CN101384246A - 含二氢黄酮衍生物的皮肤外用制剂 - Google Patents
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Abstract
为了增强活体的组织再生能力如成纤维细胞产生胶原蛋白的能力,使用二氢黄酮衍生物如杜鹃素作为皮肤外用制剂的活性成分,其中成纤维细胞为以大皱纹或伤口为典型的皮肤缺损区域真皮中的成纤维细胞。另外,为了有效地筛选对促进伤口愈合具有优良作用的物质,采用皮肤伤口模型检测胶原纤维束的重塑作用。
Description
技术领域
[0001]本发明涉及一种皮肤外用制剂,更具体而言,涉及一种含二氢黄酮衍生物的皮肤外用制剂。本发明还涉及一种增加成纤维细胞产生胶原蛋白能力的方法。另外,本发明涉及一种筛选具有伤口愈合作用物质的方法。
背景技术
[0002]皮肤由角质层、表皮、基底层和真皮形成。一般来说真皮的结构对通常能认识到的“皮肤”的性能具有大的影响。也可以说真皮的重要成份之一是胶原蛋白,其对弹性等具有重大的影响。真皮的胶原蛋白包括胶原蛋白I、胶原蛋白III、胶原蛋白IV、胶原蛋白V、胶原蛋白VII等,它们各自具有重要的功能。这些胶原蛋白源自于成纤维细胞产生的原胶原(参见,例如,非专利文献1,非专利文献2和非专利文献3)。还已知成纤维细胞产生胶原蛋白(包括原胶原)能力的降低是由于老化和UV射线损伤所引起的,并导致皮肤功能的退化。换而言之,恢复皮肤功能的一个重要因素是要恢复退化的成纤维细胞产生胶原蛋白的能力。
[0003]人随着年龄增长外貌发生变化并显示出衰老迹象。这类迹象之一是皮肤皱纹的形成,化妆品的主要作用是阻止这类迹象的形成。已经认为皱纹形成的发展机制之一可能是真皮的胶原纤维束结构的萎陷或这类结构紊乱。有时,真皮的胶原纤维束结构萎陷或紊乱导致真皮胶原纤维束本身部分缺失。该病症中的皮肤部分可具有与受伤皮肤相似的结构,通常称为“大皱纹”。已知萜烯如单萜或三萜、或其衍生物用于恢复真皮胶原纤维束以改善真皮胶原纤维束结构的萎陷或紊乱(参见,例如,专利文献1)。此外,还已知一些植物提取物对真皮胶原纤维束具有重塑的作用(参见,例如,专利文献2和专利文献3)。在植物提取物中,已知金丝桃(Hypericum)提取物对真皮胶原纤维束的重塑作用是优良的(参见,例如,专利文献4)。这类萜和提取物具有增加成纤维细胞产生胶原蛋白能力的作用,如果胶原纤维束在周围,它们能沿这种纤维束构造胶原纤维束。然而,这类物质在成纤维细胞周围本身缺少和不存在真皮胶原纤维束的情况下不能充分地构造胶原纤维束。因此,上述萜和提取物在缺少胶原纤维束的部分(如大皱纹)不能充分重塑胶原纤维束。因此,存在一个问题:不能发挥对上述症状的充分改善作用。
[0004]此外,皮肤是保护活体以及呼吸器官的重要组织,所以任何的皮肤缺损将威胁到活体的防御机能和呼吸机能。因此,有一种被证实的理论:由于遭受燃烧等而丧失表皮的三分之一会导致生命危险。关于这一点,使缺损的皮肤部分快速再生技术的发展期待了许多年。本领域已知的具有伤口愈合作用的物质包括,例如,姜黄提取物和乳铁蛋白(参见,例如,专利文献5和专利文献6)。然而,这类物质中的任何物质具有的再生皮组织的作用都不充分,因为对真皮的胶原纤维束结构没有重塑的作用。在这种情况下,已经开发了促进细胞生长和增加其胶原蛋白生产能力的用于伤口愈合的物质,菊糖(参见,例如,专利文献7),胶原蛋白水解产物(参见,例如,专利文献8),乳铁蛋白(参见,例如,专利文献6)等。这些物质的伤口愈合作用已经通过涉及成纤维细胞增生活性的皮组织的再生活性或酶的RNA表达等证实。然而,根本没有观察到任何明显这类物质导致的实际皮肤再生现象。另外,就这类物质而言,根本没有观察到对活体缺失部分(如伤口所引起的胶原纤维束结构的缺少)的重建有任何影响。
[0005]由此可见,还没有发现任何对具有缺陷部分(由于胶原纤维束结构等的缺失)的活体组织具有优良的组织再生、皱纹改善、伤口愈合等作用的物质。
[0006]另一方面,杜鹃素是一种具有二氢黄酮结构的化合物,已知包含在多种植物中,其合成方法也已知(参见,例如,专利文献9,专利文献10和专利文献11)。然而,还没有发现任何将其掺入皮肤外用制剂的技术。此外,还没有发现任何对真皮胶原纤维束的重塑作用和任何促进伤口愈合的作用。
[0007]另外,共培养研究已经表明:角质化细胞的作用可影响成纤维细胞产生胶原蛋白能力的改善(参见,例如,非专利文献4)。然而,还没有发现任何影响角质化细胞以增加成纤维细胞产生胶原蛋白能力的物质。
[0008]另一方面,关于成纤维细胞产生胶原蛋白的能力,上述用于伤口愈合的任何物质如菊糖、胶原蛋白、水解产物和乳铁蛋白已经被筛选为增加成纤维细胞产生胶原蛋白能力的物质。然而,成纤维细胞产生胶原蛋白能力的改善是促进伤口愈合的必要条件而不是充分条件。当前状况是存在尽管具有改善胶原蛋白产生能力但没有任何促进伤口愈合作用的物质。
[0009]此外,还根据成纤维细胞的迁移活性设想了促进伤口愈合作用的筛选方法(参见,例如,非专利文献5)。在该方法中,使用成纤维细胞制备胶原蛋白凝胶,然后在其中形成缺失部分,接着对迁移进入缺失部分之内的成纤维细胞计数。然而,成纤维细胞迁移能力的改善是促进伤口愈合的必要条件而不是充分条件。因此,即使对成纤维细胞迁移能力进行筛选也存在没有任何促进伤口愈合作用的成分。
[0010]换而言之,这些筛选方法不能筛选出既具有改善成纤维细胞产生胶原蛋白能力作用、又具有改善成纤维细胞迁移能力作用的物质,它是促进伤口愈合必需的。在这种情况下,需要发展一种获得具有优良的促进伤口愈合作用的物质的技术。
[0011][专利文献1]JP 2002-104921 A
[专利文献2]JP 2002-29988 A
[专利文献3]JP 2002-29987 A
[专利文献4]JP 2002-29986 A
[专利文献5]JP 11-199461 A
[专利文献6]JP 07-196529 A
[专利文献7]JP 2004-501176 A
[专利文献8]JP 2003-137807 A
[专利文献9]WO 02/092110
[专利文献10]EP 122053 A
[专利文献11]JP 58-21678 A
[非专利文献1]Keene等,J.Cell Biol.,104,611-621(1987)
[非专利文献2]Shimizu等,Lab.Invest.,Jun.,76(6),753-63(1997)
[非专利文献3]Vazquez F.等,Maturitas,25,209-15(1996)
[非专利文献4]Eming S.A.等,Hum.Gene Ther.,9(4),529-39(1998)
[非专利文献5]Roman O′Leary,Mark Rerek,和Edward John Wood,Biol.Pharm.Bull.,27(2),266-270(2004)
发明内容
