CN1615365A - 甘油二酯的生产方法 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了甘油二酯的制备方法，其包括存在固定化偏甘油酯脂肪酶时，使脂肪酸或它的低碳烷基酯与甘油反应，同时除去反应体系中反应产生的水。优选当反应混合物的酸度(AV)落入下面范围时终止反应：50R－60＞AV＞70R－150(条件是AV＞0)。本发明可以甚至在减压时也不损伤脂肪酶的活性，而有效生产高纯度甘油二酯。本发明的实施不受反应条件如脂肪酸/甘油比率、反应温度或酶浓度的变化的影响。具体地说，甚至当脂肪酸/甘油比率很高时，可以以高反应产率生产高纯度的甘油二酯。
Description
技术领域
本发明涉及有效生产高纯度甘油二酯的方法。
背景技术
甘油二酯可作为一种添加剂，提高油或脂肪的可塑性，或用于食品、药品、化妆品等领域。近来，食品利用甘油二酯优良的生理活性受到关注。
甘油二酯典型的生产过程需要酯化反应或酯交换反应。例如，在固定化1，3-特异脂肪酶存在下，通过脂肪酸或它的低碳烷基酯和甘油反应，减压从体系中取出上面反应产生的水或低级醇的过程是已知(特开昭6-65311)。
因为不仅甘油二酯，而且甘油三酯均是用1，3-特异脂肪酶通过酯化反应制备的，反应收率的升高降低甘油二酯的纯度。另一方面，反应收率的降低升高甘油二酯的纯度，但残留大量未反应的甘油或脂肪酸。为了升高甘油二酯的纯度，因此酯化反应后必然需要纯化步骤，例如汽提。
一个克服上述问题的方法，提出通过使用不作用于甘油三酯的偏甘油酯脂肪酶制备不含甘油三酯的甘油酯(特开平61-181390)。然而这种方法不适合制备高纯度甘油二酯，因为单酸甘油酯是此方法的主要产物。
工业上应用的传统酯化反应需要从体系中除去反应过程中产生的水，并移动反应平衡来增加反应收率。当使用偏甘油酯脂肪酶的酯化反应减压除去体系中的水时，包括的问题例如，在终止前停止酯化反应。同样建议一种方法(特开昭1-137989)，用偏甘油酯脂肪酶作用于含偏甘油酯和脂肪酸的油或脂肪合成甘油三酯，使用固定化酶在低水含量下进行酯化反应。这是减少单酸甘油酯和甘油二酯的甘油三酯合成过程，与制备高纯度的甘油二酯的方法有本质上的区别。
当通过酯化反应合成甘油二酯时，高收率得到高纯度甘油二酯的最适宜反应终点依赖于底物比，如脂肪酸或其对应甘油的酯的原料、反应温度、酶的浓度等。特别是当为了提高反应速率而提高脂肪酸或其对应甘油的酯的比率时，通过延长反应来提高反应收率导致例如甘油三酯的生成引起的甘油二酯纯度的降低的问题。
发明内容
因此本发明的一个目的是提供一种甚至在减压时也不损伤脂肪酶的活性，有效生产高纯度甘油二酯的方法。
本发明的另一个目的是提供一种特别是当脂肪酸/甘油比率高时，不受脂肪酸/甘油比率、反应温度或酶浓度的变化的影响，生产高纯度甘油二酯的方法。
发明人发现和存在不固定的偏甘油酯脂肪酶的反应相比，通过存在固定化偏甘油酯脂肪酶时，脂肪酸或它的低碳烷基酯与甘油反应，同时除去反应体系中反应产生的水，甘油二酯的产生率大幅增加，并且可以高收率的获得高纯度的甘油二酯。发明人还发现当反应混合物的酸度落入预先确定的与脂肪酸或其低碳烷基酯对甘油的填料比率相关的范围内时终止反应，可以在尽可能高的产率下产生高纯度的甘油二酯。
因此本发明的一个方面是提供一种制备甘油二酯的方法，其包括存在固定化偏甘油酯脂肪酶时，使脂肪酸或它的低碳烷基酯与甘油反应，同时除去反应体系中反应产生的水。
