CN108913635A - 一种生产甘油葡萄糖苷过程中恢复蛋白质含量的方法 - Google Patents

一种生产甘油葡萄糖苷过程中恢复蛋白质含量的方法 Download PDF

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吕雪峰
吴怀之
张凯
刘祥
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Abstract

本发明公开了一种生产甘油葡萄糖苷过程中恢复蛋白质含量的方法，该方法包括以下步骤：该方法包括以下步骤：获得培养后的藻细胞阶段；以及包括：GG拔高阶段一：该阶段中的培养基中含有能够改变细胞渗透压的物质，该物质在培养基中的浓度为300＜C1≤800mmol/L；和/或者，GG拔高阶段二：该阶段中的培养基中含有能够改变细胞渗透压的物质，该物质在培养基中的浓度为800＜C2≤1500mmol/L；在以上任一阶段的培养过程中，每3‑5天向培养基中补加20％‑50％的氮源。采用该工艺不仅能够获取较高产量的甘油葡萄糖苷，而且最终收获的藻粉的蛋白质含量大于60％(w/w)，满足国家标准≥55％的要求。

Description

一种生产甘油葡萄糖苷过程中恢复蛋白质含量的方法
技术领域
本发明涉及一种生产甘油葡萄糖苷过程中恢复蛋白质含量的方法，属于微藻细胞养殖技术领域。
背景技术
螺旋藻(Spirulina)又名蓝藻，具有减轻癌症放疗、化疗的毒副反应、提高免疫功能，降低血脂等功效，它富含丰富的维生素、蛋白质、不饱和脂肪酸、微量元素，尤其它含有的蛋白质是螺旋藻的主要营养物质。目前螺旋藻已成为食品界备受关注的蛋白质源，认为螺旋藻是最具有潜力生产单细胞蛋白质的藻类。
近几十年来，国内外对螺旋藻藻细胞蛋白质分离、提取和应用研究，或将藻蛋白质酶解成多肽用于保健品和食品添加。一般文献报道，藻细胞蛋白质含量60～70％左右，然而在企业规模化生产大部分产品的蛋白质含量为50-60％，另外，本申请发明人发现在制备生产GG时蛋白质的含量会很低。蛋白质含量是藻产品重要指标之一，食品藻粉国家标准蛋白质含量≥55％。可见，提高藻蛋白质含量对提高藻产品的质量、开发新产品和藻蛋白资源的利用具有重要意义。
目前在单纯生产螺旋藻藻蛋白时，提高藻细胞蛋白质含量的研究比较多，比如李博生等人研究的促进螺旋藻细胞积累蛋白质的方法，陈填烽等人对分次加硒法培养高富硒量螺旋藻及其对藻体蛋白质含量影响的研究，而对于在生产甘油葡萄糖苷(GG)时，提高蛋白质的含量的研究较少，并且两者同时提高具有一定的难度。
因此，目前迫切需要寻找合适的养殖方法使在生产GG时恢复蛋白质的含量，以满足获得甘油葡萄糖苷藻细胞养殖的产业化应用以及满足国家标准蛋白质含量≥55％的要求。
发明内容
针对以上现有技术，本发明人在研究螺旋藻生产GG的过程中，发现藻细胞中的蛋白质的含量下降非常明显，仅为40％左右，远低于蛋白质含量≥55％的国家标准，即常规工艺生产GG后获得的螺旋藻藻粉不能够用于商品销售，只能成为生产甘油葡萄糖苷的副产品。本发明是基于这一发现，才提出本发明的一种生产甘油葡萄糖苷过程中恢复蛋白质含量的方法，为此，本发明人在不影响藻细胞生长和甘油葡萄糖苷合成的前提下，通过改进培养工艺，将藻粉的蛋白质的含量提高，使其满足国家标准≥55％的要求，使得该工艺条件下获得的藻粉及GG均可作为产品进行销售。
基于此，本发明具体采用以下技术方案：
在本发明的第一个方面，提供一种生产甘油葡萄糖苷过程中恢复蛋白质含量的方法，该方法包括以下步骤：
获得培养后的藻细胞阶段；以及包括：
GG拔高阶段一：该阶段中的培养基中含有能够改变细胞渗透压的物质，该物质在培养基中的浓度为300＜C1≤800mmol/L；和/或者，
