CN106047776B - 一种木醋杆菌改良发酵培养基 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种木醋杆菌改良发酵培养基。该木醋杆菌改良发酵培养基中添加了50～100g/L葡萄糖酸/葡萄糖酸钠，加入的葡萄糖酸/葡萄糖酸钠溶液能够形成一种缓冲体系，有效控制细菌纤维素发酵生产过程中的pH，将pH控制在适宜细菌繁殖生长的范围内。发酵中间产物葡萄糖酸的加入能够让木醋杆菌更快地进入快速合成阶段，大幅度提高生产效率。同时，葡萄糖酸/葡萄糖酸钠作为额外的碳源，能够在缩短发酵周期的基础上，有效提高整个发酵过程的最终产量。

Description

一种木醋杆菌改良发酵培养基
技术领域
本发明涉及一种木醋杆菌改良发酵培养基，具体涉及一种添加葡萄糖酸/葡萄糖酸钠作为缓冲溶液兼碳源，能够缩短木醋杆菌发酵周期并且提高纤维素产量的木醋杆菌改良发酵培养基，属于生物技术领域。
背景技术
人工合成纤维素的过程中存在的产量低、发酵周期过长导致能耗大一直是较为棘手的问题，现有工艺主要通过对pH、温度、溶氧等关键培养条件的控制，达到缩短发酵时间和提高最终产量的效果。
近年来，多种方法被用于控制发酵过程中的pH，其中大多是直接接入一定量的强酸强碱先进行局部调节，然后通过搅拌或者气升的方式改变整个发酵环境的pH。文献1(N.Noro.Y，et al.Utilization of the buffering capacity of corn steep liquor inbacterial cellulose production by Acetobacter xylinum，2004，64:199-205)报道了一种用玉米浆作为缓冲溶液进行木醋杆菌发酵的方法，该方法中，玉米浆既作为缓冲溶液又作为氮源被细菌所吸收利用，提高了发酵产量，但是玉米浆成分非常复杂，无法明确指出提高产量的关键性因素。文献2(Chia-Hung Kuo，et al.Utilization of acetate bufferto improve bacterial cellulose production by Gluconacetobacter xylinus，2016，53:98-103)报道了一种以醋酸作为缓冲溶液，控制发酵条件，从而提高产量的方法，该方法仅可以提高发酵过程的最终产量，并未缩短发酵周期的。文献3(JUNG WOOK HWANG，etal..Effects of pH and Dissolved Oxygen on Cellulose Production by AcetobacterxyZh.m～BRCS in Agitated Culture，1999，88：183-188)报道木醋杆菌在发酵生成纤维素的过程中，会产生葡萄糖酸，使得pH下降，从而降低木醋杆菌的活性，导致发酵周期的延长。
综上所述，发酵条件的优化在整个发酵过程中占据着举足轻重的地位。寻找合适的缓冲剂，控制发酵过程中的pH参数，加入适当的发酵过程中的中间体从而改善发酵环境，缩短发酵周期，提高最终产量是可行之径。
发明内容
针对现有技术中的不足，本发明提供了一种木醋杆菌改良发酵培养基，该改良发酵培养基中含有葡萄糖酸/葡萄糖酸钠，其中葡萄糖酸/葡萄糖酸钠作为缓冲剂兼碳源，能够调节发酵过程中的pH，缩短木醋杆菌发酵周期的同时提高纤维素产量。
本发明的技术方案如下：
一种木醋杆菌改良发酵培养基，由以下组分组成：
