JP3195833B2

JP3195833B2 - 新規生理活性物質及びその製造法

Info

Publication number: JP3195833B2
Application number: JP26247892A
Authority: JP
Inventors: きみ子室伏
Original assignee: きみ子室伏
Priority date: 1991-09-30
Filing date: 1992-09-30
Publication date: 2001-08-06
Anticipated expiration: 2016-08-06
Also published as: JPH05230088A

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【産業上の利用分野】本発明はＤＮＡポリメラーゼα阻
害活性及び細胞増殖阻害活性を有する新規生理活性物質
と、その製造法に関する。

【０００２】

【従来の技術および発明が解決しようとする課題】従
来、種々の抗癌剤が医薬品として実用化されている。し
かしながら、副作用の問題などから、医療分野におい
て、現在も新規な抗癌剤が求められている。

【０００３】

【課題を解決するための手段】本発明者らは、真性粘菌
フィザルム・ポリセファラム（Ｐｈｙｓａｒｕｍｐｏ
ｌｙｃｅｐｈａｌｕｍ）ＭＣＩ２５２６の単相アメー
バより細胞増殖阻害活性のある生理活性物質を発見し、
その産生する物質について単離、精製を行った。

【０００４】その結果、この物質はＤＮＡポリメラーゼ
α阻害活性を有し、特に癌細胞に対し、強い阻害活性を
有するとの知見を得て、その単離・精製を行い、新規な
生理活性物質を得るに至り、本発明を完成した。

【０００５】

【問題点を解決するための手段】即ち、本発明の要旨は
下記式で表される新規生理活性物質及びその製造法に存
する。

【０００６】

【化２】

【０００７】以下、本発明につき詳細に説明する。本発
明の新規生理活性物質は上記式で表される。該生理活性
物質は例えば変形菌網モジホコリ目モジホコリ科
モジホコリ属に属する菌によって生産される。かかる生
産菌としては、例えばフィザルム・ポリセファラム（Ｐ
ｈｙｓａｒｕｍｐｏｌｙｃｅｐｈａｌｕｍ）ＭＣＩ
２５２６が挙げられ、かかる菌株は微工研菌寄第１１５
７６号（ＦＥＲＭＰ−１１５７６）として寄託されて
いる。

【０００８】フィザルム・ポリセファラム（Ｐｈｙｓａ
ｒｕｍｐｏｌｙｃｅｐｈａｌｕｍ）ＭＣＩ２５２６
（以下、「ＭＣＩ２５２６号菌」と略す）の微生物学
的性状は以下の通りである。

【０００９】１）形態学的特徴複相（２ｎ世代）の変形体は、朽ちた倒木や落葉上で生
活し、腐敗した植物体や、その上で繁殖するバクテリア
を餌としている。黄色の色素を持つ半透明ゼラチン状の
生物体で、網目状に平たく広がり、大きさは数cmから数
十cmに及ぶ。厚さは０．５〜数mm程度である。この変形
体は細胞壁のない１個の細胞からできており、内部には
多数の直径約３μｍの核を持つ。変形体の生長に伴な
い、核は分裂を繰り返し、他の細胞内小器官も数を増す
が、細胞質分裂は起こらない。餌を探して巨大なアメー
バ様に移動し生長を続けるが、生長中の変形体は湿った
暗所を好む。成熟すると、倒木の樹皮の割れ目や落ち葉
の下から、光の当たる乾いた場所へと移動し、そこで子
実体を形成する。子実体は高さ１〜１．５mmで、原形質
が集合し上へ伸びてできた柄の上に、枕状の形をした胞
子嚢が数個付着する。１個の胞子嚢の直径は０．３〜
０．５mm、胞子嚢の色は暗い紫褐色で、胞子嚢の袋（表
皮）に石灰が付着しているために、乾燥すると白っぽく
見える。子実体は、倒木や落ち葉の上に直接生じている
のではなく、変形膜と呼ばれる透明な膜を介して倒木な
どにしっかり付着している。