本发明的另一个方面也是提供上述制备甘油二酯的方法，其中当反应混合物的酸度(AV)落入50R-55＞AV＞70R-150(条件是AV＞0)的范围内时终止反应。
最佳实施方式
本发明中使用的偏甘油酯脂肪酶是一种水解偏甘油酯，如单酸甘油酯和甘油二酯，但不水解甘油三酯的脂肪酶。这种偏甘油酯脂肪酶的例子包括来源于动物器官如大鼠的小肠或猪的脂肪组织的单酸甘油酯脂肪酶或甘油二酯脂肪酶、来源于Bacillus sp.H-257(J.Biochem.，127，419-425，2000)的单酸甘油酯脂肪酶、来源于Pseudomonas sp.LP7315(Journal of Bioscience and Bioengineering，91(1)，27-32，2001)的单酸甘油酯脂肪酶、来源于Penicillium cyclopium(J.Biochem.，87(1)，205-211，1980)的脂肪酶和来源于Penicillium camembertii U-150(J.Fermentation and Bioengineering，72(3)，162-167，1991)的脂肪酶。它的可购得的产品的例子包括“单酸甘油酯脂肪酶(MGLPII)”(Asahi Kasei公司产品)和“Lipase G Amano 50”(Amino Enzyme有限公司产品)。特别是当用多元不饱和脂肪酸(意味着具有至少四个双键的不饱和脂肪酸)或它的低碳烷基酯作为反应底物时，优选使用最适宜温度在30℃或更高，但低于50℃的范围内的偏甘油酯脂肪酶。
本发明中使用的固定化偏甘油酯脂肪酶含有固定到载体上的上述偏甘油酯脂肪酶。固定载体的例子包括无机载体，例如C盐、硅藻土、高岭土、硅胶、分子筛、多孔玻璃、活性炭、碳酸钙和陶瓷；有机聚合物，例如纤维素粉、聚乙烯醇、聚丙烯、聚氨基葡糖、离子交换树脂、疏水吸附树脂、螯合树脂或合成吸附树脂。从保水能力来考虑特别优选固定到合成吸附树脂上的偏甘油酯脂肪酶。
作为离子交换树脂，优选多孔阴离子交换树脂。此树脂颗粒的尺寸优选100到1000μm，同时理想的孔的尺寸是100到1500。当树脂是孔状时，酶吸附的表面积变大，导致吸附的量增加。苯酚-甲醛、聚苯乙烯、丙烯酰胺和二乙烯基苯可用作此树脂的原料。特别期望的是酚醛树脂(商品名：“Duolite A-568”)。
在酶不失活的范围内偏甘油酯脂肪酶固定的温度没有限制，可以是0到60℃，特别优选5到30℃。用于固定的酶的水溶液的pH值可落在不导致酶变性的范围内，优选3到9。特别是当使用的脂肪酶的最适宜pH是酸性的时，为了获得最大活性，pH值优选调整到4到6。作为制备酶的水溶液的缓冲液，可使用通常采用的缓冲液例如醋酸缓冲液、磷酸缓冲液和Tris-HCL缓冲液。从固定有效性的角度，偏甘油酯脂肪酶在酶水溶液中的浓度优选低于此酶的溶解度但却是有效的浓度。如果需要，离心分离除去不溶的部分后，上清可使用。相对于1重量份的固定载体，偏甘油酯脂肪酶的优选使用量是0.05到10重量份，特别是0.1到5重量份。
在本发明中，为了赋予固定载体一种允许高活性出现的吸附状态，优选固定前用一种或多种亲脂脂肪酸或其衍生物处理固定载体。它们可以单独使用，但两种或多种联合使用将更有效。作为这些亲脂脂肪酸或其衍生物与固定载体的接触方法，可以将它们加到水或有机溶剂里，或可选的，为了改善亲脂脂肪酸或其衍生物的分散性，它们可以先分散或溶解在有机溶剂里，然后加入分散在水里的固定载体中。此有机溶剂的例子包括氯仿、己烷和乙醇。相对于1重量份的固定载体，这些亲脂脂肪酸或其衍生物可加入的量为0.01到1重量份(干重)，特别优选0.05到0.5重量份。接触温度的范围在1到100℃，特别优选20到60℃。接触时间可以从5分钟到5小时。上述处理后过滤收集固定载体。收集后将其干燥。干燥温度范围优选室温到100℃。干燥也可以在减压下进行。
