JP2018529343A

JP2018529343A - 単細胞紅藻類を培養するための新規な方法

Info

Publication number: JP2018529343A
Application number: JP2018515303A
Authority: JP
Inventors: カニャク、オリヴィエ; リシャール、ラニグ; ラブロ、ジュリー
Original assignee: フェルメンタル
Priority date: 2015-09-25
Filing date: 2016-09-22
Publication date: 2018-10-11
Also published as: CN116349890A; RU2018112989A3; CN108431202B; WO2017050917A1; JP2018527940A; RU2739847C2; WO2017050918A1; RU2018112989A; FR3041505A1; JP6976933B2; BR112018005928A2; JP2021176341A; FR3041653B1; US20180274002A1; EP3353282A1; JP2024010035A; JP7469269B2; CN108431202A; US11162126B2; MX2018003696A

Abstract

本発明は、藻類、特に、単細胞紅藻類（ＵＲＡ）を培養する分野に関する。本発明は、特に、光照射および栄養素に関する特定の培養条件により特徴付けられ、タンパク質を豊富に含むバイオマスを産生可能な、単細胞紅藻類を培養するための方法であって、前記バイオマスが、ＵＲＡを多く含有することができ、さらに色素、とりわけフィコシアニンに加えて、カロテノイド：β−カロテンおよびゼアキサンチンを産生することができる方法に関する。本発明はまた、本発明の方法を用いて産生することができるバイオマス、当該バイオマスの使用、および当該バイオマスを含むことができる製品に関する。

Description

本発明は、単細胞紅藻類（ＵＲＡ）を培養する分野に関する。

本発明は、特に、光照射および栄養素の点において特定の培養条件により、従来の培養条件下で得ることができる量よりも多くのＵＲＡからなるバイオマスであって、多量の抗酸化物質を含むとともに、多量のフィコビリタンパク質、とりわけフィコシアニンを少なくとも含み得るバイオマスを得ることができることを特徴とする、ＵＲＡを培養するための方法に関する。

本発明はまた、本発明の方法によって得ることができるバイオマス、当該バイオマスの使用、および当該バイオマスを含むことができる製品に関する。

ある種の単細胞紅藻類（ＵＲＡ）は、タンパク質（特に、フィコビリタンパク質）源、繊維源、脂質源および抗酸化物質（特に、カロテノイド）源となり得るため、補助食料源として有用なものとなり得る。ＵＲＡは、天然の状態、有利には乾燥させた状態て使用することができるだけでなく、加工された状態、例えば、粉状化した粉末の状態で使用することもできる。

ＵＲＡは、ヒトおよび動物の食事において栄養補助物質として使用されてもよく、または食品に少量組み込まれてもよい。

紅藻類（ｒｅｄａｌｇａｅ）または紅色植物（ｒｈｏｄｏｐｈｙｔｅ）（紅色植物門（Ｒｈｏｄｏｐｈｙｔａ））は、その大部分が海生生物であり、さらにその大部分が多細胞藻類である大きな生物群である。紅藻類は、唯一種類のクロロフィル、すなわちクロロフィル「ａ」、カロテノイド、および特徴的な色素であるフィコビリタンパク質を有する色素組成により特徴付けられる。

紅色植物の中には、イデユコゴメ（Ｃｙａｎｉｄｉｏｐｈｙｔｉｎａ）亜門であり、酸性の温泉に生育するＵＲＡが存在する。

イデユコゴメ（Ｃｙａｎｉｄｉｏｐｈｙｔｉｎａ）亜門は、イデユコゴメ（Ｃｙａｎｉｄｉｏｐｈｙｃｅａｅ）綱を含み、イデユコゴメ（Ｃｙａｎｉｄｉｏｐｈｙｃｅａｅ）綱自身は、イデユコゴメ（Ｃｙａｎｉｄｉａｌｅｓ）目を含み、イデユコゴメ（Ｃｙａｎｉｄｉａｌｅｓ）目自身は、イデユコゴメ（Ｃｙａｎｉｄｉａｃｅａｅ）科およびガルディエリア（Ｇａｌｄｉｅｒｉａｃｅａｅ）科を含み、これらの科自身は、シアニディオシゾン（Ｃｙａｎｉｄｉｏｓｃｈｙｚｏｎ）属、シアニジウム（Ｃｙａｎｉｄｉｕｍ）属およびガルディエリア（Ｇａｌｄｉｅｒｉａ）属に細分化され、これらのメンバーは、Ｃｙａｎｉｄｉｏｓｃｈｙｚｏｎｍｅｒｏｌａｅ１０Ｄ種、ＣｙａｎｉｄｉｏｓｃｈｙｚｏｎｍｅｒｏｌａｅＤＢＶ２０１種、Ｃｙａｎｉｄｉｕｍｃａｌｄａｒｉｕｍ種、Ｃｙａｎｉｄｉｕｍｄａｅｄａｌｕｍ種、Ｃｙａｎｉｄｉｕｍｍａｘｉｍｕｍ種、Ｃｙａｎｉｄｉｕｍｐａｒｔｉｔｕｍ種、Ｃｙａｎｉｄｉｕｍｒｕｍｐｅｎｓ種、Ｇａｌｄｉｅｒｉａｄａｅｄａｌａ種、Ｇａｌｄｉｅｒｉａｍａｘｉｍａ種、Ｇａｌｄｉｅｒｉａｐａｒｔｉｔａ種およびＧａｌｄｉｅｒｉａｓｕｌｐｈｕｒａｒｉａ種を含む。

フィコビリタンパク質は、フィコビリソーム中に見出される水溶性色素であり、シアノバクテリアおよび特定の微細藻類の中に存在する光合成複合体である。フィコシアニン、フィコエリトリン、アロフィコシアニンの４種類のフィコビリタンパク質が存在する。フィコシアニンは、６１０ｎｍ〜６５５ｎｍの間に吸収ピークを有し、フィコエリトリンは、４００ｎｍ〜６００ｎｍの間に吸収ピークを有し、フィコエリトロシアニンは、約４５０ｎｍ、約５２５ｎｍおよび約５７０ｎｍに吸収ピークを有し、アロフィコシアニンは、実質的に６５０ｎｍを中心とする領域に吸収ピークを有する。

フィコビリタンパク質の世界的な生産量は、実質的には、オープン・レースウェイ・ポンドでスピルリナを培養することによって得られ、１年間に約１５，０００トンに相当する。

スピルリナから抽出されたフィコシアニンは、食品において青色色素として使用するために、液体形態または粉末形態で補助食品としても販売されている。フィコシアニンは、米国ＦＤＡによって承認された唯一の天然青色色素である（ＦＲＤｏｃＮｏ：２０１３−１９５５０）。

スピルリナ培養物は、暑い地理的地域において、空気に開放した状態で、主に成長し、最適な培養温度は３７℃である。したがって、これらの培養は、季節的変動（温度、光）に左右される。スピルリナは、バイオマスの生産性（乾燥バイオマス（ｇ）／Ｌ／ｈ）、および／またはフィコシアニンの生産性（フィコシアニン（ｇ）／Ｌ／ｈ）が低いという欠点があり、これにより、フィコシアニン生産の工業化に必要な発酵槽における培養に移行することができない。

さらに、これらの培養は、ミクロシスチンのような毒素を産生することが知られている、スピルリナと同類のシアノバクテリアの形態によるコンタミネーションの影響も受けやすい［Ｒｅｌｌａｎ，Ｓら、ＦｏｏｄａｎｄＣｈｅｍｉｃａｌＴｏｘｉｃｏｌｏｇｙ４７（２００９）２１８９−２１９５］。ミクロシスチンは、腸の問題を引き起こすことがあり、これらの毒素に長期間晒されると、肝癌を引き起こすことがある。これに加え、特定のスピルリナ株、例えば、Ａｒｔｈｒｏｓｐｉｒａｐｌａｔｅｎｓｉｓは、これ自体が毒素を産生する［Ｒｅｌｌａｎ，Ｓら、前掲］。

Ａｒｔｈｒｏｓｐｉｒａｐｌａｔｅｎｓｉｓ株を用いた、閉じたバイオリアクター内でのスピルリナ純粋培養試験が文献に報告されている［Ｃｈｅｎ，ＦｅｎｇおよびＹｉｍｉｎｇＺｈａｎｇ；ＥｎｚｙｍｅａｎｄＭｉｃｒｏｂｉａｌＴｅｃｈｎｏｌｏｇｙ２０、ｎｏ．３（１９９７年２月１５日）：２２１−２４］。しかし、出願人の知る限りでは、バイオリアクター内でのスピルリナの工業規模の生産は報告されていない。

したがって、低いバイオマス生産性および／またはフィコシアニン生産性に加えて、食品または動物の餌にスピルリナバイオマスを直接使用することを意図した生産の健康上の安全性をどのようにして保証するかは明らかになっておらず、非常に正確な品質管理が必要となることが理解される。

ＵＲＡは、フィコシアニンを産生することが知られており、ＵＲＡの培養およびその色素組成に対する光の影響は多くの実験研究の主題となっている［ＳｌｏｔｈＪＫら、ＥｎｚｙｍｅａｎｄＭｉｃｒｏｂｉａｌＴｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、Ｖｏｌ．２８、ｎｏ．１−２、２００６年１月、１６８−１７５；ＧｒａｖｅｒｈｏｌｔＯＳら、ＡｐｐｌｉｅｄＭｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙａｎｄＢｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、Ｖｏｌ．７７、ｎｏ．１、２００７年９月５日、６９−７５］。ＮｉｃｈｏｌｓＫら［ＢｏｔａｎｉｃａｌＧａｚｅｔｔｅ、Ｖｏｌ．１２４、ｎｏ．２、１９６２年１２月１日、８５−９３］は、培養物に照射するために使用される波長を変えつつ、変異ＵＲＡにおけるフィコシアニン合成に関係があると考えられる細胞の光受容体を調べた。ＳｔｅｉｎｍｕｌｅｒＫら［ＰｌａｎｔＰｈｙｓｉｏｌｏｇｙ、Ｖｏｌ．７６、ｎｏ．４、１９８４年１２月１日、９３５−９３９］は、混合栄養条件でのＵＲＡの培養を調べ、グルコースを添加するとフィコビリタンパク質の合成が阻害され得ることを示した。

したがって、フィコビリタンパク質、特にフィコシアニンの新しい供給源、およびスピルリナ培養の既知の欠点を克服することができる培養方法が必要とされている。

ＵＲＡを培養するための従来技術の方法によって一般的に得られる量と比較してより多い量の藻類を含むＵＲＡのバイオマスを産生することができるとともに、目的の代謝物、特に、フィコビリタンパク質、特に、フィコシアニン、および／または抗酸化物質、例えば、カロテノイドを有利に豊富に含むＵＲＡを培養するための方法を有することが有益であろう。

本発明は、フィコビリタンパク質およびカロテノイドを豊富に含む単細胞紅藻類（ＵＲＡ）を培養するこのような方法を提供することを目的とする。

本発明は、少なくとも１つの炭素源を含む培地中でイデユコゴメ（Ｃｙａｎｉｄｉｏｐｈｙｃｅａｅ）綱の単細胞紅藻類（ＵＲＡ）を培養するための方法であって、当該方法が、４００〜５５０ｎｍの狭い波長スペクトルを有する放射線の形態での少なくとも１つの照射工程を含んでなることを特徴とする方法に関する。

本発明はまた、フィコビリタンパク質（フィコシアニンおよびアロフィコシアニン）含有量が２９〜２５０ｍｇ／乾燥重量（ｇ）であり、有利には、ＵＲＡ密度が２０〜２００ｇ／乾燥重量（Ｌ）、優先的には９０〜１５０ｇ／乾燥重量（Ｌ）である、本発明の方法によって得ることができるバイオマスに関する。