【００１０】胞子は厚膜に包まれており、形は丸く、直
径は約８μｍ、表面にトゲ状の突起を持つ。色は暗紫
色。胞子嚢には細毛体と呼ばれる中空の細い管が存在
し、胞子嚢の形を保ち、また胞子の飛散に役立ってい
る。直径約１０cmの変形体から１００個以上の子実体が
形成され、それぞれの子実体では、１００万個もの胞子
が作られる。

【００１１】胞子が適当な温度、湿度の条件下で発芽す
ると、単相（ｎ世代）のアメーバ（ミクソアメーバ）と
なる。このアメーバは、複相の変形体とは全く独立に生
活することができ、細胞分裂を行って増殖する。単相ア
メーバは直径約１０μｍで色素を持たない。固体上では
一般的な土壌アメーバと同様な挙動を示し、細胞ははっ
きりした極性を持たないが、水中では２本の鞭毛を生
じ、はっきりした極性を持つようになる。生存に不適当
な条件下では、周囲に主としてガラクトサミンとタンパ
ク質から成る細胞壁を形成し、休眠型細胞であるシスト
となる。シストは、直径約５μｍの球形細胞である。単
相アメーバの内部には直径約３μｍの核が１個存在する
が、この核は変形体の核と形態的には区別できない。ミ
トコンドリアは原生動物のものとよく似ていて、電子密
度の高いヌクレオイド構造を持っている。大きさは変形
体のものと変わらない。小胞体は、粗面、滑面のいずれ
もがよく発達しており、ゴルジ体は核の近くに存在す
る。（変形体では、小胞体、ゴルジ体は、鮮明には観察
されない。）中心子と基底小体は単相の時期にのみ見ら
れる構造で、中心子の大きさは１８０nm×４７０nmであ
る。単相アメーバは配偶子に相当し、雄と雌とに相当す
るもの同士が出会うと、接合して、複相（２ｎ世代）に
なる。複相の接合子は、融合と核分裂を繰り返して、黄
色い色素を持った変形体へと生長する。本発明には、以
上述べた生活環のうち、単相アメーバを生理活性物質生
産菌として用いた。

【００１２】２）生理学的性質単相アメーバについて述べる。

【表１】最適生育条件最適ｐＨ：５〜７（寒天培地上，５日間培養）最適温度：２０〜２５℃（寒天培地上，５日間培養）生育の範囲ｐＨ範囲：４〜８（寒天培地上，５日間培養）温度範囲：１０〜３０℃で生育（寒天培地上，５日間
培養）３５℃以上では細胞壁を作って休眠型細胞（シスト）と
なる。

【００１３】３）分類学的考察高次の分類学上の位置変形菌類は、主として子実体の形態によって分類がなさ
れている。本菌体は、（１）胞子嚢を作り（内生胞
子）、（２）胞子の色は暗い紫褐色で、（３）胞子嚢表
皮に顆粒状の石灰質の結晶を蓄積しており、（４）細毛
体は表面に突起模様を持たないことから、Ｍｙｃｅｔｏ
ｚｏａ；ｅｄ．３．ＢｒｉｔｉｓｈＭｕｓｅｕｍ．
（Ｎａｔ．Ｈｉｓｔ．）Ｌｏｎｄｏｎ（１９２５），Ｔ
ｈｅＭｙｘｏｍｙｃｅｔｅｓ；ｐｐ．５６１，Ｕｎ
ｉｖ．ｏｆｌｏｗａＰｒｅｓｓ，Ｉｏｗａ（１９６
９），ＴｈｅＭｙｘｏｍｙｃｅｔｅｓｉｎ “Ｔｈ
ｅＦｕｎｇｉ：ＡｎＡｄｖａｎｃｅｄＴｒｅａｔ
ｉｓ”；ｖｏｌ．４Ｂ，ｐｐ．３９，Ａｃａｄ．Ｐｒｅ
ｓｓ，ＮｅｗＹｏｒｋ（１９７３），Ｍｙｘｏｍｙｃ
ｅｔｅｓ．ＦｌｏｒａＮｅｏｔｒｏｐｉｃａＭｏｎ
ｏｇｒ；Ｎｏ．１６，ｐｐ．３０４，ＮｅｗＹｏｒｋ
Ｂｏｔ．Ｇａｒｄ．，ＮｅｗＹｏｒｋ（１９７６）
による分類に基き、変形菌網（Ｍｙｘｏｍｙｃｅｔｅ）
モジホコリ目（Ｐｈｙｓａｒａｌｅｓ）モジホコリ科
（Ｐｈｙｓａｒａｃｅａｅ）に帰属することが明らかで
ある。

