CN108588136A - 一种利用褪黑素联合缺氮促进异养微藻油脂积累的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种利用褪黑素联合缺氮促进异养微藻油脂积累的方法，属于微藻生物技术领域。本发明在温度为24~26℃条件下，以10 g/L葡萄糖为碳源的BG‑11基础培养基异养培养单针藻，待单针藻生长至对数生长期后期收集藻细胞，用缺氮的BG‑11培养基稀释重悬浮藻细胞至0.85~1 g/L作为诱导藻液；用无水乙醇配制100μmol/L的褪黑素母液，将褪黑素母液添加诱导藻液中稀释褪黑素浓度为0.1~10μmol/L，并置于温度为24~26℃、光照条件下诱导培养；利用有机溶剂提取藻细胞内的油脂。本发明方法操作简单，能够缩短藻细胞诱导的周期，提高油脂含量，保证微藻生长，可解决微藻产业化诱导过程中存在的生物量降低和油脂含量低等问题。
Description
技术领域
本发明涉及一种利用褪黑素联合缺氮促进异养微藻油脂积累的方法，属于微藻生物技术领域。
背景技术
微藻生物质作为替代陆生植物生产生物燃料的原料，因其可以进行光合作用，能有效利用太阳能将水、CO2和无机盐转化为有机物。微藻具有光合利用率高、生长速度快、对生长环境要求低及储能物质（油脂、烃）含量高等优点已被广泛研究（Mata T M, Martins AA, Caetano N S. Microalgae for biodiesel production and other applications: areview[J]. Renewable and sustainable energy reviews, 2010, 14(1): 217-232.）。
在异养条件下微藻利用葡萄糖等有机碳源可快速积累生物质，大大缩短了藻细胞生长周期，提高了细胞生物量产率，但异养条件下培养的藻细胞品质较差，一般获得的藻细胞油脂含量较低，因此异养阶段一般不适于积累油脂。而采用两阶段法诱导微藻积累油脂成为当今研究的热点，Fan等利用“连续异养-稀释-光诱导”大幅度提高了微藻中油脂含量（Fan J, Huang J, Li Y, et al. Sequential heterotrophy–dilution–photoinductioncultivation for efficient microalgal biomass and lipid production[J].Bioresource technology, 2012, 112: 206-211.）；此外，缺氮是最常见的作为诱导微藻积累油脂的方法，Pancha等自养培养珊藻Scenedesmus sp. CCNM 1077时，采用氮限制的方式诱导藻细胞快速积累油脂，发现藻细胞在缺氮条件下油脂积累量最高，但微藻生物量较低（Pancha I, Chokshi K, George B, et al. Nitrogen stress triggeredbiochemical and morphological changes in the microalgae Scenedesmus sp. CCNM1077[J]. Bioresource technology, 2014, 156: 146-154.）。
发明内容
针对上述现有技术存在的问题及不足，本发明提供一种利用褪黑素联合缺氮促进异养微藻油脂积累的方法，本发明方法采用可异养的微藻，进行藻种异养的培养使藻细胞在短时间内快速生长，随后稀释至适量的浓度进行光自养缺氮培养，同时结合褪黑素诱导藻细胞大量积累油脂，并利用有机溶剂提取藻细胞内油脂；本发明操作简单，能够缩短藻细胞的生长周期，提高油脂的产率。