本発明はまた、フィコシアニンおよび／またはカロテノイドを調製するための本発明のバイオマスの使用に関する。

本発明はまた、本発明のバイオマスから得ることができるフィコシアニンに関する。

本発明はまた、食品または動物の餌、化粧品および／または色素の用途における、本発明のバイオマスまたは本発明のフィコシアニンの使用に関する。

本発明はまた、本発明のバイオマスまたはフィコシアニンを少なくとも含んでなる製品に関する。

本明細書において、以下、簡便性はさておき、さらに分類すると、「ＵＲＡ」という用語の使用は、「イデユコゴメ（Ｃｙａｎｉｄｉｏｐｈｙｔｉｎａ）亜門の紅色植物、イデユコゴメ（Ｃｙａｎｉｄｉｏｐｈｙｃｅａｅ）綱の紅色植物、イデユコゴメ（Ｃｙａｎｉｄｉａｌｅｓ）目の紅色植物、イデユコゴメ（Ｃｙａｎｉｄｉａｃｅａｅ）科またはガルディエリア（Ｇａｌｄｉｅｒｉａｃｅａｅ）科の紅色植物、シアニディオシゾン（Ｃｙａｎｉｄｉｏｓｃｈｙｚｏｎ）属、シアニジウム（Ｃｙａｎｉｄｉｕｍ）属またはガルディエリア（Ｇａｌｄｉｅｒｉａ）属の紅色植物、Ｃｙａｎｉｄｉｏｓｃｈｙｚｏｎｍｅｒｏｌａｅ１０Ｄ種、ＣｙａｎｉｄｉｏｓｃｈｙｚｏｎｍｅｒｏｌａｅＤＢＶ２０１種、Ｃｙａｎｉｄｉｕｍｃａｌｄａｒｉｕｍ種、Ｃｙａｎｉｄｉｕｍｄａｅｄａｌｕｍ種、Ｃｙａｎｉｄｉｕｍｍａｘｉｍｕｍ種、Ｃｙａｎｉｄｉｕｍｐａｒｔｉｔｕｍ種、Ｃｙａｎｉｄｉｕｍｒｕｍｐｅｎｓ種、Ｇａｌｄｉｅｒｉａｄａｅｄａｌａ種、Ｇａｌｄｉｅｒｉａｍａｘｉｍａ種、Ｇａｌｄｉｅｒｉａｐａｒｔｉｔａ種またはＧａｌｄｉｅｒｉａｓｕｌｐｈｕｒａｒｉａ種の紅色植物」を意味すると理解される。

同様に、「イデユコゴメ綱（Ｃｙａｎｉｄｉｏｐｈｙｃｅａｅ）」という用語の使用は、さらに分類すると、「イデユコゴメ（Ｃｙａｎｉｄｉａｌｅｓ）目のイデユコゴメ綱（Ｃｙａｎｉｄｉｏｐｈｙｃｅａｅ）、イデユコゴメ（Ｃｙａｎｉｄｉａｃｅａｅ）科またはガルディエリア（Ｇａｌｄｉｅｒｉａｃｅａｅ）科のイデユコゴメ綱（Ｃｙａｎｉｄｉｏｐｈｙｃｅａｅ）、シアニディオシゾン（Ｃｙａｎｉｄｉｏｓｃｈｙｚｏｎ）属、シアニジウム（Ｃｙａｎｉｄｉｕｍ）属またはガルディエリア（Ｇａｌｄｉｅｒｉａ）属のイデユコゴメ綱（Ｃｙａｎｉｄｉｏｐｈｙｃｅａｅ）、Ｃｙａｎｉｄｉｏｓｃｈｙｚｏｎｍｅｒｏｌａｅ１０Ｄ種、ＣｙａｎｉｄｉｏｓｃｈｙｚｏｎｍｅｒｏｌａｅＤＢＶ２０１種、Ｃｙａｎｉｄｉｕｍｃａｌｄａｒｉｕｍ種、Ｃｙａｎｉｄｉｕｍｄａｅｄａｌｕｍ種、Ｃｙａｎｉｄｉｕｍｍａｘｉｍｕｍ種、Ｃｙａｎｉｄｉｕｍｐａｒｔｉｔｕｍ種、Ｃｙａｎｉｄｉｕｍｒｕｍｐｅｎｓ種、Ｇａｌｄｉｅｒｉａｄａｅｄａｌａ種、Ｇａｌｄｉｅｒｉａｍａｘｉｍａ種、Ｇａｌｄｉｅｒｉａｐａｒｔｉｔａ種またはＧａｌｄｉｅｒｉａｓｕｌｐｈｕｒａｒｉａ種のイデユコゴメ綱（Ｃｙａｎｉｄｉｏｐｈｙｃｅａｅ）」を意味すると理解される。「イデユコゴメ目（Ｃｙａｎｉｄｉａｌｅｓ）」という用語の使用は、さらに分類すると、イデユコゴメ（Ｃｙａｎｉｄｉａｃｅａｅ）科またはガルディエリア（Ｇａｌｄｉｅｒｉａｃｅａｅ）科のイデユコゴメ目（Ｃｙａｎｉｄｉａｌｅｓ）、シアニディオシゾン（Ｃｙａｎｉｄｉｏｓｃｈｙｚｏｎ）属、シアニジウム（Ｃｙａｎｉｄｉｕｍ）属またはガルディエリア（Ｇａｌｄｉｅｒｉａ）属のイデユコゴメ目（Ｃｙａｎｉｄｉａｌｅｓ）、Ｃｙａｎｉｄｉｏｓｃｈｙｚｏｎｍｅｒｏｌａｅ１０Ｄ種、ＣｙａｎｉｄｉｏｓｃｈｙｚｏｎｍｅｒｏｌａｅＤＢＶ２０１種、Ｃｙａｎｉｄｉｕｍｃａｌｄａｒｉｕｍ種、Ｃｙａｎｉｄｉｕｍｄａｅｄａｌｕｍ種、Ｃｙａｎｉｄｉｕｍｍａｘｉｍｕｍ種、Ｃｙａｎｉｄｉｕｍｐａｒｔｉｔｕｍ種、Ｃｙａｎｉｄｉｕｍｒｕｍｐｅｎｓ種、Ｇａｌｄｉｅｒｉａｄａｅｄａｌａ種、Ｇａｌｄｉｅｒｉａｍａｘｉｍａ種、Ｇａｌｄｉｅｒｉａｐａｒｔｉｔａ種またはＧａｌｄｉｅｒｉａｓｕｌｐｈｕｒａｒｉａ種のイデユコゴメ目（Ｃｙａｎｉｄｉａｌｅｓ）」を意味すると理解される。「イデユコゴメ科（Ｃｙａｎｉｄｉａｃｅａｅ）またはガルディエリア科（Ｇａｌｄｉｅｒｉａｃｅａｅ）」という表現の使用は、さらに分類すると、シアニディオシゾン（Ｃｙａｎｉｄｉｏｓｃｈｙｚｏｎ）属、シアニジウム（Ｃｙａｎｉｄｉｕｍ）属またはガルディエリア（Ｇａｌｄｉｅｒｉａ）属のイデユコゴメ科（Ｃｙａｎｉｄｉａｃｅａｅ）またはガルディエリア科（Ｇａｌｄｉｅｒｉａｃｅａｅ）、Ｃｙａｎｉｄｉｏｓｃｈｙｚｏｎｍｅｒｏｌａｅ１０Ｄ種、ＣｙａｎｉｄｉｏｓｃｈｙｚｏｎｍｅｒｏｌａｅＤＢＶ２０１種、Ｃｙａｎｉｄｉｕｍｃａｌｄａｒｉｕｍ種、Ｃｙａｎｉｄｉｕｍｄａｅｄａｌｕｍ種、Ｃｙａｎｉｄｉｕｍｍａｘｉｍｕｍ種、Ｃｙａｎｉｄｉｕｍｐａｒｔｉｔｕｍ種、Ｃｙａｎｉｄｉｕｍｒｕｍｐｅｎｓ種、Ｇａｌｄｉｅｒｉａｄａｅｄａｌａ種、Ｇａｌｄｉｅｒｉａｍａｘｉｍａ種、Ｇａｌｄｉｅｒｉａｐａｒｔｉｔａ種またはＧａｌｄｉｅｒｉａｓｕｌｐｈｕｒａｒｉａ種のイデユコゴメ科（Ｃｙａｎｉｄｉａｃｅａｅ）またはガルディエリア科（Ｇａｌｄｉｅｒｉａｃｅａｅ）」を意味すると理解される。「シアニディオシゾン属（Ｃｙａｎｉｄｉｏｓｃｈｙｚｏｎ）、シアニジウム属（Ｃｙａｎｉｄｉｕｍ）またはガルディエリア属（Ｇａｌｄｉｅｒｉａ）」という表現の使用は、さらに分類すると、「Ｃｙａｎｉｄｉｏｓｃｈｙｚｏｎｍｅｒｏｌａｅ１０Ｄ種、ＣｙａｎｉｄｉｏｓｃｈｙｚｏｎｍｅｒｏｌａｅＤＢＶ２０１種、Ｃｙａｎｉｄｉｕｍｃａｌｄａｒｉｕｍ種、Ｃｙａｎｉｄｉｕｍｄａｅｄａｌｕｍ種、Ｃｙａｎｉｄｉｕｍｍａｘｉｍｕｍ種、Ｃｙａｎｉｄｉｕｍｐａｒｔｉｔｕｍ種、Ｃｙａｎｉｄｉｕｍｒｕｍｐｅｎｓ種、Ｇａｌｄｉｅｒｉａｄａｅｄａｌａ種、Ｇａｌｄｉｅｒｉａｍａｘｉｍａ種、Ｇａｌｄｉｅｒｉａｐａｒｔｉｔａ種またはＧａｌｄｉｅｒｉａｓｕｌｐｈｕｒａｒｉａ種のシアニディオシゾン属（Ｃｙａｎｉｄｉｏｓｃｈｙｚｏｎ）、シアニジウム属（Ｃｙａｎｉｄｉｕｍ）またはガルディエリア属（Ｇａｌｄｉｅｒｉａ）」を意味すると理解る。

本明細書および特許請求の範囲において使用され得るように、単数形の「１つの（ａ）」および「１つの（ａｎ）」は、その内容が明確に他の意味であることが示されていない限り、それらの複数形を含むことに留意されたい。

特定のＵＲＡは、混合栄養生物であり、従属栄養（培地によって供される有機炭素基質の消費）および独立栄養（光合成による光を使用したＣＯ_２の捕捉）の両方を行うことができる。混合栄養は、光合成従属栄養とも呼ばれる。混合栄養の概念は、光合成のための光の使用だけではなく、色素合成などの代謝応答を誘発することができる光信号としての光の使用にも拡張される。

従属栄養が支配的な混合栄養によれば、独立栄養と従属栄養の両方の利点を組み合わせることによって、藻類由来の分子を産生することができる。従属栄養が支配的な混合栄養は、１つ又はそれ以上の有機炭素源を含有していてもよい培地を用いて、低強度および短期間の光成分を導入することからなる。従属栄養では、ＵＲＡは、有機基質を消費し、高いバイオマス生産性（乾燥バイオマスのグラム数／Ｌ／ｈで表される）および／またはバイオマス濃度（乾燥バイオマスのグラム数／Ｌで表される）を実現することができ、その結果、葉緑体および他の光感受性細胞構造が活性化される。

これらの光エネルギー受容体は、細胞内の特定のオルガネラまたは構造（例えば、葉緑体、眼点、クロノプラスト（ｃｈｒｏｎｏｐｌａｓｔ）、クロモプラストまたはフィコビリソーム）であってもよく、あるいは光に対する応答および細胞応答を引き起こすことができる個々の分子（例えば、ロドプシン、フィトクロム、クリプトクロムまたはオーレオクロム）であってもよい。

