KR20040081452A - 디글리세라이드의 제조방법 - Google Patents
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Abstract
본 발명은 고정화 부분 글리세라이드 리파아제 하에서 지방산 또는 이의 저급 알킬 에스테르와 글리세린을 반응시 생성되는 물을 시스템 밖으로 제거하는 반응으로 이루어진 디글리세라이드 제조방법을 제공한다. 상기 반응은 하기의 범위를 만족하는 반응혼합물의 산가(acid value;AV)에서 종결되는 것이 바람직하다: 50R-60 〉AV 〉70R-150(AV 〉0 인 조건).
본 발명의 제조방법은 감압하에서 리파아제 활성의 손상없이 고순도의 디글리세라이를 효율적으로 제조하는 것이 가능하다. 본 발명의 제조방법은 지방산/글리세린 비율, 반응온도 또는 효소농도와 같은 반응조건의 변수에 영향을 받지 않고 효과적이다. 특히, 지방산/글리세린 비율이 높을 경우, 고순도의 디글리세라이드를 높은 반응수율로 생산할 수 있다.
Description
디글리세라이드는 유지의 가소성(plasticity)을 향상시키기 위한 첨가제(additive), 또는 식품, 의약품, 화장품 등의 분야에 사용된다. 최근, 디글리세라이드의 우수한 생리활성(physiolgical activity)을 이용한 식품이 주목을 끌고 있다.
디글리세라이드의 전형적인 제조방법으로서, 에스테르화(esterification) 또는 에스테르 교환반응(ester exchange reaction)을 들 수 있다. 예를들면, 지방산 또는 이의 저급 알킬 에스테르와 글리세린을 고정화된 1,3-선택적 리파아제(specific lipase)의 존재하에서 반응하고 반응이 진행되는 과정에서 생성된 물 또는 저급 알콜을 감압으로 시스템 밖으로 제거하여 디글리세라이드를 얻는 방법이 알려져 있다(일본특공평 6-65311호).
상기 1,3-선택적 리파아제를 사용한 에스테르화 반응에 의해서는 디글리세라이드 뿐만 아니라 트리글리세라이드도 제조되어지기 때문에, 반응수율의 상승은 디글리세라이드의 순도를 저하시킨다. 반면, 반응수율의 저하는 디글리세라이드의 순도를 상승시키지만, 다량의 글리세린 또는 지방산이 미반응물로 남아있다. 따라서, 디글리세라이드의 순도를 상승시키기 위해, 에스테르화 반응 후 정류(stripping)와 같은 정제공정이 불가피하다.
상기의 문제점을 극복하기 위한 방법으로서, 트리글리세라이드에 작용하지 않은 부분(partial) 글리세라이드 리파아제를 사용한 트리글리세라이드-프리(free) 글리세라이드 제조법이 제안되었다(일본특개소 61-181390호). 그러나, 모노글리세라이드가 상기 방법의 주 생산물이므로, 상기 방법은 고 순도의 디글리세라이드의 제조에 적합하지 않는다.
공업적으로 사용되어온 종래의 에스테르화 반응에서 반응과정에서 생성된 물을 시스템 밖으로 제거하여 반응평형(reaction equilibrium)을 이동시켜 반응수율을 높이는 것이 필요하다. 감압하에서 시스템밖으로 물을 제거하는 동안 부분 글리세라이드 리파아제를 사용한 에스테르화 반응은 종결전에 에스테르화 반응의 종결과 같은 문제점을 갖고 있다. 또한, 일본특개평 1-137989호에 제안된 방법은 부분 글리세라이드 및 지방산을 함유하는 유지에 부분 글리세라이드 리파아제를 작용하여 트리글리세라이의 합성에서 고정화 효소(Immobilized-Enzyme)를 사용하는 동안 낮은 수분 함량하에서 에스테르화 반응을 수행하는 방법이다. 상기 방법은 모노- 및 디글리세라이드의 수율을 억제하면서 트리글리세라이드의 합성을 위한 방법이며, 고순도의 디글리세라이드를 제조하는 방법과는 본질적으로 상이한 방법이다.
디글리세라이드를 에스테르화 반응으로 합성할 경우, 글리세린에 지방산 또는 이의 에스테르반응으로 고수율로 고순도의 디글리세라이드를 얻기위한 반응의최적 종결점은 원료 물질과 같은 기질(substrate) 비율에 따라 반응온도, 효소 농도 등에 의해 결정된다. 특히, 글리세린에 지방산 또는 이의 에스테르의 비율을 반응속도 향상을 위해 높일경우, 반응이 연장됨에 따른 반응 수율의 상승은 트리글리세라이드의 형성으로 디글리세라이드 순도는 저하되는 문제점을 가져온다.
본 발명은 고순도의 디글리세라이드(diglyceride)를 효율적으로 제조하는 방법에 관한 것이다.