【００１４】属レベルの同定前述の文献によってＭＣＩ２５２６号菌の帰属を検
討すると、（１）胞子嚢の形が枕状で、（２）出来上が
ったばかりの胞子嚢は、オレンジがかった黄色だが、そ
れが成熟し乾燥するに従って、白味を帯びた紫褐色とな
り、（３）透明で繊細な細毛体が枝分かれしたりつなが
ったりして網目を作っている。また、（４）柱軸を持っ
ていることから、モジホコリ属（Ｐｈｙｓａｒｕｍ）に
帰属することは明らかである。

【００１５】種レベルの同定ＴｈｅＭｙｘｏｍｙｃｅｔｅｓ；ｐｐ．５６１，Ｕｎ
ｉｖ．ｏｆＩｏｗａＰｒｅｓｓ，Ｉｏｗａ（１９６
９）〔参照〕によれば、モジホコリ属（Ｐｈｙｓａｒ
ｕｍ）には８４種が報告されており、その後、少なくと
も１０種が付け加えられている。ＭＣＩ２５２６号菌
は、子実体の柄の上に多頭の胞子嚢が生じることから、
種はモジホコリ（モジホコリカビＰｈｙｓａｒｕｍｐ
ｏｌｙｃｅｐｈａｌｕｍ）であることが判明している。

【００１６】ＭＣＩ２５２６号菌は、神谷宣郎博士
（Ｎ．Ｋａｍｉｙａ，元．大阪大学教授，国立基礎生物
学研究所教授）が、１９３９年から１９４２年にかけて
ペンシルバニア大学のＤｒ．Ｗ．Ｓｅｉｆｒｉｚの研究
室から入手した株の一つ（ＰＰＯ株と名付けられてい
る）であり、１９５４年にお茶の水大学に分譲され、１
９６５年以降ＪｏｕｒｎａｌｏｆＧｅｎｅｒａｌ
Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ；２５，４７，（１９６１）
の方法に従って、無菌的に変形体培養を行い、更に、胞
子形成を行わせ、単胞子培養を行って、単相アメーバの
Ｊ株及びＦ株を分離（ＢｏｔａｎｉｃａｌＭａｇａｚ
ｉｎｅ（Ｔｏｋｙｏ），８６，２９０，１９７３）した
その単相アメーバのＪ株を本発明に用いている。

【００１７】モジホコリ属（Ｐｈｙｓａｒｕｍ）は一般
に、他の菌類の場合に見られるようにその性状が変化し
やすい。

【００１８】ＡＴＣＣには、この菌種フィザルム・ポリ
セファラム（ＰｈｙｓａｒｕｍＰｏｌｙｃｅｐｈａｌ
ｕｍ）の菌株２４１１２，２４４６６，２４４６７，２
４７３８，２４７３９，２６７８８，３６８２２，３８
８９８，３８８９９，３８９００，３８９０１，３８９
０２，４２４８９，４２６０１，４２６０２，４２６０
４，４２６０５，４２６２７，４４４９０，４４４９
１，４４９１２，５２７２８が寄託されており、ＭＣＩ
２５２６号菌はこれらのいずれとも起源を異にする
が、当該生理活性物質の生産能を有するものであれば本
発明の方法に使用が可能であり、例えば、上記以外に
も、ＭＣＩ２５２６号菌の、またはこの株に由来する
突然変異体（自然発生または誘発性）の、形質接合体ま
たは遺伝子組換え体であっても、当該生理活性物質の生
産能を有するものは全て本発明の方法に使用することが
できる。

