑制用皮膚外用剤である。
本発明によれば、乳酸菌の中でも安全性が高いラクトコッカス属乳酸菌を利用した皮膚外用剤が初めて提供される。特に、ラクトコッカス属の特定の乳酸菌株またはその抽出物を有効成分とするメラニン産生抑制剤および育毛・発毛剤が初めて提供される。育毛・発毛・脱毛抑制作用については、H61株とG50株がヘアサイクルの中の異なる時期にそれぞれ顕著な効果を発揮することから、両菌株を併用することによって、より効果の高い育毛・発毛剤を提供できる。また、当該乳酸菌株の機能性は死菌体またはその抽出物でも見られることから、様々な形態での利用が可能である。
以下、本発明を詳細に説明する。
本発明は特定の乳酸菌またはその抽出物を有効成分として含有する皮膚外用剤に関するものである。
本発明は特定の乳酸菌またはその抽出物を有効成分として含有する皮膚外用剤に関するものである。
〔乳酸菌について〕
本発明の乳酸菌としては、ラクトコッカス・ラクティス・サブスピーシーズ クレモリス H61株（以下、「H61」と略記することもある。）及び／又はラクトコッカス・ラクティス・サブスピーシーズ ラクティス G50株（以下、「G50」と略記することもある。）を用いる。本発明において両菌株は単独で用いても、混合して用いても良い。
本発明の乳酸菌としては、ラクトコッカス・ラクティス・サブスピーシーズ クレモリス H61株（以下、「H61」と略記することもある。）及び／又はラクトコッカス・ラクティス・サブスピーシーズ ラクティス G50株（以下、「G50」と略記することもある。）を用いる。本発明において両菌株は単独で用いても、混合して用いても良い。
H61は、本発明者が経口投与による老化抑制剤として既に特許（特許第4604207号）を取得している乳酸菌株であり、独立行政法人製品評価技術基盤機構 特許微生物寄託センターに受託番号NITE P-92として寄託されている。また、本菌株は独立行政法人農業生物資源研究所の農業生物資源ジーンバンクにもMAFF No.400007として寄託されている。しかし、H61が皮膚外用剤として有用な機能性を有することは、これまで知られていない。
本発明において、H61の培養は一般的な乳酸菌の培養法に従って行うことができる。
本発明において、H61の培養は一般的な乳酸菌の培養法に従って行うことができる。
G50は、本発明者が経口投与により免疫賦活作用を有する乳酸菌株として既に特許（特許第3671212号）を取得している乳酸菌株であり、独立行政法人製品評価技術基盤機構 特許微生物寄託センターに受託番号FERM P-18415として寄託されている。しかし、G50が皮膚外用剤として有用な機能性を有することは、これまで知られていない。
本発明において、G50の培養は一般的な乳酸菌の培養法に従って行うことができる。
本発明において、G50の培養は一般的な乳酸菌の培養法に従って行うことができる。
〔皮膚外用剤〕
本発明に係る皮膚外用剤は、上記乳酸菌またはその抽出物を含有することを特徴とする。
本発明において「皮膚外用剤」とは、皮膚上に投与する形態の組成物の総称であって、皮膚外用医薬組成物、医薬部外品、化粧料、皮膚洗浄料、浴用剤などを総括して意味する言葉である。当該皮膚外用剤の形態は特に限定されるものではなく、使用方法に応じて、例えばローション、乳液、ゲル、クリーム、軟膏剤、粉末、顆粒、経皮吸収剤等の種々の剤型の製剤とすることができる。
本発明に係る皮膚外用剤は、上記乳酸菌またはその抽出物を含有することを特徴とする。
本発明において「皮膚外用剤」とは、皮膚上に投与する形態の組成物の総称であって、皮膚外用医薬組成物、医薬部外品、化粧料、皮膚洗浄料、浴用剤などを総括して意味する言葉である。当該皮膚外用剤の形態は特に限定されるものではなく、使用方法に応じて、例えばローション、乳液、ゲル、クリーム、軟膏剤、粉末、顆粒、経皮吸収剤等の種々の剤型の製剤とすることができる。
本発明の皮膚外用剤は上記乳酸菌またはその抽出物を有効成分として含み、当該皮膚外用剤の調製は公知の方法に従って行うことができる。本発明の皮膚外用剤には、上記乳酸菌またはその抽出物以外にも、本発明の効果を奏する範囲内で、各種担体や添加剤、他の薬効成分などが含まれていても良い。
本発明においては、上記乳酸菌の培養物をそのまま皮膚外用剤として使用しても良いが、当該培養物について常法により濃縮、洗浄、精製、滅菌、pH調整、脱臭、脱色等の処理を行ったものを用いても良い。上記乳酸菌の培養物は、例えばTYG培地などを用いて、通性嫌気の条件下で1〜2日間程度培養することにより得ることができる。また上記培養物から遠心分離により菌体を集菌することができ、さらに生理食塩水や滅菌水などで1〜2回洗浄して用いることもできる。
また、本発明の乳酸菌は生菌体であっても死菌体であっても同等の機能性を発揮することから、本発明の皮膚外用剤において上記乳酸菌は特に生菌として含まれる必要はない。一般的な加熱滅菌操作による殺菌・滅菌処理物や、破砕物、凍結乾燥物等として含まれていても良い。