따라서, 본 발명이 목적은 감압하에서 리파아제 활성의 감소없이 고순도의 디글리세라이드를 효율적으로 제조하는 방법을 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 목적은 특히 지방산/글리세린 비율이 높게 정해질 경우, 지방산/글리세린 비율, 반응온도 또는 효소농도의 변수에 영향없이 높은 반응수율로 고순도의 디글리세라이드를 제조하는 방법을 제공하는 것이다.
본 발명자들은 고정화된 부분 글리세라이드 리파아제의 존재하에서 반응시 생상되는 물을 시스템 밖으로 제거하면서 지방산 또는 이의 저급 알킬 에스테르와 글리세린을 반응함으로써 비-고정화된 부분 글리세라이드 리파아제의 존재하에서의 반응과 비교하여 디글리세라이드 형성비가 비약적으로 증가함을 나타내고, 고 순도의 디글리세라이드를 고수율로 얻을 수 있음을 발견하였다. 또한, 본 발명자는 반응혼합물을 산가(acid value)가 지방산 또는 이의 저급 알킬 에스테르와 글리세린의 공급비율과 관련하여 미리 결정된 범위내에 있을 경우, 반응의 종결은 가능한 높은 수율로 고순도의 디글리세라이드를 제조하는 것이 가능하도록 함을 발견하였다.
따라서, 본 발명의 한 측면에서 고정화된 부분 글리세라이드 리파아제의 존재하에서 반응시 생성되는 물을 시스템 밖으로 제거하면서 지방산 또는 이의 저급 알킬 에스테르와 글리세린의 반응으로 이루어진 디글리세라이드의 제조방법을 제공한다.
본 발명의 또 다른 측면에서 반응혼합물의 산가(acid value;AV)가 만족스러운 50R-55 〉AV 〉70R-150(AV 〉0인 조건)의 범위내에 있을 경우, 반응이 종결되는 상기의 디글리세라이드의 제조방법을 제공한다.
본 발명에 사용된 부분 글리세라이드 리파아제는 트리글리세라이드를 가수분해하는 것이 아니라 모노글리세라이드 및 디글리세라이드와 같은 부분 글리세라이드를 가수분해하는 리파아제이다. 상기 부분 글리세라이드 리파아제의 구체적인 예로는 쥐 소장 또는 돼지 지방조직 등과 같은 동물 장기로부터 유래된 모노글리세라이드 리파아제 또는 디글리세라이드 리파아제, 바실러스속(Bacillus sp.) H-257로부터 유래된 모노글리세라이드 리파아제(J. Biochem., 127, 419-425, 2000), 슈도모나스(Pseudomonas sp.) LP7315로부터 유래된 모노글리세라이드 리파아제(Journal of Bioscience and Bioengineering, 91(1), 27-32, 2001), Penicillium cyclopium로부터 유래된 리파아제(J. Biochem, 87(1), 205-211, 1980), 및 Penicillium camembertii U-150로부터 유래된 리파아제(J. Fermentation and Bioengineering, 72(3), 162-167, 1991)를 포함한다. 상업적으로 사용가능한 상품의 예로는 "Monoglyceride Lipase(MGLPII)"(Asahi Kasei사제) 및 "Lipase G Amano 50"(Amano Enzyme Inc.사제)를 포함한다. 특히, 고도불포화(polyunsaturate) 지방산(적어도 4개 이상의 이중결합을 갖는 불포화지방산을 의미) 또는 이의 저급 알킬 에스테르를 반응기질로 사용할 경우, 30℃이상 50℃미만내의 최적 온도를 갖는 부분 글리세라이드 리파아제를 적용하는 것이 바람직하다.
본 발명에서 사용된 고정화된 부분 글리세라이드 리파아제는 담체(carrier)에 고정화된 부분 글리세라이드 리파아제를 갖는다. 상기 고정화 담체의 예로는 셀라이트(Celite), 규조토(diatomaceous earth), 고령석(kaolinite), 실라카겔, 몰레큘러시브(Molecular Sieves), 다공성 유리, 활성탄, 탄산칼슘(calcium carbonate), 및 세라믹과 같은 무기(inorganic)담체; 및 셀룰로오스 파우더, 폴리비닐알콜, 폴리프로필렌, 키토산, 이온교환 수지, 소수성(hydrophobic)흡착수지, 킬레이트(chelate) 수지 또는 합성흡착수지 등과 같은 유기성 고분자;를 포함한다. 이온 교환수지에 고정화된 부분 글리세라이드 리파아제가 보수력(water retention power)의 관점에서 특히 바람직하다.
상기 이온 교환수지로서는 다공성 음이온교환수지가 바람직하다. 상기 수지의 입자크기는 100~1000㎛가 바람직하고, 세공크기(pore size)는 100~1500Å인 것이 바람직하다. 수지가 세공의 형태일 경우 효소흡착의 표면면적이 커지고 흡착량의 증가를 가져온다. 수지의 재료로서 페놀-포름알데하이드, 폴리스틸렌, 아크릴아마이드 및 디비닐벤젠을 사용한다. 특히 바람직하게는 페놀-포름알데하이드 수지(상품명;"Duolite A-568")이다.
