CN114317277A

CN114317277A - 一种提高佐夫色绿藻异养生产虾青素的细胞预培养方法

Info

Publication number: CN114317277A
Application number: CN202210189385.5A
Authority: CN
Inventors: 牟海津; 孙翰; 付晓丹; 朱琳
Original assignee: Weihai Dipusen Biology Technology Co ltd; Nanjing Yixian Biological Technology Co ltd
Current assignee: Weihai Dipusen Biology Technology Co ltd; Nanjing Yixian Biological Technology Co ltd
Priority date: 2022-03-01
Filing date: 2022-03-01
Publication date: 2022-04-12
Anticipated expiration: 2042-03-01
Also published as: CN114317277B

Abstract

本发明提供一种提高佐夫色绿藻异养生产虾青素的细胞预培养方法，包括如下过程：预培养处理，将处于对数生长期的佐夫色绿藻进行自养、混养和异养，持续培养三批保持细胞活性；发酵处理，将预培养处理中不同细胞活性的佐夫色绿藻接入三角瓶中进行高密度培养；扩培处理，将预处理中不同细胞活性的佐夫色绿藻接入发酵罐中进行高密度发酵，获得先进报道最大生物量。本发明首次预培养的自养、混养和异养的佐夫色绿藻进行异养高密度发酵，获得最大生物量121 g/L，获得高的虾青素产量为0.56 g/L，产率为0.11 g/L/d，为虾青素市场提供充足来源。

Description

一种提高佐夫色绿藻异养生产虾青素的细胞预培养方法

技术领域

本发明涉及微藻生物领域，具体为一种提高佐夫色绿藻异养生产虾青素的细胞预培养方法。

背景技术

虾青素是种生物活性高的类胡萝卜素，含有长的共轭双键，并在链末端形成α-羟基酮结构，具有非常高的抗氧化能力，约是β-胡萝卜素的10倍，维生素E的500倍。虾青素具有三种旋光异构体：左旋（3S,3’S）、右旋（3R,3’R）和内消旋（3R,3’S），其中只有左旋具有抗癌、抗肿瘤、抗氧化等生物活性。虾青素全球市场预计2021年为6.47亿美元，以8.3%的复合年增长率增长，到2026年达到9.65亿美元。虾青素的生产方式主要有人工合成和生物提取，其中人工合成主要存在的问题是合成的虾青素在分子结构上与天然虾青素之间存在差异，导致生物活性，安全性的问题；生物提取包括从水产品加工废料中提取，细菌、真菌、微藻的发酵生产。其中，微藻来源的虾青素构型与水生动物体内所含一致，游离虾青素及其酯类的配比与水生动物中基本相似，易于吸收，其优点是人工合成和采用其他微生物发酵方法所不具备的。

目前，微藻中雨生红球藻（Haematococcus pluvialis）和佐夫色绿藻（Chromochloris zofingiensis）主要用于研究虾青素的生产。雨生红球藻自养周期长，生物量受地区和季节限制在工业生产中仅为0.2-0.5 g L^-1左右，影响虾青素的产量。异养生产虾青素的佐夫色绿藻生物量高达60 g L^-1，是一种有前景的天然虾青素来源。细胞高密度生长和虾青素大量积累是实现佐夫色绿藻产业化生产的关键。高密度佐夫色绿藻为获取虾青素提供充足原料，但目前报道藻的生物量未超过100 g L^-1。佐夫色绿藻在自养、混养和异养模式均可快速生长，但当细胞密度增加，佐夫色绿藻在发酵罐中以异养模式生长代谢。因此，提高佐夫色绿藻的异养生物量是实现虾青素工业生产的关键。

有必要设计一种高效的细胞预培养策略，确定细胞的营养模式对佐夫色绿藻异养生产虾青素的提升效果，也为其他微藻的高密度培养提供新的指导方向。

发明内容

本发明目的在于提供一种提高佐夫色绿藻异养生产虾青素的细胞预培养方法，对佐夫色绿藻进行不同营养模式的预培养，接入异养发酵体系，实现佐夫色绿藻生物量和虾青素产量的提升。

为达成上述目的，本发明提出如下技术方案：一种提高佐夫色绿藻异养生产虾青素的细胞预培养方法，包括如下过程：

预培养处理，将处于对数生长期的佐夫色绿藻进行自养、混养和异养，持续培养三批保持细胞活性；

发酵处理，将预培养处理中不同细胞活性的佐夫色绿藻接入三角瓶中进行高密度培养，筛选适合异养高密度发酵的佐夫色绿藻细胞状态，其中，在微藻的生长过程中进行营养的动态补料，补料基于以下公式：