本発明において「抽出物」とは、上記乳酸菌の生菌体または死菌体を加熱処理した後に通常の方法で抽出するか、加熱処理しない場合には熱水（85〜100℃）を用いて通常の方法で抽出することにより得ることができる。例えば代表的には、上記乳酸菌培養物から集菌して得た菌体を生理食塩水で洗浄し、加熱処理をしてから凍結乾燥し、それを抽出溶媒に懸濁し、遠心分離して菌体を除去することによって得ることができる。
抽出溶媒としては、生理食塩水、滅菌水、培地などが挙げられる。
上記抽出物はそのまま用いても良く、濃縮乾固等して用いても良い。
抽出溶媒としては、生理食塩水、滅菌水、培地などが挙げられる。
上記抽出物はそのまま用いても良く、濃縮乾固等して用いても良い。
〔メラニン産生抑制用皮膚外用剤〕
本発明の乳酸菌は、後述の実施例に示すように優れたメラニン産生抑制作用を有しているため、本発明の皮膚外用剤はメラニン産生抑制剤として用いることができる。
本発明のメラニン産生抑制剤の剤型としては、例えば、ローション、乳液、ゲル、クリーム、軟膏剤、粉末、顆粒、経皮吸収剤等が例示される。
本発明の乳酸菌は、後述の実施例に示すように優れたメラニン産生抑制作用を有しているため、本発明の皮膚外用剤はメラニン産生抑制剤として用いることができる。
本発明のメラニン産生抑制剤の剤型としては、例えば、ローション、乳液、ゲル、クリーム、軟膏剤、粉末、顆粒、経皮吸収剤等が例示される。
本発明のメラニン産生抑制剤は、皮膚に塗布することによりメラニン産生抑制作用を発揮することができる。本発明のメラニン産生抑制剤における上記乳酸菌またはその抽出物の含有量は、メラニン産生抑制効果を奏する限り特に制限されないが、例えば、乾燥菌体として50μg〜10mg/mLとすることができ、好ましくは250μg〜1mg/mL、より好ましくは500μg〜1mg/mLとすることができる。乳酸菌抽出物の場合は、上記の菌体濃度に相当する菌体抽出物を含有することが好ましい。
本発明のメラニン産生抑制剤には、上記乳酸菌またはその抽出物以外に、通常皮膚外用剤で使用される任意成分を含有することができる。かかる任意成分としては、水、アルコール、油性成分、保湿剤、柔軟剤、界面活性剤、増粘剤、防腐剤、紫外線吸収剤、抗酸化剤、緩衝剤、色素、香料、粉体類、皮膚栄養剤等が例示できる。また、ビタミンC、ハイドロキノン、レゾルシノール、アルブチンおよびこれらの誘導体等、他のメラニン産生抑制剤を含有することもできる。
〔育毛・発毛用および／または脱毛抑制用皮膚外用剤〕
毛周期（ヘアサイクル）は成長期、退行期、休止期に分けられる。そのうち成長期では、毛乳頭に分布している毛細血管から栄養を受けて、毛母細胞が細胞分裂を行い、角化しながら次々に分裂してできる新しい細胞によって表皮側に押し上げられ、毛を形成していく。退行期では、毛細血管からの血液供給を受けられなくなった毛母細胞は分裂を停止し、毛が表皮側に押し上げられていく。休止期になると、毛乳頭と毛が完全に離れ、毛包との固着がなくなるため、シャンプーや摩擦などによって毛は自然と抜け落ち、やがて再び成長期の準備に入る。
毛周期（ヘアサイクル）は成長期、退行期、休止期に分けられる。そのうち成長期では、毛乳頭に分布している毛細血管から栄養を受けて、毛母細胞が細胞分裂を行い、角化しながら次々に分裂してできる新しい細胞によって表皮側に押し上げられ、毛を形成していく。退行期では、毛細血管からの血液供給を受けられなくなった毛母細胞は分裂を停止し、毛が表皮側に押し上げられていく。休止期になると、毛乳頭と毛が完全に離れ、毛包との固着がなくなるため、シャンプーや摩擦などによって毛は自然と抜け落ち、やがて再び成長期の準備に入る。
繊維芽細胞増殖因子（FGF-7）及び血管内皮増殖因子（VEGF）は、いずれも毛乳頭細胞から分泌される増殖因子である。FGF-7は、毛母細胞に作用してその増殖を促進することにより毛髪成長を促進し、ヘアサイクルでの成長期に有効であると考えられている。VEGFは、血管新生を促進し、それにより毛母細胞が活性化することで、発毛が促進されると考えられている。VEGFは血管新生因子であることから、成長期だけでなく、毛細血管の減少が始まる退行期にも有効であると考えられている。
本発明の乳酸菌またはその抽出物は、後述の実施例に示すように優れた毛乳頭細胞賦活作用、繊維芽細胞増殖因子産生促進作用、血管内皮増殖因子産生促進作用を有しているため、本発明の皮膚外用剤は育毛・発毛剤および／または脱毛抑制剤として用いることができる。
具体的には、毛乳頭細胞賦活化試験において、H61は細胞分裂を促進する効果が顕著であり、G50は細胞を維持する効果が顕著であると認められた。また、H61では高いFGF-7産生促進作用が、G50では高いVEGF産生促進作用が認められた。したがって、H61は成長期において育毛作用を発揮し、G50は成長期〜退行期において発毛・脱毛抑制作用を発揮するものと期待される。このように、H61とG50はヘアサイクルの中の異なる時期においてそれぞれ顕著な効果を発揮することから、両菌株を併用することによって、より効果の高い育毛・発毛・脱毛抑制剤を提供できる。
