KR20030092643A

KR20030092643A - 연수유래 캄페롤 및 그 유도체를 유효성분으로 하는 효소보호제 및 항노화제

Info

Publication number: KR20030092643A
Application number: KR1020020030371A
Authority: KR
Inventors: 정해영; 최재수; 김애라
Original assignee: 대한민국(부산대학교 총장)
Priority date: 2002-05-30
Filing date: 2002-05-30
Publication date: 2003-12-06

Abstract

본 발명은 연수에서 분리한 천연 화합물 캄페롤에 관한 것으로서 상기화합물은 페록시나이트라이트를 소거하여 총활성산소종의 발생을 억제하고, 세포를 산화적 손상으로부터 보호하는 글루타치온의 수준을 유지시키는데 필요한 글루타치온 리덕타제를 보호하므로, 라디칼 등의 지속적인 축척에 의해 발생하는 노화에 대한 억제효과가 뛰어나므로 효과적인 항노화제로 사용될 수 있다.

Description

연수유래 캄페롤 및 그 유도체를 유효성분으로 하는 효소 보호제 및 항노화제{Preparations for protecting enzymes and anti-ageing comprising a kaempferol derived from a nelumbo nucifera}

본 발명은 하기 화학식 1로 표시되는 캄페롤 및 이의 유도체를 유효성분으로 하는 효소보호제 및 항노화제 조성물에 관한 것이다.

(화학식 1)

노화란 인간이 태어나서 사망할 때까지 지속적으로 일어나는 기능적, 구조적 생화학적 과정으로 대사속도의 저하, 질병의 증가, 적응력저하 등을 나타내어 궁극적으로는 세포와 신체 전체의 사망에 이르게 되는 현상이다. 노화과정을 설명하는 학설로는 크게 유전자 설과 소모설로 나뉜다. 이 중 소모설은 다시 생물체의 구성세포가 시간의 경과에 따라 기능이 저하된다고 설명하는 설과 유해물질의 축적에의한 것으로 설명하는 설로 나뉜다. 특히 인체의 대사과정, 방사선 노출, 바이러스 대기오염 등에 의해 생성되는 자유라디칼들이 독성이 강한 물질을 형성함으로써 노화를 촉진할뿐 만 아니라 노화와 관련된 각종 질병을 일으킨다는 자유라디칼이론 (free radical theory)이 가장 유력한 학설로 받아들여지고 있다.

자유라디칼은 최외곽 궤도에 짝짓지 않은 전자를 하나 가지는 물질을 총칭하는 말로, 그 구조의 불안정성에 의해 반응성이 매우 높은 특징을 가진다. 특히 산소에서 유래된 자유라디칼과 함께 질소에서 유래된 라디칼은 단백질, 지질, 탄수화물과 반응하여, 단백질 손상, 지질 과산화, DNA 손상 등을 야기시켜 결과적으로 세포사를 초래하게 된다. 특히 생체내에서는 나이트릭 옥사이드와 수퍼옥사이드가 동시에 발생하는 조건에서 라디칼-라디칼 반응으로 쉽게 생성되는 비라디칼 페록시나이트라이트는 그 반감기가 밀리초(milisecond)로 다른 라디칼에 비하여 오랜 시간 존재하며 그 반응성 또한 높으므로 활성 질소종 유래의 독작용의 가장 큰 원인이라 할 수 있으며, 퍼옥시나이트라이트의 독성 작용은 알츠하이머, 암, 관절염, 동맥경화, 피부 염증 등 여러 질환 및 노화관련 질환과 관련되는 것으로 보고되고 있다. 상기의 여러가지 라디칼에 의한 산화적 손상을 예상하기 위한 다양한 노력이 진행되어 왔으며, 특히 생체에는 퍼옥시나이트라이트를 제거하는 특이한 효소가 없으므로, 퍼옥시나이트라이트에 의한 세포손상으로부터 세포를 보호할 수 있는 효과적인 항산화, 항노화제를 개발하기 위한 연구가 절실히 요구된다. 본 발명자들은 한국 자생 식물들에서부터 유효한 항산화, 항노화 성분을 분리, 그 기전을 규명하는 것은 더욱 큰 의의가 있다고 하겠다.

연수는 다년생 초본식물로 물 속에서 자라며 식용, 약용, 관상용으로 사용되고 있다. 주요 약용 부위는 잎, 근부, 과실로 지혈, 지사. 진통, 어혈, 해열, 이뇨 작용이 있으며, 신장염, 폐렴, 골절, 신경쇠약, 요통 등에 사용하여왔다. 아스파라긴, 아르기닌 등의 아미노산과 함께 주성분으로는 알칼로이드계인 넬룸빈(nelumbine)이 알려졌다. 본 발명자는 연수의 강한 페록시나이트라이드 소거작용을 확인하고 그 유효성분으로 캄페롤 및 그 유도체를 분리하였다.