[0012]本发明旨在提供一种具有优良的重塑紊乱的真皮胶原纤维束结构作用的皮肤外用制剂(在下文中,也简称为“胶原纤维束”)。特别地,本发明旨在提供一种通过增强活体的组织再生能力(以真皮中成纤维细胞产生胶原蛋白的能力为代表)在以大皱纹或伤口为代表的皮肤缺损区域促进伤口愈合的技术。
另外,本发明旨在提供一种再生皮组织的技术。具体而言,本发明旨在提供一种通过作用于角质化细胞来增强成纤维细胞产生胶原蛋白能力的技术。
另外,本发明旨在提供一种筛选对促进伤口愈合具有优良作用的物质的方法。
[0013]本发明人一直在寻找可含在皮肤外用制剂中、具有增强成纤维细胞产生胶原蛋白能力和促进伤口愈合作用的物质,最后发现了二氢黄酮衍生物如杜鹃素的这种作用可能是优良的。此外,本发明人还发现二氢黄酮衍生物能对角质化细胞起作用以增强成纤维细胞产生胶原蛋白的能力。另外,本发明人通过发现含具有优良的改善皱纹作用的二氢黄酮衍生物的化妆品和含具有优良的促进伤口愈合作用的二氢黄酮衍生物的皮肤外用药来完成本发明。
[0014]此外,本发明人通过以下的发现来完成本发明:通过使用在寻找具有促进伤口愈合活性的物质的过程中使用的皮肤伤口模型的方法检测胶原纤维束的重塑作用可有效筛选具有促进伤口愈合作用的物质。
也就是说,本发明如下。
[0015][1]第一发明涉及一种皮肤外用制剂(在下文中亦称为“本发明的皮肤外用制剂”),含以下面的通式(1)表示的二氢黄酮衍生物和/或其盐。
[0016]
通式(1)
[0017]在通式(1)中,R1、R2、R3、R4和R5各自独立地表示氢原子或具有1至4个碳原子的烷基。
二氢黄酮衍生物优选为杜鹃素。
[0018]
杜鹃素
[0019]另外,在优选的实施方案中,本发明的皮肤外用制剂含小连翘(Hypericum erectum)、藤黄科(Guttiferae)的提取物,其中含10-6至0.1%(质量)的二氢黄酮衍生物和/或其盐。
[0020]此外,本发明的皮肤外用制剂可用于使皮肤结构正常化。特别地,它优选用于重塑紊乱的真皮胶原纤维束。另外,它优选用于促进皮肤缺损区域的再生和再生组织缺损区域的闭合以及治愈伤口。此外,它还优选地用于增强角质化细胞的活性以增强成纤维细胞产生胶原蛋白的能力。
[0021][2]第二发明是通式(1)表示的二氢黄酮衍生物和/或其盐在制备皮肤外用制剂中的用途。
[0022][3]第三发明涉及一种使皮肤结构正常化的方法,包括给皮肤施用含通式(1)表示的二氢黄酮衍生物和/或其盐的皮肤外用制剂。
上述第二和第三发明中,优选的二氢黄酮衍生物以及皮肤外用制剂的优选用途与第一发明相同。
[0023][4]第四发明涉及一种增强角质化细胞的作用以增强成纤维细胞制备胶原蛋白能力的方法,包括在成纤维细胞和角质化细胞的共存下施用通式(1)表示的二氢黄酮衍生物和/或其盐。
优选的二氢黄酮衍生物与第一发明相同。
[0024]施用可经皮施用。具体而言,二氢黄酮衍生物和/或其盐优选含在皮肤外用制剂中然后施用于皮肤。
[0025][5]第五发明涉及一种筛选具有伤口愈合作用的物质的方法,包括:
在试验物质的存在下培养正常的动物成纤维细胞;
通过向得到的培养物中加入胶原蛋白介质溶液制备胶原蛋白凝胶;
在试验物质的存在下在胶原蛋白凝胶中培养成纤维细胞;
在胶原蛋白凝胶中形成缺损区域;
在试验物质和具有缺损区域的胶原蛋白凝胶的共存下培养成纤维细胞;
和观察培养过程中缺损区域的填充度或减少(在下文中,亦称“本发明的筛选方法”)。
[0026]另外,在本发明的筛选方法中,具有促进伤口愈合作用的试验物质可通过比较在试验物质的存在下缺损区域的填充度或减少与缺少试验物质的情况下缺损区域的填充度或减少而进行筛选。
具体而言,当在试验物质的存在下缺损区域的填充度或减少比缺少试验物质的情况下缺损区域的填充度或减少大时,就可确定试验物质具有促进伤口愈合的作用。
附图简述
[0027]图1为说明实施例1获得的结果的图表,其中图1表示在没有肝素处理的情况下温育天数与细胞数目之间的关系,图2表示在0.01%-肝素的处理下温育天数与细胞数目之间的关系。
图2为在实施例2的伤口愈合模型中所观察到的成纤维细胞性状的照相显示。
图3为在实施例3中所观察到的构造胶原纤维束的行为的照相显示。
图4为在实施例6中所观察到的胶原蛋白-凝胶-缺损区域的状态的照相显示。
图5为说明在实施例9的实验1中获得的结果的图表,其中以对添加各个浓度的杜鹃素溶液的响应表示OD值(450nm)。
图6为说明在实施例9的实验2中获得的结果的图表,其中以对添加各个浓度的杜鹃素溶液的响应表示角质化细胞的生长速率。
图7为在实施例9的实验2中所观察到的角质化细胞形状的照相显示。
图8为说明在实施例9的实验3中获得的结果的图表,其中以对添加各个浓度的杜鹃素溶液的响应表示产生的原胶原的量。
图9为在实施例11中所观察到的胶原蛋白-凝胶-缺损区域的状态的照相显示。
实施本发明的最佳方式
[0028](A)用于本发明中的二氢黄酮衍生物及其盐
可用于本发明中的二氢黄酮衍生物为通式(1)表示的任何化合物。
在通式(1)中,R1、R2、R3、R4和R5各自独立地表示氢原子或具有1至4个碳原子的烷基。
R1、R2和R4中至少一个优选为氢原子,尤其三个都优选为氢原子。烷基的实例包括甲基、乙基、丙基和丁基。其中,尤其优选为甲基。
[0029]另外,R3和R5中至少一个优选为含1至4个碳原子的烷基,尤其两者均优选为含1至4个碳原子的烷基。烷基的实例包括甲基、乙基、丙基和丁基。其中,更优选为甲基。尤其,R3和R5两者均优选为甲基。
[0030]这类二氢黄酮衍生物的实例包括杜鹃素、甲基杜鹃素和二甲基杜鹃素。
[0031]二氢黄酮衍生物可按照JP 58-21678 A的描述由已知的化合物合成。此外,它们还存在于植物中,所以它们可从植物提取物分离和纯化。杜鹃素,通式(1)表示的化合物之一,可从植物小连翘、藤黄科提取物中分离和纯化。其生产方法的实例将在下文中描述。不必说,当在随后描述的皮肤外用制剂中含植物来源的二氢黄酮衍生物和/或其盐时,也可以使用含足以发挥预期效果的给定浓度的二氢黄酮衍生物及其盐的提取物。
[0032]<制备实施例1>
将10l的80%乙醇水溶液加入到1kg的小连翘Thunberg(藤黄科)的干燥地上部分,然后回流4小时同时搅拌。冷却后,通过过滤除去不溶物质然后在减压下浓缩,之后冻干。结果,得到51g的无定形物。将该产物分散于水中,装在DIAION HP20上,用5 l的水及5 l的50%乙醇水溶液的流体依次洗涤,用99%乙醇洗脱。分离所得的洗脱液。随后,将因此得到的级分进一步进行薄层色谱和HPLC以检验其内容物,将包含相同单一物质的级分合并在一起。另一方面,将包含两种或更多成分的级分通过再进行色谱进一步纯化。对得到的含单一成分的级分研究其重塑胶原纤维束的作用。然后,利用质子NMR、元素分析、质谱分析和13C-NMR鉴定在显示出这样一种强作用的级分中的单一成分的结构。结果,成分为杜鹃素,产量为3.2mg。此外,约0.006%质量的杜鹃素包含在除去溶剂的产物中,其从以80%乙醇水溶液提取的物质中获得。