用于处理固定载体的亲脂脂肪酸的例子包括具有4到24个碳原子，可被羟基取代的直链或支链，饱和或不饱和脂肪酸。优选例包括C8-18脂肪酸，含直链饱和脂肪酸，例如癸酸、月桂酸和肉豆蔻酸，不饱和脂肪酸，例如油酸和亚油酸，羟脂肪酸，例如蓖麻油酸，和支链脂肪酸，例如异硬脂酸。亲脂脂肪酸的衍生物的例子包括C8-18脂肪酸和含羟基的化合物的酯，例如一元醇酯、多元醇酯、磷脂和通过在作为例子的酯上加氧丙环得到的衍生物。一元醇酯的例子包括甲酯和乙酯，同时那些多元醇酯包括单酸甘油酯、甘油二酯、这些甘油酯的衍生物、聚甘油脂肪酸酯、失水山梨糖醇脂肪酸酯和蔗糖脂肪酸酯。从这个处理步骤便利的角度考虑，这些脂肪酸或其衍生物优选常温下的液体状态。对于这些脂肪酸或其衍生物，可使用上述脂肪酸的混合物，例如天然脂肪酸，如大豆脂肪酸。
存在固定化的偏甘油酯脂肪酶时，本发明的反应中使用的脂肪酸或其低碳烷基酯和甘油之间的反应用的脂肪酸，优选是饱和的或不饱和的C4-22脂肪酸。例子包括丁酸、戊酸、己酸、enantoic acid、辛酸、壬酸、癸酸、十一烷酸、月桂酸、肉豆蔻酸、软脂酸、棕榈油酸、硬脂酸、油酸、反油酸、亚油酸、亚麻酸、花生四烯酸、二十二烷酸、芥酸、二十碳五烯酸和二十二碳六烯酸。作为可以和上述脂肪酸形成酯的低级醇，优选具有1到3个碳原子的低级醇。C1-3低级醇的例子包括甲醇、乙醇、正丙醇、异丙醇。上述脂肪酸或其低碳烷基酯可以联合使用。也可以使用脂肪酸的混合物，例如天然脂肪酸，如大豆脂肪酸。
上述反应中脂肪酸或其酯和甘油反应优选的摩尔比R[R＝脂肪酸或其低碳烷基酯(mol)/甘油(mol)]为1.5到2.6，更优选1.6到2.5，特别是1.8到2.3。
存在固定化的偏甘油酯脂肪酶，同时从体系中除去反应产生的水，脂肪酸或其酯和甘油之间的反应可以实现。更具体的是此反应在基本上无水的条件下进行(除了脂肪酶制剂中含的水外)，通过例如减压，使用吸收剂，如沸石或分子筛，或向反应罐内通入干燥惰性气体除去酯化反应产生的水。
酯化反应的温度根据原料或产物的熔点，或使用的酶的热稳定性而不同，但优选20到80℃，根据反应性特别优选30到70℃。特别是当多元不饱和脂肪酸或其烷基酯用作反应底物时，反应温度优选设在30℃或更高，但低于50℃。从工业生产的角度，反应时间优选在10小时以内。
本发明的方法可以生产具有80wt％或更高，更优选85wt％或更高，特别优选90wt％或更高甘油二酯纯度[甘油二酯/(甘油二酯+甘油三酯)x100]的甘油二酯，反应产率(反应混合物中甘油二酯和甘油三酯的总重量的百分比)高达60wt％或更高，优选65wt％或更高，更优选70wt％或更高。
为了提高获得的甘油二酯的纯度，反应进行中在合适时间间隔测定反应混合物的酸度(AV)。为了获得60wt％或更高的反应产率和80wt％或更高的甘油二酯纯度，优选当酸度落入下面范围内时终止反应：50R-55＞AV＞70R-150(条件是AV＞0)。为了获得70wt％或更高的反应产率和85wt％或更高的甘油二酯纯度，更优选当酸度落到下面范围内时终止反应：50R-70＞AV＞70R-145(条件是AV＞0)，为了获得80wt％或更高的反应产率和90wt％或更高的甘油二酯纯度，特别优选当酸度落到下面范围内时终止反应：50R-80＞AV＞70R-140(条件是AV＞0)。