【００１９】本発明においては、前記の菌を通常の微生
物が利用しうる栄養物を含有する培地でバクテリアと共
に二員培養する。栄養源としてはグルコース、水アメ、
デキストリン、シュクロース、デンプン、糖蜜、動・植
物油等を使用できる。また窒素源として大豆粉、小麦胚
芽、コーンスティーブ・リカー、綿実粕、肉エキス、ペ
プトン、酵母エキス、硫酸アンモニウム、硝酸ソーダ、
尿素等を使用できる。その他必要に応じて、ナトリウ
ム、カリウムカルシウム、マグネシウム、コバルト、塩
素、リン酸、硫酸及びその他のイオンを生成することの
できる無機塩類を添加することは有効である。また菌の
生育を助け、上記式で表される生理活性物質（以下、当
該生理活性物質と記す。）生産を促進するような有機及
び無機物を適当に添加することができる。

【００２０】培養法としては、好気的条件下での培養
法、特に寒天培地上での暗所培養が最も適している。培
養に適当な温度は２０℃〜２５℃であるが多くの場合、
２４℃付近で培養する。また、当該生理活性物質生産菌
を培養する前に、この餌となる微生物、例えばアエロバ
クター属の細菌を作製した寒天培地上に接種し、育成さ
せておく。具体的には、このようなエアロバクター属の
細菌としてはエアロバクター・エアロゲネス（Ａｅｒｏ
ｂａｃｔｅｒａｅｒｏｇｅｎｅｓ）ＭＣＩ２５１７
号菌が挙げられ、かかる菌株は微工研菌寄第１１５７７
号（ＦＥＲＭＰ−１１５７７）として寄託されてい
る。

【００２１】本発明の生理活性物質の生産は、培地や培
養条件等により異なるが、通常４〜５日間でその蓄積量
が最高に達する。この時点で培養を停止し、培養物から
目的物質を単離精製する。本発明において、当該生理活
性物質の培養物からの採取に当たっては、その性状を利
用した通常の分離手段、例えば、溶剤抽出法、イオン交
換樹脂法、吸着または分配カラムクロマト法、ゲルろ過
法、透析法、沈殿法等を単独でまたは適宜組み合わせて
抽出精製することができる。例えば、当該生理活性物質
は、培養菌体中からはメタノールとクロロホルム／メタ
ノールで抽出し、減圧下で濃縮する。濃縮液をイオン交
換クロマトグラフィー、分取薄層クロマトグラフィー、
ゲルろ過クロマトグラフィー、逆相高速液体クロマトグ
ラフィー等を組み合わせて精製すると、純粋な当該生理
活性物質が得られる。

【００２２】

【実施例】以下、実施例により本発明をさらに具体的に
説明するが、本発明はその要旨を越えない限り、以下の
実施例に限定されるものではない。実施例１．（１）培養グルコース５．０ｇ，酵母エキス０．５ｇ，バクトペプ
トン５．０ｇ，リン酸二水素カリウム（ＫＨ₂ＰＯ₄）
２．３ｇ，リン酸水素二カリウム（Ｋ₂ＨＰＯ ₄）１．
５ｇ，硫酸マグネシウム７水塩（ＭｇＳＯ₄・７Ｈ
₂Ｏ）０．５ｇ，寒天３０ｇを１リットルの蒸留水で調
整し、滅菌後シャーレに分注し、厚さ０．７cmの寒天培
地を作製した。

【００２３】別に、粘菌アメーバの餌となるエアロバク
ター・エアロゲネス（Ａｅｒｏｂａｃｔｅｒａｅｒｏ
ｇｅｎｅｓ）ＭＣＩ２５１７号菌を斜面培地より白金
耳を用い液状培地（上記培地中から寒天を抜いたもの）
中へ植菌し、２４℃において、１日暗所で培養した。作
製した寒天培地（直径２０cmのシャーレ）上に、前記種
培養液を２〜３滴接種し、一面に広げ、更に２４℃にお
いて２日間暗所で培養した。エアロバクター・エアロゲ
ネスＭＣＩ２５１７号菌を育成した寒天培地上に、白
金耳を用い真性粘菌ＭＣＩ２５２６号菌の単相アメー
バの増殖先端部をかきとり、前記シャーレに植菌し、２
４℃において４〜５日間暗所培養した。