（1）；

其中F _S为流加的底物浓度，Y _XS为生物量比上底物浓度，当培养基中营养浓度保持不变时，公式1可以转化成：

（2）；

为了流加操作的方便，将体积转化成流加的计量指标，则公式2可以转换成：

（3）；

其中V _FS为流加速率（mL h^-1），V ₀是初始培养体积（mL），C _FS是流加培养基中营养的浓度，硝酸盐和磷酸盐的浓度，最终得到补料模型V _FS= 0.006204×exp（0.03t）；

扩培处理，将筛选的适合异养高密度发酵的佐夫色绿藻细胞接入发酵罐中进行高密度发酵。

优选的，所述预培养处理中具体的，将活化好的佐夫色绿藻培养3-6天，使其处于对数生长期，使处于对数生长期的佐夫色绿藻作为种子液，按照10-20%的接种量转接自养、混养和异养的培养基中进行摇床震荡培养，其中，自养采用培养基1，异养采用培养基2，培养温度20-30 ℃，摇床转速为100-240 rpm，培养3个周期。

优选的，所述培养基1的基本组分包括：KNO₃、NaH₂PO₄·H₂O、Na₂HPO₄·2H₂O、MgSO₄·7H₂O、CaCl₂·2H₂O、FeSO₄·7H₂O、H₃BO₃、MnSO₄·H₂O、ZnSO₄·7H₂O、CuSO₄·5H₂O和(NH₄)₆MO₇O₂₄·4H₂O，pH为6.5，所述培养基2的基本组分包括培养基1和葡萄糖，pH为6.5。

优选的，补料培养基为培养基3，组成为葡萄糖400 g/L，硝酸钾97.6 g/L，磷酸二氢钾13.1 g/L，其他营养成分为培养基1浓度浓缩80倍。

优选的，所述预培养处理中具体的，自养和混养模式下佐夫色绿藻放置光照条件下培养3-6天，光来源为太阳光、LED灯或者荧光灯灯光其中的一种或几种，光照强度为0-200 µmol m^-2 s^-1。

优选的，所述预培养处理中，将自养、混养和异养的佐夫色绿藻称重，按照相同接种量10-20%接入250 mL的三角瓶中异养培养，采用培养基2。

优选的，所述发酵处理中具体的，将自养、混养和异养的佐夫色绿藻称重，按照相同接种量10-20%接入发酵罐中。

优选的，发酵罐罐压为0.01-0.07 MPa，转速初始为100-600 rpm，溶氧设定为0-40%，培养3-6天，采用培养基2，收集发酵罐中佐夫色绿藻细胞，提取测定虾青素含量。

有益效果，本申请的技术方案具备如下技术效果：

1、本发明首次将预培养的自养、混养和异养的佐夫色绿藻筛选适合异养高密度发酵的佐夫色绿藻细胞，再进行异养高密度发酵，获得最大生物量121 g/L，是现今报道最高的佐夫色绿藻生物量；

2、异养高密度发酵是实现微藻来源高附加值产物生产的关键技术，本发明提出的预培养技术可用于其他微藻的异养培养，为微藻的高密度培养提供新的研究方向。

2、本发明获得高的虾青素产量为0.56 g/L，产率为0.11 g/L/d，为虾青素市场提供充足来源；其次，本发明方法获得的佐夫色绿藻藻粉，可以从培养基的源头控制重金属等污染物，获得的虾青素更安全。

应当理解，前述构思以及在下面更加详细地描述的额外构思的所有组合只要在这样的构思不相互矛盾的情况下都可以被视为本公开的发明主题的一部分。

结合附图从下面的描述中可以更加全面地理解本发明教导的前述和其他方面、实施例和特征。本发明的其他附加方面例如示例性实施方式的特征和/或有益效果将在下面的描述中显见，或通过根据本发明教导的具体实施方式的实践中得知。

附图说明

附图不意在按比例绘制。在附图中，在各个图中示出的每个相同或近似相同的组成部分可以用相同的标号表示。为了清晰起见，在每个图中，并非每个组成部分均被标记。现在，将通过例子并参考附图来描述本发明的各个方面的实施例，其中：