[0033]二氢黄酮衍生物盐的优选实例包括而不限于碱金属盐如钠盐和钾盐;碱土金属盐如钙盐和镁盐;有机胺盐如铵盐、三乙胺盐、三乙醇胺盐和单乙醇胺盐;以及碱性氨基酸盐如赖氨酸盐和精氨酸盐,只要它们是生理学上可接受的。
[0034]上述二氢黄酮衍生物及其盐具有促进成纤维细胞重塑真皮胶原纤维束结构的作用。具体而言,二氢黄酮衍生物使成纤维细胞迁移到任何地方甚至是不存在胶原纤维的区域,同时增强成纤维细胞本身产生胶原蛋白的能力,从而在组织缺损区域重塑胶原纤维束。另外,伤口愈合可通过促进皮肤缺损区域的皮组织的再生和增强再生组织闭合缺损区域的能力而促进。
[0035](B)本发明的皮肤外用制剂
本发明皮肤外用制剂的特征是含二氢黄酮衍生物和/或其盐。例如,它可含作为植物提取物的二氢黄酮衍生物和/或其盐。二氢黄酮衍生物可优选为杜鹃素。优选地,本发明的皮肤外用制剂可包括含杜鹃素的小连翘提取物。
[0036]如上所述,二氢黄酮衍生物及其盐具有重塑真皮胶原纤维束结构的作用。因此,本发明的皮肤外用制剂可用于使皮肤结构正常化。其中,短语“使皮肤结构正常化”指降低构成皮肤的表皮、真皮和皮下组织结构的破坏程度。具体而言,例如它包括重塑真皮紊乱的胶原纤维束结构。其中,短语“重塑真皮紊乱的胶原纤维束结构”指在真皮胶原纤维束结构紊乱的区域构造真皮的胶原纤维束结构。短语“真皮胶原纤维束结构紊乱”指胶原纤维束结构不能保持正常结构。例如,它包括胶原纤维束变薄和弱,胶原纤维的量变少,胶原纤维被切断,或胶原纤维束缺乏。另外,短语“使皮肤结构正常化”还包括皮肤缺损区域的再生。它还包括恢复缺损区域和促进缺损区域的闭合,其中再生组织能阻止缺损区域的感染发生和恢复皮肤的防御机能和呼吸机能。其中,短语“皮肤缺损”指皮肤结构的破坏状态,其中例如形成皮肤粗糙、皱纹和伤口。本发明的皮肤外用制剂特别适合于伤口愈合。另外,短语“使皮肤结构正常化”还包括使增强成纤维细胞产生胶原蛋白能力的角质化细胞的活性增强。
[0037]本发明的皮肤外用制剂的施用可没有任何特别的限制,只要将其外部施用于皮肤。外用制剂的实例包括含准药物(quasi-drugs)的化妆品、皮肤外用药、以及可外部应用的皮肤学杂物。其中,特别优选化妆品和皮肤外用药。例如,化妆品优选用于改善皱纹和轻微的皮肤粗糙。具体而言,优选将其用于从光照性皮肤老化引起的紊乱中恢复真皮胶原纤维束和用于使由于伤口或严重的光损伤而缺损的真皮的胶原纤维束结构再生。相比之下,皮肤外用药优选用于改善严重的皮肤粗糙和用于伤口愈合。
[0038]本发明皮肤外用制剂的剂型没有特别的限制,可为常规皮肤外用制剂可采用的任何剂型,根据打算的用途。化妆品剂型的优选实例包括常用于基础皮肤护理的剂型,如洗剂、乳状液、精华素、霜剂(cream)和包。此外,皮肤外用药物剂型的优选实例包括膏剂、洗剂、霜剂、乳剂和精华素。
[0039]本发明皮肤外用制剂中二氢黄酮衍生物和/或其盐的含量,可根据皮肤外用制剂的施用、靶点和给药方法而调整,下限优选为1×10-6%质量,更优选为1×10-4%质量。上限优选为1%质量,更优选为0.1%质量。
另外,特别在用于伤口愈合的皮肤外用药的情况下,二氢黄酮衍生物和/或其盐的含量作为下限可优选为1×10-6M,更优选为1×10-4M,作为上限优选为1M,更优选为0.1M。
[0040]另外,当在本发明的皮肤外用制剂中含二氢黄酮衍生物和/或其盐时,优选使用通过纯化二氢黄酮衍生物和/或其盐得到的具有增加浓度的二氢黄酮衍生物和/或其盐的植物提取物。本发明的皮肤外用制剂不包括这样的用于重塑真皮胶原纤维束的皮肤外用制剂:其含小连翘提取物粗品但不含除最初包含在提取物中的二氢黄酮衍生物之外的其它二氢黄酮衍生物和/或其盐。可用于本发明皮肤外用制剂的植物提取物可优选为通过纯化小连翘的植物提取物而得到的具有增加浓度的杜鹃素的提取物。植物提取物中二氢黄酮衍生物和/或其盐的浓度为10-6至0.1%质量,更优选为10-5至0.01%质量。在使用这类植物提取物的情况下,皮肤外用制剂中植物提取物的含量优选为0.001至10%质量,更优选为0.01至1%质量。其中,植物提取物的含量与其在除去溶剂的产物中的含量同义。
[0041]本发明的皮肤外用制剂可含常用于皮肤外用制剂中的任选成分和那些必要的成分。这类任选成分的优选实例包括∶油类/蜡如澳洲坚果油、鳄梨油、玉米油、橄榄油、菜籽油、芝麻油、蓖麻油、红花油、棉籽油、霍霍巴油、椰子油、棕榈油、液态羊毛脂、固化椰子油、固化油、日本蜡、固化蓖麻油、蜂蜡、小烛树蜡、巴西棕榈蜡、ibota蜡、羊毛脂、还原羊毛脂、硬羊毛脂和西蒙得木蜡(jojoba wax);烃如液体石蜡、角鲨烷、姥鲛烷、地蜡(ozokerite)、石蜡(paraffin)、纯地蜡(ceresin)、凡士林和微晶蜡;高级脂肪酸如油酸、异硬脂酸、月桂酸、肉豆蔻酸、棕榈酸、硬脂酸、山萮酸和十一碳烯酸;高级醇如鲸蜡醇、硬脂醇、异硬脂醇、山俞醇、辛基十二醇、肉豆蔻醇和鲸蜡硬脂醇。合成酯油类如鲸蜡基异辛酸酯、异丙基肉豆蔻酸酯、己基癸基异硬脂酸酯、二异丙基己二酸酯、二-2-乙基己基癸二酸酯、鲸蜡基乳酸酯、二异硬脂基苹果酸酯、乙二醇二-2-乙基己酸酯、新戊基二醇二癸酸酯、甘油基二-2-庚基十一烷酸酯、甘油基三-2-乙基己酸酯、三羟甲基丙烷三-2-乙基己酸酯、三羟甲基丙烷三异硬脂酸酯和季戊四醇四-2-乙基己酸酯;硅油,如链聚硅氧烷如二甲聚硅氧烷、甲基苯基聚硅氧烷和二苯基聚硅氧烷;环状聚硅氧烷如八甲基环四硅氧烷、十甲基环戊硅氧烷和十二甲基环己硅氧烷;改性聚硅氧烷如氨基改性的聚硅氧烷、聚醚改性的聚硅氧烷、烷基改性的聚硅氧烷和氟改性的聚硅氧烷;阴离子表面活性剂如脂肪酸皂(如月桂酸钠和棕榈酸钠)、月桂基硫酸钾和三乙醇胺烷基硫酸酯醚;阳离子表面活性剂如三甲基硬脂基氯化铵、苯扎氯铵和氧化月桂胺;两性表面活性剂如咪唑啉基两性表面活性剂(如2-椰油基-2-咪唑啉氢氧化物-1-羧乙基氧二钠盐)、甜菜碱基表面活性剂(如烷基甜菜碱、酰胺甜菜碱和磺基甜菜碱)、以及酰基甲基牛磺酸;非离子型表面活性剂如山梨糖醇酐脂肪酸酯(如脱水山梨醇单硬脂酸酯和脱水山梨醇倍半油酸酯)、脂肪酸甘油酯(如单硬脂酸甘油酯)、丙二醇脂肪酸酯(如丙二醇单硬脂酸酯)、固化蓖麻油衍生物、甘油烷基醚、POE脱水山梨醇脂肪酸酯(如POE脱水山梨醇单油酸酯和聚氧乙烯脱水山梨醇单硬脂酸酯)、POE山梨醇脂肪酸酯(如POE-山梨醇单月桂酸酯)、POE甘油脂肪酸酯(如POE-甘油基单异硬脂酸酯)、POE脂肪酸酯(如聚乙二醇单油酸酯和POE二硬脂酸酯)、POE烷基醚(如POE2-辛基十二烷基醚)、POE烷基苯基醚(如POE壬基苯基醚)、pluronic型、POE/POP烷基醚(如POE/POP2-癸基十四烷基醚)、tetronic型、POE蓖麻油/固化蓖麻油衍生物(如POE蓖麻油和POE固化蓖麻油)、脂肪酸糖酯、以及烷基糖苷;多元醇如聚乙二醇、甘油、1,3-丁二醇、赤藓醇、山梨醇、木糖醇、麦芽糖醇、丙二醇、一缩二丙二醇、双甘油、异戊二