これらの光受容体によって、細胞は、高い生産性を有し、またＵＲＡによって代謝可能な全ての分子を合成することができる。ＵＲＡによって産生される目的の分子は、特に、栄養、化粧品、グリーンケミストリーおよびエネルギーの分野で主要な工業的価値を有する。

これら目的の分子は様々であり、例えば、炭水化物、タンパク質、アミノ酸、有利には必須アミノ酸および色素、特に光合成色素（主要なものは、クロロフィル、カロテノイドおよびフィコビリタンパク質である）が挙げられる。

カロテノイドとの用語は、カロテン（α、β、ε、γ、δおよびζ−カロテン、リコペンおよびフィトエン）およびキサントフィル（アスタキサンチン、アンテラキサンチン、シトラナキサンチン、クリプトキサンチン、カンタキサンチン、ジアジノキサンチン、ジアトキサンチン、フラボキサンチン、フコキサンチン、ルテイン、ネオキサンチン、ロドキサンチン、ルビキサンチン、シフォナキサンチン、ビオラキサンチン、ゼアキサンチン）を含む。カロテノイドは、脂溶性色素であり、一般的に、橙色および黄色である。カロテノイドは、全ての藻類、全ての緑色植物、そして多くの真菌および細菌（シアノバクテリアを含む）によって合成される。カロテノイドは、食品を介し、動物およびヒトに吸収される。カロテノイドは、４４０ｎｍ付近および４７５ｎｍ付近に２つの主要な吸収ピークを有する。

カロテノイドは、いくつかがプロビタミンＡであり、いくつかは抗癌活性および抗酸化活性も有するため、栄養および健康において重要な役割を果たす。さらに、カロテノイドは抗体合成を刺激する。カロテノイドのいくつかは、その色素特性のために農業食品産業で広く使用されており、またその抗酸化特性および光保護能のために化粧品および医薬品産業でも広く使用されている。

特定のカロテノイド、例えば、ルテイン、ゼアキサンチンおよびアスタキサンチンは価値が非常に高く、後者のアスタキサンチンは、その高い抗酸化能のため特に価値が高い。

出願人は、広範囲にわたる研究の後に、驚くべきことに、少なくとも１つの炭素源と１つのリン源とを含んでいてもよい培地中でＵＲＡを培養し、さらに少なくとも１つの照射工程、有利には、ある特定の波長を中心とする狭いスペクトル（特に、４５５ｎｍを中心とするスペクトル）を有する光による照射を含んでいてもよい照射工程を含む培養方法により、典型的に産生される培養物と比較して、ＵＲＡの量を実質的に高めることができ、さらに、従来技術の培養で得ることができる量よりも潜在的に多くの量の目的の分子、特に、フィコシアニン、アロフィコシアニン、ゼアキサンチンおよびβ−カロテンを含むことが可能なバイオマスを得ることができることを見出した。

本発明の範囲のＵＲＡは、強い酸性のｐＨ（０．０５〜５）および非常に高い温度（２５〜５６℃）に耐え得る極限環境生物である。これらの生物は、火山および温泉の近くに見つかることが多い。一般的に、これらの混合栄養生物は、多くの炭素代謝物（グルコース、グリセロール、ペントースなど）を使用することができる［ＷｏｌｆｇａｎｇＧｒｏｓｓａｎｄＣｌａｕｓＳｃｈｎａｒｒｅｎｂｅｒｇｅｒ．「ＨｅｔｅｒｏｔｒｏｐｈｉｃＧｒｏｗｔｈｏｆＴｗｏＳｔｒａｉｎｓｏｆｔｈｅＡｃｉｄｏ−ＴｈｅｒｍｏｐｈｉｌｉｃＲｅｄＡｌｇａＧａｌｄｉｅｒｉａｓｕｌｐｈｕｒａｒｉａ．」ＰｌａｎｔａｎｄＣｅｌｌＰｈｙｓｉｏｌｏｇｙ３６、ｎｏ．４（１９９５年６月１日）：６３３−３８］。

出願人が発明した方法の別の利点は、バイオリアクター内で行うことができることであり、さらに、有利には、工業的スケールで行うことができることである。

出願人の知る限りでは、独立栄養条件、混合栄養条件または従属栄養条件でのＵＲＡの（バイオリアクター内での）工業的生産は存在しない。

特に、出願人は、少なくとも１つの炭素源および少なくとも１つの同化可能なリン源を含む培地を用い、さらに少なくとも１つの照射工程を含む方法で、本発明の範囲のＵＲＡを培養することにより、典型的に産生される培養物と比較して、バイオマス生産性および／またはバイオマス濃度を実質的に増加させることができ、得られたバイオマスは、加えて、フィコシアニンおよび／またはカロテノイドを豊富に含むことができることを見出した。

本明細書において、「フィコシアニンおよび／またはカロテノイドを豊富に含む」とは、本発明の条件下で培養して産生することができるバイオマス中のフィコビリタンパク質および／またはカロテノイドの濃度が、従来技術の条件で培養して得られる同じ藻類のバイオマスによって産生することができるフィコビリタンパク質および／またはカロテノイドの濃度より高いことを意味する。

イデユコゴメ綱（Ｃｙａｎｉｄｉｏｐｈｙｃｅａｅ）を混合栄養条件下発酵槽で培養することの顕著な利点は、この方法が滅菌培地に接種した１種類の細胞のみを含む純粋株の（または純培養の）培養物を産生することができ、これにより、Ｓｐｉｒｕｌｉｎａｐｌａｔｅｎｓｉｓをレースウェイまたはオープンポンドで培養したときに観察され得る毒性株によるコンタミネーションの問題を回避することができることである。高いバイオマス生産性および／またはバイオマス濃度とは別に、発酵槽での培養法は、健康上の安全性という観点でより多くの保証も与える。

したがって、本発明の第１の目的は、少なくとも１つの炭素源と少なくとも１つのリン源とを含む培地を用い、イデユコゴメ（Ｃｙａｎｉｄｉｏｐｈｙｃｅａｅ）綱の、有利には、イデユコゴメ（Ｃｙａｎｉｄｉａｌｅｓ）目の、より有利には、イデユコゴメ（Ｃｙａｎｉｄｉａｃｅａｅ）科またはガルディエリア（Ｇａｌｄｉｅｒｉａｃｅａｅ）科の、具体的には、シアニディオシゾン（Ｃｙａｎｉｄｉｏｓｃｈｙｚｏｎ）属、シアニジウム（Ｃｙａｎｉｄｉｕｍ）属またはガルディエリア（Ｇａｌｄｉｅｒｉａ）属の、より具体的には、Ｃｙａｎｉｄｉｏｓｃｈｙｚｏｎｍｅｒｏｌａｅ１０Ｄ種、ＣｙａｎｉｄｉｏｓｃｈｙｚｏｎｍｅｒｏｌａｅＤＢＶ２０１種、Ｃｙａｎｉｄｉｕｍｃａｌｄａｒｉｕｍ種、Ｃｙａｎｉｄｉｕｍｄａｅｄａｌｕｍ種、Ｃｙａｎｉｄｉｕｍｍａｘｉｍｕｍ種、Ｃｙａｎｉｄｉｕｍｐａｒｔｉｔｕｍ種、Ｃｙａｎｉｄｉｕｍｒｕｍｐｅｎｓ種、Ｇａｌｄｉｅｒｉａｄａｅｄａｌａ種、Ｇａｌｄｉｅｒｉａｍａｘｉｍａ種、Ｇａｌｄｉｅｒｉａｐａｒｔｉｔａ種またはＧａｌｄｉｅｒｉａｓｕｌｐｈｕｒａｒｉａ種の、優先的にはＧａｌｄｉｅｒｉａｓｕｌｐｈｕｒａｒｉａ種の単細胞紅藻類（ＵＲＡ）を培養するための方法であって、この方法が少なくとも１つの照射工程を含む方法である。

このような培養条件によって、従来技術の培養で得られるＵＲＡバイオマス生産性および／またはバイオマス濃度よりも高いＵＲＡバイオマス生産性および／またはバイオマス濃度を実現することができ、また従来技術の培養で得られるバイオマスの量よりも多くの量のバイオマスを得ることができ、さらに得られたバイオマスによるタンパク質産生を促進することができ、乾燥重量の５１％以上の量に達することが可能である。

本発明によれば、その方法の照射工程は、白色光、または有利には、青色光を用いて行うことができる。実際、出願人は、青色光を照射して本発明の範囲のＵＲＡを培養することにより、白色光を照射した同一の培養と比較して、フィコシアニン産生が促進されるとの事実を実証している。従って、本発明の実施形態によれば、本発明の方法の照射工程は、青色光を用いて行うことができる。

本発明によれば、青色光とは、４００〜５５０ｎｍ、優先的には４２０ｎｍ〜５００ｎｍの狭い波長スペクトルを有する放射線を意味する。このような放射線により、フィコシアニンおよび抗酸化物質（特に、カロテノイド）を豊富に含むバイオマスを得ることができる。本発明の改良形態によれば、前記スペクトルは、４５５ｎｍを中心としていてもよく、両側に２５ｎｍを超えて広がらないものであってもよい。好ましくは、本発明によれば、選択される波長は、４３０〜４８０ｎｍであり、さらに優先的には、選択される波長は、４５５ｎｍである。

本発明によれば、照射は、当業者に知られている任意の手段、特に、１つ又はそれ以上のランプ、１つ又はそれ以上のチューブ、１つ又はそれ以上の発光ダイオード（ＬＥＤ）によって生じさせてもよい。

出願人は、１つ又はそれ以上の発光ダイオード（ＬＥＤ）によって照射を生じさせた場合、本発明の方法はさらにより効果的であることを実証している。

したがって、本発明の改良形態によれば、照射は、１つ又はそれ以上のＬＥＤによって生じさせてもよい。ＬＥＤは、好ましくは、市販のＬＥＤである。

その例として、ＳｅｏｕｌＯｐｔｏｄｅｖｉｃｅＣｏ．，ＬＴＤ（韓国）、日亜化学工業株式会社（日本）またはＳｕｎＬＥＤＣｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ（米国）製のＬＥＤが挙げられる。

本発明の方法によれば、培養は、成長速度、フィコシアニンレベルおよび／またはカロテノイドレベルなる所望の基準を満たすのに必要な期間に少なくとも対応する十分な期間、光照射に付してもよい。当業者は、過度な実験を行うことなく、この必要な期間を判断することができる。当業者は、当該技術分野の自身の知識に基づき、この時間を合わせることができる。

より具体的には、混合栄養条件は、不連続なおよび／または経時的に変化する照射条件で得ることができる。

不連続な照射とは、暗期間によって中断される照射を指す。照射は、特に、フラッシュの形態であってもよい。フラッシュは、本発明の範囲では、所定の継続時間の光照射である。

本発明によれば、単位時間あたりのフラッシュの頻度または回数、フラッシュの継続時間、放たれる光の強度という３つの照射概念が考慮されなければならない。

本発明によれば、頻度に関し、本発明の方法で使用される単位時間あたりのフラッシュの数に基き、２種類の照射が定義される。
− フラッシュの回数が１時間あたり約２〜３．６×１０^４（５．４×１０^−４Ｈｚ〜１０Ｈｚ）、優先的には１時間あたり３〜３．６×１０^３（８．３×１０^−４Ｈｚ〜１Ｈｚ）であってもよい、低頻度の照射。ここで、１時間あたりのフラッシュ回数は、２〜３６０００の全ての値（全てを述べる必要はないが、２、３、４、・・・、３５５９８、３５５９９、３６０００）を含んでいてもよいと理解される。
− フラッシュの回数が、１時間あたり約３．６×１０^４〜５．４×１０^９（１０Ｈｚ〜１．５×１０^６Ｈｚ）、優先的には３．６×１０^５〜５．４×１０^９（１００Ｈｚ〜１．５×１０^６Ｈｚ）であってもよい、高頻度の照射。ここで、１時間あたりのフラッシュ回数は、３．６×１０^５〜５．４×１０^９の全ての値（全てを述べる必要はないが、３６０００、３６００１、３６００２、・・・、５３９９９９９９９８、５３９９９９９９９９、５４００００００００）を含んでいてもよいと理解される。