图1是佐夫色绿藻在250 mL三角瓶中培养三批的自养、混养和异养生长曲线。在自养下，佐夫色绿藻最终生物量第一批、第二批和第三批培养分别为0.2 g/L，0.2 g/L 和0.15 g/L。在混养下，佐夫色绿藻最终生物量第一批、第二批和第三批培养分别为1.9 g/L，1.8 g/L 和1.95 g/L。在异养下，佐夫色绿藻最终生物量第一批、第二批和第三批培养分别为1.0 g/L，1.7 g/L 和1.7 g/L。

图2中的a部分是佐夫色绿藻在250 mL三角瓶中的异养生长曲线。在自养、混养和异养预培养后，佐夫色绿藻在的最终生物量分别为0.75 g/L、1.78 g/L和1.47 g/L，图2中的b部分显示佐夫色绿藻中虾青素产率分别为0.93 mg/L/d、2.03 mg/L/d和1.70 mg/L/d。

图3是异养佐夫色绿藻在250 mL三角瓶中补料条件下的生物量。在自养、混养和异养预培养后，佐夫色绿藻在的最终生物量分别为0.87 g/L、8.02 g/L和7.30 g/L。

图4中的a部分是佐夫色绿藻自养预培养后，在20L发酵罐中的异养生长曲线，最终生物量为68.90 g/L，图3中的b部分显示比生长速率为0.52 d^-1，虾青素产率为0.072 g/L/d。

图5中的a部分是佐夫色绿藻异养预培养后，在20L发酵罐中的异养生长曲线，最终生物量为93.02 g/L，图4中的b部分显示比生长速率为0.59 d^-1，虾青素产率为0.086 g/L/d。

图6中的a部分是佐夫色绿藻混养预培养后，在20L发酵罐中的异养生长曲线，最终生物量为121.50 g/L，图5中的b部分显示比生长速率为0.64 d^-1，虾青素产率为0.111 g/L/d。

具体实施方式

为了更了解本发明的技术内容，特举具体实施例并配合所附图式说明如下。在本公开中参照附图来描述本发明的各方面，附图中示出了许多说明的实施例。本公开的实施例不必定义在包括本发明的所有方面。应当理解，上面介绍的多种构思和实施例，以及下面更加详细地描述的那些构思和实施方式可以以很多方式中任意一种来实施，这是因为本发明所公开的构思和实施例并不限于任何实施方式。另外，本发明公开的一些方面可以单独使用，或者与本发明公开的其他方面的任何适当组合来使用。

本发明中，选用的藻种为佐夫色绿藻Chromochloris zofingiensis。

实施例1：佐夫色绿藻自养、混养和异养培养以250 mL锥形瓶为培养容器，转入培养基100 mL。将活化后的佐夫色绿藻在摇瓶中自养培养，3天后获得处于对数生长期的佐夫色绿藻细胞，作为实验种子液。

按10%（v/v）接种量分别接入新配制自养（培养基1）、混养和异养的培养基（培养基2）中进行摇床震荡培养，每种营养方式同时进行三批培养，转速设为150 rpm，温度设为23℃，培养时间为5天。自养和混养条件使用50 µmol m^-2 s^-1的光照。第5天收集藻液，离心洗涤，冷冻干燥，并测试生物量。

培养基1的组成为：KNO₃ 2.02 g/L，NaH₂PO₄·H₂O 0.62 g/L，Na₂HPO₄·2H₂O 0.089g/L，MgSO₄·7H₂O 0.247 g/L，CaCl₂·2H₂O 14.7 mg/L，FeSO₄·7H₂O 6.95 mg/L，H₃BO₃0.061 mg/L，MnSO₄·H₂O 0.169 mg/L，ZnSO₄·7H₂O 0.287 mg/L，CuSO₄·5H₂O 0.0025 mg/L，(NH₄)₆MO₇O₂₄·4H₂O 0.01235 mg/L，pH为6.5。

培养基2的组成为培养基1加入5 g/L葡萄糖，pH为6.5。

佐夫色绿藻细胞干重的测定：取3 mL培养液，3000 rpm离心5 min，ddH₂O洗涤后重新离心，重复2次；将藻液滤至预称重的滤纸上，放入80℃真空干燥箱中烘干至恒重。