当反应在上述条件下进行时，可以以尽可能高的反应产率产生高纯度的甘油二酯，而不受各种变化的影响，即便是反应条件中如原料底物比率、反应温度或酶的浓度。当反应终止于高于上述范围的酸度时，因为虽然有高甘油二酯纯度，但反应产率低，无法得到高产率。另一方面，当反应终止于低于上述范围的酸度时，反应混合物中甘油三酯的比率提高，导致无法得到足够的甘油二酯纯度。因此不优选将反应终止于上述范围外的酸度。
实施例
实施例1
10克“Duolite A-568”(Rohm & Haas产品，平均颗粒尺寸：480μm)在0.1mol/L氢氧化钠水溶液中搅拌1小时。搅拌后，用100mL的500mM的醋酸缓冲液(pH5)2小时建立起反应混合物的pH平衡。然后用100mL的50mM的醋酸缓冲液(pH5)2小时建立起pH平衡。过滤混合物收集载体，接下来用50mL乙醇进行乙醇取代30分钟。过滤后，加入50mL含有10克蓖麻油酸的乙醇，使此蓖麻油酸吸附到载体上30分钟。过滤收集后，载体用50mM的醋酸缓冲液(pH5)50mL洗涤四次。然后除去乙醇，过滤残余，收集载体。接着，溶解于180mL的50mM醋酸缓冲液(pH5)中的20克可购得的偏甘油酯脂肪酶(脂肪酶G“Amano”50，Amano Enzyme有限公司产品)的溶液和载体接触2小时，使脂肪酶固定在载体上。过滤收集固定化的酶，用50mM的醋酸缓冲液(pH5)50mL洗涤除去没有固定的酶或蛋白质。上述操作均在20℃进行。从固定后酶溶液的剩余活性和固定前酶溶液的活性的差异测定固定率，结果为95％。实际反应中加入大豆脂肪酸(40克)作为底物，接下来40℃减压脱水。然后从大豆脂肪酸中过滤分离残余，由此得到固定化酶。
在200mL的四颈烧瓶中称取这样得到的固定化酶(20克，干重：8克)。加入大豆脂肪酸和甘油(总共80克，脂肪酸/甘油的摩尔比为2.0)，随后40℃减压酯化反应7小时，同时在合适的时间间隔测量反应混合物的酸度。当时反应混合物的酸度为9.6。三甲硅烷基化作用后，反应混合物进行气相色谱，分析甘油酯成分和未反应的底物。结果见表1。可见反应产率为90.4％，二酰基甘油(DG)的纯度高达96.7％。
实施例2
和实施例1的方式类似，使用破碎成平均颗粒尺寸为320μm的“Duolite A-568”作为载体制备固定化酶。
在200mL的四颈烧瓶中称取这样得到的固定化酶10克(干重：4克)。加入大豆脂肪酸和甘油(总共80克，脂肪酸/甘油的摩尔比为2.0)，随后50℃减压酯化反应7小时，同时在合适的时间间隔测量反应混合物的酸度。当时反应混合物的酸度为8.6。用和实施例1类似的方式分析反应混合物，结果反应产率为89.1％，DG的纯度高达96.9％。
实施例3
在200mL的四颈烧瓶中称取实施例1中得到的固定化酶10克(干重：4克)。加入大豆脂肪酸和甘油(总共80克，脂肪酸/甘油的摩尔比为2.0)，随后50℃减压酯化反应3小时，同时在合适的时间间隔测量反应混合物的酸度。当时反应混合物的酸度为33.4。用和实施例1类似的方式分析反应混合物，结果反应产率为71.0％，DG的纯度高达99.1％。
实施例4
在200mL的四颈烧瓶中称取实施例1中得到的固定化酶10克(干重：4克)。加入大豆脂肪酸和甘油(总共80克，脂肪酸/甘油的摩尔比为2.0)，随后50℃减压酯化反应2.6小时，同时在合适的时间间隔测量反应混合物的酸度。当时反应混合物的酸度为44.4。用和实施例1类似的方式分析反应混合物，结果反应产率为65.6％，DG的纯度高达99.2％。