醇、1,2-戊二醇、2,4-己二醇、1,2-己二醇和1,2-辛二醇;湿润成分如如吡咯烷酮甲酸钠、乳酸盐(酯)和乳酸钠;微粒如云母、滑石粉、高岭土、合成云母、碳酸钙、碳酸镁、硅酐(二氧化硅)、氧化铝和硫酸钡,其表面可进行处理;无机颜料如红色氧化铁、黄色氧化铁、黑色氧化铁、氧化钴、群青蓝、铁蓝、二氧化钛和氧化锌,其表面可进行处理;珍珠剂如云母钛、鱼鳞箔、和氯氧化铋,其表面可进行处理;有机染料如202号红、228号红、226号红、4号黄、404号蓝、5号黄、505号红、230号红、223号红、201号橙、213号红、204号黄、203号黄、1号蓝、201号绿、201号紫和204号红,其可色淀;有机微粒如聚乙烯粉、聚甲基丙烯酸甲酯、尼龙粉和有机聚硅氧烷弹性体;对氨基苯甲酸酯型紫外线吸收剂;邻氨基苯甲酸酯型紫外线吸收剂;水杨酸酯型紫外线吸收剂;肉桂酸酯型紫外线吸收剂;二苯甲酮型紫外线吸收剂;糖型紫外线吸收剂;紫外线吸收剂如2-(2′-羟基-5′-叔辛基苯基)苯并三唑和4-甲氧基-4′-叔丁基二苯甲酰甲烷;低级醇如乙醇和异丙醇;维生素如维生素A或其衍生物;维生素B类如维生素B6盐酸盐、维生素B6三棕榈酸酯、维生素B6二辛酸酯、维生素B2或其衍生物、维生素B12、以及维生素B15或其衍生物;维生素E类如α-生育酚、β-生育酚、γ-生育酚和维生素E醋酸酯,维生素D类,维生素H,泛酸,泛硫乙胺和吡咯并喹啉醌;以及抗菌剂如苯氧乙醇。
[0042]其中,含在用于促进伤口愈合的皮肤外用药中的任选成分特别优选为有效再生由于伤口缺损的皮组织的成分。具体而言,可特别优选光学成分,用于预防微生物感染的抗生素如青霉素、新霉素、四环素、或其盐、消毒剂如利凡诺或聚烯吡酮碘(isodine)等。作为选择,还优选瘢痕抑制剂如曲尼司特。任何有效再生皮组织的成分的含量优选为0.1至10%质量。
[0043]本发明皮肤外用制剂可通过以常规方法处理二氢黄酮衍生物和/或其盐以及光学成分来制备。
此外,本发明皮肤外用制剂的使用可根据用途、剂型、施用部位、症状等等进行改进。
[0044](C)增强角质化细胞的作用以增强成纤维细胞产生胶原蛋白能力的方法
本发明增强角质化细胞的作用以增强成纤维细胞产生胶原蛋白能力的方法(在下文中,亦称“本发明的方法”)的特征是在既有角质化细胞又有成纤维细胞的存在下施用通式(1)表示的二氢黄酮衍生物和/或其盐。
用于本发明方法中的二氢黄酮衍生物和/或其盐遵循上述(A)的描述。二氢黄酮衍生物和/或其盐具有通过作用于角质化细胞来增强成纤维细胞产生胶原蛋白能力的活性。
“胶原蛋白”的含义概念上既包括胶原蛋白,又包括胶原蛋白的前体原胶原。
[0045]短语“在既有角质化细胞又有成纤维细胞的存在下”指其中这些细胞在体外或体内相互共存的状态。例如,在体外,这种状态可通过将这些细胞共培养而产生。相比之下,在体内,这种状态可见于含表皮和真皮的皮肤。
二氢黄酮衍生物和/或其盐的施用例如可通过使二氢黄酮衍生物和/或其盐与用于角质化细胞和成纤维细胞共培养的培养基混合而进行。在这种情况下,混合物的量(剂量)按照其在介质中的浓度,作为下限优选为10-8M,更优选为10-7M,作为上限优选10-3M,更优选10-5M。
另外,体内施用方法可为经皮施用。经皮施用的方法没有特别限制,只要它是通常应用的方法,但优选将含二氢黄酮衍生物和/或其盐的皮肤外用制剂施用于皮肤的方法。可用于本发明方法中的皮肤外用制剂为如上所述的本发明的皮肤外用制剂,其优选的方面也按上述方法配制。
[0046](D)本发明的筛选方法
本发明筛选方法的特征是在试验物质的存在下培养动物的正常成纤维细胞,将胶原蛋白介质溶液加入到所得到的培养物中制备胶原蛋白凝胶,在试验物质的存在下在胶原蛋白凝胶中培养成纤维细胞,然后在胶原蛋白凝胶中形成缺损区域,培养成纤维细胞使得有缺损区域的胶原蛋白凝胶与试验物质共存,在培养过程中观察缺损区域的填充度或减少。
[0047]用于本发明筛选方法中的正常动物成纤维细胞没有特别的限制,只要它是试验中通常使用的。动物的优选实例包括小鼠、大鼠、兔和人。其中,特别优选人,因为在动物种类之间的微小差别。正常的成纤维细胞为具有形成有组织的胶原蛋白凝胶能力的非癌细胞。这种正常的成纤维细胞可由口腔粘膜、皮肤等获得,或可制备和使用其原始培养物。作为选择,确立的培养物细胞系市场上可买到,可使用这类商品。这类商业产品为优选,例如以Sanko Junyaku Co.,Ltd.制造的“正常人皮肤成纤维细胞(原始培养物)(Normal Human Skin Fibroblast(primaryculture))”和Kurabo Co.,Ltd.制造的“正常人成纤维细胞(Normal HumanFibroblast)”获得的商业产品。
注意,在下文中,正常的动物成纤维细胞也简称为成纤维细胞。
[0048]优选将成纤维细胞预先预培养至适当数量的细胞,然后进行随后的培养。预培养可在用于培养细胞的一般培养条件下进行,例如,其中使用培养基如添加10%FBS的DMEM(GIBCO制造),然后将细胞在5%的二氧化碳气流下于37℃温育直至细胞生长至60-90%融合。在0.01至0.1%胰蛋白酶的存在下通过预培养获得的细胞群优选被分为单个的细胞,制备细胞悬液。在这种情况下,优选存在乙二胺四乙酸盐与胰蛋白酶。
[0049]至于在试验物质的存在下成纤维细胞的培养,添加试验物质的方法没有特别的限制。试验物质可预先加入到介质中,与细胞的接种同时添加,或在细胞接种之后添加,然后培养适宜的时间。优选地,该方法可以是如下的方法:首先将细胞接种至平皿上,然后在无试验物质的介质中培养,之后用含试验物质的肉介质置换介质。所试验物质的量可以是任何浓度。优选地,为了测定试验物质的有效量用含多种浓度试验物质的介质进行培养。此外,培养中使用的成纤维细胞的细胞数目没有特别的限制,可以调节适应于培养平板的尺寸。例如,细胞的数目优选可调至103/cm2至105/cm2。培养可在以类似于预培养的一般条件下进行。培养时间没有特别的限制,只要细胞的数目可增至适宜的数目,所以它可以以例如约3至5天作为标准时间。在此期间,如果需要,介质可用肉介质置换。
具体而言,例如,将通过预培养的成纤维细胞分成的单个细胞获得的细胞悬浮液接种至平皿上然后培养约24小时,之后添加多种浓度的试验物质的溶液。培养优选进行3至5天。
[0050]随后,胶原蛋白凝胶通过向上述获得的成纤维细胞培养物中加入胶原蛋白介质溶液来制备。所加入的胶原蛋白介质溶液的量和胶原蛋白在胶原蛋白介质溶液中的浓度没有特别的限制,只要它们在允许成纤维细胞分散于胶原蛋白凝胶中的范围之内。所使用的胶原蛋白介质溶液可以是例如通过如下制备的溶液:将0.3-0.8%质量I型胶原蛋白溶液、DMEM介质、100-300mM的HEPES、2-4%质量的碳酸氢钠溶液、0.05-0.15N氢氧化钠水溶液、FBS和水以约4∶4∶2∶2∶1∶2∶3的比例混合。所加入的胶原蛋白介质溶液的量可限定如下:例如,胶原蛋白介质溶液与成纤维细胞培养物之比将是8-10份(质量)比1-2份(质量)。
