CN116349890A - 包含藻青蛋白的酸性组合物 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及酸性组合物，特别是酸性食物组合物，其包含抗pH酸的至少一种藻青蛋白。

Description

包含藻青蛋白的酸性组合物
本申请是申请日为2016年9月22日、申请号为201680055641.4、发明名称为“包含藻青蛋白的酸性组合物”的发明专利申请的分案申请。
发明领域
本发明涉及一种酸性组合物，特别是酸性食品组合物，其包含至少一种酸性–pH–稳定的藻青蛋白。
现有技术
藻青蛋白是食用色素，其将蓝色给予添加它们的产品。从螺旋藻提取的藻青蛋白是现在仅有的由US–FDA(FR文件号：2013–19550)批准的天然蓝色色素。其以液体形式或粉末形式售卖用作食品中的蓝色色素。
然而，源自螺旋藻的藻青蛋白具有在酸性pH下(5以下)不稳定的缺点，其导致着色的损失并导致沉淀，这限制了它的使用。在最佳的情况下，损失稳定性发生在pH 4周围(比照源自螺旋藻的藻青蛋白
Figure BDA0004009238070000011
的技术规格；http://www.dlt–spl.co.jp/business/en/spirulina/linablue.html)。
因此，有许多酸性食品组合物，特别是碳酸或非碳酸饮料，其中源自螺旋藻的藻青蛋白不能用作食用色素或用于其抗氧化性质。
存在鉴定在酸性pH下稳定的，特别是在低于4的酸性pH稳定的新的藻青蛋白的需要。在酸性pH下最小暴露10分钟之后，在本文中测量pH抗性或稳定性为小于10％的着色的损失。可通过其他方法，如酸性组合物中的藻青蛋白的物理特征作为时间的函数，来测量pH稳定性。
发明内容
因此，本发明涉及一种酸性组合物，特别是一种酸性食品组合物，其可包含至少一种抗酸性–pH的藻青蛋白。有利地，所述藻青蛋白可为藻胆蛋白，其载脂蛋白至少包含SEQID NO 1或SEQ ID 2的蛋白质或其变体。
根据本发明，藻青蛋白具体地可为从Galdieriaceae提取的，更具体地为从Galdieria提取的藻青蛋白。
根据本发明的酸性组合物，特别是酸性食品组合物，可为固体或糊状或者液体，特别是任选的碳酸饮料。
根据本发明的酸性组合物，特别是酸性食品组合物意指具有4或更小的pH，优选地具有2至4的pH，并且更优选地具有2.5至3.5的pH的组合物。
发明详述
藻青蛋白和别藻青蛋白是藻胆蛋白，其包含由共价地结合至发色团的载脂蛋白组成的α和β亚单元。不同藻青蛋白基本上通过它们的α和β-亚单元载脂蛋白的序列来区分。
根据本发明的特定实施方式，酸性组合物，特别是酸性食品组合物，包含抗酸性–pH的藻青蛋白，所述抗酸性–pH的藻青蛋白的α-亚单元载脂蛋白包含SEQ ID NO 1(登录号YP_009051179.1)或其变体，并且其β-亚单元载脂蛋白包含SEQ ID 2(登录号YP_009051180.1)或其变体。
根据本发明的优选的实施方式，酸性组合物，特别是酸性食品组合物，包含抗酸性–pH的藻青蛋白，其α-亚单元载脂蛋白由SEQ ID NO 1(登录号YP_009051179.1)或其变体组成，并且其β-亚单元载脂蛋白由SEQ ID 2(登录号YP_009051180.1)或其变体组成。
根据本发明的另一个实施方式，酸性组合物，特别是酸性食品组合物，可进一步包含与藻青蛋白组合的别藻青蛋白。
有利地，所述别藻青蛋白的α-亚单元载脂蛋白包含SEQ ID NO 3(登录号YP_009051103.1)或其变体，并且β-亚单元载脂蛋白包含SEQ ID NO 4(YP_009051104.1)或其变体。
根据本发明的另一个优选的实施方式，所述别藻青蛋白的α-亚单元载脂蛋白由SEQ ID NO 3(登录号YP_009051103.1)或其变体组成，并且β-亚单元载脂蛋白由SEQ ID NO4(YP_009051104.1)或其变体组成。
蛋白质的氨基酸组合物可根据所述氨基酸组合物给予所述蛋白质不同性质。此外，蛋白质的特征取决于其氨基酸组成和其等电点(pI)。等电点是在蛋白质不携带净电荷时的溶液的pH，或换言之在分子为电中性时的pH，并且蛋白质往往会相互吸引、聚集和沉淀。在pH在它们的等电点以上时，蛋白质往往带负电荷并互相排斥。