实施例5
在200mL的四颈烧瓶中称取实施例1中得到的固定化酶20克(干重：8克)。加入大豆脂肪酸和甘油(总共80克，脂肪酸/甘油的摩尔比为1.83)，随后40℃减压酯化反应8小时，同时在合适的时间间隔测量反应混合物的酸度。当时反应混合物的酸度为5.2。用和实施例1类似的方式分析反应混合物，结果反应产率为82.9％，DG的纯度高达92.9％。
实施例6
在200mL的四颈烧瓶中称取实施例1中得到的固定化酶20克(干重：8克)。加入大豆脂肪酸和甘油(总共80克，脂肪酸/甘油的摩尔比为2.25)，随后40℃减压酯化反应4小时，同时在合适的时间间隔测量反应混合物的酸度。当时反应混合物的酸度为22.6。用和实施例1类似的方式分析反应混合物，结果反应产率为84.0％，DG的纯度高达90.5％。
实施例7
在200mL的四颈烧瓶中称取实施例1中得到的固定化酶20克(干重：8克)。加入大豆脂肪酸和甘油(总共80克，脂肪酸/甘油的摩尔比为2.47)，随后40℃减压酯化反应3.3小时，同时在合适的时间间隔测量反应混合物的酸度。当时反应混合物的酸度为33.2。用和实施例1类似的方式分析反应混合物，结果反应产率为80.2％，DG的纯度高达90.0％。
对比实施例1
在200mL的四颈烧瓶中称取4克1，3-特异脂肪酶“LipozymeRMIM”(Novozymes产品)。加入大豆脂肪酸和甘油(总共80克，脂肪酸/甘油的摩尔比为2.0)，随后50℃减压酯化反应7小时，同时在合适的时间间隔测量反应混合物的酸度。当时反应混合物的酸度为2.6。用类似的方式分析反应混合物，结果反应产率为90.8％，DG的纯度低至72.6％。
对比实施例2
在200mL的四颈烧瓶中称取2克可购得的未固定的偏甘油酯脂肪酶(Lipase G“AMANO”50，Amano Enzyme有限公司产品)。加入大豆脂肪酸和甘油(总共80克，脂肪酸/甘油的摩尔比为2.0)，随后40℃减压酯化反应7小时，同时在合适的时间间隔测量反应混合物的酸度。当时反应混合物的酸度为140.4。用类似的方式分析反应混合物，结果反应产率为14.6％。反应没有继续进行，剩余大量没有反应的底物。
对比实施例3
在200mL的四颈烧瓶中称取实施例1中得到的固定化酶10克(干重：4克)。加入大豆脂肪酸和甘油(总共80克，脂肪酸/甘油的摩尔比为2.0)，随后50℃减压酯化反应2.2小时，同时在合适的时间间隔测量反应混合物的酸度。当时反应混合物的酸度为57.0。用和实施例1类似的方式分析反应混合物。结果DG的纯度高达99.3％，但反应产率低至59.8％。
对比实施例4
在200mL的四颈烧瓶中称取实施例1中得到的固定化酶20克(干重：8克)。加入大豆脂肪酸和甘油(总共80克，脂肪酸/甘油的摩尔比为2.25)，随后40℃减压酯化反应11小时，同时在合适的时间间隔测量反应混合物的酸度。当时反应混合物的酸度为7.0。用和实施例1类似的方式分析反应混合物，结果反应产率是94.4％，DG的纯度低至71.4％。
对比实施例5
在200mL的四颈烧瓶中称取实施例1中得到的固定化酶20克(干重：8克)。加入大豆脂肪酸和甘油(总共80克，脂肪酸/甘油的摩尔比为2.47)，随后40℃减压酯化反应8小时，同时在合适的时间间隔测量反应混合物的酸度。当时反应混合物的酸度为18.0。用和实施例1类似的方式分析反应混合物，结果反应产率是89.8％，DG的纯度低至66.3％。