[0051]下一步,将在制得的胶原蛋白凝胶中的成纤维细胞在试验物质的存在下进行培养。换而言之,将上述制备的胶原蛋白凝胶置于含试验物质的介质中,从而在胶原蛋白凝胶中进行成纤维细胞的悬浮培养。
用于培养中的试验物质在介质中的浓度可相当于在试验物质的存在下成纤维细胞的培养中所用介质的浓度。培养时间可根据胶原蛋白凝胶的减少情况来控制。具体而言,优选地培养进行直至达到凝胶尺寸相对于其在添加胶原蛋白溶液制备凝胶时的尺寸减少约1/5至1/10。作为标准培养时间可为3至5天。
[0052]下一步,在减少的胶原蛋白凝胶中形成缺损区域。缺损区域为其中部分胶原蛋白被刺穿并保持空心状的部分。缺损区域的形状和尺寸没有特别的限制,只要它适合于观察形状的变化。例如,所减少的胶原蛋白凝胶的中心部分可以圆形穿孔,得到环形的gal。穿孔方法可采用例如直径为1至5mm的一次性活检穿孔。
制备这种受损的胶原蛋白凝胶模型的方法公开于Roman O’Leary,Mark Rerek,和Edward John Wood,Biol.Pharm.Bull.,27(2),266-270(2004)。
[0053]下一步,将具有缺损区域的胶原蛋白凝胶在试验物质的存在下放置,然后培养胶原蛋白凝胶中的成纤维细胞。用于培养的平皿可根据所制得的胶原蛋白凝胶的尺寸进行选择。例如,如果胶原蛋白凝胶的直径为约2至7mm,就可选择6孔平皿。此外,胶原蛋白凝胶优选固定在孔的底部。胶原蛋白凝胶的固定可如下进行:例如,将胶原蛋白溶液滴加至孔的中心部分并在其上于37℃温育胶原蛋白凝胶15分钟。介质中试验物质的浓度可相应于在试验物质的存在下上述成纤维细胞的培养中所采用的其在介质中的浓度。采用的培养条件也可如上述培养条件的一般条件下进行。培养期(即观察期)作为标准为5至20天,但不特别限于此。
[0054]在上述培养过程中,观察胶原蛋白-凝胶-缺损区域的填充度或减少。通过记录观察结果,可测定试验物质重塑胶原蛋白的作用。例如,缺损区域的形状可用照相客观地记录。任选地,这类照片可通过将它们转化为数字图象数据进行比较和确定。具体而言,当在试验物质的存在下上述缺损区域的填充度或减少比在没有试验物质的情况下大时,可以确定上述试验物质具有促进伤口愈合的作用。此外,填充度或减少可以这样评价:采用评分等用数值代替填充度或减少。例如,当在试验物质的存在下上述缺损区域的体积为在没有试验物质的情况下的85%或更低、优选50%或更低时,可以确定上述试验物质具有促进伤口愈合的作用。
由于试验物质促进伤口愈合的作用可以通过这样一种方法评价,因此排除任何只促进成纤维细胞的迁移而不促进成纤维细胞产生胶原蛋白的物质、或任何只促进成纤维细胞产生胶原蛋白而不促进成纤维细胞的迁移(运动)的物质成为可能。因此,可以更有效地筛选出任何有效愈合伤口的物质。
实施例1
[0055]通过体外实验证实杜鹃素对真皮胶原纤维束的重塑作用。换而言之,运用以下的事实:当在肝素补加培养基中的胶原蛋白凝胶中培养成纤维细胞时,由细胞产生的胶原纤维受损且不能形成强的胶原纤维束,通过使杜鹃素与肝素补加系统共存来研究胶原纤维的损伤中减少的程度。方法将在下文中描述。
[0056]<所用细胞和试剂>
·正常人成纤维细胞(Kurabo)
·含10%FBS的DMEM(GIBCO)
·WST-8/1-甲基PMS(细胞计数试剂盒-8∶DOJINDOLABORATORIES)
将杜鹃素溶于二甲基亚砜(DMSO)中使用。
[0057]通过MTT试验检测杜鹃素的毒性,然后得到加入到肝素补加系统中杜鹃素的剂量。
<实验设计>
1.将生长至80%融合的成纤维细胞用0.05%胰蛋白酶/EDTA分散。将分散液以3×103细胞/孔的浓度接种至96孔/平皿上。
2.24小时之后,将调整浓度的杜鹃素以10ml/孔的量加入到各孔中(n=8)。
3.在添加杜鹃素24小时、48小时和72小时之后,将WST-8/1-甲基PMS以10ml/孔的量加入到各孔中,然后于37℃温育4小时。
4.在450nm的测量波长和650nm的参考波长下测量吸光度。
<结果>
不能证实在任何考虑的浓度下有显著的细胞毒性。相反,可以证实添加杜鹃素可以促进细胞增殖。尤其,当杜鹃素的浓度为10-6ml/ml-DMEM、5×10-7ml/ml-DMEM和10-7ml/ml-DMEM时细胞增殖得到促进,因此下面的胶原蛋白产生试验采用这三个浓度进行。
[0058]基于上述结果,采用肝素补加系统检测杜鹃素促进胶原蛋白产生的作用。
<所用细胞和试剂>
·正常人成纤维细胞(Kurabo)
·肝素(SIGMA∶H-3149)
·DMEM(GIBCO)
·FBS
<实验设计>
1.在含10%FBS的介质中培养成纤维细胞生长至融合,然后通过胰蛋白酶处理分散,之后离心。
2.移去上清液,然后将成纤维细胞重新悬浮于含10%FBS的DMEM中,之后将成纤维细胞以3×103细胞/cm2接种至12孔的平皿上(4.5cm2/孔)。
3.在接种细胞4小时之后,移去上清液DMEM并用含0.4%FBS的DMEM置换,之后在阻止细胞增殖的条件下(37℃,5%CO2)温育72小时。
4.移去含0.4%FBS的DMEM然后用含10%FBS的DMEM替换以解除对细胞增殖的阻止。在该方法中,培养条件为10%FBS-DMEM、0.1%肝素/10%FBS-DMEM、和1.0%肝素/10%FBS-DMEM(各自n=3)用于研究肝素的影响。另外,分别制备以10-6ml/ml-DMEM、5×10-7ml/ml-DMEM和10-7ml/ml-DMEM的浓度加入杜鹃素的培养物。
<结果>
将结果表示在图1的图表中。图1表示当在不补加肝素的条件下将各种浓度杜鹃素溶液加入到介质中时细胞增殖效果,图2表示在补加肝素的条件下的细胞增殖效果。与对照组、添加DMSO的组相比较,任何条件都显示添加杜鹃素的组有助于促进细胞增殖。因此,发现杜鹃素具有促进成纤维细胞生长的作用。
实施例2
[0059]上述实验证实杜鹃素具有促进细胞增殖的作用。此外,为了证实杜鹃素对成纤维细胞运动能力的影响,以一次性活检穿孔器穿孔的三维胶原蛋白凝胶来制备的“伤口愈合模型”用于杜鹃素添加组和无杜鹃素组之间的在源自伤口区域的成纤维细胞的行为方面的比较。
<所用细胞和试剂>
·正常人成纤维细胞(Kurabo)
·含10%FBS的DMEM(GIBCO)
·胶原蛋白介质溶液(将0.5%I型胶原蛋白∶5×DMEM∶200mMHEPES∶2.2%NaHCO3∶0.1N NaOH∶FBS∶水以4∶4∶2∶2∶1∶2∶3的比例混合)
·一次性活检穿孔器(尖端直径为3.0mm)
<实验设计>
1)将通过实施例1的方案4得到的成纤维细胞培养物和胶原蛋白介质溶液以1∶9(体积)的比例一起混合,然后在10%-FBS介质中悬浮培养1周。
2)当胶原蛋白凝胶的尺寸从添加胶原蛋白介质溶液制备时的尺寸减少至约1/5至1/10的尺寸时,将凝胶的中心部分以一次性活检穿孔器穿孔,直径3mm。