부분 글리세라이드 리파아제의 고정화 온도는 효소를 비활성화하지 않는 범위내에서 제한적이지 않으며, 0~60℃, 바람직하게는 5~30℃이다. 고정화에 사용되는 수용성 효소 용액의 pH는 효소의 변형을 야기시키지 않는 범위내, 바람직하게는 3~9이다. 최적 pH가 산성인 리파아제를 적용하는 것이 바람직하며, pH는 최대 활성을 달성하기 위해 4~6으로 조절하는 것이 바람직하다. 수용성 효소용액의 제조에 사용되는 완충용액으로서 아세테이트 완충용액, 인산염 완충용액 및 Tris-HCl 완충용액과 같은 일반적 것들을 사용한다. 수용성 효소용액에서 부분 글리세라이드 리파아제의 농도는 효소의 용해도보다 낮지만, 고정화 효율의 관점에서 충분하다. 필요에 따라 원심분리로 불용성 부분을 제거한 후 상층을 사용할 수 있다. 부분 글리세라이드 리파아제는 고정화 담체 1중량부에 대하여 0.05~10중량부, 바람직하게는 0.1~5중량부의 양으로 사용된다.
본 발명에서 고정화 담체는 고활성을 발현하도록 하는 흡착상태가 되도록하기 위해 고정화에 앞서 고정화 담체는 하나 이상의 지용성(lipophilic) 지방산 또는 이의 유도체로 처리하는 것이 바람직하다. 이는 단독으로 사용할 수 있지만, 2종이상 조합하여 사용하는 것이 효과적이다. 상기 지용성 지방산 또는 이의 유도체와 고정화 담체의 접촉법으로 선택적으로 물 또는 유기용매를 부가할 수 있으며, 상기 지용성 지방산 또는 이의 유도체를 유기용매에 분산 또는 용해시켜 물에 분산된 고정화 담체에 부가할 수 있다. 상기 유기성 용매의 예로는 클로로포름, 헥산 및 에탄올이 있다. 지용성 지방산 또는 이의 유도체는 고정화 담체 1중량부에 대하여 0.01~1중량부(건조중량), 바람직하게는 0.05~0.5중량부의 양으로 첨가된다. 접촉온도는 0~100℃, 바람직하게는 20~60℃이다. 접촉시간은 5분~5시간이다. 고정화 담체는 상기 처리 후, 여과과정으로 회수할 수 있으며, 이때 건조할 수 있다. 건조시간은 상온에서 100℃가 바람직하다. 또한, 건조는 감압하에서 수행될 수 있다.
고정화 담체의 처리에 사용되는 지용성 지방산의 구체적인 예로는 탄소수 4~24개의 직쇄(linear) 또는 분지쇄(branched), 포화 또는 불포화 지방산을 포함하며, 수산기로 대용될 수 있다. 바람직한 예로는 카프르산(capric acid), 라우르산(Lauric acid) 및 미리스트산(myristic acid)과 같은 직쇄형 포화 지방산, 올레산(oleic acid) 및 리놀렌산(linoleic acid)과 같은 불포화 지방산, 리시놀산(ricinolic acid)과 같은 히드록시(hydroxy)지방산, 및 이소스테아르산(isostearic acid)과 같은 분지쇄 지방산을 포함하는 C8~18지방산을 포함한다. 상기 지용성 지방산 유도체의 예로는 모노하이드릭(monohydric) 알콜 에스테르, 폴리하이드릭(polyhydric) 알콜 에스테르, 인지질(phospholipid) 및 에스테르에 에틸렌 옥사이드를 부가하여 얻어진 유도체와 같은 C8~18지방산 및 수산기-함유 화합물의 에스테르를 포함한다. 모노하아디륵 알콜 에스테르의 구체적인 예로는 메틸 에스테르 및 에틸 에스테르를 포함하고, 폴리하이드릭 알콜 에스테르의 예로는 모노글리세라이드, 디글리세라이드, 상기 글리세라이드의 유도체, 폴리글리세린 지방산 에스테르, 소르비탄 지방산 에스테르 및 수크로오스 지방산 에스테르를 포함한다. 상기 처리단계의 용이성의 관점에서 상기 지방산 또는 이의 유도체들은 상온에서 액체 형태를 갖는 것이 바람직하다. 지방산 또는 이의 유도체로서 상기 지방산의 혼합물, 예를들어, 대두지방산(soybean fatty acid)과 같은 천연유래의 지방산을 사용한다.