【００２４】シャーレ一面に育成した単相アメーバを寒
天培地上らか採取し、エアロバクター・エアロゲネスＭ
ＣＩ２５１７号菌を除去するために数十倍量の蒸留水
に懸濁し、５００〜１０００回転／分で遠心分離を行い
上清を除いた。この操作を数回繰り返し、上清がきれい
になったところで、再び蒸留水を加え、３０００〜３５
００回転／分で遠心分離し培養菌体を得た。この菌体
は、エタノール中に懸濁し、−８０℃で保存した。

【００２５】（２）培養物の精製前記（１）で得られた菌体（シャーレ５０枚×２）に、
２０倍量のメタノールを数回に分けて加え、３０分間超
音波破砕装置にかけ、その後遠心分離機で上清を分離し
抽出した。同様の操作で、前記沈殿物をクロロホルム：
メタノール＝１：２、クロロホルム：メタノール＝１：
１、クロロホルム：メタノール＝２：１の順番で抽出
し、各々の得られた抽出液を全て混合し、減圧下濃縮乾
固し抽出物を得た。

【００２６】これを、再びメタノールに溶かし、超音波
破砕装置にかけた後、遠心分離機で上清を沈殿物より分
離した。同様の操作で、クロロホルム：メタノール＝
１：２、クロロホルム：メタノール＝１：１の順番で抽
出し、各々得られた抽出液を全て混合し、減圧下濃縮乾
固し抽出物を得た。次に、これを少量のクロロホルム：
メタノール＝１：２に溶かし、同溶媒で平衡下充填した
ＤＥＡＥ−セファデックスのカラムにのせ、同溶媒でイ
オン交換クロマトグラフィーを行った。ＤＮＡポリメラ
ーゼα阻害活性画分を集め、減圧下濃縮乾固し抽出物を
得た。

【００２７】さらに、これを少量のクロロホルム：メタ
ノール＝１：２に溶かし、分取薄層クロマトグラフィー
（６０プレート）にのせ、クロロホルム：メタノール：
水＝６０：４０：９の混合溶媒で展開し、活性画分（Ｒ
ｆ＝０．５０〜０．６５）を削り取り、１０倍量のメタ
ノールを加え、３０分間超音波破砕装置にかけた後、遠
心分離機で上清を分離し抽出した。同様の操作で、クロ
ロホルム：メタノール＝１：２、クロロホルム：メタノ
ール＝１：１、クロロホルム：メタノール２：１の順番
で抽出し、各々の得られた抽出液を全て混合し、減圧下
濃縮乾固し抽出物を得た。

【００２８】これを再び、分取薄層クロマトグラフィー
（１４プレート）にのせ、クロロホルム：メタノール：
酢酸：水＝１０：２：２：４：１の混合溶媒で展開し、
活性画分（Ｒｆ＝０．４５〜０．６０）を削り取り、１
０倍量のメタノールを加え、３０分間超音波破砕装置に
かけた後、遠心分離機で上清を分離し抽出した。同様の
操作で、クロロホルム：メタノール＝１：２、クロロホ
ルム：メタノール＝１：１、クロロホルム：メタノール
＝２：１の順番で抽出し、各々の得られた抽出液を全て
混合し、減圧下濃縮乾固し抽出物を得た。

【００２９】得られた抽出物を少量のクロロホルム：メ
タノール＝１：１に溶かし、遠心分離機にかけ不溶物を
除き、同溶媒で充填したセファデックスＧ−１５のカラ
ムにのせ、同溶媒でゲル濾過を行った。活性画分を集
め、減圧下濃縮乾固し抽出物を得た。更にこれをメタノ
ール：水＝６５：３５に溶かし、遠心分離機にかけ不溶
物を除き、同溶媒を用い逆相高速液体クロマトグラフィ
ー（ＨＰＬＣ島津６Ａシリーズ）で精製した。用いた
カラムは、ＴＳＫ−ＯＤＳ−８０ＴＭ，０．４６×１５
cm、溶出速度は、１ml／min 、温度は３５℃に設定し
た。フラクションＮｏ．１４〜１７に活性物質が溶出し
たが、最も活性が高かったのはＮｏ．１５であり、減圧
下濃縮乾固の結果、約２５０μｇ活性物質が得られた。
同物質は、以下の物性から上記した式で表される。