3)预备6孔平皿然后将15μl的胶原蛋白溶液滴至孔的中心。随后,将所穿刺的三维胶原蛋白凝胶装在其上并温育10分钟(37℃,5%CO2)。
4)当所滴加的胶原蛋白固化且三维胶原蛋白凝胶附于孔的底部时,以3ml/孔的量添加10%FBS-DMEM、0.1%肝素/10%FBS-DMEM和1.0%肝素/10%FBS-DMEM。
5)进一步,制备其中10-6ml/ml-DMEM的杜鹃素加入到(4)的各培养条件的组。
<结果>
观察制备“伤口愈合模型”24小时之后成纤维细胞的行为。来源于一次性活检穿孔器穿孔的伤口区域的成纤维细胞的照片以图2表示。对于未补加的10%FBS-DMEM,与无杜鹃素的组相比较,在添加杜鹃素的组中观察到成纤维细胞较长的运动距离和细胞运动的活性更强。相反,对于0.1%肝素/10%FBS-DMEM和1.0%肝素/10%FBS-DMEM,在杜鹃素添加组和无杜鹃素的组之间没有差别,它们各自的运动被肝素的作用阻止。
因此,结果表明杜鹃素不是抑制肝素对成纤维细胞运动能力的影响,而是直接作用于成纤维细胞以增强该细胞的运动能力。
实施例3
[0060]采用下面的方法研究杜鹃素是否具有这样的作用:阻止所添加的肝素对胶原纤维束构建的抑制作用。结果如图3所示。发现杜鹃素能阻止肝素对胶原纤维束构建的抑制作用且发挥重塑真皮胶原纤维束的作用。
[0061]<实验设计>
通过将0.5%I型胶原蛋白∶5×DMEM∶200mM HEPES∶2.2%NaHCO3∶0.1N NaOH∶FBS∶水以4∶4∶2∶2∶1∶2∶3的比例混合(在冷却过程中进行)制得胶原蛋白溶液。
↓
下层的胶原蛋白溶液通过将胶原蛋白溶液与水以9∶1的比例混合来制备。
↓
将下层胶原蛋白溶液以100μl/孔的量分配入48孔平皿的各孔中。
↓
在CO2培养箱中进行固化(约15分钟)。
↓
按照常规方法回收NHDF。
↓
(细胞通过细胞过滤器彼此分离)。
↓
对细胞的数目计数(锥虫蓝)然后调至1×105细胞/ml。
↓
将胶原蛋白溶液与细胞悬液以9:1(体积)的比例混合,然后以300μl/孔的量分配入各孔中。
(为了防止细胞不规则分散,该操作在间歇搅拌下进行(最终1×104细胞/ml)。
↓
让细胞在CO2培养箱中静置4小时。
↓
通过注射针将凝胶从孔的内壁上分离而不是阻止凝胶的减少。
↓
1.8%肝素/10%FBS-DMEM的添加以500μl/孔的量进行(最终1%肝素/孔)。
↓
以0.9μl/孔(1,000倍稀释)的量加入杜鹃素(溶于DMSO中)。
↓
在CO2培养箱中进行温育(5天)。
↓
得到样品用于SEM观察。
实施例4
[0062]按照如下所述的配方,制备本发明的皮肤外用制剂化妆品(精华素)。将A、B和C加热至80℃,将B逐渐加入到A中同时搅拌至乳化,然后加入C中和,之后在冷却下搅拌。结果,得到精华素1。进行类似的操作制备比较实施例1,其中精华素1的杜鹃素用乙醇代替。
[0063]
表1
[0064]<试验实施例1>
采用两个5人组、总计10个专门小组(40至50岁),将上述制得的精华素1和比较实施例1的化妆品进行涂布试验8周。这些化妆品每天早晚两次连续数日使用,在涂布试验之前和之后得到眼睛外角的模型(replicas)。在45°的斜角光照射下,皱纹形成的阴影由显微镜拍照,然后二进制化得到视野中的阴影面积比,之后获得其在该组中的平均值。结果列于表2中。因此,发现本发明皮肤外用制剂的化妆品(精华素)对皱纹具有优良的改善作用。
[0065]
实施例5
[0066]<试验实施例2>
按照类似于精华素1中的以下配方,制备本发明的皮肤外用制剂精华素2。按照试验实施例1中描述的方法进行评价。因此,这样的效果被证实:皱纹面积比从试验前的8.2±3.2%变为试验后的3.9±1.1%。
[0067]
表3
实施例6
[0068]采用“有伤口的缺损皮组织皮组织的模型”,其中缺损区域通过穿刺胶原蛋白凝胶制得,研究杜鹃素促进缺损区域组织再生的作用。方法将在下文中描述。结果如图4所示。从图中可以发现:在10-5M或10-6M的杜鹃素终浓度下穿孔尺寸的减少被明显促进,而在10-7M的浓度下的减少促进不明显。因此,发现本发明的皮肤外用制剂中杜鹃素的下限优选为10-6M。
1)将生长至80%融合的正常人成纤维细胞用0.05%胰蛋白酶/EDTA分散。以3×105细胞/25cm2的细胞密度接种成纤维细胞。
2)在24小时之后,介质用加有杜鹃素(终浓度10-5M、10-6M或10-7M)和DMSO的介质置换,之后培养4天。
3)胶原蛋白凝胶通过将胶原蛋白介质溶液加入到培养物中来制备,其中培养物通过在类似于实施例2的各条件下培养而获得。然后将制备的胶原蛋白凝胶在与(2)的培养条件相同的介质中悬浮培养1周。在制备胶原蛋白凝胶之后,将在含(2)的10-5M、10-6M或10-7M杜鹃素的介质中培养的成纤维细胞,分别在含10-5M、10-6M或10-7M杜鹃素的介质中培养。
4)当胶原蛋白凝胶的尺寸从添加胶原蛋白介质溶液制备时的尺寸减少至约1/5至1/10的尺寸时,将凝胶的中心部分以一次性活检穿孔器穿孔成直径3mm的环形。结果,制得“伤口模型”。
5)预备6孔平皿然后将5μl的胶原蛋白溶液滴至孔的中心部分。随后,将伤口模型胶原蛋白凝胶装在其上并于37℃温育15分钟。
6)当所滴加的胶原蛋白固化且凝胶附于孔底部时,在与(3)相同的条件下加入3ml的介质,之后作为“有伤口的缺损皮组织模型”培养。随后,肉眼观察到胶原蛋白凝胶伤口区域的闭合过程。
实施例7
[0069]按照如下所述的配方,制备本发明的皮肤外用制剂化妆品(精华素)。将A、B和C加热至80℃,将B逐渐加入到A中同时搅拌至乳化,然后加入C中和,之后在冷却下搅拌。结果,得到精华素3。进行类似的操作制备比较实施例2,其中精华素3的杜鹃素用乙醇代替。
[0070]
表4
[0071]<试验实施例3>
用精华素3和比较实施例2,在专门小组中研究促进有伤口的缺损区域的组织再生作用。将修边模放在专门小组成员上臂的内侧部分上,用手术刀剥去表皮得到三个1mm×1mm的部分。从除去表皮的那天开始将精华素3施用于一部分,一天一次,施用5天。将比较实施例2施用于另一部分,从除去表皮的那天开始一天一次,施用5天,剩余的一部分不进行任何处理。在施用1周和2周之后进行观察,以确定缺损区域组织再生的程度。结果如表5所示。因此,发现本发明皮肤外用制剂精华素3促进缺损区域组织再生的作用是优良的。此外,根本没有观察到疤痕的形成。
[0072]
表5
实施例8
[0073]<试验实施例4>
按照如下所述的配方,以类似于实施例7的方法制备本发明的皮肤外用制剂,皮肤外用药物1。进行与试验实施例3中相同的评价。结果,该药显示出优良的促进缺损皮组织再生的作用,即使它与抗生素共存。
[0074]
表6
实施例9
[0075]按照下面的方法研究杜鹃素对角质化细胞的作用。
[0076]<实验1∶杜鹃素对角质化细胞的细胞毒性评价>
[所用细胞和试剂]
·正常人表皮角质化细胞(Kurabo Co.,Ltd.制造)