본 발명의 고정화 부분 글리세라이드 리파아제의 존재하에서 지방산 또는 이의 저급 알킬 에스테르의 반응에서 사용되는 지방산으로서, 포화 또는 불포화 C4~22지방산이 바람직하다. 구체적인 예로는 부티르산(butyric acid), 길초산(valeric acid), 카프로산(caproic acid), 에난토르산(enantoic acid), 카프릴산(caprylic acid), 펠라르곤산(Pelargonic acid), 카프르산(Capric acid), 운데칸산(Undecanoic acid), 라우르산(Lauric acid), 미리스트산(myristic acid), 팔미트산(palmitic acid), 주머르산(zoomaric acid), 스테아르산(stearic acid), 올레산(oleic acid), 엘라이드산(elaidic acid), 리놀레산(linoleic acid), 리놀렌산(linolenic acid), 아라키돈산(arachidonic acid), 베헨산(behenic acid), 에루신산(Erucic acid), 아이코사펜타엔산(eicosapentaenoic acid), 및 도코사헥사엔산(docosa hexaenoic acid)을 포함한다. 상기 지방산과 에스테르를 형성하는 저급 알콜로서, 탄소수 1~3개를 갖는 저급 알콜이 바람직하다. 상기 C1~3의 저급알콜의 예로는 메탄올, 에탄올, 1-프로판올 및 2-프로판올을 포함한다. 상기 지방산 또는 이의 저급 알킬 에스테르는 조합하여 사용될 수 있다. 지방산의 혼합물은 예를들어, 대두지방산과 같은 천연유래의 지방산을 사용한다.
상기의 반응에서 지방산 또는 이의 에스테르, 및 글리세린은 몰비(molar ratio) R [R= 지방산 또는 이의 저급알킬 에스테르(㏖) / 글리세린(㏖)]이 1.5~2.6, 바람직하게는 1.6~2.5, 특히 바람직하게는 1.8~2.3에서 반응한다.
지방산 또는 이의 에스테르와 글리세린의 반응은 고정화 부분 글리세라이드 리파아제의 존재하에서 반응시 생성되는 물을 시스템 밖으로 제거하면서 발생한다.좀 더 구체적으로, 반응은 리파아제 제조에 함유된 물을 제외하고는 실질적으로 무수(water-free) 조건하에서 수행되고, 에스테르화 반응시 발생하는 물은 감압방법, 제올라이트 또는 몰레큘러시브(molecular sieve)와 같은 흡수제(absorbent) 사용, 또는 반응탱크에 건조 불활성 가스를 주입하는 등의 방법을 사용하여 시스템 밖으로 제거한다.
에스테르화 반응의 온도는 원료 또는 생성물의 융점, 또는 적용된 효소의 열안정성에 의해 변하지만, 반응성의 관점에서 바람직하게는 20~80℃, 더 바람직하게는 30~70℃이다. 특히, 고도불포화 지방산 또는 이의 알킬 에스테르를 반응기질로 사용할 경우, 반응온도는 30℃이상 50℃미만이 바람직하다. 반응시간은 공업적 생산성의 관점에서 10시간 이내가 바람직하다.
본 발명의 방법은 디글리세라이드 순도[ 디글리세라이드 / (디글리세라이드 + 트리글리세라이드) ×100 ]가 80wt%이상, 바람직하게는 85wt%이상, 특히 더 바람직하게는 90wt%이상을 갖는 디글리세라이드를 반응수율(반응혼합물에서 디글리세라이드 및 트리글리세라이드의 전체중량 퍼센트)에서 60wt%이상, 바람직하게는 65wt%이상, 더 바람직하게는 70wt%이상으로 생산하는 것이 가능하다.
따라서, 얻어진 디글리세라이드의 순도를 향상시키기 위해 반응은 적절한 시간 간격에서 반응혼합물의 산가(AV)를 측정하는 동안 시행되어진다. 60wt%이상의 반응수율 및 80wt%이상의 디글리세라이드 순도를 얻기 위해 산가가 하기의 범위: 50R-55〉AV〉70R-150(AV〉0의 조건)내에 있을때, 반응이 종결되는 것이 바람직하다. 산가가 하기의 범위: 50R-70〉AV〉70R-145(AV〉0의 조건)내에 있을때, 70wt%이상의 반응수율 및 85wt%이상의 디글리세라이드 순도를 얻기 위해 반응이 종결되는 것이 더 바람직하며, 산가가 하기의 범위: 50R-80〉AV〉70R-140(AV〉0의 조건)내에 있을때, 80wt%이상의 반응수율 및 90wt%이상의 디글리세라이드 순도를 얻기 위해 반응이 종결되는 것이 특히 더 바람직하다.
반응이 상기에 기재된 조건하에서 수행될어질 경우, 원료물질의 비율, 반응온도 또는 효소농도 등 다양한 변수에 영향없이 가능한 높은 반응수율로 고순도의 디글리세라이드를 제조하는 것이 가능하다. 반응이 상기에 기재된 범위보다 높은 산가에서 종결되어질 경우, 고순도의 디글리세라이드에도 불구하고 저반응 수율로 높은 생산성을 얻을 수 없다. 반면, 반응이 상기에 기재된 범위보다 낮은 산가에서 종결되어질 경우, 충분한 순도의 디글리세라이드를 얻는 것이 불가능하다. 따라서, 상기에 기재된 범위 밖의 산가에서의 반응종결은 바람직하지 않다.