实施例1效果分析：佐夫色绿藻在三批培养后，细胞最终生物量趋于稳定。其中，第三批培养中，混养下佐夫色绿藻生物量为1.95 g/L，是自养和异养分别13倍和1.15倍。

实施例2：佐夫色绿藻预培养后在250 mL三角瓶中异养生长

实施例2与实施例1基本相同，不同点在于将佐夫色绿藻进行自养、混养和异养三批后，接入250 mL三角瓶中进行异养生长。收集藻粉并测定虾青素含量。

虾青素的检测：称取20 mg冻干后的藻粉，低温研磨后加入5 mL无水乙醇震荡提取10 min，离心（4 ℃下3000 rpm离心5 min）收集上清，沉淀中重新加入3 mL无水乙醇震荡提取，直至藻粉呈现白色。收集提取液，4 ℃下12000 rpm离心10 min，取上清氮气吹干，再加入1 mL无水乙醇溶解色素，过膜后高效液相色谱仪（HPLC）分析，整个过程避光条件下进行。

HPLC分析方法：高效液相色谱仪waters2695，配置PDA检测器，检测波长450 nm，选用C18反相柱（250 mm × 4.6 mm × 5 mm）。流动相为：A相为纯乙酸乙酯，B相为乙腈：甲醇：水=84:2:14，C相为纯甲醇，采用梯度洗脱，流动相均采用HPLC级。

梯度洗脱条件如下：

时间（min）	A（%）	B（%）	C（%）	流速（mL/min）
					0	0	100	0	0.8
15	32	0	68	0.8
					30	32	0	68	0.8
35	0	100	0	0.8

实施例2的效果分析：在混养预培养后，佐夫色绿藻异养的最终生物量1.78 g/L，是自养和异养预培养的2.37倍和1.21倍；虾青素的产率为2.03 mg/L/d，是自养和异养预培养的2.18倍和1.19倍。

实施例3：佐夫色绿藻基于营养补料的动力学模型的生长

实施例3与实施例2基本相同，不同点在于在微藻的生长过程中进行营养的动态补料。补料基于以下公式：

（1）

其中F _S为流加的底物浓度，Y _XS为生物量比上底物浓度。当培养基中营养浓度保持不变时，公式1可以转化成：

（2）

（3）

其中V _FS为流加速率（mL h^-1），V ₀是初始培养体积（mL），C _FS是流加培养基中营养的浓度，硝酸盐和磷酸盐的浓度。最终得到补料模型V _FS= 0.006204×exp（0.03t）。

补料培养基为培养基3，组成为葡萄糖400 g/L，硝酸钾97.6 g/L，磷酸二氢钾13.1g/L，其他营养成分为培养基1浓度浓缩80倍。

实施例3的效果分析：基于营养的动态补料模型，在混养预培养后，佐夫色绿藻异养的最终生物量为8.02 g/L，是没有补料条件的4.50倍；在自养预培养后，佐夫色绿藻异养的最终生物量为0.87 g/L，是没有补料条件的1.16倍；在异养预培养后，佐夫色绿藻异养的最终生物量为7.30 g/L，是没有补料条件的4.88倍。

实施例4：佐夫色绿藻自养预培养后在20 L发酵罐中异养生长

实施例4与实施例3基本相同，不同点在于将佐夫色绿藻进行自养三批后，接入20L发酵罐中进行异养生长。由于培养体系增大100倍，因此补料模型为V _FS= 0.6204×exp（0.03t）。实施例3的效果分析：佐夫色绿藻最终生物量为68.90 g/L，比生长速率为0.52 d^-1，虾青素产率为0.072 g/L/d。

实施例5：佐夫色绿藻异养预培养后在20 L发酵罐中异养生长

实施例5与实施例3基本相同，不同点在于将佐夫色绿藻进行异养三批后，接入20L发酵罐中进行异养生长，补料模型为V _FS= 0.6204×exp（0.03t）。

实施例5的效果分析：佐夫色绿藻最终生物量为93.02 g/L，是实施例3的1.35倍；比生长速率为0.59 d^-1，是实施例3的1.13倍，虾青素产率为0.086 g/L/d，是实施例3的1.19倍。