GG拔高阶段二：该阶段中的培养基中含有能够改变细胞渗透压的物质，该物质在培养基中的浓度为800＜C2≤1500mmol/L；
在以上任一阶段的培养过程中，每3-5天向培养基中补加20％-50％的氮源。
进一步的，在所述获得培养后的藻细胞阶段的步骤后，还包括GG生成阶段：该阶段中的培养基中含有能改变细胞渗透压的物质，该物质在培养基中的浓度为100～300mmol/L。
在本发明的第二个方面，提供一种甘油葡萄糖苷和藻蛋白的制备方法，该方法包括上述生产甘油葡萄糖苷过程中恢复蛋白质含量的方法的步骤。
在本发明的第三个方面，还保护采用上述方法制备得到的甘油葡萄糖苷和/或蛋白质产品。
与现有技术相比，本发明的技术方案的有益效果是：
(1)本发明首次提出了在螺旋藻生产GG的过程中，藻蛋白含量下降明显的技术问题，并针该技术问题提供了一种大规模培养藻细胞合成甘油葡萄糖苷过程中恢复藻细胞蛋白质含量的工艺。采用该工艺不仅能够获取较高产量的甘油葡萄糖苷，而且最终收获的藻粉的蛋白质含量大于60％(w/w)，满足国家标准≥55％的要求。
(2)本发明通过逐级调控培养，能够获得较高含量GG的藻细胞，在GG和蛋白质拔高阶段一后达到GG含量15％(w/w)以上，在GG和蛋白质拔高阶段二后达到GG含量30％以上，能够实现GG大规模的工业生产。
(3)本发明通过特定培养条件的四个阶段可以获得高含量GG的藻细胞，降低GG的分离提取成本。
具体实施方式
应该指出，以下详细说明都是示例性的，旨在对本发明提供进一步的说明。除非另有指明，本文使用的所有技术和科学术语具有与本发明所属技术领域的普通技术人员通常理解的相同含义。
需要注意的是，这里所使用的术语仅是为了描述具体实施方式，而非意图限制根据本发明的示例性实施方式。如在这里所使用的，除非上下文另外明确指出，否则单数形式也意图包括复数形式，此外，还应当理解的是，当在本说明书中使用术语“包含”和/或“包括”时，其指明存在特征、步骤、操作和/或它们的组合。
术语解释：
微藻：一般是指那些在显微镜下才能辨别形态微小的藻类。
正如背景技术所介绍的，现有技术中藻细胞的养殖工艺存在一定的不足，使得在生产GG的过程中损失大量的微藻蛋白质，无法满足国家标准蛋白质含量≥55％的要求，为了解决如上的技术问题，本发明提出了一种生产甘油葡萄糖苷过程中恢复蛋白质含量的方法，该方法包括以下步骤：
获得培养后的藻细胞阶段；以及包括：
GG拔高阶段一：该阶段中的培养基中含有能够改变细胞渗透压的物质，该物质在培养基中的浓度为300＜C1≤800mmol/L；和/或者，
GG拔高阶段二：该阶段中的培养基中含有能够改变细胞渗透压的物质，该物质在培养基中的浓度为800＜C2≤1500mmol/L；
在以上任一阶段的培养过程中，每3-5天向培养基中补加20％-50％的氮源(即加入原培养基氮源总质量的20～50％)。氮源包括但不限于尿素、碳酸氢铵、硝酸钠、磷酸一铵、磷酸二铵、硝酸铵的一种或多种。使用该方法收获的藻粉蛋白质含量均大于60％，且不影响螺旋藻的生长和GG的合成。
在本发明中，所述藻细胞的种类为绿藻、硅藻、红球藻、杜氏藻、小球藻或螺旋藻等，种类不受限制。在本发明的最优选的具体实施方式中，所述藻细胞的种类为螺旋藻。
作为一种可选的实施方式，在所述获得培养后的藻细胞阶段的步骤后，还包括GG生成阶段：该阶段中的培养基中含有能改变细胞渗透压的物质，该物质在培养基中的浓度为100～300mmol/L。
在本发明较优选的实施方式中，提供了一种生产甘油葡萄糖苷过程中恢复蛋白质含量的方法，该方法包括以下步骤：
获得培养后的藻细胞阶段；
GG拔高阶段一：将上述阶段中的藻细胞接种至含有能够改变细胞渗透压的物质的培养基中进行培养，其中，该物质在培养基中的浓度为300＜C1≤800mmol/L；