이에 본 발명자들은 퍼옥시나이트라이트에 의한 세포의 산화적 손상과 이에 의한 노화를 억제할 수 있는 물질을 찾고자 연구한 결과, 한국자생식물인 연수의 퍼옥시나이트라이트 억제 효과를 확인하고, 이는 연수의 성분 중 캄페롤 및 그 유도체에 의해 특이적으로 억제됨을 밝히고 그 작용기전을 규명하고 이의 효소보호작용을 통해 항 노화제로 이용될 수 있음을 확인함으로써 본 발명을 완성하였다.

본 발명의 상기 목적은 연수의 성분인 캄페롤의 항산화 활성을 조사하고, 페록시나이트라이트에 대한 항산화 활성을 나타내며, 페록시나이트라이트로부터 효소를 보호하는 작용을 측정함으로써 효소보호제 및 항노화제로 유용한 화합물 및 이을 유효 성분으로 하는 약학조성물을 제공하는 것을 목적으로 한다.

도 1은 연수로부터 분리한 캄페롤의 구조식을 나타내는 그림이다.

도 2는 캄페롤의 페록시나이트라이트 소거기전을 나타내는 그래프이다.

도 2a는 타이로신 500 μM에 의한 그래프이다.

도 2b는 타이로신 500 μM와 페록시나이트라이트 500 μM에 의한 그래프이다.

도 2c는 캄페롤 25 μM에 의한 그래프이다.

도 2d는 캄페롤 25 μM과 페록시나이트라이트 500 μM에 의한 그래프이다.

도 2e는 캄페롤 10 μM과 페록시나이트라이트 500 μM에 의한 그래프이다.

도 2f는 캄페롤 5 μM과 페록시나이트라이트 500 μM에 의한 그래프이다.

도 3a는 페록시나이트라이트에 의한 글루타치온 리덕타제의 불활성화을 나타내는 그래프이다.

도 3b 는 캄페롤이 글루타치온 리덕타제를 페록시나이트라이트에 의한 불활성화로 부터 보호하는 작용을 나타내는 그래프이다.

도 3c 는 페록시나이트라이트에 의한 글루타치온 리덕타제의 나이트로타이로신 생성작용을 나타내는 그래프이다.

도 3d 는 캄페롤이 글루타치온 리덕타제를 페록시나이트라이트에 의한 나이트로타이로신 생성을 억제하는 작용을 나타내는 그래프이다.

본 발명은 하기 화학식 1로 표시되는 캄페롤 및 이의 유도체를 유효성분으로하는 효소보호제 및 항노화제 조성물에 관한 것이다.

(화학식 1)

본 발명을 연수성분인 캄페롤의 페록시나이트라이트 제거능 및 항산화능을 나타내는 단계; 캄페롤의 페록시나이트라이트 제거 기전을 나타내는 단계; 캄페롤의 효소보호능을 나타내는 단계로 구성된다. 이하 본 발명의 구체적인 구성 및 효과는 실시예를 들어 설명하지만, 본 발명의 권리범위가 이들 실시예에 한정되는 것은 아니다.

실시예 1 : 캄페롤의 페록시나이트라이트 제거능 및 항산화능의 측정

시약

캄페롤, 페니실아민, 산화글루타치온, NADPH, 글루타치온 리덕타제는 시그마알드리치에서 구입하여 사용하였다. 디하이드로로다민123, 디클로로하이드로플루오레신 디아세테이트는 몰레큘라 프로브사로부터 구입하였으며, 다이아미노플루오레신은 다이치화학회사로 부터, 페록시나이트라이트는 케이맨사로부터 구입하였다. 폴리비닐리딘 플로라이드 맨브레인은 밀리포아사에서 구입하였으며, 케모루미노센스 측정시약은 아머샴 라이프 사이언스사에서 구입하여 사용하였고, 나이트로타이로신 항체는 업스테이트 바이오테크놀러지사에서 구입하였다.

실험기기

바이오테크 인스트루먼트사의 미세판형광 판독기 (FL 500, Bio-Tek Instrument)을 이용하였다.

페록시나이트라이트에 대한 소거효과 측정

본 발명의 캄페롤이 페록시나이트라이트에 대하여 소거작용을 갖는지를 확인하기 위하여 Kooy 등의 방법을 변형하여 디하이드로로다민123 의 산화를 측정함으로써 수행하였다. 90 mM 염화나트륨, 50 mM 인산나트륨, 5 mM 염화칼슘 (pH 7.4) 및 100 mM 디에틸렌트리아민펜타아세트산으로 구성된 완충액에 시료와 페록시나이트라이트 용액을 넣어 산화된 디하이드로로다민123의 형광강도를 여기파장 480 nm, 방출파장 530 nm 인 미세판형광 판독기에서 측정하였다. 이때 IC₅₀은 페록시나이트라이트만 첨가한 형광도 값을 50% 감소시키는데 필요한 캄페롤 유도체의 양 (μM)으로 표1에 정리하였다.