使用由Patrickios和Yamasaki描述的计算机程序比较分析多种蛋白质的等电点(Polypeptide Amino Acid Composition and Isoelectric Point.II.Comparisonbetween Experiment and Theory.Analytical Biochemistry.231,1,1995:82–91.1995)显示出理论计算和实际上观察到的酸性pH抗性之间的一定的相关性。
由申请人进行的研究表明藻青蛋白的酸性pH抗性可与所述藻青蛋白的α亚单元的氨基酸序列连接。此外，值得注意地是，在藻青蛋白的α亚单元的氨基酸序列中，最初的26个氨基酸的鉴定好像特别重要。特别是通过培养Cyanidioschyzon、Cyanidium或Galdieria属的微藻株，更特别地是Galdieria sulphuraria、Cyanidium caldarium和Cyanidioschyzonmerolae株获得的藻青蛋白的情况。
因此，优选地，根据本发明的组合物可包含至少一种藻青蛋白，其中至少一种载脂蛋白，特别是其α亚单元，可具有允许在酸性pH下更好稳定性的低等电点。
低等电点意指3或更小，优选为2.5或更小，更优选为2.2或更小的等电点。
因此，更优选地，根据本发明的组合物可包含至少一种藻青蛋白，其中至少一种载脂蛋白，特别是其α亚单元可具有3或更小，优选为2.5或更小，更优选为2.2或更小的等电点。
因此，根据本发明的特定实施方式，酸性组合物，特别是酸性食品组合物，可包含至少一种藻青蛋白，其α-亚单元载脂蛋白可具有低等电点，更具体地包含至少一种藻青蛋白，其α-亚单元载脂蛋白可包含SEQ ID NO 1，或其变体。
因此，根据本发明的另一个特定实施方式，酸性组合物，特别是酸性食品组合物，包含至少一种藻青蛋白，其α-亚单元载脂蛋白可具有低等电点，更具体地包含至少一种藻青蛋白，其α-亚单元载脂蛋白可由SEQ ID NO 1或变体组成。
根据本发明的变体意指与参考序列相对应的蛋白质序列，在此情况下，由SEQ IDNO 1或SEQ ID NO 2或SEQ NO 3或SEQ NO 4表示的蛋白质通过参考序列的一个或多个氨基酸的一个或多个取代、插入或缺失来修饰，并且其具有与所述参考序列相同的功能性质。
优选地，根据本发明的变体与藻青蛋白的α亚单元具有至少83％的序列同一性，并且与藻青蛋白的β亚单元具有至少82％的序列同一性。
优选地，根据本发明的变体与α(SEQ ID NO 1)和β(SEQ ID NO 2)亚单元具有至少90％的同一性。
类似地，对于别藻青蛋白，变体优选地与别藻青蛋白的α亚单元具有至少89％的序列同一性，并且与别藻青蛋白的β亚单元具有至少90％的序列同一性。
本领域的技术人员知道如何利用其掌握的常规方法，特别是BLASTP程序(http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi)来测量蛋白质序列同一性。
类似地，本领域的技术人员知道如何通过在酸性pH中的简单稳定性实验，例如通过进行测试如实施例3中提出的测试，来鉴定所述序列的变体和证实它们保持相同结构性质。
本领域的技术人员知道，可通过至少一种氨基酸的取代、插入和/或缺失来修饰多肽而基本上不修改其功能。
例如，已知通过另外的化学上等价的氨基酸取代给定位置的氨基酸是序列变化的实例，其基本上不影响蛋白质的性质。
这些“保守”取代可被定义为在以下氨基酸的组中的交换
-Ala、Ser、Thr、Pro、Gly
-Asp、Asn、Glu、Gln
-His、Arg、Lys
-Met、Leu、Ile、Val、Cys和
-Phe、Tyr、Trp
因此，根据本发明的藻青蛋白和/或别藻青蛋白的载脂蛋白的变体相对于相应参考序列，特别是涉及藻青蛋白的α和/或β亚单元，可包含1至30个氨基酸的差异，只要获得的变体保持参考蛋白的性质和上述的百分比同源性/同一性。
更精确地根据本发明，
-源自取代、插入和/或缺失的、用于根据本发明的酸性组合物的藻青蛋白的α-亚单元载脂蛋白变体相对于相应参考序列可包含1至27个氨基酸的差异，只要获得的变体保持参考蛋白的性质和上述的百分比同一性。
-源自取代、插入和/或缺失的、用于根据本发明的酸性组合物的藻青蛋白的β-亚单元载脂蛋白变体相对于相应参考序列可包含1至30个氨基酸的差异，只要获得的变体保持参考蛋白的性质和上述的百分比同一性。
-源自取代、插入和/或缺失的、用于根据本发明的酸性组合物的别藻青蛋白的α-亚单元载脂蛋白变体相对于相应参考序列可包含1至24个氨基酸的差异，只要获得的变体保持参考蛋白的性质和上述的百分比同一性。