葡萄糖20～25g/L，蔗糖20～30g/L，硫酸铵0.8～1.2g/L，磷酸二氢钾3～6g/L，硫酸镁0.5～0.7g/L，乳酸钙0.2～0.3g/L，蛋白胨8～15g/L，酵母浸粉5～10g/L，醋酸1～3g/L，柠檬酸0.5～0.8g/L，羧甲基纤维素钠0.3～0.4g/L，葡萄糖酸/葡萄糖酸钠50～100g/L，其中，葡萄糖酸与葡萄糖酸钠的质量比为1:1～5。
利用本发明的木醋杆菌改良发酵培养基进行发酵时，通过常规方法将菌种活化，再通过摇瓶扩大培养得到木醋杆菌种子液，最后将木醋杆菌种子液加入到改良发酵培养基中进行动态培养。发酵过程中木醋杆菌种子液的接种量为5％～10％，即每100mL发酵液中加入5～10mL种子液。动态培养中，转速为160～200rpm。
与现有技术相比，本发明的木醋杆菌改良发酵培养基，通过添加葡萄糖酸/葡萄糖酸钠，并调控葡萄糖酸与葡萄糖酸钠的比例，加入的葡萄糖酸/葡萄糖酸钠溶液形成缓冲体系，有效控制细菌纤维素发酵生产过程中的pH，将pH控制在适宜的细菌繁殖生长的范围，葡萄糖酸作为中间产物，其加入能够让细菌更快进入快速合成阶段，生产效率大幅提高。同时，葡萄糖酸/葡萄糖酸钠作为额外的碳源，能够在缩短发酵周期的基础上，有效提高整个发酵过程的最终产量。
附图说明
图1是实施例1中木醋杆菌在含有不同浓度的葡萄糖酸/葡萄糖酸钠的发酵培养基中的发酵产量对比图。
图2是实施例2中木醋杆菌在添加葡萄糖酸/葡萄糖酸钠的发酵培养基和未添加葡萄糖酸/葡萄糖酸钠的发酵培养基中的发酵产量对比图。
图3是实施例3中木醋杆菌在添加葡萄糖酸/葡萄糖酸钠的发酵培养基和未添加葡萄糖酸/葡萄糖酸钠的发酵培养基中的发酵过程中的pH对比图。
具体实施方式
以下结合实施例和附图对本发明作进一步详述。
本发明实施例中采用的木醋杆菌为Acetobacter xylinum NUST4.2。
本发明中种子液的制备以及参数监测可参考现有方法，其中种子液可通过以下步骤制得：
将4℃低温保藏的菌种于30℃条件下静置20min，用接种环挑取一环菌种划线于固体平板培养基中，将平板培养基于30℃培养箱中静置培养36h。固体培养基组成(g/100mL)：葡萄糖2.0，蔗糖1.0，硫酸镁0.04，柠檬酸0.11，磷酸二氢钠0.25，蛋白胨1.0，琼脂1.8，酵母浸粉0.1。pH＝6.0。121℃灭菌30min；
将所得已活化种子用接种环挑取2～3环，接种到装有1/5种子液的500mL锥形瓶中，然后放入摇床中以120-160rpm往复摇晃培养48h。种子液组成(g/100mL)：葡萄糖2.0，硫酸铵0.6，磷酸二氢钾0.1，硫酸镁0.04，蛋白胨0.3，酵母浸粉0.225，羧甲基纤维素钠0.04。121℃灭菌30min。
BC产量和pH参数监测参考以下方法：
BC产量：将发酵得到的细菌纤维素用1mol/L的NaOH于80℃水浴60min，取出后用醋酸中和多余的NaOH，用水将多余的醋酸冲洗干净，120℃的干燥箱干燥至衡重，于1/10000分析天平测定得到质量，按发酵液体积换算得到各个状态的纤维素产量。
pH监测：采用pH电极对发酵过程中的pH进行检测。
实施例1
将种子液加入到40个摇瓶中，每个摇瓶含有100mL发酵液，加入比例为100mL发酵液中加入5mL种子液。发酵液组成(g/100mL)：葡萄糖2.5，蔗糖3.0，硫酸铵0.12，磷酸二氢钾0.6，硫酸镁0.07，乳酸钙0.03，蛋白胨1.5，酵母浸粉1.0，醋酸0.3，柠檬酸0.08，羧甲基纤维素钠0.04。将摇瓶标记为1～4组，每组10个，每组分别加入葡萄糖酸/葡萄糖酸钠(1:1)：0g、2g、5g、10g。加入种子液前121℃灭菌30min。
将上述40个摇瓶置于160～200rpm摇床中动态培养。每隔8h取出1～4组中摇瓶各一个，按照参数监测中BC产量监测的方法进行纤维素含量的测定，结果如图1所示。