本発明の継続時間に関し、選択される照射の頻度にかかわらず、フラッシュの継続時間は、１秒の１／１５００００から１７９９秒まで（２９分５９秒）までであってもよい。

もちろん、高頻度の照射が使用される場合、フラッシュの継続時間は、優先的には、１秒の１／１５００００から１秒の１／１０までであってもよい。

また、低頻度の照射が使用される場合、フラッシュの継続時間は、優先的には、１秒の１／１０から１７９９秒まで（２９分５９秒）までであってもよい。

本発明の光強度に関し、フラッシュの形態で与えられる光の強度は、５〜５０００μｍｏｌ・ｍ^−２・ｓ^−１、好ましくは５〜５００μｍｏｌ・ｍ^−２・ｓ^−１、または５０〜４００μｍｏｌ・ｍ^−２・ｓ^−１、さらに優先的には１５０〜３００μｍｏｌ・ｍ^−２・ｓ^−１であってもよい（１μｍｏｌ・ｍ^−２・ｓ^−１は、１μＥｍ^−２・ｓ^−１（アインシュタイン）に対応し、この単位は、文献で使用されることが多い）。

本発明によれば、１時間あたりのフラッシュの回数は、フラッシュの強度と継続時間の関数として選択することができる（上を参照）。

本発明によれば、頻度、継続時間および光強度という概念は、本発明によって想定される照射、すなわち選択される光源、有利には、４００ｎｍ〜５５０ｎｍ、好ましくは４２０ｎｍ〜５００ｎｍ、より優先的には４３０〜４８０ｎｍ、さらにより優先的には４５５ｎｍを中心とする狭い波長スペクトルを有する放射線を発するＬＥＤによって生じさせる照射、および本発明で考慮される期間の照射に適用する。

本発明の好ましい形態は、４００ｎｍ〜５５０ｎｍ、優先的には４２０ｎｍ〜５００ｎｍ、より優先的には４３０〜４８０ｎｍの狭い波長スペクトル、最も優先的には４５５ｎｍの波長を有する放射線を発するＬＥＤを用いて得られるフラッシュの形態での不連続な光の形態で照射を与えることができる、本発明の方法であってもよい。

本発明の別の実施形態によれば、照射は変動してもよく、変動とは、照射が暗期間によって中断されないが、光強度が経時的に変化することを意味する。光強度の変化は、規則的であってもよく、不規則であってもよく、そして断続的であってもよく、周期的であってもよい。本発明によれば、連続した照射期間と不連続な照射期間の組み合わせで光が与えられてもよい。

変動する照射とは、光強度が規則的な様式で１時間に少なくとも２回変わることを意味する。本発明の方法に適した照射条件の一例は、ＷＯ２０１２／０３５２６２号に記載される。

照射には、好ましくは、強度の変動があってもよく、その振幅は、一般的には、５μｍｏｌ・ｍ^−２・ｓ^−１〜２０００μｍｏｌ・ｍ^−２・ｓ^−１、好ましくは５０〜１５００μｍｏｌ・ｍ^−２・ｓ^−１、さらに優先的には５０〜２００μｍｏｌ・ｍ^−２・ｓ^−１である。

好ましい実施形態によれば、照射には、強度の変動があり、その振幅は、５〜１０００μｍｏｌ・ｍ^−２・ｓ^−１、好ましくは５〜４００μｍｏｌ・ｍ^−２・ｓ^−１であり、これらの変動は、１時間に２〜３６００回、好ましくは、１時間に２〜２００回起こる。

これらの培養条件によって、所定量の光を与えることが可能となる。光は、不連続な照射期間および／または変動する照射期間を含んで与えられてもよく、強度の変動は、同じ振幅を有していてもよく、異なる振幅を有していてもよい。

本発明によれば、ＵＲＡ株のための培養条件は、選択した株を培養するために従来技術で知られ、そして使用されている条件であってもよく、その条件には、照射工程が加わっている。有利には、最良のバイオマス生産性および／または最良のバイオマス濃度を得ることができる条件が使用される。

当業者は、成長速度および目的の代謝物のレベル、特に、カロテノイドおよび／またはフィコビリタンパク質のレベルに関し、本発明の所望の基準を満たすバイオマスのために、既知の方法に本発明の照射工程を組み込むことができるであろう。この点において、ＷｏｌｆｇａｎｇＧｒｏｓｓおよびＣｌａｕｓＳｃｈｎａｒｒｅｎｂｅｒｇｅｒ（前掲）によって記載される方法が挙げられる。

高いバイオマス生産性またはバイオマス濃度を得るための方法が望ましい。このような方法の例として、Ｇｒａｖｅｒｈｏｌｔら、［Ａｐｐｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．（２００７）７７：６９−７５］によって記載される方法が挙げられる。

より具体的には、この工程は、出願人による出願ＷＯ２０１２／０３５２６２号に記載される方法に組み込むことができる。

本発明によれば、培養は、ＵＲＡと少なくとも炭素源とを接触させることができる任意の既知の培養技術、例えば、フラスコまたはリアクターだけではなく、ＵＲＡ成長に適した発酵槽または任意の容器（例えば、レースウェイまたはオープンポンド）、および、４００ｎｍ〜５５０ｎｍ、好ましくは４３０ｎｍ〜４８０ｎｍ、より優先的には４５５ｎｍを中心とする狭いスペクトルを有する波長を発する少なくとも１つの光源であって、培養物に対する光源の作用によって、バイオマスの望ましい巨視的な組成（すなわち、フィコビリタンパク質（フィコシアニンおよびアロフィコシアニン）を豊富に含み、細胞内濃度が２９〜２５０ｍｇ／乾燥重量（ｇ）、優先的には３５〜１５０ｍｇ／乾燥重量（ｇ）であり、さらに場合により、抗酸化物質（特にカロテノイド、有利には、ゼアキサンチンおよびβ−カロテン）を０．１〜１０ｍｇ／ｇ、有利には０．２５０〜１ｍｇ／ｇの濃度で豊富に含むバイオマス）を得ることができる光源が取り付けられた培養技術によって実施することが出来る。これらの結果は、乾燥バイオマスの生産性および／または乾燥バイオマスの濃度に関し、また、細胞内フィコビリタンパク質およびカロテノイドの含有量に関し、工業的生産で一般的に使用される容積である、１ｍ^３、４ｍ^３、１０ｍ^３および２００ｍ^３のバイオリアクターでも得ることができる。

出願人は、回分培養の場合において、初期培地中の炭素（Ｃ）およびリン（Ｐ）の濃度が、これら濃度のＰ／Ｃ比（リンのモル数／炭素のモル数で表される）が０．０１８９８より小さく、有利には０．０１５０３より小さく、さらに有利には０．０１０５４より小さく、なおさらに有利には０．００５２７より小さく、優先的には０．００２６３より小さく、最も優先的には０．００１３１より小さくなるような濃度であるとき、バイオマスの細胞内フィコシアニン含有量が、従来技術の標準条件で得られるバイオマスの細胞内フィコシアニン含有量と比較して、多くなることを示すこともできた。

同様に、流加培養または連続培養において、出願人は、消費されるリンおよび炭素の量が、これら消費される量のＰ／Ｃ比（リンのモル数／炭素のモル数で表される）が０．０１８９８より小さく、有利には０．０１５０３より小さく、さらに有利には０．０１０５４より小さく、なおさらに有利には０．００５２７より小さく、優先的には０．００２６３７より小さく、さらに優先的には０．００１３１より小さくなるような量であるとき、バイオマスのフィコシアニン含有量が多くなることを示すことができた。

本発明によれば、リン源は、以下のもの：リン酸、リン塩、有利には、リン酸水素ナトリウム（Ｎａ_２ＨＰＯ_４）、またはリン酸二水素ナトリウム（ＮａＨ_２ＰＯ_４）、またはリン酸二水素カリウム（ＫＨ_２ＰＯ_４）、またはリン酸水素カリウム（Ｋ_２ＨＰＯ_４）、またはこれらリン源のうち少なくとも２つの任意の割合での任意の混合物から選択することができる。

本発明によれば、炭素源は、以下のもの：グルコース、グリセロール、アセテート、スクロース、またはこれら炭素源のうち少なくとも２つの任意の割合での任意の混合物から選択することができる。

したがって、本発明の別の目的は、少なくとも１つの炭素源と少なくとも１つのリン源とを含む培地中で、イデユコゴメ（Ｃｙａｎｉｄｉｏｐｈｙｃｅａｅ）綱の、有利には、イデユコゴメ（Ｃｙａｎｉｄｉａｌｅｓ）目の、さらに有利には、イデユコゴメ（Ｃｙａｎｉｄｉａｃｅａｅ）科またはガルディエリア（Ｇａｌｄｉｅｒｉａｃｅａｅ）科の、特に、シアニディオシゾン（Ｃｙａｎｉｄｉｏｓｃｈｙｚｏｎ）属、シアニジウム（Ｃｙａｎｉｄｉｕｍ）属またはガルディエリア（Ｇａｌｄｉｅｒｉａ）属の、さらに特定的には、Ｃｙａｎｉｄｉｏｓｃｈｙｚｏｎｍｅｒｏｌａｅ１０Ｄ種、ＣｙａｎｉｄｉｏｓｃｈｙｚｏｎｍｅｒｏｌａｅＤＢＶ２０１種、Ｃｙａｎｉｄｉｕｍｃａｌｄａｒｉｕｍ種、Ｃｙａｎｉｄｉｕｍｄａｅｄａｌｕｍ種、Ｃｙａｎｉｄｉｕｍｍａｘｉｍｕｍ種、Ｃｙａｎｉｄｉｕｍｐａｒｔｉｔｕｍ種、Ｃｙａｎｉｄｉｕｍｒｕｍｐｅｎｓ種、Ｇａｌｄｉｅｒｉａｄａｅｄａｌａ種、Ｇａｌｄｉｅｒｉａｍａｘｉｍａ種、Ｇａｌｄｉｅｒｉａｐａｒｔｉｔａ種またはＧａｌｄｉｅｒｉａｓｕｌｐｈｕｒａｒｉａ種の、優先的にはＧａｌｄｉｅｒｉａｓｕｌｐｈｕｒａｒｉａ種のＵＲＡを培養するための方法であって、この方法が少なくとも１つの照射工程を含む方法である。

本発明の方法の第１の改良形態によれば、回分培養の場合には、初期培地中の炭素濃度およびリン濃度が、これら濃度のＰ／Ｃ比（リンのモル数／炭素のモル数で表される）が０．０１８９８より小さく、有利には０．０１５０３より小さく、さらに有利には０．０１０５４より小さく、なおさらに有利には０．００５２７より小さく、優先的には０．００２６３より小さく、さらに優先的には０．００１３１より小さくなるような量であってもよい。

本発明の方法の第２の改良形態によれば、流加培養または連続培養の場合には、培養中に消費される炭素およびリンの量が、これら消費される量のＰ／Ｃ比（リンのモル数／炭素のモル数で表される）が０．０１８９８より小さく、有利には０．０１５０３より小さく、さらに有利には０．０１０５４より小さく、なおさらに有利には０．００５２７より小さく、優先的には０．００２６３より小さく、さらに優先的には０．００１３１より小さくなるような量であってもよい。