[실시예 1]
수산화나트륨 수용액 0.1㏖/ℓ에 "Duolite A-568"(Rohm & Haas사제, 평균입자크기:480㎛) 10g을 1시간동안 교반하였다. 교반 후, 반응혼합물의 pH 평형은 500mM 아세테이트 완충용액(pH 5) 100㎖로 2시간동안 시행하였다. 다음, pH 평형은 50mM 아세테이트 완충용액(pH 5) 100㎖로 2시간동안 2번 시행하였다. 다음, 혼합물을 여과하여 담체를 수집하고, 에탄올 50㎖로 30분동안 에탄올 치환을 시행하였다. 여과후, 10g의 리시놀산(ricinolic acid)을 함유하는 에탄올 50㎖을 부가하여 30분간 리시놀산을 담체에 흡착되도록 하였다. 여과로 수집한 후, 담체를 50mM 아세테이트 완충용액(pH 5) 50㎖로 4회 세척하였다. 다음, 에탄올을 제거하고 잔여물을 여과하여 담체를 수집하였다. 다음, 상업적 사용가능한 부분 글리세라이드 리파아제(Lipase G "Amano"50, Amano Enzyme Inc.사제) 20g을 50mM 아세테이트 완충용액(pH 5) 180㎖에 용해시킨 효소용액을 담체와 2시간동안 접촉시켜 리파아제를 고정화하였다. 고정화된 효소는 여과로 수집하고, 50mM 아세테이트 완충용액(pH 5) 50㎖로 세척하여 고정화되지 않은 효소 또는 단백질을 제거하였다. 상기의 각각의 과정들은 20℃에서 수행하였다. 고정화비율은 고정화 후 효소액의 잔여활성과 고정화 전 효소액의 활성의 차이로 결정하였으며, 그 결과 95%였다. 실제 반응에 기질로 대두지방산 40g을 부가하고, 감압하 40℃에서 탈수를 시행하였다. 다음, 대두지방산으로부터 잔여물을 여과하고 분리하여 고정화된 효소를 얻었다.
다음, 얻어진 고정화 효소 20g(건조중량:8g)을 200㎖ 4구 플라스크에서 평량하였다. 다음, 대두지방산과 글리세린 80g(지방산/글리세린의 몰비=2.0)을 부가하고, 적절한 시간간격으로 반응혼합물의 산가를 측정하면서 감압하 40℃에서 7시간동안 에스테르화반응을 하였다. 반응혼합물의 산가는 9.6이었다. 트리메틸실리레이트화(trimethylsilylation) 후, 반응혼합물을 가스 크로마토그래피를 이용하여 글리세라이드 조성 및 미반응된 물질을 분석하였다. 그 결과를 하기 표 1에 나타낸다. 그 결과, 반응수율은 90.4%이고, 디글리세라이드(diglyceride;DG) 순도는 96.7%로 높았다.
[실시예 2]
상기 실시예 1과 유사한 방법으로 담체로서 평균입경 320㎛를 갖도록 깨뜨린 "Duolite A-568"을 사용하여 고정화 효소를 제조하였다.
200㎖ 4구 플라스크에 상기에서 얻어진 고정화 효소 10g(건조중량:4g)을 평량하였다. 다음, 대두지방산과 글리세린 80g(지방산/글리세린의 몰비=2.0)을 부가하고, 적절한 시간간격으로 반응혼합물의 산가를 측정하면서 감압하 50℃에서 7시간동안 에스테르화반응을 하였다. 반응혼합물의 산가는 8.6이었다. 반응혼합물을 상기 실시예 1과 동일한 방법으로 분석하였다. 그 결과, 반응수율은 89.1%이고, DG 순도는 96.9%로 높았다.
[실시예 3]
200㎖ 4구 플라스크에 상기 실시예 1에서 얻어진 고정화 효소 10g(건조중량:4g)을 평량하였다. 다음, 대두지방산과 글리세린 80g(지방산/글리세린의 몰비=2.0)을 부가하고, 적절한 시간간격으로 반응혼합물의 산가를 측정하면서 감압하 50℃에서 3시간동안 에스테르화반응을 하였다. 반응혼합물의 산가는 33.4이었다. 반응혼합물을 상기 실시예 1과 동일한 방법으로 분석하였다. 그 결과, 반응수율은 71.0%이고, DG 순도는 99.1%로 높았다.
[실시예 4]
200㎖ 4구 플라스크에 상기 실시예 1에서 얻어진 고정화 효소 10g(건조중량:4g)을 평량하였다. 다음, 대두지방산과 글리세린 80g(지방산/글리세린의 몰비=2.0)을 부가하고, 적절한 시간간격으로 반응혼합물의 산가를 측정하면서 감압하 50℃에서 2.6시간동안 에스테르화반응을 하였다. 반응혼합물의 산가는 44.4이었다. 반응혼합물을 상기 실시예 1과 동일한 방법으로 분석하였다. 그 결과, 반응수율은 65.6%이고, DG 순도는 99.2%로 높았다.