本発明の育毛・発毛・脱毛抑制剤の剤型としては、例えば、ローション、乳液、ゲル、クリーム、軟膏剤、ヘアートニック、リンス、シャンプー、ヘアーフォーム、ヘアーゲル等が例示される。
本発明の育毛・発毛・脱毛抑制剤は、皮膚に塗布することにより育毛・発毛・脱毛抑制作用を発揮することができる。本発明の育毛・発毛・脱毛抑制剤における上記乳酸菌またはその抽出物の含有量は、育毛・発毛・脱毛抑制効果を奏する限り特に制限されないが、例えば、乾燥菌体として0.1μg〜10mg/mLとすることができ、好ましくは1μg〜10mg/mL、より好ましくは1〜100μg/mLとすることができる。乳酸菌抽出物の場合は、上記の菌体濃度に相当する菌体抽出物を含有することが好ましい。
本発明の育毛・発毛・脱毛抑制剤には、上記乳酸菌またはその抽出物以外に、通常皮膚外用剤で使用される任意成分を含有することができる。かかる任意成分としては、水、アルコール、油性成分、保湿剤、柔軟剤、界面活性剤、増粘剤、防腐剤、紫外線吸収剤、抗酸化剤、緩衝剤、色素、香料、粉体類、皮膚栄養剤等が好ましく例示できる。また、アデノシン等、他の育毛・発毛剤または脱毛抑制剤を含有することもできる。
以下に実施例、および比較例を挙げて本発明を具体的に説明するが、本発明はこれらに限定されるものではない。
実施例１（ヒト毛乳頭細胞賦活効果）
毛乳頭細胞を被験物質（H61又はG50）添加下で培養後、生細胞数を測定し、また繊維芽細胞増殖因子（FGF-7）、血管内皮増殖因子（VEGF）産生量をELISA法にて測定した。
毛乳頭細胞を被験物質（H61又はG50）添加下で培養後、生細胞数を測定し、また繊維芽細胞増殖因子（FGF-7）、血管内皮増殖因子（VEGF）産生量をELISA法にて測定した。
（１）細胞
ヒト毛乳頭細胞（TOYOBO）は、白色人種、51歳女性由来のヒト頭髪毛乳頭培養細胞を購入して使用した。
ヒト毛乳頭細胞（TOYOBO）は、白色人種、51歳女性由来のヒト頭髪毛乳頭培養細胞を購入して使用した。
（２）ヒト頭髪毛乳頭細胞の培養条件
毛乳頭細胞は、付属の毛乳頭細胞専用培地（TOYOBO）を用い、CO２インキュベーター（5％CO２、37℃）内で培養した。培養に使用したフラスコはＩ型コラーゲンコート（Cellmatrix Type I-C、新田ゼラチン）して使用した。細胞の継代には付属の毛乳頭細胞専用サブカルチャーセット（TOYOBO）を用いて細胞をフラスコより剥離し、使用した。
毛乳頭細胞は、付属の毛乳頭細胞専用培地（TOYOBO）を用い、CO２インキュベーター（5％CO２、37℃）内で培養した。培養に使用したフラスコはＩ型コラーゲンコート（Cellmatrix Type I-C、新田ゼラチン）して使用した。細胞の継代には付属の毛乳頭細胞専用サブカルチャーセット（TOYOBO）を用いて細胞をフラスコより剥離し、使用した。
（３）被験物質調整
ラクトコッカス・ラクティス・サブスピーシーズ クレモリス H61およびラクトコッカス・ラクティス・サブスピーシーズ ラクティス G50は、予めそれぞれTYG培地で常法に従って一昼夜培養し、洗浄、加熱処理（121℃、15分間）を行った後、凍結乾燥して得られた乾燥菌体を被検物質とした。なお、当該乾燥菌体0.001mgあたりに含まれる菌数は×10５レベルであった。
ラクトコッカス・ラクティス・サブスピーシーズ クレモリス H61およびラクトコッカス・ラクティス・サブスピーシーズ ラクティス G50は、予めそれぞれTYG培地で常法に従って一昼夜培養し、洗浄、加熱処理（121℃、15分間）を行った後、凍結乾燥して得られた乾燥菌体を被検物質とした。なお、当該乾燥菌体0.001mgあたりに含まれる菌数は×10５レベルであった。
各被験物質を100mg/mL濃度となるよう毛乳頭細胞専用培地によく懸濁し、10倍濃縮溶液として使用した。また、濾過滅菌処理において前述懸濁液を遠心分離（12000×g、5分間）し、上清を低吸着タイプの0.45μm濾過滅菌フィルター（Millex-HV、Millex）にて滅菌処理を行った。濾過液を10倍濃縮溶液として使用した。
陽性対照のアデノシン（Wako）は25mg/mL濃度となるようジメチルスルホキシド（DMSO）（nacalai tesque）に溶解した。本試験ではアデノシン終濃度25μg/mLとし、このときの溶媒（DMSO）濃度は0.1％になる。
（４）細胞賦活試験
細胞を1.2×10４cells/0.3ｍｌ/ウェルで48ウェルプレートに播種した。CO２インキュベーター内（5％CO２、37℃）で、1日間培養後、被験物質（0.001mg/mL, 0.1mg/mL, 10mg/mL）を含む培地に置換した。その後、1日間及び3日間培養し、それぞれの細胞の増殖性（viability）を生細胞数測定試薬SF（nacalai tesque）で比較検討した。n＝3にて行った。その際、培養上清を回収し、後述のように培養上清中のFGF-7,VEGF産生量をELISA法で測定した。