GG拔高阶段二：将GG拔高阶段一中的藻细胞接种至含有能够改变细胞渗透压的物质的培养基中进行培养，其中，该物质在培养基中的浓度为800＜C2≤1500mmol/L；
在以上任一阶段的培养过程中，每3-5天向培养基中补加20％-50％的氮源。
在本发明最优选的实施方式中，提供了一种生产甘油葡萄糖苷过程中恢复蛋白质含量的方法，该方法包括以下步骤：
获得培养后的藻细胞阶段；
GG生成阶段：将上述阶段中的藻细胞接种至含有能够改变细胞渗透压的物质的培养基中进行培养，其中，该物质在培养基中的浓度为100～300mmol/L；
GG拔高阶段一：将GG生成阶段中的藻细胞接种至含有能够改变细胞渗透压的物质的培养基中进行培养，其中，该物质在培养基中的浓度为300＜C1≤800mmol/L；
GG拔高阶段二：将GG拔高阶段一中的藻细胞接种至含有能够改变细胞渗透压的物质的培养基中进行培养，其中，该物质在培养基中的浓度为800＜C2≤1500mmol/L；
在以上任一阶段的培养过程中，每3-5天向培养基中补加20％-50％的氮源。
在本发明较优选的实施方式中，在最后一个阶段的培养过程中，每3-5天向培养基中补加20％-50％的氮源。
在本发明最优选的实施方式中，在全部阶段的培养过程中，每3-5天向培养基中补加20％-50％的氮源。
在本发明中，所述能够改变细胞渗透压的物质为无机盐和/或有机盐的一种或多种组合。
优选的，所述无机盐为氯化钠、硫酸钠、氯化钾或其他无机盐类中的一种或多种；所述有机盐为甲酸钠、乙酸铵或其他有机盐类中的一种或多种。
在本发明中，各培养阶段的光照采用自然光或变光均可，为使培养效果最优，在本发明优选的实施方式中，各培养阶段的光照光波长范围均为400～700nm。
在最优选的实施方式中，GG生成阶段、GG拔高阶段一和GG拔高阶段二是诱导GG、积累GG以及不让已经合成的GG受其他环境条件影响被消费掉的过程，是分三步逐级提高GG含量的过程。
在获得培养后的藻细胞阶段中：
获得培养后的藻细胞有多种途径或方法，在此并没有特别的限定，但为了能够快速有效的制造大量的藻细胞，本发明提出一种优选的藻种养殖方法，该方法包括：将藻细胞接种于低盐的淡水培养基中进行培养，其中盐浓度小于100mmol/L。
优选的，该阶段的培养时间为3-20天。
优选的，该阶段的培养温度为：15-40℃，进一步优选的，该阶段的培养温度为20-40℃。
优选的，所述低盐的淡水培养基中含有氮、磷、铁、镁、钠、钾以及微藻成长所需要的微量元素。
优选的，所述低盐的淡水培养基的配方为Zarrouk培养基，详细成分见表1和表2。该低盐的淡水培养基能够使得藻细胞大量的繁殖，为大量合成和积累GG作基础。
表1 Z氏培养基配方
表2母液配方
该阶段中选取了适宜波长的光照和碳源，以供光合作用。
对于碳源，在自养条件下选用含有二氧化碳的混合空气，二氧化碳浓度为10％(v/v)以内，优选的，二氧化碳的浓度为1～5％(v/v)，或者选用无机碳酸盐，或者同时选用含有二氧化碳的混合空气与无机碳酸盐；在异养条件下，在低盐的淡水培养基中额外加入葡萄糖、麦芽糖、甘油、醋酸等。
在GG生成阶段中：
藻细胞选用上述获得培养后的藻细胞阶段培养后成长起来的细胞，在正常的情况下，在接入GG生成阶段的培养基之前细胞内部是不含有GG组分，或者即使含有也是很少的。
作为细胞培养使用的培养基具有既要保证藻细胞的成长同时，又要让藻细胞内合成GG，除了获得培养后的藻细胞阶段中所述微藻成长所需的营养元素以外，还需要增加对细胞形成胁迫条件，诱导GG合成反应的物质，通常是选用能够改变细胞渗透压的物质，比如加入100～300mmol/L浓度的能够改变细胞渗透压的物质，该物质可以是氯化钠，或者氯化钾等，也不限于前述物质，只要能够诱导GG合成反应都可以。