[실시예 5]
200㎖ 4구 플라스크에 상기 실시예 1에서 얻어진 고정화 효소 20g(건조중량:8g)을 평량하였다. 다음, 대두지방산과 글리세린 80g(지방산/글리세린의 몰비=1.83)을 부가하고, 적절한 시간간격으로 반응혼합물의 산가를 측정하면서 감압하 40℃에서 8시간동안 에스테르화반응을 하였다. 반응혼합물의 산가는 5.2이었다. 반응혼합물을 상기 실시예 1과 동일한 방법으로 분석하였다. 그 결과, 반응수율은 82.9%이고, DG 순도는 92.9%로 높았다.
[실시예 6]
200㎖ 4구 플라스크에 상기 실시예 1에서 얻어진 고정화 효소 20g(건조중량:8g)을 평량하였다. 다음, 대두지방산과 글리세린 80g(지방산/글리세린의 몰비=2.25)을 부가하고, 적절한 시간간격으로 반응혼합물의 산가를 측정하면서 감압하 40℃에서 4시간동안 에스테르화반응을 하였다. 반응혼합물의 산가는 22.6이었다. 반응혼합물을 상기 실시예 1과 동일한 방법으로 분석하였다. 그 결과, 반응수율은84.0%이고, DG 순도는 90.5%로 높았다.
[실시예 7]
200㎖ 4구 플라스크에 상기 실시예 1에서 얻어진 고정화 효소 20g(건조중량:8g)을 평량하였다. 다음, 대두지방산과 글리세린 80g(지방산/글리세린의 몰비=2.47을 부가하고, 적절한 시간간격으로 반응혼합물의 산가를 측정하면서 감압하 40℃에서 3.3시간동안 에스테르화반응을 하였다. 반응혼합물의 산가는 33.2이었다. 반응혼합물을 상기 실시예 1과 동일한 방법으로 분석하였다. 그 결과, 반응수율은 80.2%이고, DG 순도는 90.0%로 높았다.
[비교예 1]
200㎖ 4구 플라스크에 1,3-선택적 리파아제인 "Lipozyme RMIM"(Novozyme사제) 4g을 평량하였다. 다음, 대두지방산과 글리세린 80g(지방산/글리세린의 몰비=2.0)을 부가하고, 적절한 시간간격으로 반응혼합물의 산가를 측정하면서 감압하 50℃에서 7시간동안 에스테르화반응을 하였다. 반응혼합물의 산가는 2.6이었다. 반응혼합물을 동일한 방법으로 분석하였으며, 그 결과, 반응수율은 90.8%이고, DG 순도는 72.6%로 낮았다.
[비교예 2]
200㎖ 4구 플라스크에 고정화되지 않은 상업적으로 사용가능한 부분 글리세라이드 리파아제(Lipase G "AMANO"50, Amano Enzyme Inc.사제) 2g을 평량하였다. 다음, 대두지방산과 글리세린 80g(지방산/글리세린의 몰비=2.0)을 부가하고, 적절한 시간간격으로 반응혼합물의 산가를 측정하면서 감압하 40℃에서 7시간동안 에스테르화반응을 하였다. 반응혼합물의 산가는 140.4이었다. 반응혼합물을 동일한 방법으로 분석하였으며, 그 결과, 반응수율은 14.6%이었다. 반응은 진행되지 않고 과량의 미반응된 물질이 남았다.
[비교예 3]
200㎖ 4구 플라스크에 상기 실시예 1에서 얻은 고정화된 효소 10g(건조중량:4g)을 평량하였다. 다음, 대두지방산과 글리세린 80g(지방산/글리세린의 몰비=2.0)을 부가하고, 적절한 시간간격으로 반응혼합물의 산가를 측정하면서 감압하 50℃에서 2.2시간동안 에스테르화반응을 하였다. 반응혼합물의 산가는 57.0이었다. 반응혼합물을 상기 실시예 1과 동일한 방법으로 분석하였으며, 그 결과, DG 순도는 99.3%로 높았지만, 반응수율은 59.8%로 낮았다.
[비교예 4]
200㎖ 4구 플라스크에 상기 실시예 1에서 얻은 고정화된 효소 20g(건조중량:8g)을 평량하였다. 다음, 대두지방산과 글리세린 80g(지방산/글리세린의 몰비=2.25)을 부가하고, 적절한 시간간격으로 반응혼합물의 산가를 측정하면서 감압하 40℃에서 11시간동안 에스테르화반응을 하였다. 반응혼합물의 산가는 7.0이었다.반응혼합물을 상기 실시예 1과 동일한 방법으로 분석하였으며, 그 결과, 반응수율은 94.4%이고, DG 순도는 71.4%로 낮았다.