細胞を1.2×10４cells/0.3ｍｌ/ウェルで48ウェルプレートに播種した。CO２インキュベーター内（5％CO２、37℃）で、1日間培養後、被験物質（0.001mg/mL, 0.1mg/mL, 10mg/mL）を含む培地に置換した。その後、1日間及び3日間培養し、それぞれの細胞の増殖性（viability）を生細胞数測定試薬SF（nacalai tesque）で比較検討した。n＝3にて行った。その際、培養上清を回収し、後述のように培養上清中のFGF-7,VEGF産生量をELISA法で測定した。
生細胞数測定において、培養上清を除去した細胞に生細胞数測定試薬SFを10％含む培地を添加（300μL/ウェル）した。添加後、30分、90分後に培養上清（100μL/ウェル）を別の96ウェルプレートに移し、マイクロプレートリーダーにて吸光度測定した。90分、30分の値から1時間あたりの吸光度変化量を算出した。
培養1日後の結果を図１に、培養3日後の結果を図２に示す。図中、‘Non’は未処理対照、‘25μg/mL Ade’はアデノシン25μg/mLを添加した陽性対照（DMSO濃度 0.1％）、‘0.1％DMSO’は前記陽性対照からアデノシンを除いたもの、縦軸は生細胞数と比例関係にある1時間当りの吸光度ABSの変化量（単位：ABS/hr）、をそれぞれ示す。
被験物質処理1日間ではH61株、G50株ともに低濃度域に細胞賦活性が認められた（図１）。H61株は0.001mg/mLで対照（Non）の1.28倍、G50株は0.1mg/mLで1.24倍であった。一方、被験物質処理3日間ではH61株、G50株ともに0.1mg/mL濃度区で最大の賦活性を示したが、G50株の方がより賦活性を示した（H61株は対照（Non）の1.47倍、G50株は2.21倍）（図２）。一方、陽性対照であるアデノシンは、1日間の処理で0.1％DMSO区の1.29倍に生細胞数が上昇したが、3日間の処理では細胞の賦活性が認められなかった。
被験物質処理1日間ではH61株、G50株ともに低濃度域に細胞賦活性が認められた（図１）。H61株は0.001mg/mLで対照（Non）の1.28倍、G50株は0.1mg/mLで1.24倍であった。一方、被験物質処理3日間ではH61株、G50株ともに0.1mg/mL濃度区で最大の賦活性を示したが、G50株の方がより賦活性を示した（H61株は対照（Non）の1.47倍、G50株は2.21倍）（図２）。一方、陽性対照であるアデノシンは、1日間の処理で0.1％DMSO区の1.29倍に生細胞数が上昇したが、3日間の処理では細胞の賦活性が認められなかった。
なお、培養上清回収前に細胞形態を顕微鏡観察したところ、H61、G50ともに細胞形態の異常は認められないことから大きな細胞毒性はないと判断できる。
（５）FGF-7産生試験
細胞を5×10３cells/0.1ｍｌ/ウェルで96ウェルプレートに播種したこと以外は、上述（４）の試験と同様の条件で培養した細胞から回収した培養上清を、測定まで-80℃で保存した。測定時に氷上で解凍し、FGF7 Human ELISA kit（abcam）にて培養上清中のFGF-7量を測定した。予備検討により培養上清を希釈せず、原液を測定することとした。詳細なプロトロールを以下に示す。
細胞を5×10３cells/0.1ｍｌ/ウェルで96ウェルプレートに播種したこと以外は、上述（４）の試験と同様の条件で培養した細胞から回収した培養上清を、測定まで-80℃で保存した。測定時に氷上で解凍し、FGF7 Human ELISA kit（abcam）にて培養上清中のFGF-7量を測定した。予備検討により培養上清を希釈せず、原液を測定することとした。詳細なプロトロールを以下に示す。
〔FGF-7測定プロトコール〕
(1)FGF-7標準原液（50ng/ml）をもとに、反応緩衝液を用いて400、133.3、44.44、14.81、4.94、1.65、0.55pg/mlのFGF-7標準溶液を調製する。
(2)FGF-7標準溶液および検体（培養上清）100μLをFGF-7固相化マイクロプレートの各ウェルに添加し、室温にて2時間30分反応する（一次反応）。
(3)ウェル内の溶液を除去し、洗浄液で4回洗浄する。
(4)ビオチン標識抗FGF-7抗体溶液を各ウェルに100μLずつ添加し、室温で60分間反応させる（二次反応）。
(5)ウェル内の溶液を除去し、洗浄液で4回洗浄する。
(6)ストレプトアビジン溶液100μLを各ウェルに添加し、室温で45分反応する。
(7)酵素基質溶液100μLを各ウェルに添加し、遮光・室温下で30分間静置する（発色反応）。
(8)反応停止溶液を各ウェルに50μlずつ添加し、プレートミキサーで1分間混和後、マイクロプレートリーダーで各ウェルの吸光度を測定する（測定波長450nm）。