【００３０】１）分子量４２６マトリックス剤にグリセリンを使用し、高速原子衝撃イ
オン化法マススペクトロメトリー（ＦＡＢ−ＭＳ）によ
り測定した。Ｍ／ｚ＝４２７にプロトン化イオン（Ｍ＋
Ｈ）⁺が観測された。測定したスペクトルを図１に示
す。

【００３１】１）分子式Ｃ₂₀ Ｈ ₃₆Ｏ₆ＰＮａ

【００３２】３）赤外吸収スペクトル（ＦＴ−ＩＲ）測定したスペクトルを図２に示す。

【００３３】４）水素核磁気共鳴スペクトル重クロロホルム：重メタノール＝１：１の溶媒中で測定
した５００．０２MHz水素核磁気共鳴スペクトルを図３
に示す。

【００３４】５）Ｊ相関¹Ｈ−¹Ｈ２次元核磁気共鳴ス
ペクトル（Ｈ−ＨＣＯＳＹ）重クロロホルム：重メタノール＝３：１の溶媒を用い、
共鳴周波数は¹Ｈ５００．０２MHz 、位相検出２量子フ
ィルター法で測定した。観測幅は５KHz 、データ点は、
ｔ₂軸５１２、ｔ₁軸１２８にとり、データ処理時にｔ
₁軸のみ４倍にゼロ・ファイリングした。測定したスペ
クトルを図４に示す。

【００３５】６）異種核間（¹Ｈ−¹³Ｃ）Ｊ相関２次元
核磁気共鳴スペクトル（Ｈ−ＣＣＯＳＹ）重クロロホ
ルム：重メタノール＝３：１の溶媒を用い、ＨＭＱＣ法
（水素核観測による高感度スペクトル測定法）で、１／
２Ｊ＝３．５ｍｓｅｃ（Ｊ〜１４３Hz），３．１ｍｓｅ
ｃ（Ｊ〜１６１Hz）の２点につき測定を行った。共鳴周
波数は、¹Ｈ５００．０２MHz ，¹³Ｃ１２５．８MH
z 、観測幅は、ｔ₂（¹Ｈ）軸４KHz,ｔ₁（¹³Ｃ）軸
２５KHz 、データ点は、ｔ₂軸５１２、ｔ₁軸１２８
にとり、データ処理時にｔ₁軸のみ４倍にゼロ・ファイ
リングした。測定したスペクトルを図５，図６に示す。

【００３６】７）ＮＯＥ相関¹Ｈ−¹Ｈ２次元核磁気共
鳴スペクトル（ＮＯＥＳＹ）重クロロホルム：重メタノール＝３：１の溶媒を用い、
共鳴周波数は、¹Ｈ５００．０２MHz で測定を行った。
データ点は、ｔ₂軸５１２、ｔ₁軸１２８にとり、デー
タ処理時にｔ₁軸のみ４倍にゼロ・ファイリングした。
測定したスペクトルを図７に示す。

【００３７】８）³¹Ｐ核磁気共鳴スペクトル重クロロホルム：重メタノール＝３：１の溶媒を用い、
共鳴周波数³¹Ｐ２０２．５MHz で、測定したスペクトル
を図８に示す。９）ＣＡＤスペクトル本発明の生理活性物質を５ＮのＮaＣl中、７０℃にて５
時間加水分解した後ジエチルエーテルで抽出し、それを
負イオンＦＡＢ／ＭＳ測定した。ｍ／ｚ＝２６７に検出
されたカルボン酸由来と考えられるイオンから、磁場強
度を調製することにより親イオンを選択し、電場電圧を
走査し、ＭＳ／ＭＳ分析した。ＦＡＢ／ＭＳ測定ならび
にＭＳ／ＭＳ分析の条件は下記のとうり。