-源自取代、插入和/或缺失的、用于根据本发明的酸性组合物的别藻青蛋白的β-亚单元载脂蛋白变体相对于相应参考序列可包含1至20个氨基酸的差异，只要获得的变体保持参考蛋白的性质和上述的百分比同一性。
更具体地根据本发明，并且不管所考虑的参考序列如何(藻青蛋白α和/或β亚单元和/或别藻青蛋白α和/或β亚单元)，所述亚单元的变体相对于相应参考序列可优选地包含1至15个氨基酸的差异，优选1至10个氨基酸的差异，特别是1或2或3或4或5或6或7或8或9或10个氨基酸的差异，只要获得的变体保持参考蛋白的性质和上述的百分比同一性。
根据本发明，可通过培养天然表达藻青蛋白或其感兴趣的变体的天然有机体或通过培养遗传转化以表达由于其产生所述藻青蛋白或其变体的能力而选择的藻青蛋白或其感兴趣的变体的有机体来获得单独或与别藻青蛋白或其变体混合的，用于酸性组合物，特别是酸性食品组合物的藻青蛋白或其变体。
天然地表达用于根据本发明的组合物的藻青蛋白或其感兴趣的变体的示例性天然有机体包括Cyanidiales目的藻类(或微藻类)。
Cyanidiales目包括Cyanidiaceae和Galdieriaceae科，其自身细分为Cyanidioschyzon、Cyanidium和Galdieria属，此外，其中的成员包括，Cyanidioschyzonmerolae 10D、Cyanidioschyzon merolae DBV201、Cyanidiumcaldarium、Cyanidiumdaedalum、Cyanidium maximum、Cyanidium partitum、Cyanidium rumpens、Galdieriadaedala、Galdieria maxima、Galdieria partita和Galdieria sulphuraria种。可特别提及Galdieria sulphuraria(也称为Cyanidium caldarium)UTEX#2919株。
因此，根据本发明的实施方式，酸性组合物，特别是酸性食品组合物，包含来自如Cyanidiales目的藻类或微藻类的天然有机体，特别是来自Cyanidiaceae和Galdieriaceae科的天然有机体的抗酸性–pH的藻青蛋白。
更具体地根据本发明，酸性组合物，特别是酸性食品组合物，包含来自属于Cyanidioschyzon、Cyanidium、Galdieria属，优选地选自Cyanidium和Galdieria属的物种的天然有机体的抗酸性–pH的藻青蛋白。
甚至更具体地根据本发明，酸性组合物，特别是酸性食品组合物，包含来自选自以下的天然有机体的抗酸性–pH的藻青蛋白：Cyanidioschyzon merolae 10D、Cyanidioschyzon merolae DBV201、Cyanidium caldarium、Cyanidium daedalum、Cyanidium maximum、Cyanidium partitum、Cyanidium rumpens、Galdieria daedala、Galdieria maxima、Galdieria partita和Galdieria sulphuraria种。
根据本发明的酸性组合物，特别是酸性食品组合物的优选的形式包含来自天然微藻如Galdieria sulphuraria、Cyanidium caldarium或Cyanidioschyzon merolae的抗酸性–pH的藻青蛋白。更优选地，抗酸性–pH的藻青蛋白来自选自Galdieria sulphuraria和Cyanidium caldarium的天然微藻。
通过转化以表达由于其产生所述藻青蛋白或其变体的能力而选择的藻青蛋白或其感兴趣的变体的有机体的实例，可提及转化以表达SEQ ID NO 1和/或SEQ ID NO 2和/或SEQ ID NO 3和/或SEQ ID NO 4的载脂蛋白的微生物，所述微生物还包含产生发色团和将其结合至载脂蛋白需要的生物合成途径。特别地可提及酵母作为可经修饰以产生用于根据本发明的食品组合物的藻青蛋白和/或别藻青蛋白的微生物。
本领域的技术人员在现有技术中不难发现用于培养可产生用于根据本发明的组合物的藻青蛋白的天然和/或修饰的有机体的方法的描述。
例如，培养本领域技术人员公知的Cyanidiales目的Cyanidiaceae或Galdieriaceae可以混合营养模式有利地进行，光通常是色素的生物合成必需的。