(9)標準曲線から、検体中のFGF-7濃度を算出する。
(1)FGF-7標準原液（50ng/ml）をもとに、反応緩衝液を用いて400、133.3、44.44、14.81、4.94、1.65、0.55pg/mlのFGF-7標準溶液を調製する。
(2)FGF-7標準溶液および検体（培養上清）100μLをFGF-7固相化マイクロプレートの各ウェルに添加し、室温にて2時間30分反応する（一次反応）。
(3)ウェル内の溶液を除去し、洗浄液で4回洗浄する。
(4)ビオチン標識抗FGF-7抗体溶液を各ウェルに100μLずつ添加し、室温で60分間反応させる（二次反応）。
(5)ウェル内の溶液を除去し、洗浄液で4回洗浄する。
(6)ストレプトアビジン溶液100μLを各ウェルに添加し、室温で45分反応する。
(7)酵素基質溶液100μLを各ウェルに添加し、遮光・室温下で30分間静置する（発色反応）。
(8)反応停止溶液を各ウェルに50μlずつ添加し、プレートミキサーで1分間混和後、マイクロプレートリーダーで各ウェルの吸光度を測定する（測定波長450nm）。
(9)標準曲線から、検体中のFGF-7濃度を算出する。
培養1日後のFGF-7産生量を図３に、培養3日後のFGF-7産生量を図４に、それぞれ示す。図中、‘Non’は未処理対照、‘25μg/mL Ade’はアデノシン25μg/mLを添加した陽性対照（DMSO濃度 0.1％）、‘0.1％DMSO’は前記陽性対照からアデノシンを除いたもの、をそれぞれ示す。図３、４の縦軸は培養上清中の繊維芽細胞増殖因子FGF-7の量（単位：pg/mL）を示す。
処理１日間ではH61株、G50株ともに最高濃度である10mg/mLで顕著にFGF-7の産生を促進していた（H61株は対照（Non）の3.85倍、G50株は7.10倍）が、陽性対照であるアデノシンでは、0.1％DMSO区と比べてFGF-7の産生促進効果は見られなかった（図３）。処理3日間では、H61株において0.001mg/mL（1μg/mL）、0.1mg/mL（100μg/mL）もFGF-7の蓄積が認められた（それぞれ対照（Non）の1.57倍、1.48倍）（図４）。しかし、G50株は処理3日間で1μg/mL、100μg/mL濃度において10mg/mL区と同程度まで増加しなかった。陽性対照であるアデノシンは、処理期間3日間で0.1％DMSO区の1.66倍の増加を示した。
処理１日間ではH61株、G50株ともに最高濃度である10mg/mLで顕著にFGF-7の産生を促進していた（H61株は対照（Non）の3.85倍、G50株は7.10倍）が、陽性対照であるアデノシンでは、0.1％DMSO区と比べてFGF-7の産生促進効果は見られなかった（図３）。処理3日間では、H61株において0.001mg/mL（1μg/mL）、0.1mg/mL（100μg/mL）もFGF-7の蓄積が認められた（それぞれ対照（Non）の1.57倍、1.48倍）（図４）。しかし、G50株は処理3日間で1μg/mL、100μg/mL濃度において10mg/mL区と同程度まで増加しなかった。陽性対照であるアデノシンは、処理期間3日間で0.1％DMSO区の1.66倍の増加を示した。
（６）VEGF産生試験
上述（４）の試験の条件で培養した細胞から回収した培養上清を、測定まで-80℃で保存した。測定時に氷上で解凍し、Human VEGF Quantikine ELISA（R & D Systems）にて培養上清中のVEGF量を測定した。予備検討により培養上清を３倍希釈し測定することとした。詳細なプロトロールを以下に示す。
上述（４）の試験の条件で培養した細胞から回収した培養上清を、測定まで-80℃で保存した。測定時に氷上で解凍し、Human VEGF Quantikine ELISA（R & D Systems）にて培養上清中のVEGF量を測定した。予備検討により培養上清を３倍希釈し測定することとした。詳細なプロトロールを以下に示す。
〔VEGF測定プロトコール〕
(1)VEGF標準原液（2000pg/ml）をもとに、反応緩衝液を用いて1000、500、250、125、62.5、31.2、15.6pg/mlのVEGF標準溶液を調製する。
(2)VEGF標準溶液および検体（培養上清）200μLを、50μLの希釈溶液を各ウェルに添加したVEGF固相化マイクロプレートに添加し、室温にて2時間反応する（一次反応）。
(3)ウェル内の溶液を除去し、洗浄液で3回洗浄する。
(4)西洋ワサビペルオキシダーゼ結合VEGF抗体溶液を各ウェルに200μLずつ添加し、室温で2時間反応させる（二次反応）。
(5)ウェル内の溶液を除去し、洗浄液で3回洗浄する。
(6)基質溶液200μLを各ウェルに添加し、室温で20分反応する。
(7)反応停止溶液を各ウェルに50μlずつ添加し、プレートミキサーで1分間混和後、マイクロプレートリーダーで各ウェルの吸光度を測定する（測定波長450nm）。