光源条件除了前述的光合成所需要的波长范围的光能以外，虽然连续光照也能够促进GG的积累，但是与连续光照相比，间歇光照更能促进GG的积累，温度差也更能促进GG的积累。在间歇光照的暗反应过程中，通入的二氧化碳混合气中降低氧气浓度更能促进GG的积累。
基于此，对该阶段的培养条件进行优化，以期获得含有GG的藻细胞，为拔高阶段提供良好基础。
优选的，该阶段的培养时间为3-20天，进一步优选的，该阶段的培养时间为5-10天。
优选的，培养温度为：15-40℃，进一步优选的，培养温度为20-40℃。
优选的，此阶段选择间歇光照，光暗比为1:1，光暗时长分别为6-18h和6-18h，光强500-3000μE·m-2·s-2。
进一步优选的，在间歇光照的暗反应过程中，将氧气浓度降低至1～2％(v/v)，经过大量实验验证，在间歇光照的暗反应过程中，通入的二氧化碳混合气中降低氧气浓度更能促进GG的积累。
在GG拔高阶段一中：
在最优选的实施方式中，藻细胞特征是经过GG生成阶段培养后已经含有一定量的GG。在GG生成阶段中长时间持续培养，细胞会分泌一些对细胞成长起到阻碍作用的物质，从而导致细胞代谢活性降低，细胞内的GG合成能力下降。而将经过培养后含有一定量GG的细胞接入GG拔高阶段一的培养基后，细胞能够恢复活性继续成长，为GG合成反应提供驱动力，提高了GG累积的效率。
GG拔高阶段一的培养基条件，基本上与GG生成阶段相同，作为细胞培养使用的培养基具有既要保证藻细胞的成长同时，又要让藻细胞内合成GG。除了微藻成长所需的营养元素以外，需要增加对细胞形成胁迫条件，诱导GG合成反应的物质，这种GG诱导物质的添加量至少要维持与GG生成阶段相同，增大GG诱导物质添加量更有效的促进GG的合成反应，比如加入300＜C1≤800mmol/L浓度的氯化钠，或者氯化钾等，也不限于前述物质，只要能够诱导GG合成反应都可以。
光源条件除了前述的光合成所需要的波长范围的光能以外，虽然连续光照也能够促进GG的积累，但是与连续光照相比，间歇光照更能促进GG的积累，温度差也更能促进GG的积累。在间歇光照的暗反应过程中，通入的二氧化碳混合气中降低氧气浓度更能促进GG的积累。
基于此，对GG拔高阶段一的培养条件进行优化，以期获得较高含量GG的藻细胞。
优选的，培养时间为大于2天，优选时间为3-5天。
优选的，培养温度为：15-40℃；进一步优选的，黑暗期间温度设置15-25℃，光照期间温度设置25-40℃。
优选的，此阶段选择间歇光照，光暗比为1:1，光暗时长分别为6-18h和6-18h，光强500-3000μE·m-2·s-2。
进一步优选的，在间歇光照的暗反应过程中，将氧气浓度降低至1～2％(v/v)，经过大量实验验证，在间歇光照的暗反应过程中，通入的混合气既能降低氧气浓度又能促进GG的积累。
在最优选的实施方式中，通过GG拔高阶段一培养后，可以获得GG含量10％(w/w)以上的藻细胞。
在GG拔高阶段二中：
对于自养型微藻，选用与GG拔高阶段一相同培养条件，区别是能够改变细胞渗透压的物质在培养基中的浓度为800＜C2≤1500mmol/L。
对于异养型微藻或者经过基因工程技术改造后提高细胞壁的小分子透过性的微藻细胞，在本培养基内除了使能够改变细胞渗透压的物质浓度为800＜C2≤1500以外，还需添加合成GG的反应底物，比如甘油或者可以利用的糖，比如葡萄糖、麦芽糖，但不限于上述两种糖，可以进一步提高微藻细胞的GG含量。优选的，所述甘油或者葡萄糖，通过流加等方式维持甘油的浓度0.5-2g/L，葡萄糖的浓度为0.5-5g/L。
优选的，培养时间为大于2天，优选时间为3-5天。
本发明中的各个步骤所使用的反应器不限，可以是密闭式反应器，也可以是开放式跑道池。对于异养型微藻细胞，用封闭式反应器更有效的防止杂菌污染。
在本发明的具体实施例中采用下述方法进行检测藻细胞内GG含量，该方法包括提取方法和检测方法：
其中，提取方法包括以下步骤：