实施例6：佐夫色绿藻混养预培养后在20 L发酵罐中异养生长

实施例6与实施例3基本相同，不同点在于将佐夫色绿藻进行混养三批后，接入20L发酵罐中进行异养生长，补料模型为V _FS= 0.6204×exp（0.03t）。

实施例6的效果分析：佐夫色绿藻最终生物量为121.50 g/L，是实施例3和实施例4的1.76倍和1.31倍；比生长速率为0.64 d^-1，是实施例3和实施例4的1.23倍和1.08倍；虾青素产率为0.111 g/L/d，是实施例3和实施例4的1.54倍和1.29倍。

本发明首次将细胞预培养技术用于佐夫色绿藻的培养，再进行异养高密度发酵，佐夫色绿藻生物量到121.5 g/L，为现今报道最高，虾青素产率达0.111 g/L/d，使佐夫色绿藻具有工业生产虾青素潜力。主要包括佐夫色绿藻预培养条件优化、20L发酵罐培养条件优化、胞内产物虾青素的获得和检测等工艺步骤。并给出了实施例，发现佐夫色绿藻混养预培养提高其异养高密度培养的最终生物量121.5 g/L，为现今报道最高，是自养和异养预培养的1.76倍和1.31倍；混养预培养提高虾青素产率至0.111 g/L/d，是自养和异养预培养的1.54倍和1.29倍。本发明提出的微藻细胞预培养技术可应用于其他微藻的高密度培养。

虽然本发明已以较佳实施例揭露如上，然其并非用以限定本发明。本发明所属技术领域中具有通常知识者，在不脱离本发明的精神和范围内，当可作各种的更动与润饰。因此，本发明的保护范围当视权利要求书所界定者为准。

Claims

1.一种提高佐夫色绿藻异养生产虾青素的细胞预培养方法，其特征在于：包括如下过程：

（1）；

（2）；

（3）；

2.根据权利要求1所述的一种提高佐夫色绿藻异养生产虾青素的细胞预培养方法，其特征在于：所述预培养处理中具体的，将活化好的佐夫色绿藻培养3-6天，使其处于对数生长期，使处于对数生长期的佐夫色绿藻作为种子液，按照10-20%的接种量转接自养、混养和异养的培养基中进行摇床震荡培养，其中，自养采用培养基1，异养采用培养基2，培养温度20-30 ℃，摇床转速为100-240 rpm，培养3个周期。

3.根据权利要求2所述的一种提高佐夫色绿藻异养生产虾青素的细胞预培养方法，其特征在于：所述培养基1的基本组分包括：KNO₃、NaH₂PO₄·H₂O、Na₂HPO₄·2H₂O、MgSO₄·7H₂O、CaCl₂·2H₂O、FeSO₄·7H₂O、H₃BO₃、MnSO₄·H₂O、ZnSO₄·7H₂O、CuSO₄·5H₂O和(NH₄)₆MO₇O₂₄·4H₂O，pH为6.5，所述培养基2的基本组分包括培养基1和葡萄糖，pH为6.5。

4.根据权利要求3所述的一种提高佐夫色绿藻异养生产虾青素的细胞预培养方法，其特征在于：补料培养基为培养基3，组成为葡萄糖400 g/L，硝酸钾97.6 g/L，磷酸二氢钾13.1 g/L，其他营养成分为培养基1浓度浓缩80倍。

5.根据权利要求1所述的一种提高佐夫色绿藻异养生产虾青素的细胞预培养方法，其特征在于：所述预培养处理中具体的，自养和混养模式下佐夫色绿藻放置光照条件下培养3-6天，光来源为太阳光、LED灯或者荧光灯灯光其中的一种或几种，光照强度为0-200 µmolm^-2 s^-1。

6.根据权利要4所述的一种提高佐夫色绿藻异养生产虾青素的细胞预培养方法，其特征在于：所述预培养处理中，将自养、混养和异养的佐夫色绿藻称重，按照相同接种量10-20%接入250 mL的三角瓶中异养培养，采用培养基2。

7.根据权利要求6所述的一种提高佐夫色绿藻异养生产虾青素的细胞预培养方法，其特征在于：所述发酵处理中具体的，将自养、混养和异养的佐夫色绿藻称重，按照相同接种量10-20%接入发酵罐中。

8.根据权利要求7所述的一种提高佐夫色绿藻异养生产虾青素的细胞预培养方法，其特征在于：发酵罐罐压为0.01-0.07 MPa，转速初始为100-600 rpm，溶氧设定为0-40%，培养3-6天，采用培养基2，收集发酵罐中佐夫色绿藻细胞，提取测定虾青素含量。