一种利用褪黑素联合缺氮促进异养微藻油脂积累的方法，具体步骤如下：
（1）诱导藻液的制备：在温度为24~26℃条件下，以10 g/L葡萄糖为碳源的BG-11基础培养基异养培养单针藻，待单针藻生长至对数生长期后期收集藻细胞，用缺氮的BG-11培养基稀释重悬浮藻细胞至0.85~1 g/L作为诱导藻液；
（2）诱导藻细胞积累油脂：用无水乙醇配制100 μmol/L的褪黑素母液，将褪黑素母液添加到步骤（1）的诱导藻液中稀释褪黑素浓度为0.1~10 μmol/L，并置于温度为24~26℃、光照条件下诱导培养；
（3）利用有机溶剂提取步骤（2）藻细胞内的油脂；
所述单针藻为单针藻菌株Monoraphidium sp. QLY-1（NCBI：KM199735）；
所述步骤（2）中光照强度为29~31 μmol m−2 s−1；
所述步骤（3）中有机溶剂为氯仿-甲醇溶液，氯仿-甲醇溶液中氯仿与甲醇的体积比为1:2；有机溶剂提取藻细胞内的油脂的方法为：将培养液经5000 r/min离心富集5 min，用蒸馏水反复洗涤3次后冻干制成干藻粉，称重；加入石英砂并研磨混匀，再加入氯仿-甲醇溶液重复抽提至藻体发白，离心收集有机相即得油脂；其中石英砂的质量为干藻粉质量的2倍。
本发明的有益效果为：
（1）本发明工序简单方便、本较少，只需添加微量的褪黑素就可以保障微藻在缺氮条件下的生物量，又可以进一步提高微藻中油脂的积累；
（2）本发明显著提高了微藻在氮胁迫下的油脂含量，当外源添加1 μmol/L褪黑素联合缺氮下油脂含量比对照组提高了20.53%；
（3）本发明的褪黑素分子量小、易被植物吸收，还可以保证植物在逆境中的生长和发育。在产油微藻的培养中，褪黑素可作为外源植物激素促进微藻大量积累次级代谢产物和提高微藻的抗逆性。
具体实施方式
下面结合具体实施方式，对本发明作进一步说明。
对比例1：一种异养微藻油脂积累的方法，具体步骤如下：
（1）诱导藻液的制备：在温度为25℃条件下，以10 g/L葡萄糖为碳源的BG-11基础培养基异养培养单针藻Monoraphidium sp. QLY-1，待单针藻Monoraphidium sp. QLY-1生长至对数生长期后期（生物量达到5 g/L）收集藻细胞，用新鲜的BG-11培养基稀释重悬浮藻细胞至0.85 g/L作为诱导藻液；
（2）诱导藻细胞积累油脂：将步骤（1）的诱导藻液置于温度为25 ℃、光照强度为30 μmol m−2 s−1条件下，冷光灯持续光照诱导培养，每天离心收集藻细胞；
（3）利用有机溶剂提取步骤（2）藻细胞内的油脂；其中有机溶剂为氯仿-甲醇溶液，氯仿-甲醇溶液中氯仿与甲醇的体积比为1:2；有机溶剂提取藻细胞内的油脂的方法为：将培养液经5000 r/min离心富集5 min，用蒸馏水反复洗涤3次后冻干制成干藻粉，称重；加入石英砂并研磨混匀，再加入氯仿-甲醇溶液重复抽提至藻体发白，离心收集有机相即得油脂；其中石英砂的质量为干藻粉质量的2倍。诱导第3天油脂含量达到最高为细胞干重的35.28%（见表1），生物量为1.02g/L。
对比例2：一种缺氮促进异养微藻油脂积累的方法，具体步骤如下：
（1）诱导藻液的制备：在温度为25℃条件下，以10 g/L葡萄糖为碳源的BG-11基础培养基异养培养单针藻，待单针藻生长至对数生长期后期收集藻细胞，用新鲜缺氮的BG-11培养基稀释重悬浮藻细胞至0.85 g/L作为诱导藻液；