【表２】ＦＡＢ／ＭＳ測定条件装置：ＶＧ社ＺＡＢ^_ＨＦ質量分析計データ処理：ＶＧ社 11/250データ処理システムイオン化方式：ＦＡＢ測定イオン：負イオン衝突原子：キセノン衝突原子加速電圧：約８kＶＦＡＢ銃エッミッション電流：約１mＡマトリックス：ジエタノールアミンイオン加速電圧：８.０kＶ走査速度：３０sec./decade 走査間隔：２sec. 走査範囲：ｍ／ｚ＝１０〜１０００ＭＳ／ＭＳ分析条件走査部：電場走査速度：１０sec. 走査範囲：８keＶ〜５００eＶ衝突ガス：ヘリウム（ガス圧２×１
０^-6mbar）積算回数：１０回その他の条件はＦＡＢ／ＭＳ測定条件と同じ。測定した
スペクトルを図９に示す。各ピークはＣＨ₂を示してお
り、本発明の生理活性物質が上記式で表されることがわ
かった。

【００３８】試験例１．〔ＤＮＡポリメラーゼα阻害活性試験〕基質として、活
性化ＤＮＡ，デオキシリボヌクレオチド三リン酸（ｄＮ
ＴＰｓ）、トリチウム標識したデオキシチミジン三リン
酸（³Ｈ−ｄＴＴＰ）を用い、実施例１で得られた生理
活性物質の、精製された牛胸腺由来ＤＮＡポリメラーゼ
α〔バイオケミカバイオフィジカアクタ（Ｂｉｏｃ
ｈｉｍｉｋａｅｔＢｉｏｐｈｙｓｉｃａＡｃｔ
ａ）９５０，１９８８２６３〜２７３〕に対する阻害
活性を測定した。

【００３９】牛胸腺由来ＤＮＡポリメラーゼα５ｎｇ，
活性化ＤＮＡ２μｇ，ｄＮＴＰｓ２０μＭ（０．４μＣ
ｉ³Ｈ−ｄＴＴＰを含む），２−メルカプトエタノール
２ｍＭ，牛血清アルブミン４００μｇ／ml，１０％グリ
セロール，塩化マグネシウム１０ｍＭ，トリス塩酸塩５
０ｍＭ（ＰＨ７．５）を混合し、得られた反応液を５０
μｌとし、当該生理活性物質を０，１４，３５，７０，
１４０，２１０，２８０ｎｇ加え、各々３７℃で６０分
間保温し反応させた。

【００４０】反応後、これを円形ろ紙（Ｗｈａｔｔｍａ
ｎ３ＭＭ）にスポットし、１０％トリクロロ酢酸で１
５分間洗浄後、５％トリクロロ酢酸で１５分間３回洗浄
を繰り返し、更に９９％エタノールで洗浄した後、ろ紙
を乾燥させた。ろ紙上の放射活性を、トルエンシンレー
ターの中で、液体シンチレーションカウンター（Ｐａｃ
ｋａｒｄ社，Ｔｒｉ−ｃａｒｂ３２５５）を用いて測定
し、合成されたＤＮＡの定量を行った。その結果を図１
０に示す。

【００４１】試験例２〔各種由来ＤＮＡポリメラーゼα阻害活性試験〕Ｔｒｉ
ｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．５）４０ｍＭ、デオキシアデニン
三リン酸（ｄＡＴＰ）２０μＭ、デオキシシトシン三リ
ン酸（ｄＣＴＰ）２０μＭ、デオキシグアニン三リン酸
（ｄＧＴＰ）２０μＭ、デオキシチミジン三リン酸（ｄ
ＴＴＰ）１０μＭ、ＭｇＣｌ₂７ｍＭ、ＫＣｌ５０ｍ
Ｍ、ウシ血清アルブミン（ＢＡＳ）１０μｇ、１０％グ
リセロース、２−メルカプトエタノール２ｍＭ、活性化
ＤＮＡ２μｇ、ＤＮＡポリメラーゼα０．０５ユニッ
ト、本発明の生理活性物質０．２５μを混合し、得られ
た反応液を２５μｌと下。この反応液を３７℃にて６０
分間（ＰｈｙｓａｒｕｍＰｏｌｙｃｅｐｈａｌｕｍ由
来のＤＮＡポリメラーゼαを含んでいるものは２５℃に
て６０分間）反応させ、当該生理活性物質に取り込まれ
た放射活性を上記試験例１と同様の方法により測定し
た。その結果を表−１に示す。