(1)取2mL藻液，10,000rpm/min离心30min，将沉淀与上清液分开。
(2)向细胞沉淀加入200μL水混匀，随后加入800μL无水乙醇再次混匀，65℃水浴4h。
(3)10,000rpm/min离心10min，弃沉淀，上清用N2吹干，加入合适的ddH2O稀释后测定。
GG检测方法包括以下步骤：
(1)将样品进行适当的稀释。
(2)稀释液使用0.22μm的滤器进行过滤获得离子色谱检测前样品。
(3)使用离子色谱ICS-5000+(Thermo Fisher)进行样品测定，检测器为配套的电化学检测器，柱子为内径4×250mm的DinexTM CarboPacTM PA10色谱柱。使用前柱子用25mMNaOH在1.0mL/min条件下平衡，待电化学检测器的基线稳定后开始样品测定。
为了使得本领域技术人员能够更加清楚地了解本发明的技术方案，以下将结合具体的实施例详细说明本发明的技术方案。
实施例1
一种生产甘油葡萄糖苷过程中恢复蛋白质含量的方法，该方法具体包括以下步骤：
(1)获得培养后的藻细胞阶段：
将该藻细胞接种于低盐的淡水培养基Zarrouk培养基(详见表1和表2)中，初始接种浓度为0.2g/L，控制培养该藻细胞的淡水培养基的温度程序为：恒温25℃，光照程序为：持续光照，光照强度为500μE·m-2·s-2，光波长范围为400～700nm，通气量为：0.3VVM，所通入的气体为含有二氧化碳的混合空气，二氧化碳浓度为5％(v/v)。
此阶段的培养时间为5-7天。
(2)GG拔高阶段：
藻细胞选用上述步骤(1)培养后成长起来的细胞，控制培养该藻细胞的淡水培养基的温度程序为：光照时温度32℃，黑暗时温度22℃，光照程序为：光暗比为1:1，光暗时长分别为12小时和12小时，光强1000μE·m-2·s-2，光波长范围为400～700nm，通气量为：0.3VVM，所通入的气体为含有二氧化碳的混合空气，二氧化碳浓度为5％(v/v)。
其中，所述淡水培养基为步骤(1)中的淡水培养基中加入氯化钠，使其在淡水培养基中的浓度为400mmol/L。
此阶段的培养时间为3-5天。
在以上培养过程中的拔高阶段一中开始的第3天在培养基中补加20％的氮源，氮源是尿素。
通过以上两个步骤的培养后，经检测，可以获得GG含量17％和蛋白质含量61％(w/w)以上的藻细胞。
实施例2
一种生产甘油葡萄糖苷过程中恢复蛋白质含量的方法，该方法包括以下步骤：
(1)获得培养后的藻细胞阶段：
将该藻细胞接种于低盐的淡水培养基Zarrouk培养基(详见表1和表2)中，初始接种浓度为0.2g/L，控制培养该藻细胞的淡水培养基的温度程序为：恒温25℃，光照程序为：持续光照，光照强度为500μE·m-2·s-2，光波长范围为400～700nm，通气量为：0.3VVM，所通入的气体为含有二氧化碳的混合空气，二氧化碳浓度为5％(v/v)。
此阶段的培养时间为5-7天。
(2)GG拔高阶段：
藻细胞选用上述步骤(1)培养后成长起来的细胞，控制培养该藻细胞的淡水培养基的温度程序为：光照时温度32℃，黑暗时温度22℃，光照程序为：光暗比为1:1，光暗时长分别为12小时和12小时，光强1000μE·m-2·s-2，光波长范围为400～700nm，通气量为：0.3VVM，所通入的气体为含有二氧化碳的混合空气，二氧化碳浓度为5％(v/v)。
其中，所述淡水培养基为步骤(1)中的淡水培养基中加入氯化钠，使其在淡水培养基中的浓度为900mmol/L。
此阶段的培养时间为3-5天。
在以上培养的整个过程中每4天在培养基中补加20％的氮源，氮源是碳酸氢铵和硝酸钠。
通过以上两个步骤的培养后，经检测，可以获得GG含量31％和蛋白质含量61％(w/w)以上的藻细胞。
实施例3
一种生产甘油葡萄糖苷过程中恢复蛋白质含量的方法，该方法包括以下步骤：
(1)获得培养后的藻细胞阶段：