[비교예 5]
200㎖ 4구 플라스크에 상기 실시예 1에서 얻은 고정화된 효소 20g(건조중량:8g)을 평량하였다. 다음, 대두지방산과 글리세린 80g(지방산/글리세린의 몰비=2.47)을 부가하고, 적절한 시간간격으로 반응혼합물의 산가를 측정하면서 감압하 40℃에서 8시간동안 에스테르화반응을 하였다. 반응혼합물의 산가는 18.0이었다. 반응혼합물을 상기 실시예 1과 동일한 방법으로 분석하였으며, 그 결과, 반응수율은 89.8%이고, DG 순도는 66.3%로 낮았다.
| 반응혼합물의 조성(%) | 기질 몰비 | 반응수율(%) | 반응완료시 산가 | DG순도(%) | |||||
| 미반응 FA | 미반응 Gly | MG | DG | TG | FA/Gly | DG+TG | DG/(DG+TG)×100 | ||
| 실시예1 | 4.8 | 0.0 | 4.7 | 87.5 | 2.9 | 2.0 | 90.4 | 9.6 | 96.7 |
| 실시예2 | 4.3 | 0.0 | 6.7 | 86.3 | 2.8 | 2.0 | 89.1 | 8.6 | 96.9 |
| 실시예3 | 16.7 | 0.1 | 12.2 | 70.4 | 0.6 | 2.0 | 71.0 | 33.4 | 99.1 |
| 실시예4 | 22.2 | 0.3 | 11.9 | 65.1 | 0.5 | 2.0 | 65.6 | 44.4 | 99.2 |
| 실시예5 | 2.6 | 0.3 | 14.2 | 77.0 | 5.9 | 1.83 | 82.9 | 5.2 | 92.9 |
| 실시예6 | 11.3 | 0.0 | 4.7 | 76.0 | 8.0 | 2.25 | 84.0 | 22.6 | 90.5 |
| 실시예7 | 16.6 | 0.0 | 3.2 | 72.2 | 8.0 | 2.47 | 80.2 | 33.2 | 90.0 |
| 비교예1 | 1.3 | 0.1 | 7.8 | 65.9 | 24.9 | 2.0 | 90.8 | 2.6 | 72.6 |
| 비교예2 | 70.2 | 1.8 | 13.4 | 14.2 | 0.4 | 2.0 | 14.6 | 140.4 | 97.3 |
| 비교예3 | 28.5 | 0.4 | 11.3 | 59.3 | 0.5 | 2.0 | 59.8 | 57.0 | 99.3 |
| 비교예4 | 3.5 | 0.0 | 2.1 | 67.4 | 27.0 | 2.25 | 94.4 | 7.0 | 71.4 |
| 비교예5 | 9.0 | 0.0 | 1.2 | 59.5 | 30.3 | 2.47 | 89.8 | 18.0 | 66.3 |
| - FA:지방산, Gly:글리세린, MG:모노글리세라이드, DG:디글리세라이드, TG:트리글리세라이드 |
본 발명의 제조방법(실시예 1~7)은 고수율로 90%이상의 고순도를 갖는 디글리세라이드를 제조하는 것이 가능하게하였다.
[실시예 8]
상기 실시예 1에서 얻은 고정화 효소를 실제 반응에서 기질인 지방산(DHA 함량:44wt%)을 함유하는 고도불포화(polysaturated) 지방산으로 세척하였다. 200㎖ 4구플라스크에 결과 고정화효소 20g(건조중량:8g)을 평량하였다. 다음, 산(DHA 함량:44wt%)을 함유하는 고도불포화 지방산 및 글리세린 80g(지방산/글리세린의 몰비=2.30)을 부가하고, 적절한 시간간격으로 반응혼합물의 산가를 측정하면서 감압하 40℃에서 45시간동안 에스테르화 반응을 수행하였다. 반응혼합물의 산가는 27.8이었다. 다음, 반응혼합물을 HPLC를 이용하여 글리세라이드 조성 및 미반응 물질을 분석하였다. 게다가, 반응혼합물로 점 찍은 TLC판을 전개(전개용액: 클로로포름/아세톤/메탄올 = 93.5/4.5/2.0 부피%)시켜 각 글리세라이드로 분리하였다. 에틸아세테이트로 용리 및 비용매화(desolventation)한 후, 지방산 조성은 GC로 분석하였다. 그 결과를 하기 표 2에 나타내었다. 그 결과, 반응수율은 74.2%이고, 디글리세라이드(DG) 순도는 85.3%로 높고, 디글리세라이드에 DHA 함량도 44%로 높음을 확인하였다.