【表３】表−１中、−ＰＨＹＬＰＡは本発明の生理活性物質を加
えない場合、＋ＰＨＹＬＰＡは本発明の生理活性物質を
加えた場合を示し、’はＤＥ−Ｉ、”はＤＥ−IIを示
す。試験例３〔ｉｎｖｉｖｏにおける癌細胞増殖抑制効果〕エムシ
ーディービー１０４（ＭＣＤＢ１０４）培地に、インシ
ュリン５μｇ／ml，トランスフェリン５μｇ／ml，デキ
サメサゾン１０ｎｇ／ml，ピーディージーエフ（ＰＤＧ
Ｆ）１２５ｎｇ／mlを加えた無血清培地を作製し、ヒト
子宮頸癌由来ヒーラ細胞（Ｈｅｌａ細胞）をシャーレに
１０⁴個／cm²接種し、３７℃で４日間ＣＯ₂インキュ
ベータで培養した。

【００４２】これに実施例１で得られた生理活性物質を
０．５−１μｇ／ml濃度で当培養系に添加したところ、
Ｈｅｌａ細胞をほぼ１００％死滅させた。一方、同様の
条件下でヒト胎児肺由来ティーアイジィー３細胞（ＴＩ
Ｇ−３細胞）をシャーレに１０⁴個／cm²接種し、３７
℃で４日間ＣＯ₂インキュベータで培養し、実施例１で
得られた生理活性物質を０．５−１μｇ／ml濃度で添加
したところ、ＴＩＧ−３細胞の増殖を１００％抑制し
た。また、当培養系から当該生理活性物質を除去すると
細胞の増殖能が回復し、この抑制作用は可逆的であっ
た。

【００４３】

【発明の効果】本発明の新規生理活性物質は、ＤＮＡポ
リメラーゼα阻害活性を有しており、抗癌剤としての有
用性が期待される。

【図面の簡単な説明】

【図１】図１は、正イオンＦＡＢマススペクトルを示す
図である。

【図２】図２は、赤外吸収スペクトル（ＦＴ−ＩＲ）を
示す図である。

【図３】図３は、水素核磁気共鳴スペクトルの全領域を
示す図である。

【図４】図４は、Ｊ相関水素−水素２次元核磁気共鳴ス
ペクトル（Ｈ−ＨＣＯＳＹ）を示す図である。

【図５】図５は、ＨＭＱＣ法を用い、１／２Ｊ＝３．５
ｍｓｅｃで測定した異種核間（ ¹Ｈ−¹³Ｃ）Ｊ相関２次
元核磁気共鳴スペクトルを示す図である。

【図６】図６は、ＨＭＱＣ法を用い、１／２Ｊ＝３．１
ｍｓｅｃで測定した異種核間（ ¹Ｈ−¹³Ｃ）Ｊ相関２次
核磁気共鳴スペクトルを示す図である。

【図７】図７は、ＮＯＥ相関水素−水素核磁気共鳴スペ
クトル（ＮＯＥＳＹ）を示す図である。

【図８】図８は、リン核磁気共鳴スペクトルを示す図で
ある。

【図９】図９は、ＣＡＤスペクトルを示す図である。

【図１０】図１０は、ＤＮＡポリメラーゼα阻害活性試
験結果を示す図である。

Claims

(57)【特許請求の範囲】

【請求項１】下記式【化１】で表される新規生理活性物質。
【請求項２】真性粘菌フィザルム・ポリセファラム（Ｐ
ｈｙｓａｒｕｍｐｏｌｙｃｅｐｈａｌｕｍ）の単相ア
メーバを培地中で培養することを特徴とする請求項１記
載の新規生理活性物質の製造方法。