这样的工业培养可以在大体积(即，1,000–升,10,000–升,20,000–升,100,000–升)发酵桶中有利地进行。培养可在本领域技术人员已知的条件下进行。其可以分批模式、以补料分批模式或以连续模式进行。
用于根据本发明的组合物的藻青蛋白可更具体地从通过如上所定义培养Cyanidiales目的藻获得的生物质提取，所述Cyanidiales以混合营养模式和具有400nm至550nm，优选地为420nm至500nm，优选为430至480nm，更优选地为约455nm的波长的光培养。其可为包含所述波长的光的具有宽光谱的“白”光。其还可有利地是由所述波长组成的窄光谱的光。
用于以混合营养模式工业制备Cyanidiales生物质的这样的方法和由此获得的生物质在2015年9月25日提交的专利申请FR 15 59072中特别描述，其内容通过提述并入本文。
本发明的目的是提供一种组合物，其中藻青蛋白在酸性pH下是稳定的。根据本发明，酸性组合物意指包含无机酸或有机酸和藻青蛋白的任何组合物。所述组合物可为液体、流体或粘性、糊状或固体，其具有酸性pH并且其中并入抗酸性–pH的藻青蛋白。
对于水性液体组合物，以通常的方式测量pH。对于非水性液体组合物或对于糊状或固体组合物，在将组合物溶解于足够量的水中以溶解包含在其中的可溶性化合物(包括无机酸或有机酸和藻蓝蛋白)之后测量pH值。
优选地，根据本发明的组合物是水性液体组合物，任选地呈凝胶形式，或者设计成溶解于水溶液或包含水的固体或糊状组合物的糊状或固体组合物。根据本发明的另一个优选的实施方式，酸性组合物糊状或固体组合物意图在潮湿的环境中使用和/或储存在潮湿的环境中。
用于根据本发明的组合物的无机酸或有机酸是本领域技术人员公知的。示例性的无机酸特别地包括碳酸、磷酸、盐酸、硫酸、高氯酸、磺酸和硝酸。示例性的有机酸特别地包括柠檬酸、乳酸、苹果酸、酒石酸、琥珀酸、优选为柠檬酸。
根据本发明的酸性食品组合物意指设计成通过人或动物摄入的并且落入先前定义中的任何组合物。必须认为营养食品酸性组合物落入本发明的上下文中的酸性食品组合物的定义中。
根据本发明的酸性食品组合物是本领域的技术人员公知的。它们可包含载体，所述载体可以包含与鉴定了其营养供应或有益于人类或动物的其健康性质的活性化合物相关的结构组分。根据本发明的酸性食品组合物还可包含食品添加剂，如变形剂、调味剂、防腐剂或本领域技术人员公知的任何组分。载体可包含水和/或蛋白质和/或脂肪和/或纤维和/或糖。载体的组分可仅具有结构性质，但他们通常因它们的营养供应而闻名。
根据本发明的酸性组合物可为即用型或以食品添加剂的形式添加到固体、糊状或液体制剂以制备可食用食品。
对于食品组合物，会从批准用于食品的酸化剂的列表中优选地选择酸，特别是碳酸、磷酸、柠檬酸、苹果酸、酒石酸和乳酸，更特别是柠檬酸。
此外，涉及根据本发明的非食品酸性组合物，它们可为药物、兽医或化妆品组合物，并且进一步包含已知并用于这样的组合物的任何添加剂和/或活性剂。
在根据本发明的固体、液体或糊状酸性组合物中，藻青蛋白可例如以粉末形式并入。所述酸性组合物，特别是所述酸性食品组合物，因此可为任何已知常规形式，如乳霜、凝胶、泡沫、糊剂等。示例性的固体食品组合物包括蛋糕或饼干、用于烹饪的干燥食品、可溶性粉末、胶状固体组合物(果冻)、泡沫等。
根据本发明，所述液体酸性组合物可为水性组合物，其中是溶解了藻青蛋白。其可为即用型组合物的形式或用于稀释的液体浓缩物的形式，特别地被摄取或添加至固体食品用于其制备或用于其摄取，例如应用于蛋糕给予其颜色的浓缩的液体“顶部”组合物。在这些浓缩的组合物中，可提及糖浆，其任选地含有醇。
根据本发明的液体酸性组合物可为改变粘度的，并且任选地包含添加剂如粘度剂、胶凝剂和本领域技术人员已知的其他构成添加剂，并且通常用于液体食品组合物的制备。
根据本发明的特定实施方式，液体食品组合物可任选地为碳酸酸性饮料。可特别提及苏打水、果汁、运动饮料、能量饮料、恢复饮料等。这些饮料的组合物是本领域的技术人员公知的，并且可特别地包含糖、矿物盐、食品添加剂、溶解气体等。根据本发明的饮料是常规的酸性饮料，其中，经常采用的着色剂已经由根据本发明的抗酸性–pH的藻青蛋白全部或部分代替。
根据本发明，根据本发明的组合物中的藻青蛋白含量可与本领域技术人员的实践一致。
例如，当藻青蛋白会用来着色酸性组合物时，那么所述组合物中的藻青蛋白含量可与本领域技术人员关于着色的实践一致。