（2）诱导藻细胞积累油脂：将步骤（1）的诱导藻液中稀释褪黑素浓度为1 μmol/L，并置于温度为25℃、光照强度为30 μmol m−2 s−1条件下，冷光灯持续光照诱导培养，每天离心收集藻细胞；
（3）利用有机溶剂提取步骤（2）藻细胞内的油脂；其中有机溶剂为氯仿-甲醇溶液，氯仿-甲醇溶液中氯仿与甲醇的体积比为1:2；有机溶剂提取藻细胞内的油脂的方法为：将培养液经5000 r/min离心富集5 min，用蒸馏水反复洗涤3次后冻干制成干藻粉，称重；加入石英砂并研磨混匀，再加入氯仿-甲醇溶液重复抽提至藻体发白，离心收集有机相即得油脂；其中石英砂的质量为干藻粉质量的2倍。诱导第1天油脂含量达到最高为细胞干重的42.63%（见表1），生物量为0.87g/L，缺氮条件下的生物量为对比例1的85.3%，比对比例1低14.7%，而藻细胞油脂含量较对比例1增加了20.83%。
实施例1：一种利用褪黑素联合缺氮促进异养微藻油脂积累的方法，具体步骤如下：
（1）诱导藻液的制备：在温度为25℃条件下，以10 g/L葡萄糖为碳源的BG-11基础培养基异养培养单针藻，待单针藻生长至对数生长期后期收集藻细胞，用缺氮的BG-11培养基稀释重悬浮藻细胞至0.85 g/L作为诱导藻液；
（2）诱导藻细胞积累油脂：用无水乙醇配制100 μmol/L的褪黑素母液，将褪黑素母液添加到步骤（1）的诱导藻液中稀释褪黑素浓度为1 μmol/L，并置于温度为25℃、光照强度为30μmol m−2 s−1条件下，冷光灯持续光照诱导培养，每天离心收集藻细胞；
（3）利用有机溶剂提取步骤（2）藻细胞内的油脂；其中有机溶剂为氯仿-甲醇溶液，氯仿-甲醇溶液中氯仿与甲醇的体积比为1:2；有机溶剂提取藻细胞内的油脂的方法为：将培养液经5000 r/min离心富集5 min，用蒸馏水反复洗涤3次后冻干制成干藻粉，称重；加入石英砂并研磨混匀，再加入氯仿-甲醇溶液重复抽提至藻体发白，离心收集有机相即得油脂；其中石英砂的质量为干藻粉质量的2倍。诱导第1天油脂含量达到最高为细胞干重的51.38%（见表1），生物量为0.99g/L，从表1可知，添加褪黑素联合缺氮条件下的生物量达到对比例1的97.06%，生物量为对比例2的1.138倍，藻细胞油脂含量较对比例1增加了45.63%，较对比例2增加了20.53%。
实施例2：一种利用褪黑素联合缺氮促进异养微藻油脂积累的方法，具体步骤如下：
（1）诱导藻液的制备：在温度为 24℃条件下，以 10 g/L葡萄糖为碳源的BG-11基础培养基异养培养单针藻，待单针藻生长至对数生长期后期收集藻细胞，用缺氮的BG-11培养基稀释重悬浮藻细胞至 0.85 g/L作为诱导藻液；
（2）诱导藻细胞积累油脂：用无水乙醇配制 100 μmol/L的褪黑素母液，将褪黑素母液添加到步骤（1）的诱导藻液中稀释褪黑素浓度为 0.1 μmol/L，并置于温度为 24℃、光照强度为 29 μmol m−2 s−1条件下，冷光灯持续光照诱导培养，每天离心收集藻细胞；
（3）利用有机溶剂提取步骤（2）藻细胞内的油脂；其中有机溶剂为氯仿-甲醇溶液，氯仿-甲醇溶液中氯仿与甲醇的体积比为1:2；有机溶剂提取藻细胞内的油脂的方法为：将培养液经5000 r/min离心富集5 min，用蒸馏水反复洗涤3次后冻干制成干藻粉，称重；加入石英砂并研磨混匀，再加入氯仿-甲醇溶液重复抽提至藻体发白，离心收集有机相即得油脂；其中石英砂的质量为干藻粉质量的2倍。诱导第1天油脂含量达到最高为细胞干重的49.97%，生物量为0.96 g/L（见表1），添加褪黑素联合缺氮条件下的生物量达到对比例1的94.12%，生物量为对比例2的1.10倍，藻细胞油脂含量较对比例1增加了41.64%，较对比例2增加了17.22%。