本発明の方法の好ましい改良形態によれば、後者は、上述の改良形態に従って行われてもよいが、青色光を用いて行われる少なくとも１つの照射工程をさらに含む。

したがって、本発明の方法のさらに別の好ましい改良形態によれば、回分培養の場合には、当該方法は、青色光を用いて行われる少なくとも１つの照射工程を含み、初期培地中の炭素濃度およびリン濃度が、これら濃度のＰ／Ｃ比（リンのモル数／炭素のモル数で表される）が０．０１８９８より小さく、有利には０．０１５０３より小さく、さらに有利には０．０１０５４より小さく、なおさらに有利には０．００５２７より小さく、優先的には０．００２６３より小さく、さらに優先的には０．００１３１より小さくなるような量であってもよい。

本発明のさらに別の好ましい改良形態によれば、流加培養または連続培養の場合には、当該方法は、青色光を用いて行われる少なくとも１つの照射工程を含み、培養中に消費される炭素およびリンの量が、これら消費される量のＰ／Ｃ比（リンのモル数／炭素のモル数で表される）が０．０１８９８より小さく、有利には０．０１５０３より小さく、さらに有利には０．０１０５４より小さく、なおさらに有利には０．００５２７より小さく、優先的には０．００２６３より小さく、さらに優先的には０．００１３１より小さくなるような量であってもよい。

これらの改良形態によれば、青色光を用いた照射条件は、上に記載したものであってもよい。

有利には、本発明によれば、その方法は、同時にまたは独立して、バイオマスの成長のため、または目的の分子（フィコシアニンおよびカロテノイド）の産生のために必要な任意の他の工程、例えば、限定されないが、光を用いない１つ又はそれ以上の培養工程、または１つ又はそれ以上のバイオマス回収工程を含んでいてもよい。

一般的に、本発明によれば、その方法の培養は、１５℃〜４７℃、有利には２２℃〜４２℃の温度で行われてもよい。

本発明によれば、その培養方法は、特定の属の１種類のＵＲＡ株、特定の１種類の属のいくつかの株、または異なる特定の属のいくつかの株（２種類の異なる属の少なくとも２つの種）を培養するために使用することができる。

本発明によれば、炭素源は、選択される株に従って、任意の既知のおよび使用可能な炭素源から選択されてもよい。当業者は、培養される株に最も適した炭素源をどのようにして選択するかを容易に知るであろう。使用可能な炭素源の例としては、グルコース、スクロース、アセテートまたはグリセロールが挙げられる［ＷｏｌｆｇａｎｇＧｒｏｓｓおよびＣｌａｕｓＳｃｈｎａｒｒｅｎｂｅｒｇｅｒ、前掲］が、これらに限定されない。

培地中に含まれる有機炭素基質は、複合分子または基質の混合物からなるものであってもよい。デンプン（例えば、トウモロコシ、コムギまたはジャガイモ）の生体内変化から誘導される産物、特にデンプン加水分解物は低分子からなり、例えば、本発明の細胞の混合栄養培養に適した有機炭素基質を構成する。

この方法に従って使用される炭素源の量は、もちろん、選択される株によって変わるであろう。ここで再び、当業者は、純粋な形態または混合物で培養される株に炭素源の量をどのように適用するかを容易に知るであろう。

本発明の一つの実施形態によれば、有機炭素基質は、５ｍＭ〜１．５Ｍ、好ましくは５０ｍＭ〜８００ｍＭの濃度を有していてもよい。

本発明の方法は、ＵＲＡを回収する工程をさらに含んでいてもよい。ＵＲＡの回収は、バイオマスを回収することができる任意の技術によって、特に、重力式濾過法または定圧濾過法、デカンテーション法によって、または沈殿法の後の重力式濾過法によっても行うことができる。

本発明はまた、本発明の方法の改良形態のいずれか１つによって得ることができるバイオマスに関する。

本発明によれば、前記バイオマスは、少なくとも２０ｇ／乾燥重量（Ｌ）から２００ｇ／乾燥重量（Ｌ）まで、優先的には、少なくとも５０ｇ／乾燥重量（Ｌ）、さらに優先的には少なくとも９０ｇ／乾燥重量（Ｌ）から約１５０ｇ／乾燥重量（Ｌ）までのＵＲＡ密度を有していてもよい。

本発明によれば、前記バイオマスは、細胞内濃度が２９〜２５０ｍｇ／乾燥重量（ｇ）、優先的には３５〜１５０ｍｇ／乾燥重量（ｇ）の細胞内フィコビリタンパク質（フィコシアニンおよびアロフィコシアニン）含有量を有していてもよい。

さらに本発明によれば、前記バイオマスは、２９〜２００ｍｇ／乾燥重量（ｇ）、優先的には４０〜１００ｍｇ／乾燥重量（ｇ）の細胞内フィコシアニン含有量を有していてもよい。

本発明によれば、前記バイオマスによって産生されるフィコビリタンパク質、特に、フィコシアニンを抽出し、例えば、食品に、または色素として使用することができる。前記バイオマスからのフィコビリタンパク質、特に、フィコシアニンの抽出は、当業者に知られている任意の抽出技術、例えば、Ｍｏｏｎら、２０１４（Ｍｙｏｕｎｇｈｏｏｎ、ＳａｎｊｉｖＫＭｉｓｈｒａ、ＣｈｕｌＷｏｏｎｇＫｉｍ、ＷｉｌｌｉａｍＩＳｕｈ、ＭｉｎＳＰａｒｋおよびＪｉ−ＷｏｎＹａｎｇ．「ＩｓｏｌａｔｉｏｎａｎｄｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎｏｆｔｈｅｒｍｏｓｔａｂｌｅｐｈｙｃｏｃｙａｎｉｎｆｒｏｍＧａｌｄｉｅｒｉａｓｕｌｐｈｕｒａｒｉａ」３１（２０１４）：１−６）によって記載される技術、またはＪｏｕｅｎら、１９９９（Ｊａｏｕｅｎ、Ｐ．、Ｂ．Ｌｅｐｉｎｅ、ＮＲ．Ｒｏｓｓｉｇｎｏｌ、Ｒ．ＲｏｙｅｒおよびＦ．Ｑｕｅｍｅｎｅｕｒ．「ＣｌａｒｉｆｉｃａｔｉｏｎａｎｄｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎｗｉｔｈｍｅｍｂｒａｎｅｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙｏｆａｐｈｙｃｏｃｙａｎｉｎｓｏｌｕｔｉｏｎｅｘｔｒａｃｔｅｄｆｒｏｍＳｐｉｒｕｌｉｎａｐｌａｔｅｎｓｉｓ．」ＢｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙＴｅｃｈｎｉｑｕｅｓ１３、ｎｏ．１２（１９９９年１２月）：８７７−８１．ｄｏｉ：１０．１０２３／Ａ：１００８９８０４２４２１９．）または特許ＦＲ２７８９３９９Ａ１号に記載される技術に従って行うことができる。

したがって、本発明はまた、フィコシアニンを調製するための方法であって、以下の工程：
（ａ）上および以下に定義される、４００〜５５０ｎｍの狭い波長スペクトルを有する放射線の形態での少なくとも１つの照射工程を用いて、少なくとも１つの炭素源を含む培地中で、イデユコゴメ（Ｃｙａｎｉｄｉｏｐｈｙｃｅａｅ）綱のＵＲＡを培養し、前記培地中に前記ＵＲＡを少なくとも２０ｇ／乾燥重量（Ｌ）の細胞密度で含んでなる発酵マストを得る工程と、
（ｂ）この発酵マストから得られるバイオマスを回収する工程と、
（ｃ）このバイオマスからフィコシアニンを回収する工程と
を少なくとも含むことを特徴とする方法に関する。

前記バイオマスから得ることができるフィコシアニンは、別の生物の培養物によって得ることができるフィコシアニン、特に、例えば、スピルリナの培養物から得ることができるフィコシアニンと比較して、顕著に異なる特性を有する。

本発明に従って得られるバイオマス、特にＧａｌｄｉｅｒｉａｓｕｌｐｈｕｒａｒｉａバイオマスから得ることができるフィコシアニンは、ｐＨが２〜８、優先的には３〜７、さらに優先的には４〜５の溶液中で、ほとんど消えないか、あるいは全く消えない青色を有することが可能である。

さらに、本発明に従って得られるバイオマス、特にＧａｌｄｉｅｒｉａｓｕｌｐｈｕｒａｒｉａバイオマスから得ることができるフィコシアニンは、スピルリナバイオマスから得ることができるフィコシアニンとは異なり、酸性ｐＨ、特に２〜４のｐＨではほとんど沈殿しないか、または全く沈殿しないという利点を有することができる。この特性により、本発明に従って得られるバイオマス、特にＧａｌｄｉｅｒｉａｓｕｌｐｈｕｒａｒｉａバイオマスから得ることができるフィコシアニンは、炭酸または非炭酸の酸性飲料に使用するための優れた候補となる。

さらに、本発明に従って得られるバイオマス、特にＧａｌｄｉｅｒｉａｓｕｌｐｈｕｒａｒｉａバイオマスから得ることができるフィコシアニンは、スピルリナから抽出されたフィコシアニンと比較して、５０℃を超える温度で優れた耐熱性を有することが可能である（Ｍｏｏｎら、２０１４）。

最後に、本発明に従って得られるバイオマス、特にＧａｌｄｉｅｒｉａｓｕｌｐｈｕｒａｒｉａバイオマスから得ることができるフィコシアニンは、スピルリナフィコシアニンと比較して、向上したエタノール耐性を有することが可能である。

本発明によれば、（酸性ｐＨ、温度、および／またはエタノールに対する）「フィコシアニンの耐性」は、着色の消失がないか、あるいは、Ｓｐｉｒｕｌｉｎａｐｌａｔｅｎｓｉｓから抽出されるフィコシアニンについて記載されている着色の消失と比較して、着色の消失が低いことを意味する。着色の消失は、Ｍｏｏｎ（２０１４）に記載されるように、分光光度計を用い、標準的な温度およびｐＨの条件下で、水溶液の吸光度を比較し、次いで、これらの結果を、例えば、高温、酸性ｐＨまたはアルカリ性ｐＨ条件で得られた吸光度、および／または溶液にエタノールを加えた場合の吸光度と比較することによって定量化することができる。

したがって、本発明はまた、７０℃〜０℃、優先的には６５℃〜２５℃、さらに優先的には６０℃〜５０℃の温度に対し耐性であり、および／または８〜２、優先的には３〜７、さらに優先的には４〜５のｐＨに対して耐性であり、および／または５０％〜１％、優先的には４０％〜１０％、さらに優先的には２０〜３０％のエタノール濃度に対し耐性であることが可能な、本発明の方法に従って得ることができるフィコシアニンに関する。

本発明はまた、食品または動物の餌における、補助食品としての、または色素、特に食用色素としての本発明の方法に従って得ることができるフィコシアニンの使用に関する。

本発明の方法によって得ることができるＵＲＡバイオマスからフィコシアニンを抽出した後に得ることができる食物は、食品または動物の餌において、タンパク質およびカロテノイドを豊富に含む補助食品として使用することができる。

本発明によれば、前記バイオマスは、細胞内カロテノイド含有量が、０．１〜１０ｍｇ／乾燥重量（ｇ）、有利には０．２５０〜１ｍｇ／乾燥重量（ｇ）であってもよい。

ＵＲＡは、例えば、食品または動物の餌、化粧品、医薬品など多くの分野で使用される高い可能性を有する。

本発明によれば、本発明に従って得ることができるＵＲＡバイオマスは、回収後、直接的に、場合により乾燥させて使用するか、あるいは加工した後に使用することができる。特に、前記バイオマスは、食品組成物に含まれる粉状物の形態で、あるいは補助食品の形態で使用することができる。

本発明に従って得ることができるＵＲＡバイオマスは、当業者に既知の任意の方法に従って粉状物に加工してもよい。したがって、例えば、ＵＲＡを、培地から分離し、溶解させ、濃縮して微粒子（平均直径１０ミクロン）にし、次いで乾燥させてもよいことが想定され得る。