在本发明的上下文中的液体酸性组合物中，藻青蛋白含量可为2.5mg/L至2,500mg/L，优选为25mg/L至300mg/L。
在即用型饮料类型的液体组合物中，藻青蛋白含量通常可为25mg/L至300mg/L，优选为50mg/L至100mg/L。
在使用前用于稀释的浓缩的液体组合物中，如糖浆，藻青蛋白含量通常可为250mg/L至2,500mg/L，优选为500mg/L至1,000mg/L。
在固体组合物中，藻青蛋白含量通常可为0.01mg/g至10mg/g，优选为0.1mg/g至5.0mg/g，更优选为0.25mg/g至2.5mg/g。
如在以下实施例中可见，本发明的优点之一在于由抗酸性–pH的藻青蛋白提供的着色随着时间更稳定。
本发明的其他方面和特征由阅读实施例和附图会变得更明显。
附图说明
图1描述了具有下述的Galdieria sulphuraria藻青蛋白和别藻青蛋白载脂蛋白的氨基酸序列：
SEQ ID NO 1 :YP_009051179.1: 藻青蛋白α亚单元；
SEQ ID NO 2 :YP_009051180.1: 藻青蛋白β亚单元；
SEQ ID NO 3 :YP_009051103.1: 别藻青蛋白α亚单元；
SEQ ID NO 4 :YP_009051104.1: 别藻青蛋白β亚单元；
图2呈现相对于源自螺旋藻的藻青蛋白
Figure BDA0004009238070000091
的稳定性曲线，稳定性曲线作为从其载脂蛋白序列由SEQ ID NO 1或其变体组成的Galdieria sulphuraria(UTEX2919)和Cyanidioschyzon merolae(ACUF 199)提取的藻青蛋白的pH的函数。
Figure BDA0004009238070000092
来自Galdieria sulphuraria(UTEX#2919)的藻青蛋白
Figure BDA0004009238070000093
来自Cyanidioschyzon merolae(ACUF 199)的藻青蛋白
(––o*––):Lina
Figure BDA0004009238070000094
来自钝顶螺旋藻(钝顶节旋藻)(Spirulina platensis(Arthrospira platensis))的藻青蛋白(从网址http://www.dlt–spl.co.jp/business/en/spirulina/linablue.html获得的数据),显示藻青蛋白沉淀出现时的pH值。
图3表示包含藻青蛋白的酸性饮料的随着时间的颜色变化。W0、W2、W4和W6:第0、2、4和6周。
实施例
实施例1：从Galdieria sulphuraria UTEX#2919产生和提取藻青蛋白
材料和方法株：Galdieria sulphuraria(还称为Cyanidium caldarium)UTEX#2919培养基
混合营养：30g/L甘油,8g/L(NH4)2SO4,1g/L KH2PO4,716mg/L MgSO4,44mg/LCaCl2,3mL/L的Fe–EDTA储备溶液(6.9g/L FeSO4和9.3g/LEDTA–Na2)和4mL/L的微量金属溶液(3.09g/L EDTA–Na2；0.080g/LCuSO4,5H2O；2.860g/L H3BO3；0.040g/L NaVO3,4H2O；1.820g/L MnCl2；0.040g/L CoCl2,6H2O；0.220g/L ZnSO4,7H2O；0.017g/L Na2SeO3；0.030g/L(NH4)6Mo7O24,4H2O)。
培养条件：
具有计算机控制的自动化系统的1–至2–L–使用体积的反应器中进行培养。通过添加碱(14％氨溶液(wNH3/w))和/或酸(4N硫酸溶液)来调控培养物pH。将培养温度设置到37℃。通过装备有白色LED或蓝色LED系统的(455nm)挡板以与专利WO 2014/174182中描述的类似的方法照射培养物。通过测量在800nm的吸光度在不同时间进行细胞生长的跟踪。并通过过滤进行干质量的测量。
生长结束时的培养物的性能特征汇总在下表1中：
Figure BDA0004009238070000101
每克干物质的细胞内藻青蛋白含量的测量使用由Moon及其同事描述的提取和测定进行[Moon et al.,Korean J.Chem.Eng.,2014,1–6]，同时使用水代替磷酸缓冲液。
实施例2：提取藻青蛋白