表1
| 反应混合物的组成(％) | 底物摩尔比 | 反应产率(％) | 反应完成时的酸度 | DG的纯度(％) | |||||
| 未反应的FA | 未反应的Gly | MG | DG | TG | FA/Gly | DG+TG | DG/(DG+TG)×100 | ||
| 实施例1 | 4.8 | 0.0 | 4.7 | 87.5 | 2.9 | 2.0 | 90.4 | 9.6 | 96.7 |
| 实施例2 | 4.3 | 0.0 | 6.7 | 86.3 | 2.8 | 2.0 | 89.1 | 8.6 | 96.9 |
| 实施例3 | 16.7 | 0.1 | 12.2 | 70.4 | 0.6 | 2.0 | 71.0 | 33.4 | 99.1 |
| 实施例4 | 22.2 | 0.3 | 11.9 | 65.1 | 0.5 | 2.0 | 65.6 | 44.4 | 99.2 |
| 实施例5 | 2.6 | 0.3 | 14.2 | 77.0 | 5.9 | 1.83 | 82.9 | 5.2 | 92.9 |
| 实施例6 | 11.3 | 0.0 | 4.7 | 76.0 | 8.0 | 2.25 | 84.0 | 22.6 | 90.5 |
| 实施例7 | 16.6 | 0.0 | 3.2 | 72.2 | 8.0 | 2.47 | 80.2 | 33.2 | 90.0 |
| 对比实施例1 | 1.3 | 0.1 | 7.8 | 65.9 | 24.9 | 2.0 | 90.8 | 2.6 | 72.6 |
| 对比实施例2 | 70.2 | 1.8 | 13.4 | 14.2 | 0.4 | 2.0 | 14.6 | 140.4 | 97.3 |
| 对比实施例3 | 28.5 | 0.4 | 11.3 | 59.3 | 0.5 | 2.0 | 59.8 | 57.0 | 99.3 |
| 对比实施例4 | 3.5 | 0.0 | 2.1 | 67.4 | 27.0 | 2.25 | 94.4 | 7.0 | 71.4 |
| 对比实施例5 | 9.0 | 0.0 | 1.2 | 59.5 | 30.3 | 2.47 | 89.8 | 18.0 | 66.3 |
FA：脂肪酸 Gly：甘油 MG：单酸甘油酯
DG：甘油二酯 TG：甘油三酯
本发明的制备方法(实施例1到7)可以以极高产率制备甘油二酯的纯度为90％或更高的甘油二酯。
实施例8
实施例1的固定化酶用含多元不饱和脂肪酸的脂肪酸(DHA含量：44wt.％)洗涤，所述酸是实际反应的底物。在200mL的四颈烧瓶中称取得到的固定化酶20克(干重：8克)。加入含多元不饱和脂肪酸的脂肪酸(DHA含量：44wt.％)和甘油(总共80克，脂肪酸/甘油的摩尔比为2.30)，随后40℃减压酯化反应45小时，同时在合适的时间间隔测量反应混合物的酸度。当时反应混合物的酸度为27.8。然后反应混合物进行HPLC，分析甘油酯成分和未反应的底物。另外，展开点了反应混合物的TLC板(展开剂∶氯仿/丙酮/甲醇＝93.5/4.5/2.0vol.％)，以分开每一种甘油酯。乙酸乙酯洗脱和去溶剂后，脂肪酸成分用GC分析。结果见表2。可见反应产率为74.2％，甘油二酯(DG)的纯度高达85.3％，同时甘油二酯中DHA的含量高达44％。
实施例9