本発明はまた、ＵＲＡを使用する任意の既知の分野、特に、食品または動物の餌、化粧品、医薬品の分野における、本発明に従って得ることができるＵＲＡバイオマスの任意の使用に関する。

本発明の方法に従ってＵＲＡを培養した後に得られるバイオマスによって、特に、抗酸化物質、特に、カロテノイド（特に、ゼアキサンチンおよびβ−カロテン）を０．１〜１０ｍｇ／乾燥重量（ｇ）、有利には０．２５〜１ｍｇ／乾燥重量（ｇ）の量で特に、ゼアキサンチンを０．０５〜５ｍｇ／乾燥重量（ｇ）、有利には０．１〜１ｍｇ／乾燥重量（ｇ）の量で、および／または、β−カロテンを０．０５〜５ｍｇ／乾燥重量（ｇ）、有利には０．１〜１ｍｇ／乾燥重量（ｇ）の量で豊富に含み、食欲が増す、味が良いという点で特に食品産業での需要を満たし、多量の抗酸化物質を提供し、食品または動物の餌において使用可能な粉状物を得ることができる。

したがって、本発明は、本発明の方法によって得ることができるＵＲＡバイオマスの加工後に得ることができる粉状物に関する。

本発明の方法によって得ることができる製品の使用形態（天然または加工されたバイオマス）にかかわらず、製品は純粋なまま使用してもよく、あるいは特に食品または化粧品において従来から使用されている他の成分と混合してもよい。

本発明はまた、本発明に従って得ることができる藻類バイオマスを少なくとも含んでいてもよい任意の製品に関する。本発明はまた、本発明に従って得ることができる藻類バイオマスを加工して得られる粉状物を少なくとも含んでいてもよい任意の製品に関する。

図１は、バイオリアクターにおけるＧａｌｄｉｅｒｉａｓｕｌｐｈｕｒａｒｉａ成長の最適化を示す。図１は、使用した培養の栄養モードに依るＧａｌｄｉｅｒｉａｓｕｌｐｈｕｒａｒｉａ株の、時間の関数としてのバイオマス濃度の変化を示す。結果、混合栄養条件（−○−）は、従属栄養条件（−◆−）と比較して、株のより迅速かつ顕著に高い成長を得ることができることが示される。この曲線はまた、混合栄養条件を用いた培養終了時において、乾燥バイオマス濃度が、従属栄養条件を用いた場合に比べて顕著に高いことを示す。図２は、成長および色素産生に対する青色光の影響を示す。 ○ 図２Ａは、ｍｇ／乾燥重量（ＤＷ）（ｇ）で表される細胞内フィコシアニン（ＰＣ）含有量（濃いグレー色のバー）、および８００ｎｍでの光学密度の測定によって概算されるバイオマスの細胞濃度（薄いグレー色のバー）を示す。白色光および青色光で試験を行った。１８０時間および２５０時間で測定を行った。 ○図２Ｂは、白色光および青色光における、１８０時間および２５０時間での、同じ培養物中のクロロフィルの量（濃いグレー色のバー）、β−カロテンの量（中程度のグレー色のバー）およびゼアキサンチン（薄いグレー色のバー）の量を示す。図３は、成長およびフィコシアニン産生に対する窒素およびリンの影響を示す。図３は、Ｇａｌｄｉｅｒｉａｓｕｌｐｈｕｒａｒｉａの培養において、窒素濃度の影響の試験（図３Ａおよび３Ｂ）およびリン濃度の影響の試験（図３Ｃおよび３Ｄ）中に得られた結果を示す。図３Ａおよび図３Ｃは、１ｇ／Ｌ（−△−）、２ｇ／Ｌ（−□−）、４ｇ／Ｌ（−○−）および８（−◆−）ｇ／Ｌの硫酸アンモニウム存在下（図３Ａ）、または２５０ｍｇ（−△−）、５００ｍｇ（−□−）、１０００ｍｇ（−○−）および２０００（−◆−）ｍｇのＫＨ_２ＰＯ_４存在下（図３Ｃ）での株の成長を、時間の関数として表す。図３Ｂおよび図３Ｄは、１ｇ／Ｌ（濃いグレー色のバー）、２ｇ／Ｌ（中程度のグレー色のバー）、４ｇ／Ｌ（薄いグレー色のバー）および８（白色のバー）ｇ／Ｌの（ＮＨ_４）_２ＳＯ_４存在下（図３Ｂ）、または２５０ｍｇ（濃いグレー色のバー）、５００ｍｇ（中程度のグレー色のバー）、１０００ｍｇ（薄いグレー色のバー）および２０００（白色のバー）ｍｇのリンＫＨ_２ＰＯ_４存在下（図３Ｄ）での、培養株中のｍｇ／乾燥重量（ｇ）で表される細胞内フィコシアニン含有量を表す。図４は、Ｇａｌｄｉｅｒｉａｓｕｌｐｈｕｒａｒｉａの培養において、色素産生に対する、青色光とリンの限定とを組み合わせた影響を示す。図４Ａは、試験した異なる条件下で得られた、ｍｇ／乾燥重量（ｇ）で表される細胞内フィコシアニン含有量を示す。図４Ｂは、同じ培養物中の細胞内クロロフィル含有量（黒色のバー）、β−カロテン含有量（グレー色のバー）およびゼアキサンチン含有量（斜線入りのバー）を示す。図５は、青色バッフル（４５５ｎｍ）を用いた連続モードの発酵槽における培養の追跡を示す。 ○図５Ａは、８００ｎｍでの吸光度の測定、およびマスト１リットルあたりの乾燥重量の測定による、発酵槽におけるＧａｌｄｉｅｒｉａｓｕｌｐｈｕｒａｒｉａ株の成長の追跡を示す。 ○図５Ｂは、ｍｇ／乾燥重量（ＤＷ）（ｇ）で表される細胞内フィコシアニン含有量を示す。図６は、Ｓｐｉｒｕｌｉｎａｐｌａｔｅｎｓｉｓから抽出されたフィコシアニンと比較した、Ｇａｌｄｉｅｒｉａｓｕｌｐｈｕｒａｒｉａから抽出されたフィコシアニンの物理化学的特徴を示す。（Ａ）ｐＨ耐性の試験、（Ｂ）温度耐性の試験、（Ｃ）エタノール耐性の試験。 ○図６Ａは、Ｇａｌｄｉｅｒｉａｓｕｌｐｈｕｒａｒｉａから抽出されたフィコシアニンが、良好なｐＨ耐性を有することを示す。色素の消失率はｐＨ２．７５まで２０％未満であり、この消失率はｐＨ２まで大きくなる。 ○図６Ｂは、Ｇａｌｄｉｅｒｉａｓｕｌｐｈｕｒａｒｉａから抽出されたフィコシアニンが、良好な温度耐性を有することを示す。７０℃で３０分後に、４０％を超える色素が残存している。 ○図６Ｃは、Ｇａｌｄｉｅｒｉａｓｕｌｐｈｕｒａｒｉａから抽出されたフィコシアニンが、良好なエタノール耐性を有することを示す。色素は、３０％エタノール中では４０％消失し、５０％エタノール中では約７０％消失する。

実施例１：発酵槽における成長の最適化
材料および方法
株：Ｇａｌｄｉｅｒｉａｓｕｌｐｈｕｒａｒｉａ（Ｃｙａｎｉｄｉｕｍｃａｌｄａｒｉｕｍとも呼ばれる）ＵＴＥＸ番号２９１９

培地
従属栄養および混合栄養：３０ｇ／Ｌのグリセロール、８ｇ／Ｌの（ＮＨ_４）_２ＳＯ_４、１ｇ／ＬのＫＨ_２ＰＯ_４、７１６ｍｇ／ＬのＭｇＳＯ_４、４４ｍｇ／ＬのＣａＣｌ_２、３ｍＬ／ＬのＦｅ−ＥＤＴＡストック溶液（６．９ｇ／ＬのＦｅＳＯ_４および９．３ｇ／ＬのＥＤＴＡ−Ｎａ_２）および４ｍＬ／Ｌの微量金属溶液（３．０９ｇ／ＬのＥＤＴＡ−Ｎａ_２；０．０８０ｇ／ＬのＣｕＳＯ_４・５Ｈ_２Ｏ；２．８６０ｇ／ＬのＨ_３ＢＯ_３；０．０４０ｇ／ＬのＮａＶＯ_３・４Ｈ_２Ｏ；１．８２０ｇ／ＬのＭｎＣｌ_２；０．０４０ｇ／ＬのＣｏＣｌ_２・６Ｈ_２Ｏ；０．２２０ｇ／ＬのＺｎＳＯ_４・７Ｈ_２Ｏ；０．０１７ｇ／ＬのＮａ_２ＳｅＯ_３；０．０３０ｇ／Ｌの（ＮＨ_４）_６Ｍｏ_７Ｏ_２４・４Ｈ_２Ｏ）。

培養条件：
培養は、コンピュータ制御された自動化システムを備える、有効体積が１Ｌ〜２Ｌのリアクターで行う。培養物のｐＨは、塩基（１４％アンモニア溶液（ｗＮＨ_３／ｗ））および／または酸（４Ｎ硫酸溶液）を添加することによって制御する。培養温度は、４２℃に設定する。撹拌は、３つのインペラ：スパージャーの上側にある撹拌軸の下端に配置された６個のまっすぐなブレードを有する１つのＲｕｓｈｔｏｎタービン、および撹拌軸上に配置された２つのトリプルブレード型ＨＴＰＧ２インペラによって行う。液相の溶存酸素圧は、培養中常に、撹拌軸の回転速度（２５０〜１８００ｒｐｍ）および空気および／または酸素の通気流速によって、培地中で制御される。温度、圧力および培地組成を一定とする条件下で、コンピュータ制御された自動化システムに組み込まれた制御パラメータによって、液相中の溶存酸素の分圧を空気飽和値の５〜３０％に維持することができる。培養時間は、５０〜３００時間であった。

ＵＲＡ株の成長を最適化するために、種々の栄養モードを試験した。
− 従属栄養（−◆−）：グリセロール基質を流加モードで与える。光は与えない。
− 混合栄養（−○−）：グリセロール基質を流加モードで与え、光を与える。

− 結果
種々の条件下での成長終了時の性能特徴を以下の第１表にまとめる。

混合栄養培養は、従属栄養モードまたは独立栄養モードでの培養によって得られるバイオマス濃度よりも高いバイオマス濃度をより迅速に得ることができる。

混合栄養モードでのバイオマス生産性は、従属栄養モードでのバイオマス生産性が０．１９バイオマス（ｇ）／Ｌ／ｈであるのに対し、０．９８バイオマス（ｇ）／Ｌ／ｈである。従来技術のＧｒａｖｅｒｈｏｌｔらは、従属栄養モードで０．２８６ｇ／Ｌ／ｈの生産性を得たことを付記する［Ｇｒａｖｅｒｈｏｌｔら、前掲］。

結果を図１に示す。

成長が早いことに加え、光の存在が、細胞でのタンパク質産生を促進し、従属栄養モードでは２９．５７％の乾燥重量であるのに体し、混合栄養モードでは５１．５６％の乾燥重量に達することが可能である（第２表：Ｇ．ｓｕｌｐｈｕｒａｒｉａまたはＳ．ｐｌａｔｅｎｓｉｓのバイオマスのアミノ酸含有量の分析）。

Ｇａｌｄｉｅｒｉａｓｕｌｐｈｕｒａｒｉａの高いタンパク質含有量は、そのアミノ酸スコアが、ＦＡＯ（国連食糧農業機関）によって推奨されるアミノ酸スコアより高く、またそのスコアが、ヒトの栄養に必須の７種類のアミノ酸のうち４種類についてスピルリナのスコアより高いため、食品サプリメントの調製に含まれ、したがって、その市場でのスピルリナと競合する良好な候補となる（第３表）。