在实施例1的条件下培养Galdieria sulphuraria(UTEX#2919)和/或Cyanidioscyizon merolae(ACUF199)株。
然后根据由Moon et al.,2014(op.cit.)描述的方案中的改变提取藻青蛋白。所述改变在于用软化水代替用来溶解藻青蛋白的磷酸缓冲液。
由此获得提取物(还称为“藻青蛋白提取物”或“粗提物”)，其除了感兴趣的藻青蛋白之外还包含其他水溶性蛋白质。藻青蛋白提取物根据使用的提取和/或纯化的方法可具有几种可能的性质。例如，除了藻青蛋白之外，粗提物会含有比在纯化的提取物中发现的更高量的水溶性蛋白质。纯化的提取物意指通过超滤、中空纤维过滤或离子交换色谱这些本领域技术人员已知的方法去除一部分的水溶性蛋白质同时保留藻青蛋白的粗提物。
纯度指数在传统上通过计算在618nm(藻青蛋白的特定吸光度)的溶液与在280nm的溶液的吸光度的比率表示，芳香氨基酸的特定吸光度给出总蛋白质水平的想法。该比率越低，溶液中除了藻青蛋白之外的蛋白质的量越高。
使用来自
Figure BDA0004009238070000111
实验室的
Figure BDA0004009238070000112
切向流动式过滤系统纯化粗提物。
Figure BDA0004009238070000113
表2.在纯化之前和之后藻青蛋白提取物的纯度指数测量
实施例3：从Galdieria sulphuraria(UTEX#2919)和Cyanidioschyzon merolae(ACUF199)株和钝顶螺旋藻(节旋藻)(Spirulina(Arthrospira)platensis)提取的藻青蛋白作为pH的函数的稳定性研究
在实施例1的条件下培养Galdieria sulphuraria(UTEX#2919)和Cyanidioschyzon merolae(ACUF199)株
通过从公司DIC Lifetec Co.,Ltd.(东京,日本)取得商业产品
Figure BDA0004009238070000114
(http://www.dlt–spl.co.jp/business/en/spirulina/linablue.html)(即从钝顶螺旋藻(节旋藻)提取的藻青蛋白)的数据作为参考来进行测试。
用实施例2中制备并具有2.12的纯度指数的藻青蛋白进行这些测试。通过用超速2100pro分光光度计(Amersham)测量在618nm的吸光度完成蓝色的测量。在参考条件下(pH6)相对于样品的吸光度测量计算百分比颜色损失。
对于在酸性条件下的抗性测试，通过将5％柠檬酸溶液(Sigma 251275)添加至藻青蛋白制剂来逐渐降低pH。对于每个pH值，收集藻青蛋白溶液的样品，并且在降低pH至所希望的值后10分钟，在618nm测量其吸光度。
在图2中呈现这些测试的结果。
与螺旋藻的pH-抗性相比，从Galdieria sulphuraria(UTEX#2919)
Figure BDA0004009238070000121
提取的藻青蛋白表现出非常好的pH-抗性，直至pH 2.75时具有少于10％的色素损失(其在pH 3的着色为98.25％,在pH 2.75为92.4％)，当pH 2.5时损失增加(在pH 2.5为79％；在pH2.25为75％；在pH 2为46％)。
与螺旋藻的pH-抗性相比，从Cyanidioschyzon merolae(ACUF 199)
Figure BDA0004009238070000122
株提取的藻青蛋白表现良好的pH-抗性，其在pH 3的着色为大于90％，在pH 2.75为70％；在pH 2.5为40％；在pH 2.25为23％；在pH 2为20％。
从钝顶螺旋藻[(––o*––)]株提取的藻青蛋白表现出其在pH 4的着色仅为90％，在pH 3.8为80％；在pH 3.6为60％；在pH 3.4为38％。从钝顶螺旋藻提取的藻青蛋白当pH 3.8时开始沉淀。
总之，Galdieria sulphuraria或Cyanidioschyzon merolae藻青蛋白比从螺旋藻提取的藻青蛋白更抗酸性pH。
实施例4–来自不同微藻的藻青蛋白和别藻青蛋白的载脂蛋白序列的比较分析及其等电点的测量
为了鉴定增加对酸性pH抗性的可能的原因，基于数据库中可访问的公开序列(参见登录号)，使用本领域的技术人员广泛使用的BLASTP程序比较由多种微生物特别是微藻产生的藻青蛋白和别藻青蛋白的α和β亚单元的序列。相对对应于Galdieria sulphuraria株的亚单元的载脂蛋白序列做出比较。