实施例3：实施例3：一种利用褪黑素联合缺氮促进异养微藻油脂积累的方法，具体步骤如下：
（1）诱导藻液的制备：在温度为 25℃条件下，以 10 g/L葡萄糖为碳源的BG-11基础培养基异养培养单针藻，待单针藻生长至对数生长期后期收集藻细胞，用缺氮的BG-11培养基稀释重悬浮藻细胞至 1 g/L作为诱导藻液；
（2）诱导藻细胞积累油脂：用无水乙醇配制 100 μmol/L的褪黑素母液，将褪黑素母液添加到步骤（1）的诱导藻液中稀释褪黑素浓度为 2 μmol/L，并置于温度为 26℃、光照强度为 31μmol m−2 s−1条件下，冷光灯持续光照诱导培养，每天离心收集藻细胞；
（3）利用有机溶剂提取步骤（2）藻细胞内的油脂；其中有机溶剂为氯仿-甲醇溶液，氯仿-甲醇溶液中氯仿与甲醇的体积比为1:2；有机溶剂提取藻细胞内的油脂的方法为：将培养液经5000 r/min离心富集5 min，用蒸馏水反复洗涤3次后冻干制成干藻粉，称重；加入石英砂并研磨混匀，再加入氯仿-甲醇溶液重复抽提至藻体发白，离心收集有机相即得油脂；其中石英砂的质量为干藻粉质量的2倍。诱导第1天油脂含量达到最高为细胞干重的49.7%，生物量为0.95 g/L（见表1），添加褪黑素联合缺氮条件下的生物量达到对比例1的 93.13%，生物量为对比例2的1.09倍，藻细胞油脂含量较对比例1增加了40.87%，较对比例2增加了16.58%。
对比例3：一种利用褪黑素联合缺氮促进异养微藻油脂积累的方法，具体步骤如下：
（1）诱导藻液的制备：在温度为 25℃条件下，以 10 g/L葡萄糖为碳源的BG-11基础培养基异养培养单针藻，待单针藻生长至对数生长期后期收集藻细胞，用缺氮的BG-11培养基稀释重悬浮藻细胞至 0.9 g/L作为诱导藻液；
（2）诱导藻细胞积累油脂：用无水乙醇配制 100 μmol/L的褪黑素母液，将褪黑素母液添加到步骤（1）的诱导藻液中稀释褪黑素浓度为 5 μmol/L，并置于温度为 25.5℃、光照强度为 30.5 μmol m−2 s−1条件下，冷光灯持续光照诱导培养，每天离心收集藻细胞；
（3）利用有机溶剂提取步骤（2）藻细胞内的油脂；其中有机溶剂为氯仿-甲醇溶液，氯仿-甲醇溶液中氯仿与甲醇的体积比为 1:2 ；有机溶剂提取藻细胞内的油脂的方法为：将培养液经5000 r/min离心富集5 min，用蒸馏水反复洗涤3次后冻干制成干藻粉，称重；加入石英砂并研磨混匀，再加入氯仿-甲醇溶液重复抽提至藻体发白，离心收集有机相即得油脂；其中石英砂的质量为干藻粉质量的2倍。诱导第1天油脂含量达到最高为细胞干重的41.84%，生物量为0.95 g/L（见表1），添加褪黑素联合缺氮条件下的生物量达到对比例1的84.31%，生物量达到对比例2的98.85%，藻细胞油脂含量较对比例1增加了18.59%，较对比例2降低了1.89%；褪黑素含量过高，对微藻有毒害作用，导致微藻细胞死亡，降低了生物量和藻细胞油脂含量。
对比例4：一种利用褪黑素联合缺氮促进异养微藻油脂积累的方法，具体步骤如下：
（1）诱导藻液的制备：在温度为 25℃条件下，以10 g/L葡萄糖为碳源的BG-11基础培养基异养培养单针藻，待单针藻生长至对数生长期后期收集藻细胞，用缺氮的BG-11培养基稀释重悬浮藻细胞至 1 g/L作为诱导藻液；