(8)標準曲線から、検体中のVEGF濃度を算出する。
(1)VEGF標準原液（2000pg/ml）をもとに、反応緩衝液を用いて1000、500、250、125、62.5、31.2、15.6pg/mlのVEGF標準溶液を調製する。
(2)VEGF標準溶液および検体（培養上清）200μLを、50μLの希釈溶液を各ウェルに添加したVEGF固相化マイクロプレートに添加し、室温にて2時間反応する（一次反応）。
(3)ウェル内の溶液を除去し、洗浄液で3回洗浄する。
(4)西洋ワサビペルオキシダーゼ結合VEGF抗体溶液を各ウェルに200μLずつ添加し、室温で2時間反応させる（二次反応）。
(5)ウェル内の溶液を除去し、洗浄液で3回洗浄する。
(6)基質溶液200μLを各ウェルに添加し、室温で20分反応する。
(7)反応停止溶液を各ウェルに50μlずつ添加し、プレートミキサーで1分間混和後、マイクロプレートリーダーで各ウェルの吸光度を測定する（測定波長450nm）。
(8)標準曲線から、検体中のVEGF濃度を算出する。
培養1日後のVEGF産生量を図５に、培養3日後のVEGF産生量を図６に、それぞれ示す。図中、‘Non’は未処理対照、‘Ade’はアデノシン25μg/mLを添加した陽性対照（DMSO濃度 0.1％）、‘0.1％DMSO’は前記陽性対照からアデノシンを除いたもの、をそれぞれ示す。図５、６の縦軸は培養上清中の血管内皮増殖因子VEGFの量（単位：pg/mL）を示す。
処理期間1日においてH61、G50ともに産生促進効果を示したが（0.001mg/mL、0.1mg/mL、10mg/mLでH61株は、それぞれ対照（Non）の3.54倍、3.29倍、2.51倍であり、G50株は2.76倍、3.44倍、5.77倍）、なかでもG50の10mg/mLは顕著に増加していた（図５）。一方、処理期間3日においてもH61、G50ともに0.001mg/mL（1μg/mL）、0.1mg/mL（100μg/mL）濃度で増加を示したが（H61株で対照（Non）の1.93倍、2.01倍、G50株で1.81倍、1.78倍）、10mg/mL濃度は無添加区（Non）と同程度まで減少していた（図６）。一般に過剰に合成された成分がフィードバック効果により合成が抑制される場合がある。1日目において過剰に分泌されたことで3日目において抑制作用が働いた可能性が考えられる。陽性対照であるアデノシンは、1日処理ではVEGFの産生促進効果は見られなかったが、3日間処理で1.23倍の促進作用を示した。
処理期間1日においてH61、G50ともに産生促進効果を示したが（0.001mg/mL、0.1mg/mL、10mg/mLでH61株は、それぞれ対照（Non）の3.54倍、3.29倍、2.51倍であり、G50株は2.76倍、3.44倍、5.77倍）、なかでもG50の10mg/mLは顕著に増加していた（図５）。一方、処理期間3日においてもH61、G50ともに0.001mg/mL（1μg/mL）、0.1mg/mL（100μg/mL）濃度で増加を示したが（H61株で対照（Non）の1.93倍、2.01倍、G50株で1.81倍、1.78倍）、10mg/mL濃度は無添加区（Non）と同程度まで減少していた（図６）。一般に過剰に合成された成分がフィードバック効果により合成が抑制される場合がある。1日目において過剰に分泌されたことで3日目において抑制作用が働いた可能性が考えられる。陽性対照であるアデノシンは、1日処理ではVEGFの産生促進効果は見られなかったが、3日間処理で1.23倍の促進作用を示した。
（７）考察
細胞賦活試験においてH61及びG50の毛乳頭細胞への有効性が認められた。しかし、その効果・性質は異なっていた。H61は、細胞賦活試験では処理期間1日で低濃度域で比較的作用を示すことから、細胞分裂を促進する効果があることが考えられる（培養1日は細胞増殖曲線のうち増殖期、培養3日は維持期を検証することになる）。一方、G50は、処理期間3日で顕著に細胞賦活性が現れたことから、細胞の抗老化など細胞維持に関与するものと考えられる。ヘアサイクルにおいて細胞分裂の盛んな成長期にはH61が、分裂を停止し細胞を維持する段階の退行期にはG50が、有効に作用する可能性がある。
細胞賦活試験においてH61及びG50の毛乳頭細胞への有効性が認められた。しかし、その効果・性質は異なっていた。H61は、細胞賦活試験では処理期間1日で低濃度域で比較的作用を示すことから、細胞分裂を促進する効果があることが考えられる（培養1日は細胞増殖曲線のうち増殖期、培養3日は維持期を検証することになる）。一方、G50は、処理期間3日で顕著に細胞賦活性が現れたことから、細胞の抗老化など細胞維持に関与するものと考えられる。ヘアサイクルにおいて細胞分裂の盛んな成長期にはH61が、分裂を停止し細胞を維持する段階の退行期にはG50が、有効に作用する可能性がある。