将该藻细胞接种于低盐的淡水培养基Zarrouk培养基(详见表1和表2)中，初始接种浓度为0.2g/L，控制培养该藻细胞的淡水培养基的温度程序为：恒温25℃，光照程序为：持续光照，光照强度为500μE·m-2·s-2，光波长范围为400～700nm，通气量为：0.3VVM，所通入的气体为含有二氧化碳的混合空气，二氧化碳浓度为5％(v/v)。
此阶段的培养时间为5-7天。
其中，所述淡水培养基的具体配方为Zarrouk培养基(详见表1和表2)。
(2)GG拔高阶段一：
藻细胞选用上述步骤(1)培养后成长起来的细胞，控制培养该藻细胞的淡水培养基的温度程序为：光照时温度32℃，黑暗时温度22℃，光照程序为：光暗比为1:1，光暗时长分别为12小时和12小时，光强1000μE·m-2·s-2，光波长范围为400～700nm，通气量为：0.3VVM，所通入的气体为含有二氧化碳的混合空气，二氧化碳浓度为5％(v/v)。
其中，所述淡水培养基为步骤(1)中的淡水培养基中加入氯化钠，使其在淡水培养基中的浓度为400mmol/L。
此阶段的培养时间为5-7天。
(3)GG拔高阶段二：
藻细胞选用上述步骤(2)培养后成长起来的细胞，此阶段的培养条件与步骤(2)的基本相同，区别在于：水培养基为步骤(2)中的淡水培养基中继续加入氯化钠，使其在淡水培养基中的浓度为900mmol/L。
此阶段的培养时间为5天。
在以上培养的整个过程中每5天在培养基中补加40％的氮源，氮源是磷酸二铵。
通过以上三个步骤的培养后，经检测，可以获得GG含量30％和蛋白质含量61％(w/w)以上的藻细胞。
实施例4
一种生产甘油葡萄糖苷过程中恢复蛋白质含量的方法，该方法包括以下步骤：
(1)获得培养后的藻细胞阶段：
将该藻细胞接种于低盐的淡水培养基Zarrouk培养基(详见表1和表2)中，初始接种浓度为0.2g/L，控制培养该藻细胞的淡水培养基的温度程序为：恒温25℃，光照程序为：持续光照，光照强度为500μE·m-2·s-2，光波长范围为400～700nm，通气量为：0.3VVM，所通入的气体为含有二氧化碳的混合空气，二氧化碳浓度为5％(v/v)。
此阶段的培养时间为5-7天。
其中，所述淡水培养基的具体配方为Zarrouk培养基(详见表1和表2)。(2)GG生成阶段：
藻细胞选用上述步骤(1)培养后成长起来的细胞，控制培养该藻细胞的淡水培养基的温度程序为：光照时温度32℃，黑暗时温度22℃，光照程序为：光暗比为1:1，光暗时长分别为12小时和12小时，光强1000μE·m-2·s-2，光波长范围为400～700nm，通气量为：0.3VVM，所通入的气体为含有二氧化碳的混合空气，二氧化碳浓度为5％(v/v)。
其中，所述淡水培养基为步骤(1)中的淡水培养基中加入氯化钠，使其在淡水培养基中的浓度为200mmol/L。
此阶段的培养时间为5-7天。
(3)GG拔高阶段一：
该阶段的藻细胞特征是经过步骤(2)培养后已经含有一定量的GG，此阶段的培养条件与步骤(2)的基本相同，区别在于：淡水培养基为步骤(2)中的淡水培养基中继续加入氯化钠，使其在淡水培养基中的浓度为400mmol/L。
此阶段的培养时间为3-5天。
通过步骤(3)培养后，经检测，可以获得GG含量11％(w/w)以上的藻细胞。
(4)GG拔高阶段二：
对于自养型微藻-螺旋藻，选用与步骤(3)相同培养条件，区别在于：将步骤(3)获得的微藻细胞接入步骤(4)的新鲜培养基，所述新鲜培养基为含900mmol/L氯化钠的Zarrouk培养基。
此阶段的培养时间为5天。
在以上培养过程中的整个过程每5天在培养基中补加20％的氮源，氮源是碳酸氢铵和硝酸钠。
通过以上四个步骤的培养后，经检测，可以获得GG含量32％和蛋白质含量64％(w/w)以上的藻细胞。
实施例5