与此同时，通过Patrickios和Yamasaki(1995)描述的计算机程序来测定进行序列比较的藻青蛋白和别藻青蛋白的α和β亚单元的等电点。
由Galdieria sulphuraria株产生的藻青蛋白和别藻青蛋白用作这些研究的参考。
结果
序列比较和pI计算的结果呈现在下表3和4中：
Figure BDA0004009238070000123
Figure BDA0004009238070000131
表3.比较多种有机体的藻青蛋白的α和β载脂蛋白序列。显示出每个蛋白的等电点(Patrickios和Yamasaki,1995)。
Figure BDA0004009238070000132
Figure BDA0004009238070000141
表4.比较来自多种有机体的别藻青蛋白的α和β载脂蛋白序列。显示出每个蛋白的等电点(Patrickios和Yamasaki,1995)。
序列和等电点比较显示出最抗酸性pH的藻青蛋白的α亚单元具有低于3的等电点和与Galdieria sulphuraria的序列较高的百分比同一性。
实施例5：在饮料中随时间的稳定性
从UTEX#2919株提取的藻青蛋白在酸性培养基中随时间的稳定性测试通过将藻青蛋白添加至柠檬水饮料(pH 2.95；如实施例6所述:饮料1)进行。在添加0.025‰的由SEQ IDNO 1的变体组成的藻青蛋白载脂蛋白序列之后，在室温下，将饮料暴露于使用人造光源的昼/夜循环(16h/8h)6周。
随时间常规取样以测量在618nm的吸光度。在第0周(W0)、2(W2)、4(W4)和6周(W6)取等分试样，并且用超速2100pro分光光度计(Amersham)测量在618nm的吸光度，以定义100％着色点。剩余颜色表示为初始参考值的百分比。
图3显示了该实验的结果。值得注意地是，在长期暴露于光期间稳定的颜色随时间损失。然而，暴露6周后，保留了多于60％的颜色。
实施例6：包含藻青蛋白的液体形式的酸性饮料的实例
含有藻青蛋白的饮料可具有以下组合物：
饮料1-苏打水饮料：
Figure BDA0004009238070000151
该饮料的pH为2.95
饮料2–运动员的保健饮料:
Figure BDA0004009238070000152
该饮料的pH为3.5
实施例6:包含藻青蛋白的可溶性粉末形式的酸性饮料
Figure BDA0004009238070000153
由此制备的粉末(75至110g)可溶解于1L的水中以获得蓝色着色的酸性饮料。
实施例7:包含藻青蛋白的固体酸性组合物:酸性糖果:
Figure BDA0004009238070000154
Figure BDA0004009238070000161
参考文献
-Moon et al.,Korean J.Chem.Eng.,2014,1–6
-Patrickios et Yamasaki,Polypeptide Amino Acid Composition andIsoelectricPoint.II.Comparison between Experiment and Theory.Analytical
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-FR Doc No:2013–19550
-WO 2014/174182
-FR 15 59072filed on 25September 2015
-http://www.dlt–spl.co.jp/business/en/spirulina/linablue.html
-http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi
更具体地，本申请提供下列各项：
1.一种酸性组合物，特别是一种酸性食品组合物，其包含至少一种无机酸或有机酸和至少一种抗酸性-pH的藻青蛋白。
2.根据项1的组合物，其特征在于所述藻青蛋白为藻胆蛋白，其载脂蛋白包含SEQID NO 1或SEQ ID 2的蛋白质或其变体。
3.根据项2的组合物，其特征在于所述藻青蛋白的α-亚单元载脂蛋白包含SEQ IDNO 1或其变体，且所述藻青蛋白的β-亚单元包含SEQ ID 2或其变体。
4.根据项3的组合物，其特征在于所述α-亚单元载脂蛋白由SEQ ID NO 1或其变体组成，且所述β-亚单元由SEQ ID 2或其变体组成。