·Humedia KG2(GIBCO Co.,Ltd.制造)
·WST-8/1-甲基PMS(细胞计数工具-8∶DOJINDOLABORATORIES)
[样品制备]
通过用DMSO稀释10-2M溶于DMSO中的杜鹃素调节其浓度来制备杜鹃素样品。
[实验设计]
1)将生长至80%融合的正常人表皮的角质化细胞用0.05%胰蛋白酶/EDTA分散。将分散细胞以3×103细胞/孔和6×103/孔的浓度接种至96孔/平皿上。
2)24小时之后,将调整浓度的杜鹃素样品以100μl/孔的量加入到各孔中(n=8)。
3)在添加杜鹃素样品24小时、48小时之后,将WST-8/1-甲基PMS以10μl/孔的量加入到各孔中,然后于37℃温育4小时。
4)在450nm的测量波长和650nm的参考波长下测量吸光度(OD值)。
<结果>
以MTT评价的结果在图5的图表中表示。显示OD值随杜鹃素的浓度增加。至于在24小时时3×103细胞/孔的OD值,10-5M杜鹃素显示出高于对照、DMSO两倍或更多的值。在48小时时,也显示出高于DMSO值1.7倍的值。然而,细胞的数目少且预期其OD值低,用接种细胞的倍数6×103细胞/孔证实了结果的重现性。结果,可得到几乎相似的结果。
另一方面,目测评价没有给出这样的印象:与DMSO组相比较,杜鹃素添加组中细胞增殖被促进。
[0077]<实验2∶杜鹃素对角质化细胞的细胞增殖作用(直接评价)>
[所用细胞和试剂]
·正常人表皮角质化细胞(Kurabo Co.,Ltd.制造)
·Humedia KG2(GIBCO Co.,Ltd.制造)
[实验设计]
1)以6×103细胞/ml的细胞密度制备正常人表皮角质化细胞,然后分别将其1-ml等分试样接种至96孔/平皿上。
2)24小时之后,从各个孔中除去上清液,然后将添加有以DMSO调过浓度的杜鹃素样品的介质加入到每个孔中。
3)在添加样品24小时、48小时和72小时之后,将细胞用0.05%胰蛋白酶/EDTA分散,然后通过血液细胞计数器对其数目进行计数。顺便地,在实验1中,对WST-8的评价用作细胞数目的指示。由于这种方法用于通过作用于线粒体中的脱水酶间接评价细胞的数目,本发明的研究对细胞数目直接计数。
[结果]
将细胞计数结果如图6所示。该图表示当对照组(DMSO添加组)细胞数目定义为100%时细胞增殖的速率。与对照组比较,细胞增殖速率倾向于以浓度依赖性的方式被抑制。10-5M杜鹃素添加组的细胞增殖速率在24小时之后被抑制至75.1±5.2%。此外,至于其它浓度,在10-6M时细胞增殖速率保持在75.5±5.8%,在10-7M时保持在77.1±8.6%。在48小时之后,10-5M杜鹃素添加组显示出约71.9±16.6%的增殖速率。然而,低于上述浓度的任何浓度显示出与对照组几乎相同的增殖速率。此外,细胞形状没有变化(图7)。也就是说,对用WST-8细胞数目的间接评价的结果与直接评价的结果不一致。因此,暗示杜鹃素可能促进每个角质化细胞线粒体中的柠檬酸循环反应。因此,可以预见在柠檬酸循环反应过程中产生的NADH的作用也可促进随后的反应步骤,氧化磷酸化反应。因此,显示作为细胞能源提供的ATP的产生、或能量代谢性能可被促进。
[0078]<实验3∶通过表皮角质化细胞研究对成纤维细胞的影响>
[概述]
为了弄清楚是否可能存在表皮角质化细胞和成纤维细胞之间的任何相互作用或杜鹃素对共培养的成纤维细胞的任何作用,对产生的原胶原的量进行测定。该方法是基于Eming SA等,Hum.Gene.Ther.,9(4),529-39(1998)中描述的方法。
[所用细胞和试剂]
·正常人表皮角质化细胞(Kurabo Co.,Ltd.制造)
·Humedia KG2(Kurabo Co.,Ltd.制造)
·正常人成纤维细胞(Kurabo Co.,Ltd.制造)
·DMEM(GIBCO Co.,Ltd.制造)
·PIP EIA Kit(TAKARA BIO INC.制造)
[实验设计]
1)表皮角质化细胞
第1天∶将细胞以3×104细胞/孔的细胞密度接种至24孔/平皿上。
第6天∶平皿用PBS洗涤,然后将介质用DMEM+2%FBS置换,之后加入杜鹃素(10-6M,10-7M,10-8M,DMSO)。
第7天∶收集培养物的上清液。
2)成纤维细胞
第3天∶将细胞以2.5×104细胞/孔的细胞密度接种至24孔/平皿上。
第7天∶平皿用PBS洗涤,然后加入表皮角质化细胞的培养物上清液(900μl),之后培养48小时。
第9天∶平皿用PBS和无血清的DMEM洗涤,然后将介质用500μl的无血清DMEM置换,之后培养2小时。收集培养物的上清液,然后根据下文中描述的的方法测量离心上清液(15000rpm,5秒)中原胶原的量。
[所产生的原胶原的量的定量测定]
1)在向平皿的每个孔中加入100μl的标准抗体溶液之后,将预先制备的各个浓度(320、160、80、40、20和10μl/ml;试验物质用DMEM稀释)的PIP标准溶液和20μl的试验样品借助微量吸液管加入到两排的各个孔中,之后在37℃反应3小时(第一次的反应)。
2)除去反应溶液,然后将孔用PBS洗涤4次。然后,将100μl的底物溶液(TMBZ)用八管尖的吸管加入到各个孔中,之后在室温下(20℃至30℃)反应15分钟(第二次反应)。
3)随后,将100μl的终止溶液按加入底物溶液终止反应然后加入混合孔的次序加入到各个孔中。
4)通过将介质的吸光度设置为零作为参比将450mm波长的吸光度值绘图形成标准曲线。然后,从试验物质相应的吸光度读出PIP浓度。
[结果]
结果如图8所示。原胶原的量根据杜鹃素的浓度而显著地增加。另一方面,另一系统通过在培养成纤维细胞时添加杜鹃素然后加入表皮角质化细胞的培养上清液的方法进行测定,产生的原胶原的量没有显示出大的变化。根据此事实,杜鹃素对成纤维细胞直接促进原胶原产生的增加的作用可能较小。因此,可以确定杜鹃素作用于表皮角质化细胞,表皮角质化细胞促进成纤维细胞增强胶原蛋白产生的作用。由此可见,成纤维细胞产生胶原蛋白的能力可通过在共培养系统中应用角质化细胞来改变。因此,例如,就三维培养皮肤等而论,适用于改变三维皮肤的性能至期望的性能。
实施例10
[0079]按照如下所述的配方制备含杜鹃素的皮肤外用制剂(化妆品∶洗剂)。将配方成分混合并在室温下溶解以制备洗剂。通过将洗剂经皮施用于小鼠或人的皮肤可增加皮肤真皮中产生的原胶原的量,导致真皮中胶原蛋白的量增加。这是因为角质化细胞与皮肤中的成纤维细胞共存。
[0080]
表7
实施例11
[0081]<试验物质的制备>
制备小连翘提取物,作为供筛选的试验物质。将10l的80%乙醇水溶液加入到1kg的小连翘Thunberg(藤黄科)的干燥地上部分,然后回流4小时同时搅拌。冷却后,通过过滤除去不溶物质然后在减压下浓缩,之后冻干。由此,得到51g的无定形物。将该产物分散于水中,装在DIAION HP20上,用5l的水及5l的50%乙醇水溶液的流体依次洗涤,用99%乙醇洗脱。分离所得的洗脱级分。随后,将由此得到的级分进一步进行薄层色谱和HPLC以检验其内容物,将包含相同单一物质级分合并在一起。另一方面,将包含两种或更多成分的级分通过再进行色谱进一步纯化。因此,得到含单一成分的七个级分。