활성산소에 대한 소거효과 측정

신장파쇄액에 비형광성 2',7'-DCFDA (2`,7`-dichlorodihydro fluoresceindiacetate)를 첨가한 후, 캄페롤의 첨가에 따른 형광도의 변화를 측정하였다. 이는 신장 파쇄액에서 자체 생성되는 활성산소에 의해 비 형광성 물질 DCFDA가 형광성 물질인 DCF로 산화되기 때문이다. 본 실시예에서는 시료에 캄페롤을 농도별로 처리한 후 형광의 변화를 여기 파장 485nm 및 방출 파장 530nm에서 60분간 10분 간격으로 미세판형광 판독기로 측정하였다. 이때 IC₅₀은 신장파쇄액만 첨가한 형광도 값을 50% 감소시키는데 필요한 캄페롤 유도체의 양 (μM)으로 표1에 정리하였다.

나이트릭 옥사이드에 대한 소거효과 측정

본 발명의 캄페롤이 니트로플루시드 나트륨 유래의 나이트릭 옥사이드에 하여 소거효과를 나타내는 지를 확인하기 위하여 다이아미노플루오레신(DAF-2)을 이용하여 형광의 변화를 측정하였다. 이는 나이트릭 옥사이디에 의해 비형광성인 DAF-2가 형광성인 DAF-2T로 산화되기 때문이다. 시료와 니트로플루시드 나트륨, 50mM potassium phosphate buffer(pH 7.4)에 DAF-2 용액을 넣어 37℃에서 5분간 shaking 하였다. 형광의 변화를 여기 파장 495nm 및 방출 파장 515nm에서 60분간 10분 간격으로 미세판형광 판독기로 측정하였다. 이때 IC₅₀은 니트로플루시드 나트륨만 첨가한 형광도 값을 50% 감소시키는데 필요한 캄페롤 유도체의 양 (μM)으로 표1에 정리하였다.

캄페롤 유도체에 의한 페록시나이트라이트, 수퍼옥사이드, 나이트릭옥사이드 소거력

화합물	IC₅₀(μM)
	ONOO^-	^.O₂ ^-	^.NO
캄페놀	3.0 ± 0.1	64.3 ± 6.6	8.2 ± 0.8
캄페놀 3-O-글루쿠로닉산	3.2 ± 0.4	98.3 ± 5.0	18.1 ± 0.1
캄페롤 3-O 글루코시드	7.0 ± 0.4	> 100	132.2 ± 8.5
캄페롤 3-O 갈락토시드	16.6 ± 4.9	> 100	> 200
페니실아민^*	3.2 ± 0.4
트롤록스^*		29.7 ± 0.3	1.5 ± 0.1
카르브폭시 PTIO^*

^*대조군

실시예 2 : 캄페롤의 페록시나이트라이트 제거 기전 측정

본 발명의 캄페롤의 페록시나이트라이트 소거 기전을 확인하기 위하여 Pannala 등의 방법을 변형하여 분광측정법으로 분석하였다. 50 mM patassium phosphate (pH 7.4)에 농도별로 페록시나이트라이트와 캄페롤을 가한 용액을 190 nm에서 600 nm까지 파장을 이동하여 측정하였다. 430 nm 근처에서 peak가 관찰되면 질화과정으로 페록시나이트라이트를 소거하며, peak가 관찰되지 않으면 전자 공여과정으로 소거함을 알수있다. 실험결과 도3에서 나타나듯이 캄페롤의 페록시나이트라이트와의 반응에서는 peak가 관찰되지 않았으므로 캄페롤은 전자공여과정으로 페록시나이트라이트를 제거함을 알 수 있다 (도 2 참조).