[실시예 9]
상기 실시예 1에서 얻은 고정화 효소를 세척한 후, 200㎖ 4구플라스크에 결과 고정화효소 20g(건조중량:8g)을 평량하였다. 다음, 지방산(DHA 함량:44wt%)을 함유하는 고도불포화 지방산 및 글리세린 80g(지방산/글리세린의 몰비=1.87)을 부가하고, 적절한 시간간격으로 반응혼합물의 산가를 측정하면서 감압하 40℃에서 165시간동안 에스테르화 반응을 수행하였다. 반응혼합물의 산가는 3.6이었다. 다음, 반응혼합물을 상기 실시예 8과 동일한 방법으로 분석하였으며, 그 결과, 반응수율은 83.8%이고, 디글리세라이드(DG) 순도는 88.3%로 높고, 디글리세라이드에 DHA 함량도 37%로 높음을 확인하였다.
[비교예 6]
200㎖ 4구 플라스크에 상업적으로 사용가능한 고정화 효소로 1,3-선택적 리파아제인 "Lipozyme RMIM"(Novozyme사제) 4g을 평량하였다. 다음, 지방산(DHA 함량:44wt%)을 함유하는 고도불포화 지방산 및 글리세린 80g(지방산/글리세린의 몰비=2.36)을 부가하고, 적절한 시간간격으로 반응혼합물의 산가를 측정하면서 감압하50℃에서 48시간동안 에스테르화반응을 하였다. 반응혼합물의 산가는 45.2이었다. 반응혼합물을 상기 실시예 8과 동일한 방법으로 분석하였으며, 그 결과, 반응수율은 57.1%이고, 디아실글리세롤(diacylglycerol;DG) 순도는 65.8%로 낮았다.
[비교예 7]
상기 실시예 1에서 얻은 고정화 효소를 세척한 후, 200㎖ 4구플라스크에 결과 고정화효소 20g(건조중량:8g)을 평량하였다. 다음, 지방산(DHA 함량:44wt%)을 함유하는 고도불포화 지방산 및 글리세린 80g(지방산/글리세린의 몰비=2.66)을 부가하고, 적절한 시간간격으로 반응혼합물의 산가를 측정하면서 감압하 40℃에서 18시간동안 에스테르화 반응을 수행하였다. 반응혼합물의 산가는 30.6이었다. 다음, 반응혼합물을 상기 실시예 8과 동일한 방법으로 분석하였으며, 그 결과, 반응수율은 77.2%이고, 디글리세라이드(DG) 순도는 66.2%로 낮았다.
| 반응혼합물의 조성(%) | 기질몰비 | 반응수율(%) | 반응완료시 산가 | DG순도(%) | DG내 DHA함량(%) | |||||
| 미반응FA | 미반응 Gly | MG | DG | TG | FA/Gly | DG+TG | DG/(DG+TG)×100 | |||
| 실시예8 | 15.3 | 0.0 | 10.5 | 63.3 | 10.9 | 2.30 | 74.2 | 27.8 | 85.3 | 44 |
| 실시예9 | 2.0 | 0.2 | 14.0 | 74.0 | 9.8 | 1.87 | 83.8 | 3.6 | 88.3 | 37 |
| 비교예6 | 24.8 | 0.0 | 18.1 | 37.6 | 19.5 | 2.36 | 57.1 | 45.2 | 65.8 | 33 |
| 비교예7 | 16.8 | 0.0 | 6.0 | 51.1 | 26.1 | 2.66 | 77.2 | 30.6 | 66.2 | 29 |
본 발명의 디글리세라이드 제조방법은 고순도의 디글리세라이드(diglyceride)를 효율적으로 얻을 수 있다.
Claims (5)
- 지방산 또는 이의 저급 알킬 에스테르와 글리세린을 고정화(immobilized) 부분 글리세라이드 리파아제 하에서 반응시 생성되는 물을 시스템 밖으로 제거하면서 반응시키는 디글리세라이드(diglyceride) 제조방법.
- 제 1항에 있어서, 상기 지방산 또는 이의 저급 알킬 에스테르, 및 글리세린은 1.5~2.6의 몰비 R [R=지방산 또는 이의 저급 알킬 에스테르(㏖)/글리세린(㏖)]에서 반응하는 것임을 특징으로 하는 제조방법.
- 제 1항 또는 제 2항에 있어서, 상기 고정화 부분 글리세라이드 리파아제는 지용성(lipophilic) 지방산 또는 이의 유도체로 전처리한 고정화 담체에 부분 글리세라이드 리파아제를 고정화하여 얻는 것임을 특징으로 하는 제조방법.
- 제 1항 내지 제 3항 중 어느 한 항에 있어서, 80wt% 이상의 디글리세라이드 순도[디글리세라이드 / (디글리세라이드 + 트리글리세라이드) ×100]를 갖는 디글리세라이드는 60wt% 이상의 반응수율(반응혼합물에서 디글리세라이드 및 트리글리세라이드의 중량퍼센트)로 얻어짐을 특징으로 하는 제조방법.
- 제 1항 내지 제 4항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 반응은 하기의 범위를 만족하는 반응혼합물의 산가(acid value;AV)에서 종결됨을 특징으로 하는 제조방법: 50R-55 〉AV 〉70R-150(AV 〉0 인 조건).
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