実施例２：エレンマイヤーフラスコ中での、Ｇａｌｄｉｅｒｉａｓｕｌｐｈｕｒａｒｉａ株のフィコシアニン産生に対する青色光の影響
材料および方法
株：Ｇａｌｄｉｅｒｉａｓｕｌｐｈｕｒａｒｉａ（またはＣｙａｎｉｄｉｕｍｃａｌｄａｒｉｕｍ）ＵＴＥＸ番号２９１９

培地：
３０ｇ／Ｌのグリセロール、８ｇ／Ｌの（ＮＨ_４）_２ＳＯ_４、１ｇ／ＬのＫＨ_２ＰＯ_４、７１６ｍｇ／ＬのＭｇＳＯ_４、４４ｍｇ／ＬのＣａＣｌ_２、３ｍＬ／ＬのＦｅ−ＥＤＴＡストック溶液（６．９ｇ／ＬのＦｅＳＯ_４および９．３ｇ／ＬのＥＤＴＡ−Ｎａ_２）および４ｍＬ／Ｌの微量金属溶液（３．０９ｇ／ＬのＥＤＴＡ−Ｎａ_２；０．０８０ｇ／ＬのＣｕＳＯ_４・５Ｈ_２Ｏ；２．８６０ｇ／ＬのＨ_３ＢＯ_３；０．０４０ｇ／ＬのＮａＶＯ_３・４Ｈ_２Ｏ；１．８２０ｇ／ＬのＭｎＣｌ_２；０．０４０ｇ／ＬのＣｏＣｌ_２・６Ｈ_２Ｏ；０．２２０ｇ／ＬのＺｎＳＯ_４・７Ｈ_２Ｏ；０．０１７ｇ／ＬのＮａ_２ＳｅＯ_３；０．０３０ｇ／Ｌの（ＮＨ_４）_６Ｍｏ_７Ｏ_２４・４Ｈ_２Ｏ）。

培養条件：
各１００ｍＬエレンマイヤーフラスコ中で、培地を２４０時間前培養し、インキュベートする（０．１％、ｖ／ｖ）。光とリン濃度を組み合わせた効果を調べるために、各エレンマイヤーフラスコを、白色ＬＥＤまたは青色ＬＥＤ（４５５ｎｍ）システムで照射する。各条件の光強度は、１００μｍｏｌｍ^−２ｓ^−１である。緩やかに撹拌しながら（２００ｒｐｍ）、温度４２℃で、細胞を培養する。８００ｎｍでの吸光度を測定することによって、細胞成長の追跡を２４時間ごとに行う。静止期に達したら（約１９０時間）、細胞懸濁物５０ｍＬを採取し、濾過によって乾燥重量の測定を行い、Ｒｅｆｌｅｃｔｏｑｕａｎｔ（登録商標）によって培地中のリン濃度の測定（当業者に既知の方法）を行う。

乾燥重量１グラムあたりの細胞内フィコシアニン含有量の概算を、Ｍｏｏｎら［Ｍｏｏｎら、ＫｏｒｅａｎＪ．Ｃｈｅｍ．Ｅｎｇ．、２０１４、１−６］によって説明される方法を用い、異なる培養時間で行った（Ａ）。クロロフィルおよびカロテノイドなどの他の色素は、当業者に既知のＨＰＬＣアッセイ方法によって概算した（Ｂ）。

結果
この試験により、１８０時間ですでに、青色光におけるフィコシアニン濃度が白色光におけるフィコシアニン濃度よりも３００％大きいことが示される（図２Ａ）。この差異は、２５０時間では、有意ではあるが、せいぜい２５％である。

２５０時間での培地のリン含有量を分析することによって、青色光では、エレンマイヤーフラスコに約１００ｍｇ／Ｌ残っており、一方、白色光では、５ｍｇ／Ｌ残っており、この値は、後の３においてわかるように、フィコシアニン産生を誘発する培地のリン値より低いことが注目される。１８０時間では、株は、クロロフィルを含有していないが、すでにβ−カロテンおよびゼアキサンチンを含有している（図２Ｂ）。

波長４７５ｎｍの青色光を用いた試験は、４５５ｎｍと同様の効果を示し、したがって、青色光の全波長範囲を使用し、フィコシアニン産生が促進されることを想定することができる。

白色光は別として、青色光のみによって、フィコシアニン産生を伴う株の成長を得ることが可能となる。

青色光に曝すことにより、乾燥重量１グラムあたりの細胞内ＰＣ（フィコシアニン）含有量の有意な増加を伴い、白色光で観察される成長と実質的に同等の成長が可能である（図２）。

実施例３：フィコシアニン産生に対する培地組成の影響
材料および方法
株：Ｇａｌｄｉｅｒｉａｓｕｌｐｈｕｒａｒｉａ（Ｃｙａｎｉｄｉｕｍｃａｌｄａｒｉｕｍとも呼ばれる）ＵＴＥＸ番号２９１９

培地：
リン濃度の影響を調べるために、４種類の異なる培地で培養を追跡した。これらの培地は同じ基剤で構成される：
３０ｇ／Ｌのグリセロール、８ｇ／Ｌの（ＮＨ_４）_２ＳＯ_４、７１６ｍｇ／ＬのＭｇＳＯ_４、４４ｍｇ／ＬのＣａＣｌ_２、３ｍＬ／ＬのＦｅ−ＥＤＴＡストック溶液（６．９ｇ／ＬのＦｅＳＯ_４および９．３ｇ／ＬのＥＤＴＡ−Ｎａ_２）および４ｍＬ／Ｌの微量金属溶液（３．０９ｇ／ＬのＥＤＴＡ−Ｎａ_２；０．０８０ｇ／ＬのＣｕＳＯ_４・５Ｈ_２Ｏ；２．８６０ｇ／ＬのＨ_３ＢＯ_３；０．０４０ｇ／ＬのＮａＶＯ_３・４Ｈ_２Ｏ；１．８２０ｇ／ＬのＭｎＣｌ_２；０．０４０ｇ／ＬのＣｏＣｌ_２・６Ｈ_２Ｏ；０．２２０ｇ／ＬのＺｎＳＯ_４・７Ｈ_２Ｏ；０．０１７ｇ／ＬのＮａ_２ＳｅＯ_３；０．０３０ｇ／Ｌの（ＮＨ_４）_６Ｍｏ_７Ｏ_２４・４Ｈ_２Ｏ）。

リンを限定するために、２５０ｍｇ／Ｌ、５００ｍｇ／Ｌ、１ｇ／Ｌおよび２ｇ／Ｌなる濃度のＫＨ_２ＰＯ_４を用意する。培地を作製したら、３６ＮＨ_２ＳＯ_４を用いてｐＨを３に調整し、次いで、滅菌する。同じプロトコルを培地に適用し、あるいは窒素濃度を変え、このときは、ＫＨ_２ＰＯ_４濃度を初期値１ｇ／Ｌに保つ。

培養条件：
各１００ｍＬエレンマイヤーフラスコ中で、培地を２４０時間前培養し、インキュベートする（０．１％）。蛍光灯（Ｏｓｒａｍ８６５ＣｏｏｌＤａｙｌｉｇｈｔ）によって１００μｍｏｌｍ^−２ｓ^−１で一定照射しつつ、緩やかに撹拌しながら（１４０ｒｐｍ）、温度４２℃で、細胞を培養する。８００ｎｍでの吸光度を測定することによって、細胞成長の追跡を２４時間ごとに行う。

結果：
図３に、これらの試験の結果を示す。
（Ａ）初期培地における、種々の濃度の（ＮＨ_４）_２ＳＯ_４存在下での株の成長。
（Ｂ）培養終了時における、バイオマス中の細胞内フィコシアニン含有量の概算。
（Ｃ）初期培地における、種々の濃度のＫＨ_２ＰＯ_４存在下での株の成長。
（Ｄ）１８０時間および２５０時間での、バイオマス中のＰＣ量の概算。

これらの実験のために、細胞に白色光を照射する（１００μＥｍ^−２・ｓ^−１）。

フィコシアニン産生を促進する目的で培地に多量の窒素を加えることを除けば、出願人は、フィコビリタンパク質およびカロテノイドの産生には、培地中のリンの量が支配的であることを示すことができた（図３）。

出願人は、成長を同等にした場合に（図３Ｃ）、すなわち、リン濃度を限定しない場合に、２５０ｍｇ／ＬのＫＨ_２ＰＯ_４（または０．００２５モルのリン／Ｌ）を含有する培地におけるフィコシアニン産生が、２ｇ／ＬのＫＨ_２ＰＯ_４（または０．２モルのリン／Ｌ）を含有する培地におけるフィコシアニン産生よりも高いことを決定することができた（図３Ｂ）。

初期培地中の炭素源の濃度を固定した場合、初期培地中のリン濃度が直線的に高くなるほど、細胞内フィコシアニン含有量が低くなり、その逆も同様である。言い換えると、培地中の初期濃度のＰ／Ｃ比（リンのモル数／炭素のモル数で表される）が高いほど、バイオマス中の細胞内フィコシアニンおよびカロテノイド含有量が高くなる。

結果、回分培養法は、培地中のリンレベルを維持することを目的とし、理想的なリン濃度範囲を決定することによって、フィコビリタンパク質およびカロテノイド双方の産生を伴った成長を可能にする。クロレラに関する国際出願ＷＯ２０１５１０７３１２号公報に記載された事項とは逆に、リンの欠乏により、Ｇａｌｄｉｅｒｉａｓｕｌｐｈｕｒａｒｉａにおけるタンパク質含有量の全体的な増加が誘発されない。本発明者らの結果によれば、フィコビリタンパク質濃度は増加するが、バイオマスのタンパク質含有量（ＡＡ％）は一定のままである。

実施例４：フィコシアニンおよびカロテノイド産生に対する青色光とリン濃度とを組み合わせた影響
材料および方法
株：Ｇａｌｄｉｅｒｉａｓｕｌｐｈｕｒａｒｉａ（またはＣｙａｎｉｄｉｕｍｃａｌｄａｒｉｕｍ）ＵＴＥＸ番号２９１９

培地：
３０ｇ／Ｌのグリセロール、８ｇ／Ｌの（ＮＨ_４）_２ＳＯ_４、７１６ｍｇ／ＬのＭｇＳＯ_４、４４ｍｇ／ＬのＣａＣｌ_２、３ｍＬ／ＬのＦｅ−ＥＤＴＡストック溶液（６．９ｇ／ＬのＦｅＳＯ_４および９．３ｇ／ＬのＥＤＴＡ−Ｎａ_２）および４ｍＬ／Ｌの微量金属溶液（３．０９ｇ／ＬのＥＤＴＡ−Ｎａ_２；０．０８０ｇ／ＬのＣｕＳＯ_４・５Ｈ_２Ｏ；２．８６０ｇ／ＬのＨ_３ＢＯ_３；０．０４０ｇ／ＬのＮａＶＯ_３・４Ｈ_２Ｏ；１．８２０ｇ／ＬのＭｎＣｌ_２；０．０４０ｇ／ＬのＣｏＣｌ_２・６Ｈ_２Ｏ；０．２２０ｇ／ＬのＺｎＳＯ_４・７Ｈ_２Ｏ；０．０１７ｇ／ＬのＮａ_２ＳｅＯ_３；０．０３０ｇ／Ｌの（ＮＨ_４）_６Ｍｏ_７Ｏ_２４・４Ｈ_２Ｏ）。

培養条件：
青色光または白色光の存在下、ＫＨ_２ＰＯ_４の形態での所定範囲のリン濃度を使用し、エレンマイヤーフラスコ中、Ｇａｌｄｉｅｒｉａｓｕｌｐｈｕｒａｒｉａ株を２５０時間成長させた。