一种生产甘油葡萄糖苷过程中恢复蛋白质含量的方法，该方法包括以下步骤：
(1)获得培养后的藻细胞阶段：
将该藻细胞接种于淡水培养基中，初始接种浓度为0.15g/L，控制培养该藻细胞的淡水培养基的温度程序为：恒温28℃，光照程序为：持续光照，光照强度为200μE·m-2·s-2，光波长范围为400～700nm，通气量为：0.2VVM，所通入的气体为含有二氧化碳的混合空气，二氧化碳浓度为2％(v/v)，以及向培养基中加入100mmol NaHCO3。
此阶段的培养时间为3-5天。
其中，所述淡水培养基的具体配方为：Zarrouk培养基。
(2)GG生成阶段：
藻细胞选用上述步骤(1)培养后成长起来的细胞，控制培养该藻细胞的淡水培养基的温度程序为：光照时温度32℃，黑暗时温度23℃，光照程序为：光暗比为1:1，光暗时长分别为12小时和12小时，光强300μE·m-2·s-2，光波长范围为400～700nm，通气量为：0.2VVM，所通入的气体为含有二氧化碳的混合空气，二氧化碳浓度为5％(v/v)。
其中，所述淡水培养基为步骤(1)中的淡水培养基中加入氯化钠，使其在淡水培养基中的浓度为150mmol/L。
此阶段的培养时间为3-5天。
(3)GG拔高阶段一：
该阶段的藻细胞特征是经过步骤(2)培养后已经含有一定量的GG，此阶段的培养条件与步骤(2)的基本相同，区别在于：淡水培养基为步骤(2)中的淡水培养基中继续加入氯化钠，使其在淡水培养基中的浓度为500mmol/L。
此阶段的培养时间为3天。
通过步骤(3)培养后，经检测，可以获得GG含量10％(w/w)以上的藻细胞。
(4)GG拔高阶段二：
对于自养型微藻-螺旋藻，选用与步骤(3)相同培养条件，区别在于：将步骤(3)获得的微藻细胞接入步骤(4)的新鲜培养基，所述新鲜培养基为含有900mmol氯化钠的Zarrouk培养基。
此阶段的培养时间为3天。
在以上培养过程中GG拔高阶段一开始每4天在培养基中补加20％的氮源，氮源是磷酸二铵。
通过以上四个步骤的培养后，经检测，可以获得GG含量31％和蛋白质含量63％(w/w)以上的藻细胞。
实施6
一种生产甘油葡萄糖苷过程中恢复蛋白质含量的方法，该方法包括以下步骤：
(1)获得培养后的藻细胞阶段：
将该藻细胞接种于淡水培养基中，初始接种浓度为0.1g/L，控制培养该藻细胞的淡水培养基的温度程序为：恒温30℃，光照程序为：持续光照，光照强度为200μE·m-2·s-2，光波长范围为400～700nm，通气量为：0.2VVM，所通入的气体为含有二氧化碳的混合空气，二氧化碳浓度为2％(v/v)。
此阶段的培养时间为5-7天。
其中，所述淡水培养基的具体配方为：Zarrouk培养基。
(2)GG生成阶段：
藻细胞选用上述步骤(1)培养后成长起来的细胞，控制培养该藻细胞的淡水培养基的温度程序为：光照时温度32℃，黑暗时温度25℃，光照程序为：光暗比为1:1，光暗时长分别为12小时和12小时，光强250μE·m-2·s-2，光波长范围为400～700nm，通气量为：0.2VVM，所通入的气体为含有二氧化碳的混合空气，二氧化碳浓度为5％(v/v)。
其中，所述淡水培养基为步骤(1)中的淡水培养基中加入氯化钠，使其在淡水培养基中的浓度为200mmol/L。
此阶段的培养时间为3-5天。
(3)GG拔高阶段一：
该阶段的藻细胞特征是经过步骤(2)培养后已经含有一定量的GG，此阶段的培养条件与步骤(2)的基本相同，区别在于：淡水培养基为步骤(2)中的淡水培养基中继续加入氯化钠，使其在淡水培养基中的浓度为500mmol/L。
此阶段的培养时间为3天。
通过步骤(3)培养后，经检测，可以获得GG含量10％(w/w)以上的藻细胞。
(4)GG拔高阶段二：