由图1可以看出，加入了葡萄糖酸/葡萄糖酸钠的2～4组在相同的发酵时间的条件下，产量明显高于第1组没有加的。同时，随着时间的增加，产生的加速效果逐渐明显，但第3、4组效果接近，可以得出，葡萄糖酸/葡萄糖酸钠最适宜的加入量为50～100g/L。
实施例2
为了进一步得到发酵过程中的产量变化，可以将取样时间间隔进一步缩短至4h。
将种子液加入到40个装有100mL的发酵液中，加入比例为100mL发酵液中加入8mL种子液。发酵液组成(g/100mL)：葡萄糖2.25，蔗糖2.75，硫酸铵0.1，磷酸二氢钾0.5，硫酸镁0.07，乳酸钙0.02，蛋白胨1.0，酵母浸粉0.75，醋酸0.15，柠檬酸0.06，羧甲基纤维素钠0.04。向其中20个摇瓶中，每个摇瓶加入5g葡萄糖酸/葡萄糖酸钠(1:3)，并将含有葡萄糖酸/葡萄糖酸钠的瓶子标记为A1类，其余为B1类。加入种子液前121℃灭菌30min。
将上述40个摇瓶置于160～200rpm摇床中动态培养。每隔4h取出含有葡萄糖酸/葡萄糖酸钠和不含有的摇瓶各一个，按照参数监测中BC产量监测的方法进行纤维素含量的测定，结果如图2所示。
由图2可见，相对于没有添加葡萄糖酸/葡萄糖酸钠的发酵液，添加了葡萄糖酸/葡萄糖酸钠的发酵液中的纤维素增长速率明显较快，而且最终纤维素产量也高出前者较多。
实施例3
将种子液加入到40个装有100mL的发酵液中，加入比例为100mL发酵液中加入10mL种子液。发酵液组成(g/100mL)：葡萄糖2.0，蔗糖2.0，硫酸铵0.08，磷酸二氢钾0.3，硫酸镁0.05，乳酸钙0.02，蛋白胨0.8，酵母浸粉0.5，醋酸0.1，柠檬酸0.05，羧甲基纤维素钠0.03。向其中20个摇瓶中，每个摇瓶加入10g葡萄糖酸/葡萄糖酸钠(1:5)，并将含有葡萄糖酸/葡萄糖酸钠的瓶子标为A2类，其余的标为B2类。加入种子液前121℃灭菌30min。
将上述40个摇瓶置于160～200rpm摇床中动态培养。每隔4h取出含有葡萄糖酸/葡萄糖酸钠和不含有的摇瓶各一个，按照参数监测中pH监测的方法进行纤维素含量的测定，结果如图3所示。
由图3可以看出，添加了葡萄糖酸/葡萄糖酸钠的发酵液pH变化趋势明显较未加入的更小，起到了缓冲溶液的作用。同时，整个过程的pH集中在适合细菌发酵生产纤维素的4.0～5.5之间，说明葡萄糖酸/葡萄糖酸钠的加入可以加速细菌纤维素生成速率。

Claims (4)

1.一种木醋杆菌改良发酵培养基，其特征在于，由以下组分组成：
葡萄糖20～25g/L，蔗糖20～30g/L，硫酸铵0.8～1.2g/L，磷酸二氢钾3～6g/L，硫酸镁0.5～0.7g/L，乳酸钙0.2～0.3g/L，蛋白胨8～15g/L，酵母浸粉5～10g/L，醋酸1～3g/L，柠檬酸0.5～0.8g/L，羧甲基纤维素钠0.3～0.4g/L，葡萄糖酸/葡萄糖酸钠50～100g/L，其中，葡萄糖酸与葡萄糖酸钠的质量比为1:1～5。
2.根据权利要求1所述的木醋杆菌改良发酵培养基在细菌纤维素发酵中的应用，其特征在于，方法如下：将菌种活化，再通过摇瓶扩大培养得到木醋杆菌种子液，最后将木醋杆菌种子液加入到改良发酵培养基中进行动态培养。
3.根据权利要求2所述的木醋杆菌改良发酵培养基在细菌纤维素发酵中的应用，其特征在于，所述的发酵过程中木醋杆菌种子液的接种量为5％～10％。
4.根据权利要求2所述的木醋杆菌改良发酵培养基在细菌纤维素发酵中的应用，其特征在于，所述的动态培养中，转速为160～200rpm。
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