各１００ｍＬエレンマイヤーフラスコ中で、培地を２４０時間前培養し、インキュベートする（０．１％、ｖ／ｖ）。光とリン濃度を組み合わせた影響を調べるために、各エレンマイヤーフラスコに、白色ＬＥＤまたは青色ＬＥＤ（４５５ｎｍ）システムで照射する。各条件の光強度は、１００μｍｏｌｍ^−２ｓ^−１である。緩やかに撹拌しながら（２００ｒｐｍ）、温度４２℃で、細胞を培養する。８００ｎｍでの吸光度を測定することによって、細胞成長の追跡を２４時間ごとに行う。

結果：
図４に、これらの試験の結果を示す。

視覚的に、株には、青緑色から緑色を経由し淡黄色までの範囲の色の差がある。

上の実験に記載したのと同様に、青色光およびリンの欠乏について正の影響がみられる。

データの相互比較により、フィコシアニン、カロテノイドまたはクロロフェニルのいずれであれ、色素産生に最も望ましい条件は、低濃度のリン存在下かつ青色光での培養であることが明確に示される。

以下の第４表に、２５０時間成長させた後のバイオマス中の種々の色素の濃度を示す。

リン濃度の影響は、いずれの場合も有意であるが、白色光の存在下よりも青色光の存在下の方が、とりわけ顕著であり、フィコシアニンについて濃度を２倍に（図４Ａおよび第４表）、β−カロテンについて濃度を４．５倍に、そしてゼアキサンチンについて濃度を７倍に増やすことができる（図４Ｂおよび第４表）。

実施例５：連続培養におけるフィコシアニンおよびカロテノイド産生に対する青色光とリン濃度とを組み合わせた影響
培養条件：
５００ｍｇのＫＨ_２ＰＯ_４および波長４５５ｎｍで３ワットの光パワーを伝達する青色バッフルを用い、ＧａｌｄｉｅｒｉａＵＴＥＸ２９１９株を実施例１の条件で培養した。フィード培地は、マスト１リットルあたり６０〜６５ｇの乾燥重量を得るような割合である。培地の各成分の濃度は、実施例１に記載する培養開始時に使用される培地の割合に準じて調整される。

回分培養、流加培養、その後約６０ｇのＤＷ／Ｌへの安定化に対応する最初の培養期のために、光を最大出力の５０％に維持する。６００時間培養した後（産生期とみなされる）、光パワーを１００％、すなわち３ワットに上げた。

図５Ａ：（−○−）乾燥重量による成長の追跡；（−□−）８００ｎｍでの吸光度の測定による成長の追跡。

図５Ｂ：培養中の細胞内フィコシアニン含有量の変化の測定。

結果：
３週間後、マスト１リットルあたりのＤＥが定常的に６０〜６５ｇである培養法を確立した（図５Ａ）。６００時間で光パワーを上げると、その結果、バイオマス中のＰＣ含有量は４０ｍｇ／ＤＷ（ｇ）に達するまで徐々に増加する。最後の２００時間の培養中に測定されたＰＣ含有量は、平均して、上記値に近い値に維持される。

実施例６：本発明に従って培養されたＧａｌｄｉｅｒｉａＵＴＥＸ２９１９株から抽出されたフィコシアニンの物理化学特性評価
試験プロトコル
ＧａｌｄｉｅｒｉａＵＴＥＸ２９１９株を実施例２の条件で培養した。

これらの試験のために、Ｍｏｏｎら、２０１４（前掲）に記載のプロトコルに従って、フィコシアニンを抽出した。フィコシアニンの青色を、分光光度計（ＡｍｅｒｓｈａｍＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓＵｌｔｒａＳｐｅｃ２１００Ｐｒｏ）を用い、６１８ｎｍでの吸光度によって測定する。色の消失率は、参照条件（ｐＨ試験用に、ｐＨ６、温度試験用に、２５℃、アルコール耐性用に、０％エタノール）でのサンプルの吸光度測定に対して計算する。

酸性条件に対する耐性試験のために、フィコシアニン調製物にクエン酸溶液を加えることによって、ｐＨを徐々に下げる。各ｐＨ値について、フィコシアニン溶液のサンプルを採取し、６１８ｎｍでの吸光度を測定する。

温度に対する耐性試験のために、フィコシアニン溶液を、７０℃に予備加熱した水浴中に３０分間置き、室温まで冷却した後、６１８ｎｍでのサンプルの吸光度を測定する。

アルコールに対する耐性試験のために、１体積のフィコシアニン溶液を、１当量体積の０％、４０％、６０％、８０％および１００％のエタノール溶液と混合し、それぞれフィコシアニンを０％、２０％、３０％、４０％および５０％含む溶液を得る。１時間インキュベートした後、各混合物について、６１８ｎｍでの吸光度の測定を行う。

結果：
これらの試験の結果を図６に示す。

図６Ａは、Ｇａｌｄｉｅｒｉａｓｕｌｐｈｕｒａｒｉａ（ＵＴＥＸ２９１９）株から抽出されたフィコシアニンが、ｐＨ２．７５で、元の着色の８０％超を有することを示す。

図６Ｂは、Ｇａｌｄｉｅｒｉａｓｕｌｐｈｕｒａｒｉａ（ＵＴＥＸ２９１９）株から抽出されたフィコシアニンが、７０℃で３０分間インキュベートした後、元の着色の４０％超を有することを示す。

図６Ｃは、Ｇａｌｄｉｅｒｉａｓｕｌｐｈｕｒａｒｉａ（ＵＴＥＸ２９１９）株から抽出されたフィコシアニンが、４０％エタノール中で１時間インキュベートした後、元の着色の３０％超を有することを示す。

これらの結果は、スピルリナフィコシアニンについての従来技術に記載の結果に相当する（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｄｌｔ−ｓｐｌ．ｃｏ．ｊｐ／ｂｕｓｉｎｅｓｓ／ｅｎ／ｓｐｉｒｕｌｉｎａ／ｌｉｎａｂｌｕｅ．ｈｔｍ）。

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FR 2 789 399
WO2012/035262

Claims

少なくとも１つの炭素源を含む培地中でイデユコゴメ綱の単細胞紅藻類（ＵＲＡ）を培養するための方法であって、当該方法が、４００〜５５０ｎｍの狭い波長スペクトルを有する放射線の形態での少なくとも１つの照射工程を含んでなることを特徴とする、方法。
前記ＵＲＡが、イデユコゴメ（Ｃｙａｎｉｄｉａｌｅｓ）目のＵＲＡであり、より有利には、イデユコゴメ（Ｃｙａｎｉｄｉａｃｅａｅ）科またはガルディエリア（Ｇａｌｄｉｅｒｉａｃｅａｅ）科のＵＲＡであり、具体的には、シアニディオシゾン（Ｃｙａｎｉｄｉｏｓｃｈｙｚｏｎ）属、シアニジウム（Ｃｙａｎｉｄｉｕｍ）属、またはガルディエリア（Ｇａｌｄｉｅｒｉａ）属のＵＲＡであり、より具体的には、Ｃｙａｎｉｄｉｏｓｃｈｙｚｏｎｍｅｒｏｌａｅ１０Ｄ種、ＣｙａｎｉｄｉｏｓｃｈｙｚｏｎｍｅｒｏｌａｅＤＢＶ２０１種、Ｃｙａｎｉｄｉｕｍｃａｌｄａｒｉｕｍ種、Ｃｙａｎｉｄｉｕｍｄａｅｄａｌｕｍ種、Ｃｙａｎｉｄｉｕｍｍａｘｉｍｕｍ種、Ｃｙａｎｉｄｉｕｍｐａｒｔｉｔｕｍ種、Ｃｙａｎｉｄｉｕｍｒｕｍｐｅｎｓ種、Ｇａｌｄｉｅｒｉａｄａｅｄａｌａ種、Ｇａｌｄｉｅｒｉａｍａｘｉｍａ種、Ｇａｌｄｉｅｒｉａｐａｒｔｉｔａ種、またはＧａｌｄｉｅｒｉａｓｕｌｐｈｕｒａｒｉａ種のＵＲＡであり、優先的には、Ｇａｌｄｉｅｒｉａｓｕｌｐｈｕｒａｒｉａ種のＵＲＡである、請求項１に記載の方法。
前記照射が、４２０ｎｍ〜５００ｎｍ、有利には４３０〜４８０ｎｍ、より優先的には４５５ｎｍの狭い波長スペクトルを有する放射線の形態である、請求項１または２に記載の方法。
前記炭素源が、グルコース、スクロース、アセテートまたはグリセロールから選択されるものである、請求項１〜３のいずれか一項に記載の方法。
前記炭素源が、初期培地中、５ｍＭ〜１．５Ｍ、好ましくは５０ｍＭ〜８００ｍＭの濃度である、請求項１〜４のいずれか一項に記載の方法。
回分培養の場合、初期培地中の炭素濃度およびリン濃度が、または流加培養または連続培養の場合、培養中に消費される炭素およびリンの量が、リンのモル数／炭素のモル数で表される前記濃度のＰ／Ｃ比が０．０１８９８より小さく、有利には０．０１５０３より小さく、より有利には０．０１０５４より小さく、さらにより有利には０．００５２７より小さく、優先的には０．００２６３より小さく、より優先的には０．００１３１より小さくなるような量であってもよい、請求項１〜５のいずれか一項に記載の方法。
請求項１〜６のいずれか一項に記載の方法によって得られるバイオマスであって、ＵＲＡの密度が、２０〜２００ｇ／乾燥重量（Ｌ）、優先的には９０〜１５０ｇ／乾燥重量（Ｌ）である、バイオマス。
フィコビリタンパク質（フィコシアニンおよびアロフィコシアニン）の含有量が、２９〜２５０ｍｇ／乾燥重量（ｇ）、優先的には３５〜１５０ｍｇ／乾燥重量（ｇ）である、請求項６または７に記載のバイオマス。
フィコシアニンの含有量が、２９〜２００ｍｇ／乾燥重量（ｇ）、優先的には４０〜１００ｍｇ／乾燥重量（ｇ）である、請求項６〜８のいずれか一項に記載のバイオマス。
ｐＨが８〜２、優先的には７〜３、より優先的には４〜５の溶液中で着色がほとんど消えないか、あるいは全く消えない青色を有し、および／または、５０℃を超える温度で着色がほとんど消えないか、あるいは全く消えない青色を有し、および／または、エタノール中で着色がほとんど消えないか、あるいは全く消えない青色を有するフィコシアニンを含んでなる、請求項６〜９のいずれか一項に記載のバイオマス。
フィコシアニンを調製するための方法であって、当該方法が以下の工程：
（ａ）請求項１〜６のいずれか一項に記載の、４００〜５５０ｎｍの狭い波長スペクトルを有する放射線の形態での少なくとも１つの照射工程を用いて、少なくとも１つの炭素源を含む培地中でイデユコゴメ綱のＵＲＡを培養し、前記培地中に前記ＵＲＡを少なくとも２０ｇ／乾燥重量（Ｌ）の細胞密度で含んでなる発酵マストを得る工程と、
（ｂ）前記発酵マストから得られるバイオマスを回収する工程と、
（ｃ）前記バイオマスからフィコシアニンを回収する工程と
を少なくとも含んでなることを特徴とする方法。
食品または動物の餌、化粧品の用途における、請求項６〜１０のいずれか一項に記載のバイオマスの使用。
フィコシアニンおよび／またはカロテノイドを調製するための、請求項６〜１０のいずれか一項に記載のバイオマスの使用。
請求項７〜１２のいずれか一項に記載のバイオマスを少なくとも含んでなる製品。
請求項６〜１０のいずれか一項に記載のバイオマスから得られるか、または請求項１１に記載の方法によって得られるフィコシアニン。
食品における、および／または色素としての、請求項１５に記載のフィコシアニンの使用。
請求項１５に記載のフィコシアニンを少なくとも含んでなる製品。