在200mL的四颈烧瓶中称取洗涤后的实施例1中得到的固定化酶20克(干重：8克)。加入含多元不饱和脂肪酸的脂肪酸(DHA含量：44％)和甘油(总共80克，脂肪酸/甘油的摩尔比为1.87)，随后40℃减压酯化反应165小时，同时在合适的时间间隔测量反应混合物的酸度。当时反应混合物的酸度为3.6。然后用和实施例8类似的方式分析反应混合物，结果反应产率是83.8％，DG的纯度高达88.3％，同时DG中DHA的含量高达37％。
对比实施例6
在200mL的四颈烧瓶中称取4克可购得的固定化酶：1，3-特异脂肪酶“Lipozyme RMIM”(Novozymes生产)。加入含多元不饱和脂肪酸的脂肪酸(DHA含量：44％)和甘油(总共80克，脂肪酸/甘油的摩尔比为2.36)，随后50℃减压酯化反应48小时，同时在合适的时间间隔测量反应混合物的酸度。当时反应混合物的酸度为45.2。用和实施例8类似的方式分析反应混合物，结果反应产率为57.1％，DG的纯度低至65.8％。
对比实施例7
在200mL的四颈烧瓶中称取洗涤后的实施例1中得到的固定化酶20克(干重：8克)。加入含多元不饱和脂肪酸的脂肪酸(DHA含量：44％)和甘油(总共80克，脂肪酸/甘油的摩尔比为2.66)，随后40℃减压酯化反应18小时，同时在合适的时间间隔测量反应混合物的酸度。当时反应混合物的酸度为30.6。然后用和实施例8类似的方式分析反应混合物，结果反应产率是77.2％，DG的纯度低至66.2％。
表2
| 反应混合物的组成(％) | 底物摩尔比 | 反应产率(％) | 反应完成时的酸度 | DG的纯度(％) | DG中DHA的含量(％) | |||||
| 未反应的FA | 未反应的Gly | MG | DG | TG | FA/Gly | DG+TG | DG/(DG+TG)×100 | |||
| 实施例8 | 15.3 | 0.0 | 10.5 | 63.3 | 10.9 | 2.30 | 74.2 | 27.8 | 85.3 | 44 |
| 实施例9 | 2.0 | 0.2 | 14.0 | 74.0 | 9.8 | 1.87 | 83.8 | 3.6 | 88.3 | 37 |
| 对比实施例6 | 24.8 | 0.0 | 18.1 | 37.6 | 19.5 | 2.36 | 57.1 | 45.2 | 65.8 | 33 |
| 对比实施例7 | 16.8 | 0.0 | 6.0 | 51.1 | 26.1 | 2.66 | 77.2 | 30.6 | 66.2 | 29 |
Claims (5)
1.一种制备甘油二酯的方法，所述方法包括存在固定化偏甘油酯脂肪酶时，使脂肪酸或它的低碳烷基酯与甘油反应，同时除去反应体系中反应产生的水。
2.如权利要求1所述的方法，其中脂肪酸或其低碳烷基酯和甘油的反应摩尔比R[R＝脂肪酸或其低碳烷基酯(mol)/甘油(mol)]的范围为1.5到2.6。
3.如权利要求1或2所述的方法，其中通过将偏甘油酯脂肪酶固定到预先用亲脂脂肪酸或其衍生物处理过的固定载体上得到固定化偏甘油酯脂肪酶。
4.如权利要求1至3中任意一项所述的方法，其中以反应产率(反应混合物中甘油二酯和甘油三酯的总重量百分比)为60wt％或更高生产甘油二酯纯度[甘油二酯/(甘油二酯+甘油三酯)×100]为80wt％或更高的甘油二酯。
5.如权利要求1至4中任意一项所述的方法，其中反应混合物的酸度(AV)落入下面范围时终止反应：50R-55＞AV＞70R-150(条件是AV＞0)。
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