[0082]<筛选实施例>
提供上述得到的含单一成分的级分作为试验物质,然后对各试验物质构建胶原蛋白的作用进行评价以筛选出具有伤口愈合作用的物质。特定的方法将在后面描述。
使用具有由穿刺含动物成纤维细胞的胶原蛋白凝胶而形成的缺损区域的“伤口模型”,观察在试验物质的存在下缺损区域的填充度或减少。步骤如下。将与其余的试验物质相比较缺损区域填充度或减少最高的单一成分结构的试验物质,进行质子NMR、质谱分析、和13C-NMR,鉴定为杜鹃素。顺便地,由上述提取物中得到的杜鹃素,产量为3.2mg。在80%的乙醇水溶液提取物的除去溶剂的产物中杜鹃素的含量为约0.006%质量。
另外,将杜鹃素的终浓度分别调至10-5M、10-6M和10-7M,然后观察各浓度下缺损区域的减少程度。结果如图9所示。从图中可以发现:当杜鹃素的终浓度为10-5M或10-6M时穿孔(缺损区域)的减少被明显促进而在10-7M下减少的促进不明显。因此,当使用至少10-6M的杜鹃素时杜鹃素促进胶原蛋白构建的作用可发挥促进伤口愈合的作用。由此可见,按照本发明的筛选方法,也可获得试验物质促进伤口愈合作用的有效浓度。
[0083]<方法>
1)将预培养的生长至80%融合的正常人成纤维细胞用0.05%胰蛋白酶/EDTA分散。然后将成纤维细胞以3×105细胞/25cm2(1×104细胞/cm2)的细胞密度在平皿上接种。
2)在培养24小时后,介质用加有杜鹃素(终浓度10-5M、10-6M或10-7M)和DMSO的介质置换,之后培养4天。
3)胶原蛋白凝胶通过将胶原蛋白介质溶液加入到以类似于实施例3的方式获得的培养物中来制备。胶原蛋白凝胶中的成纤维细胞以(2)中所用的介质培养。介质中试验物质的浓度相当于(2)中介质的浓度。也就是说,在(2)中含终浓度10-5M、10-6M和10-7M杜鹃素的介质中培养的成纤维细胞,即使在胶原蛋白凝胶制备之后,仍分别以含终浓度10-5M、10-6M和10-7M杜鹃素的介质进行培养。
4)培养1周后,胶原蛋白凝胶的尺寸从添加胶原蛋白介质溶液制备时的尺寸减少至约1/5到1/10的尺寸。随后,将胶原蛋白凝胶的中心部分通过一次性活检穿孔器穿孔成直径为3mm的环形。结果,制得“伤口模型”。
5)制备6孔平皿然后将5μl的胶原蛋白溶液滴至孔的中心部分。随后,将伤口模型胶原蛋白凝胶装在其上并于37℃温育15分钟,使胶原蛋白凝胶附在孔的底部。
6)随后,将3ml与(2)中同样的介质加入到每个孔中,然后将上述成纤维细胞胶原蛋白凝胶培养7天。在培养过程中,肉眼观察到胶原蛋白凝胶伤口区域的闭合过程。
工业实用性
[0084]本发明的皮肤外用制剂适用于化妆品、皮肤外用药等。此外,本发明的皮肤外用制剂可促进伤口愈合。
另外,就三维培养的皮肤等而论,增强成纤维细胞产生胶原蛋白能力的方法可通过将三维皮肤的性能变化至期望的性能在人造皮肤的生产中使用。
适于皮肤外用药的具有促进伤口愈合作用的物质可采用本发明的筛选方法进行筛选。
Claims (23)
3.按照权利要求1或2的皮肤外用制剂,包含∶
小连翘、藤黄科的提取物,其含10-6至0.1%质量的二氢黄酮衍生物和/或其盐。
4.按照权利要求1-3任何一项的皮肤外用制剂,其用于使皮肤结构正常化。
5.按照权利要求4的皮肤外用制剂,其中皮肤结构的正常化是重塑紊乱的真皮胶原纤维束结构。
6.按照权利要求4的皮肤外用制剂,其中皮肤结构的正常化是再生皮肤缺损区域。
7.按照权利要求4的皮肤外用制剂,其中皮肤结构的正常化是再生皮肤缺损区域和通过再生组织促进缺损区域的闭合。
8.按照权利要求6或7的皮肤外用制剂,其中皮肤缺损是由于伤口造成的。
9.按照权利要求1至8任何一项的皮肤外用制剂,其中二氢黄酮衍生物和/或其盐的含量为1×10-6至1%质量。
10.按照权利要求4的皮肤外用制剂,其中皮肤结构的正常化是增强角质化细胞的作用以增强成纤维细胞产生胶原蛋白的能力。
12.按照权利要求11的方法,其中二氢黄酮衍生物为杜鹃素。
13.按照权利要求11或12的方法,其中二氢黄酮衍生物和/或其盐的剂量为10-8M或更高。
14.按照权利要求11至13任一项的方法,包括∶
施用含二氢黄酮衍生物和/或其盐的小连翘提取物。
15.按照权利要求11至14任一项的方法,其中施用为经皮施用。
16.按照权利要求15的方法,包括∶
将含二氢黄酮衍生物和/或其盐的皮肤外用制剂施用于皮肤。
17.按照权利要求11至16任一项的方法,其中胶原蛋白为原胶原。
18.一种筛选具有伤口愈合作用的物质的方法,包括∶
在试验物质的存在下培养正常的动物成纤维细胞;
通过向得到的培养物中加入胶原蛋白介质溶液制备胶原蛋白凝胶;
在试验物质的存在下在胶原蛋白凝胶中培养成纤维细胞;
在胶原蛋白凝胶中形成缺损区域;
在试验物质与具有缺损区域的胶原蛋白凝胶的共存下培养成纤维细胞;和
在培养过程中观察缺损区域的填充度或减少。
19.按照权利要求18的筛选方法,进一步包括∶
在没有试验物质的情况下培养正常的动物成纤维细胞;
通过向得到的培养物中加入胶原蛋白介质溶液制备胶原蛋白凝胶;
在没有试验物质的情况下在胶原蛋白凝胶中培养成纤维细胞;
在胶原蛋白凝胶中形成缺损区域;
在没有试验物质的情况下培养成纤维细胞同时放置具有缺损区域的胶原蛋白凝胶;和
在培养过程中观察缺损区域的填充度或减少,其中当在试验物质的存在下缺损区域的填充度或减少比在没有试验物质的情况下缺损区域填充度或减少大时,就确定试验物质具有促进伤口愈合的作用。
20.按照权利要求19的筛选方法,其中当在试验物质的存在下缺损区域的体积为在没有试验物质的情况下缺损区域体积的85%或更低时,就确定试验物质具有促进伤口愈合的作用。
21.按照权利要求18至20任一项的筛选方法,其中正常的成纤维细胞源自人。
22.按照权利要求18至21任一项的筛选方法,其中缺损区域通过穿孔器穿孔产生。
23.按照权利要求19至22任一项的筛选方法,包括下列步骤∶
(1)在含试验物质的介质中和无试验物质的介质中培养分离成单个细胞的正常动物成纤维细胞;
(2)通过向(1)中得到的培养物中加入胶原蛋白介质溶液来制备胶原蛋白凝胶;
(3)使用与(1)相同的介质在(2)的胶原蛋白凝胶中混悬培养正常的成纤维细胞;
(4)当胶原蛋白凝胶的尺寸减少至添加胶原蛋白介质溶液制备胶原蛋白时的尺寸的约1/5至1/10时,通过以穿孔器穿孔胶原蛋白凝胶的中心部分形成缺损区域;
(5)在平皿的孔上滴加胶原蛋白溶液,在孔上装上并培养(4)中制得的胶原蛋白凝胶以使胶原蛋白凝胶附于孔的底部;和
(6)使用与(1)相同的介质培养胶原蛋白凝胶并观察培养过程中缺损区域的填充度或减少。
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