对于自养型微藻-螺旋藻，选用与步骤(3)相同培养条件，区别在于：将步骤(3)获得的微藻细胞接入步骤(4)的新鲜培养基，所述新鲜培养基为含950mmol/L氯化钠的Zarrouk培养基。
此阶段的培养时间为3-5天。
在以上培养过程中的拔高阶段二培养的第4天在培养基中补加50％的氮源，氮源是磷酸二铵。
通过以上四个步骤的培养后，经检测，可以获得GG含量33％和蛋白质含量60.5％(w/w)以上的藻细胞。
上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。

Claims (10)

1.一种生产甘油葡萄糖苷过程中恢复蛋白质含量的方法，其特征是，该方法包括以下步骤：
获得培养后的藻细胞阶段；以及包括：
GG拔高阶段一：该阶段中的培养基中含有能够改变细胞渗透压的物质，该物质在培养基中的浓度为300＜C1≤800mmol/L；和/或者，
GG拔高阶段二：该阶段中的培养基中含有能够改变细胞渗透压的物质，该物质在培养基中的浓度为800＜C2≤1500mmol/L；
在以上任一阶段的培养过程中，每3-5天向培养基中补加20％-50％的氮源。
2.如权利要求1所述的方法，其特征是：在所述获得培养后的藻细胞阶段的步骤后，还包括GG生成阶段：该阶段中的培养基中含有能改变细胞渗透压的物质，该物质在培养基中的浓度为100～300mmol/L。
3.如权利要求1或2所述的方法，其特征是：在最后一个阶段的培养过程中，每3-5天向培养基中补加20％-50％的氮源。
4.如权利要求1或2所述的方法，其特征是：在全部阶段的培养过程中，每3-5天向培养基中补加20％-50％的氮源。
5.如权利要求1所述的方法，其特征是：所述能够改变细胞渗透压的物质为无机盐和/或有机盐的一种或多种组合；
优选的，所述无机盐为氯化钠、硫酸钠、氯化钾、碳酸氢钠、碳酸钠或其他无机盐类中的一种或多种；所述有机盐为甲酸钠、乙酸铵或其他有机盐类中的一种或多种；
优选的，各培养阶段的光照光波长范围均为400～700nm。
6.如权利要求1所述的方法，其特征是：所述获得培养后的藻细胞阶段中，
培养时间为3-20天；
优选的，对于碳源，在自养条件下选用含有二氧化碳的混合空气，二氧化碳浓度为10％(v/v)以内，优选的，二氧化碳的浓度为1～5％(v/v)，或者选用无机碳酸盐，或者同时选用含有二氧化碳的混合空气与无机碳酸盐；在异养条件下，选用葡萄糖、麦芽糖、甘油和醋酸中的一种或两种。
7.如权利要求1所述的方法，其特征是：所述GG拔高阶段一中，
培养时间为3-20天；
优选的，培养温度为：20-40℃；
优选的，此阶段选择间歇光照，光照时间6-18小时，黑暗时间6-18小时，光强500-3000μE·m-2·s-2；
优选的，在间歇光照的暗反应过程中，将氧气浓度降低至1～2％(v/v)；
所述GG拔高阶段二中，
优选的，培养时间为大于2天；
进一步优选的，培养时间为3-5天；
优选的，此阶段选择间歇光照，光照时间6-18小时，黑暗时间6-18小时，光强500-3000μE·m-2·s-2；
优选的，在间歇光照的暗反应过程中，将氧气浓度降低至1～2％(v/v)。
8.如权利要求1所述的方法，其特征是：在GG生成阶段中，
培养时间为3-20天；
优选的，培养温度为：20-40℃；
优选的，此阶段选择间歇光照，光照时间6-18小时，黑暗时间6-18小时，光强500-3000μE·m-2·s-2；
优选的，在间歇光照的暗反应过程中，将氧气浓度降低至1～2％(v/v)。
9.一种甘油葡萄糖苷和藻蛋白的制备方法，该方法包括权利要求1～8中任一项所述的生产甘油葡萄糖苷过程中恢复蛋白质含量的方法的步骤。
10.采用权利要求9所述的方法制备得到的甘油葡萄糖苷和/或蛋白质产品。
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