細胞増殖因子産生に及ぼす効果として、G50は処理期間1日でVEGFの大部分を促進することから、短期的な作用効果があると考えられる。VEGFは血管新生因子であり、成長期だけでなく毛細血管の減少が始まる退行期にも有効であることから、G50は退行期において短期間使用で作用（主に発毛・脱毛抑制作用）を発揮する可能性がある。一方、H61は低濃度であっても処理期間3日でゆるやかにFGF-7の産生を促進することから、長期的効果があると考えられる。FGF-7は毛母細胞分裂を促進することから、ヘアサイクルでの成長期に有効であると考えられる。したがって、H61は成長期において長期間使用で作用（主に育毛作用）を発揮する可能性がある。
以上に述べたように、本実施例により、ラクトコッカス属乳酸菌H61、G50はいずれも高い育毛・発毛効果および脱毛抑制効果を奏することが示された。育毛・発毛剤および／または脱毛抑制剤における乳酸菌抽出物の添加濃度は0.001〜10mg/mLとすることが好ましく、0.001〜0.1mg/mL（いずれも乾燥菌体換算）とすることがより好ましいことがわかった。H61とG50はヘアサイクルの中の異なる時期においてそれぞれ顕著な効果を発揮することから、両菌株を併用することによって、より効果の高い育毛・発毛剤および／または脱毛抑制剤を提供できる。また、両菌株の育毛・発毛作用および／または脱毛抑制作用は死菌体（乾燥菌体）の抽出物でも見られることから、幅広い加工処理に対応できると考えられる。
実施例２（メラニン産生抑制効果）
マウスB16メラノーマ細胞(以下「B16細胞」と略す。)は、日焼けやシミの原因となるメラニンを産生する特徴を有する。また,α-メラノサイト刺激ホルモン(以下「α-MSH」と略す。)により、メラニン産生が促進されることが知られている。このため、日焼けやシミをターゲットとしたメラニン産生の細胞モデル系として研究などに広く用いられている。本試験では、B16細胞がα-MSH刺激または未刺激条件下で産生するメラニンを測定し、未処置対照のメラニン産生量に対する試験液（H61又はG50を含有）添加時のメラニン産生量からメラニン産生率を求め、メラニン産生抑制作用を評価した。
マウスB16メラノーマ細胞(以下「B16細胞」と略す。)は、日焼けやシミの原因となるメラニンを産生する特徴を有する。また,α-メラノサイト刺激ホルモン(以下「α-MSH」と略す。)により、メラニン産生が促進されることが知られている。このため、日焼けやシミをターゲットとしたメラニン産生の細胞モデル系として研究などに広く用いられている。本試験では、B16細胞がα-MSH刺激または未刺激条件下で産生するメラニンを測定し、未処置対照のメラニン産生量に対する試験液（H61又はG50を含有）添加時のメラニン産生量からメラニン産生率を求め、メラニン産生抑制作用を評価した。
（１）試験液の調製
ラクトコッカス・ラクティス・サブスピーシーズ クレモリス H61およびラクトコッカス・ラクティス・サブスピーシーズ ラクティス G50は、予めそれぞれTYG培地で常法に従って一昼夜培養し、洗浄、加熱処理（121℃、15分間）を行った後、凍結乾燥して得られた乾燥菌体を検体とした。なお、当該乾燥菌体500μgあたりに含まれる菌数は10８レベルであった。
ラクトコッカス・ラクティス・サブスピーシーズ クレモリス H61およびラクトコッカス・ラクティス・サブスピーシーズ ラクティス G50は、予めそれぞれTYG培地で常法に従って一昼夜培養し、洗浄、加熱処理（121℃、15分間）を行った後、凍結乾燥して得られた乾燥菌体を検体とした。なお、当該乾燥菌体500μgあたりに含まれる菌数は10８レベルであった。
検体に生理食塩液を加え30秒間かくはんした後、遠心分離(18000g、5分間)し、上清を分取した。これを50mg/mL試験液原液とし、培地で希釈して検体濃度4000、2000及び1000μg/mLの試験液を調製した。
（２）試験操作
B16細胞を24ウェルプレートに播種後1日間培養した。4000、2000及び1000μg/mLの各試験液を添加した（検体の終濃度は1000、500及び250μg/mL）。この際、α-MSH刺激条件では、α-MSH（和光純薬工業株式会社）を終濃度5μmol/Lとなるように添加した。培地のみを加えたものを未処置対照、アルブチン（和光純薬工業株式会社）を終濃度1mmol/Lとなるように加えたものを陽性対照として同様に試験を行った。4日間培養後、倒立型位相差顕微鏡にて観察及び撮影した。24ウェルプレートの培養上清を除去し，1mol/L水酸化ナトリウム溶液を加え、80℃、1時間加温し、B16細胞に蓄積したメラニンを抽出した。主な試験条件を表１に示した。
B16細胞を24ウェルプレートに播種後1日間培養した。4000、2000及び1000μg/mLの各試験液を添加した（検体の終濃度は1000、500及び250μg/mL）。この際、α-MSH刺激条件では、α-MSH（和光純薬工業株式会社）を終濃度5μmol/Lとなるように添加した。培地のみを加えたものを未処置対照、アルブチン（和光純薬工業株式会社）を終濃度1mmol/Lとなるように加えたものを陽性対照として同様に試験を行った。4日間培養後、倒立型位相差顕微鏡にて観察及び撮影した。24ウェルプレートの培養上清を除去し，1mol/L水酸化ナトリウム溶液を加え、80℃、1時間加温し、B16細胞に蓄積したメラニンを抽出した。主な試験条件を表１に示した。