5.根据项1至4中任一项的组合物，其特征在于，其进一步包含与所述藻青蛋白组合的别藻青蛋白。
6.根据项5的组合物，其特征在于，所述别藻青蛋白的α-亚单元载脂蛋白包含SEQID NO 3或其变体，且所述别藻青蛋白的β-亚单元包含SEQ ID NO 4或其变体。
7.根据项6的组合物，其特征在于，所述别藻青蛋白α-亚单元载脂蛋白由SEQ IDNO 3或其变体组成，且β-亚单元载脂蛋白由SEQ ID NO 4或其变体组成。
8.根据项1至7中任一项的组合物，其特征在于，所述藻青蛋白为从Cyanidiales目的藻(或微藻)提取的藻青蛋白。
9.根据项1至8中任一项的组合物，其特征在于，所述藻青蛋白为从Cyanidiaceae科或Galdieriaceae科的藻(或微藻)提取的藻青蛋白。
10.根据项1至9中任一项的组合物，其特征在于，所述藻青蛋白为从Cyanidioschyzon、Cyanidium或Galdieria属的藻(或微藻)提取的藻青蛋白。
11.根据项1至10中任一项的组合物，其特征在于，所述藻青蛋白为从Cyanidioschyzon merolae 10D、Cyanidioschyzon merolae DBV201、Cyanidiumcaldarium、Cyanidium daedalum、Cyanidium maximum、Cyanidium partitum、Cyanidium rumpens、Galdieria daedala、Galdieria maxima、Galdieria partita、Galdieria sulphuraria种，优选地从Galdieria sulphuraria、Cyanidium caldarium和Cyanidioschyzon merolae种的藻(或微藻)提取的藻青蛋白。
12.根据项1至11中任一项的组合物，其特征在于，其具有4或更小的pH。
13.根据项1至11中任一项的组合物，其特征在于，其具有2至4的pH。
14.根据项1至11中任一项的组合物，其特征在于，其具有约2.5至3.5的pH。
15.根据项1至14中任一项的组合物，其特征在于，所述藻青蛋白的α–亚单元载脂蛋白具有低于3的等电点。
16.根据项1至14中任一项的组合物，其特征在于，所述藻青蛋白的α–亚单元载脂蛋白具有低于2.5的等电点。
17.根据项1至14中任一项的组合物，其特征在于，所述藻青蛋白的α–亚单元载脂蛋白具有低于2.2的等电点。
18.根据项1至17中任一项的组合物，其特征在于，其为固体。
19.根据项18的组合物，其特征在于，所述藻青蛋白含量为0.25mg/g至2.5mg/g。
20.根据项1至17中任一项的组合物，其特征在于，其为液体。
21.根据项15的组合物，其特征在于，所述藻青蛋白含量为2.5mg/L至2,500mg/L。
22.一种碳酸或非碳酸饮料，其包含根据项20或21中一项的液体酸性组合物。

Claims (10)

1.一种酸性食品组合物，其pH范围为2.5至4且包含至少一种无机酸或有机酸和至少一种抗酸性-pH的藻青蛋白，其中所述抗酸性-pH的藻青蛋白在pH等于或小于4时是稳定的，所述抗酸性-pH的藻青蛋白为从Cyanidioschyzon属的藻提取的藻青蛋白。
2.根据权利要求1的组合物，其特征在于，其进一步包含与所述藻青蛋白组合的别藻青蛋白。
3.根据权利要求1或2的组合物，其特征在于，所述藻青蛋白为从Cyanidioschyzonmerolae种提取的藻青蛋白。
4.根据权利要求1至3中任一项的组合物，其特征在于，所述组合物具有2.5至3.5的pH。
5.根据权利要求1至4中任一项的组合物，其特征在于，所述藻青蛋白的α–亚单元载脂蛋白具有低于3的等电点。
6.根据权利要求1至4中任一项的组合物，其特征在于，所述藻青蛋白的α–亚单元载脂蛋白具有低于2.5的等电点。
7.根据权利要求1至4中任一项的组合物，其特征在于，所述藻青蛋白的α–亚单元载脂蛋白具有低于2.2的等电点。
8.根据权利要求1至7中任一项的组合物，其特征在于，所述组合物为固体。
9.根据权利要求8的组合物，其特征在于，所述藻青蛋白含量为0.25mg/g至2.5mg/g。
10.根据权利要求1至7中任一项的组合物，其特征在于，所述组合物为液体。
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