<실시예 3: 캄페롤의 효소보호능 측정>

효소에 대해 페록시나이트라이트가 미치는 영향

페록시나이트라이트가 글루타사이온 리덕타제에 이치는 영향을 확인하기 위하여 효소의 활성 및 니이트로타이로신을 측정하였다. 효소 활성 측정은 Mavis 등의 방법을 변형하여 분황광도계로 NADPH 감소를 측정하였으며, 나이트로타이로신은 Western bolt analysis로 실시하였다. 먼저 0.6 U/ml 의 글루타치온 리덕타제에 각각 0, 10, 50, 100, 150 μM의 페록시나이트라이트를 가하고 10분간 방치한 용액을, 완충액 (100 mM potassium phosphate, 3.4 mM ethylenediaminetetraacetic acid, pH 7.6)에 1 mM 글루타치온, 0.09 mM beta-nicotinamide adenine dinucleotide phosphate, 0.13% (w/v) bovine serum albumin을 가하여 25 ℃에서 5분간 방치한 용액에 첨가하여 그 활성을 측정하였다. 특히 페록시나이트라이트 100, 150μM의 투여에 의해 그 활성은 37.49 ±7.29, 42.81 ± 1.27% 로 현저히 감소하였다 (도 3a 참조). 또한 도 4c에서 나타나듯이 nitrotyrosine의 양도 현저히 증가하였다. 50 mM potassium phosphate, pH 7.2에 글루타치온 0.45 U/ml, 페록시나이트라이트0,25, 50, 100 μM을 가하고 37℃에서 10 분간의 방치하여 효소의 구성 단백질의 변화를 야기시킨 시료를 8 % SDS-PAGE 에 전기영동하였다. 전기영동후 폴리비닐리딘 플로라이드 막에 단백질을 전이시키고, 5% 탈지유가 포함된 TBS-Tween 용액 (10 mM Tris. HCl, 100 mM NaCl, 0.1% Tween 20, pH 7.5)에 담궈 비특이적인 반응을 차단하였다. 이후 나이트로타이로신에 대한 마우스의 항체(Upstate)를 1/100으로 희석한 용액과 상온에서 2시간 동안 반응시킨 다음, 2차 항체로서 항 마우스 IgG 항체를 이용하여 반응??켰다. 반응이 끝난 막을 TBS-Tween 용액으로 4회 세척하고 ECL 검출시약과 1분간 반응시킨 후 상온에서 X-선 필름에 감광시켰다. 그 결과 도 3c에 나타난 바와 같이 나이트로타이로신의 생성은 페록시나이트라이트의 농도 증가에 따라 증가하였다. 상기 결과를 통하여 페록시나이트라이트는 단백질의 변화를 야기시키며, 이는 효소 활성에도 영향을 미침을 알수있다.

캄페롤의 효소보호능 측정

본 발명의 캄페롤의 효소보호능을 측정하기 위하여 0.6 U/ml의 효소와 50 μM의 페록시나이트라이트 와 캄페롤을 이용하였다. 효소용액에 캄페롤 3, 15, 30 μM을 각각 가하여 5분간 방치하였다. 페록시나이트라이트를 가하여 10분간 더 방치한 후 효소의 활성을 측정하였다. 또한 상기와 동일한 방법으로 시료를 조제하여 Western blot analysis을 실시하였다. 그 결과 도 3b에서 나타나듯이 캄페롤 3, 15, 30 μM은 효소의 활성감소를 21.38 ± 4.32, 54.75 ± 6.52, 및 80.01 ± 4.53 %로 억제하였으며 nitrotyrosine의 생성도 감소시켰다( 도 3d 참조). 상기 결과를 통하여 캄페롤은 페록시나이트라이트의 작용을 억제하여, 페록시나이트라이트에 의한 효소내 단백질의 변화를 저해함으로써 효소의 불활성화를 저해하는 효소보호제로 작용함을 알 수 있다.

본 발명의 연수유래 캄페롤은 페록시나이트라이트의 반응성을 억제시키고, 페록시나이트라이트를 생성시키는 두개의 라디칼, 수퍼옥사이드와 나이트릭옥사이드를 소거시키므로 페록시나이트라이트의 생성을 억제시킬수있다. 또한 캄페롤은 세포내 항상성을 유지시키는데 주요한 역할을 하는 글루타치온 리덕타제의 페록시나이트라이트에 의한 단백질 변화와 이에 따른 효소활성의 저하를 효과적으로 억제하였다. 따라서 본 발명의 유도체는 세포내 산화적 손상에 의해 진행되는 노화를 효과적으로 방지할 수 있는 항노화제로 이용될 수 있다.

Claims

하기 화학식 1로 표시되는 캄페롤을 유효성분으로 함유하는 것을 특징으로 하는 효소보호제용 약학적 조성물.

(화학식 1)
화학식 1로 표시되는 캄페롤을 효성분으로 함유하는 것을 특징으로 하는 항노화제용 약학적 조성물.
제 1항에 있어서, 캄페롤은 연수 추출물인 것을 특징으로 하는 효소보호제용 약학적 조성물.
제 2항에 있어서, 캄페롤은 연수 추출물인 것을 특징으로 하는 항노화제용 약학적 조성물.
제 2항에 있어서, 캄페롤은 페록시나이트라이트에 의한 글루타치온 리덕타제의 나이트로타이로신 생성을 억제하는 것을 특징으로 하는 항노화제용 약학적 조성물.
제 2항에 있어서, 캄페롤은 페록시나이트라이트에 의한 글루타치온 리덕타제의 활성을 억제하는 것을 특징으로 하는 항노화제용 약학적 조성물.