（３）測定方法
マイクロプレートリーダー（SpectraMax M2e ，Molecular Devices Corporation）を用い、抽出したメラニンの吸光度を405nmにて測定した。
マイクロプレートリーダー（SpectraMax M2e ，Molecular Devices Corporation）を用い、抽出したメラニンの吸光度を405nmにて測定した。
（４）算出方法
未処置対照の吸光度に対する各試験液の吸光度から、次式によりメラニン産生率を算出した。陽性対照は各試験液と同様に算出した。
未処置対照の吸光度に対する各試験液の吸光度から、次式によりメラニン産生率を算出した。陽性対照は各試験液と同様に算出した。
メラニン産生率（％）＝Sa／CN ×100
Sa：各試験液の吸光度
CN：未処置対照の吸光度の平均値（n＝3）
Sa：各試験液の吸光度
CN：未処置対照の吸光度の平均値（n＝3）
（５）結果と考察
メラニン産生抑制試験の結果を表２、３および図７、８に示す。なお、図７、８の棒グラフのうち、黒はコントロール（未処置対照）を、ドットはアルブチン1mM添加区（陽性対照）を、斜線は被検物質（H61又はG50）500μg/mL添加区を、それぞれ示す。
H61、G50とも、陽性対照であるアルブチンよりはやや劣るものの、メラニン産生抑制効果を示した。特にα-MSH刺激条件では、乳酸菌無添加の未処置対照に比べて、H61はメラニン産生を68％に抑制し、G50は81％に抑制することができた（いずれも500μg/mL添加時）。このことから、メラニン産生に及ぼす影響は乳酸菌の種類により異なると考えられた。
また、乳酸菌抽出物の添加濃度は250〜1000μg/mLとすることが好ましく、500〜1000μg/mL（いずれも乾燥菌体換算）とすることがより好ましいことがわかった。
なお、アルブチンは発ガン性物質であるハイドロキノンの配糖体であることから、使用濃度によっては安全性に問題がある場合がある。一方、本発明の乳酸菌はいずれも長い食経験を持つラクトコッカス属乳酸菌であり、安全性が高いと思われる。
メラニン産生抑制試験の結果を表２、３および図７、８に示す。なお、図７、８の棒グラフのうち、黒はコントロール（未処置対照）を、ドットはアルブチン1mM添加区（陽性対照）を、斜線は被検物質（H61又はG50）500μg/mL添加区を、それぞれ示す。
H61、G50とも、陽性対照であるアルブチンよりはやや劣るものの、メラニン産生抑制効果を示した。特にα-MSH刺激条件では、乳酸菌無添加の未処置対照に比べて、H61はメラニン産生を68％に抑制し、G50は81％に抑制することができた（いずれも500μg/mL添加時）。このことから、メラニン産生に及ぼす影響は乳酸菌の種類により異なると考えられた。
また、乳酸菌抽出物の添加濃度は250〜1000μg/mLとすることが好ましく、500〜1000μg/mL（いずれも乾燥菌体換算）とすることがより好ましいことがわかった。
なお、アルブチンは発ガン性物質であるハイドロキノンの配糖体であることから、使用濃度によっては安全性に問題がある場合がある。一方、本発明の乳酸菌はいずれも長い食経験を持つラクトコッカス属乳酸菌であり、安全性が高いと思われる。
本発明によれば、乳酸菌の中でも安全性が高いラクトコッカス属乳酸菌の特定菌株を利用した皮膚外用剤（メラニン産生抑制剤および育毛・発毛・脱毛抑制剤）が初めて提供される。また、当該乳酸菌株の機能性は死菌体や抽出物でも見られることから、様々な形態での利用が可能である。
したがって、本発明は化粧品、医薬部外品、医薬品等の分野に好適に利用できる。
したがって、本発明は化粧品、医薬部外品、医薬品等の分野に好適に利用できる。
Claims (2)
- ラクトコッカス・ラクティス・サブスピーシーズ クレモリス（Lactococcus lactis subsp. cremoris） Ｈ６１株（ＮＩＴＥ Ｐ−９２）の抽出物を有効成分として含有することを特徴とするメラニン産生抑制用皮膚外用剤。
- ラクトコッカス・ラクティス・サブスピーシーズ クレモリス（Lactococcus lactis subsp. cremoris） Ｈ６１株（ＮＩＴＥ Ｐ−９２）及びラクトコッカス・ラクティス・サブスピーシーズ ラクティス（Lactococcus lactis subsp. lactis） Ｇ５０株（ＦＥＲＭ Ｐ−１８４１５）の抽出物を有効成分として含有することを特徴とする育毛・発毛・脱毛抑制用皮膚外用剤。
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