（2）诱导藻细胞积累油脂：用无水乙醇配制 100 μmol/L的褪黑素母液，将褪黑素母液添加到步骤（1）的诱导藻液中稀释褪黑素浓度为10 μmol/L，并置于温度为 26℃、光照强度为 31 μmol m−2 s−1条件下，冷光灯持续光照诱导培养，每天离心收集藻细胞；
（3）利用有机溶剂提取步骤（2）藻细胞内的油脂；其中有机溶剂为氯仿-甲醇溶液，氯仿-甲醇溶液中氯仿与甲醇的体积比为 1:2 ；有机溶剂提取藻细胞内的油脂的方法为：将培养液经5000 r/min离心富集5 min，用蒸馏水反复洗涤3次后冻干制成干藻粉，称重；加入石英砂并研磨混匀，再加入氯仿-甲醇溶液重复抽提至藻体发白，离心收集有机相即得油脂；其中石英砂的质量为干藻粉质量的2倍。诱导第1天油脂含量达到最高为细胞干重的38.5 %，生物量为0.81 g/L（见表1），
表1 不同培养模式下微藻生物量和油脂含量结果
添加褪黑素联合缺氮条件下的生物量仅达到对比例1的79.41%，生物量达到对比例2的93.1%，藻细胞油脂含量较对比例1增加了9.13%，较对比例2降低了9.69%，褪黑素含量过高，对微藻有毒害作用，导致微藻细胞死亡，降低了生物量和藻细胞油脂含量。
异养培养微藻可快速增加微藻生物量，利用光自养诱导异养后的藻细胞积累油脂，发现缺氮条件下可促进藻细胞中油脂的积累，但微藻生长受到抑制；添加适量浓度（0.1~2μmol/L）的外源褪黑素联合缺氮更有效的促进了藻细胞中油脂的积累，且维持了藻细胞的生长；通过此诱导微藻的方法，既实现了藻细胞中油脂的快速、大量积累，又保证了微藻稳定的生长；褪黑素含量过高，对微藻有毒害作用，导致微藻细胞死亡，降低了生物量和藻细胞油脂含量。
Claims (4)
1.一种利用褪黑素联合缺氮促进异养微藻油脂积累的方法，其特征在于，具体步骤如下：
（1）诱导藻液的制备：在温度为24~26℃条件下，以10 g/L葡萄糖为碳源的BG-11基础培养基异养培养单针藻，待单针藻生长至对数生长期后期收集藻细胞，用缺氮的BG-11培养基稀释重悬浮藻细胞至0.85~1 g/L作为诱导藻液；
（2）诱导藻细胞积累油脂：用无水乙醇配制100 μmol/L的褪黑素母液，将褪黑素母液添加到步骤（1）的诱导藻液中稀释褪黑素浓度为0.1~10 μmol/L，并置于温度为24~26℃、光照条件下诱导培养；
（3）利用有机溶剂提取步骤（2）藻细胞内的油脂。
2.根据权利要求1所述利用褪黑素联合缺氮促进异养微藻油脂积累的方法，其特征在于：单针藻为单针藻菌株Monoraphidium sp. QLY-1（NCBI：KM199735）。
3.根据权利要求1所述利用褪黑素联合缺氮促进异养微藻油脂积累的方法，其特征在于：步骤（2）中光照强度为29~31 μmol m−2 s−1。
4.根据权利要求1所述利用褪黑素联合缺氮促进异养微藻油脂积累的方法，其特征在于：步骤（3）中有机溶剂为氯仿-甲醇溶液，氯仿-甲醇溶液中氯仿与甲醇的体积比为1:2；有机溶剂提取藻细胞内的油脂的方法为：将培养液经5000 r/min离心富集5 min，用蒸馏水反复洗涤3次后冻干制成干藻粉，称重；加入石英砂并研磨混匀，再加入氯仿-甲醇溶液重复抽提至藻体发白，离心收集有机相即得油脂；其中石英砂的质量为干藻粉质量的2倍。
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