CN103710404B - 一种高分子量γ- 聚谷氨酸的生产方法 - Google Patents
一种高分子量γ- 聚谷氨酸的生产方法 Download PDFInfo
- Publication number
- CN103710404B CN103710404B CN201310749440.2A CN201310749440A CN103710404B CN 103710404 B CN103710404 B CN 103710404B CN 201310749440 A CN201310749440 A CN 201310749440A CN 103710404 B CN103710404 B CN 103710404B
- Authority
- CN
- China
- Prior art keywords
- polyglutamic acid
- gamma
- fermentation
- molecular weight
- pure water
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Active
Links
Landscapes
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
Abstract
本发明公开了一种高分子量γ-聚谷氨酸的生产方法，属于生物发酵生产高分子材料的技术领域，以地衣芽孢杆菌CGMCC？NO.3336为出发菌株，通过对发酵过程中通风与转速的调控，发酵后期降低转速减少剪切力对聚谷氨酸合成的影响，改变温度从而影响聚谷氨酸合成酶的活性，特别是依靠流加葡萄糖，氯化钠，CaCl2·6H2O，MnSO4，MgSO4；控制发酵pH并增加培养基中的离子强度从而得到分子量明确的聚谷氨酸，且分子量均较高，发酵结束，经检测γ-聚谷氨酸的分子量在100万-400万道尔顿。本发明工艺简单，γ-聚谷氨酸的分子量较高且相对稳定可控，可实现规模化生产。
Description
技术领域：
本发明属于生物发酵生产高分子材料技术领域，具体地涉及一种高分子量γ-聚谷氨酸的生产方法。
背景技术
γ-聚谷氨酸是由D-谷氨酸和L-谷氨酸通过α-氨基和γ-羧基间的酰胺键结合而成的一种多功能生物可降解高分子材料。由于γ-聚谷氨酸及其衍生物具有优良的水溶性和吸附性，能彻底被生物降解，对人和动物安全无毒，可以食用等优点，因而可作为保水剂、增稠剂、絮凝剂、重金属吸附剂、药物/肥料缓释剂及药物载体等，在农业、食品、医药、化妆品、环保、合成纤维和涂膜等领域具有广阔的应用前景。随着化工合成材料造成的环境污染日益严重，开发生物可降解材料在一定程度上替代化学材料已成为整个国际社会的迫切需求。
γ-聚谷氨酸的制备方法有化学合成、提取和微生物发酵三种方法。微生物发酵法比前两种方法的生产成本低，生产过程对环境的污染小，所以现在主要采用微生物发酵法生产γ-聚谷氨酸，主要生产菌是芽孢杆菌属的菌株，包括各种（纳豆）枯草芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌、炭疽芽孢杆菌，近年来国内外主要以枯草芽孢杆菌来发酵生产。
γ-聚谷氨酸的分子量和多分散性是其重要的特征参数，Shih等对γ-聚谷氨酸分子量的控制进行了专门研究。一般而言，由芽孢杆菌产生的γ-聚谷氨酸的平均分子量在105-8x106之间，而多分散在2-5之间。分子量越大，其粘性、吸水与保水性越强，应用领域越广泛，但同时，分子量越大，其流变性越难控制，这给生产高分子量的γ-聚谷氨酸带来瓶颈。高华，张艳丽,刘克为以枯草芽孢杆菌纳豆亚种为出发菌株，制备的γ-聚谷氨酸分子量为42.6万道尔顿，（《现代生物医学进展》2009年第14期2637-2640页,2605页,共5页）；中国专利CN101597627B公开了一种高分子γ-聚谷氨酸的生产方法，利用纳豆菌通过外界环境胁迫的方法提高了γ-聚谷氨酸（γ-PGA）的产率，抑制了γ-PGA的分解，增加了γ-PGA生产的稳定性与大分子量的高粘度特性，γ-PGA的分子量达到300万道尔顿以上，但是纳豆菌难以实现规模化生产。
目前，国内外对制备γ-PGA研究主要集中在提高γ-PGA的发酵产率上，对γ-PGA分子量的关注很少，这主要与γ-聚谷氨酸的分子量的多分散性有关，在传统的发酵方法中，由于发酵体系中γ-聚谷氨酸分解酶的存在，使得γ-聚谷氨酸在大量生产中存在着分子量和产量不稳定等问题，且分子量较小，一般在100万道尔顿以下，生产高分子量的生产菌主要是纳豆菌，有时分子量可达300万道尔顿以上。
γ-聚谷氨酸的分子量范围较难控制，且其得到的γ-聚谷氨酸具体的分子量范围尚不明确，因此，探索一种稳定生产高分子量γ-聚谷氨酸的规模化生产方法迫在眉睫，目前，尚未见利用地衣芽孢杆菌发酵生产高分子量γ-聚谷氨酸的文献报道。
发明内容
本发明所解决的技术问题是以地衣芽孢杆菌（Bacilluslicheniformis）CGMCCNO.3336为出发菌株，通过液体深层发酵，调整和优化培养条件及培养基组成，生产出分子量较高的γ-聚谷氨酸，提供了一种相对稳定生产高分子量γ-聚谷氨酸的规模化生产方法。
本发明提供的生产高分子量γ-聚谷氨酸的菌株具体为地衣芽孢杆菌（Bacilluslicheniformis）CGMCCNO.3336。该菌株已于2009年10月14日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心（简称CGMCC，地址：中国北京市朝阳区北辰西路1号院3号,邮编100101），保藏号为CGMCCNO.3336，分类命名为：地衣芽孢杆菌（Bacilluslicheniformis）TKPG091。
一种高分子量γ-聚谷氨酸的生产方法，包括如下步骤：
（1）菌种活化：将地衣芽孢杆菌CGMCCNO.3336原始菌株接种在斜面培养基上，于37℃培养16小时，如此活化2-3次，制备成熟的斜面种子；
所述斜面培养基组成为：蛋白胨10g/L，酵母粉5g/L，NaCl10g/L，琼脂20g/L，pH7.2，不足部分纯净水补足；
（2）种子液的制备：将一环活化后的斜面种子接种于装有50ml液体培养基的500ml三角瓶中，37℃，220rpm培养16小时至对数生长期；
所述种子培养基组成为：葡萄糖30g/L，酵母膏7g/L，胰蛋白胨10g/L，K2HPO40.5g/L，MgSO4·7H2O0.5g/L，pH7.2，不足部分纯净水补足；
（3）发酵罐发酵：将步骤（2）中的种子液以10%的接种量接种于发酵罐，30L发酵罐发酵培养基装液量为15L，初始发酵温度38-40℃，罐压0.01-0.05Mpa通风量0.5-1.0vvm，转速400-600rpm；当发酵液OD660在0.550-0.600时，控制发酵温度30-35℃，调节转速至200-350rpm，通风量1.5-2.0vvm，并开始补加流加培养基，通过pH的反馈调节流加培养基的流加速度，控制pH在7.2-7.5至发酵结束前2-6小时，发酵时间72h。
所述发酵培养基组成为：葡萄糖40-60g/L，酵母膏15-25g/L，NH4NO33.5-5.5g/L，MgSO4·6H2O0.5-1.2g/L，NaCl8.0-12g/L，CaCl2·6H2O1-1.5g/L，FeSO40.008-0.010g/L,谷氨酸钠70-80g/L,pH值7.2-7.5,不足部分纯净水补足；
所述流加培养基组成为：葡萄糖650-850g/L，氯化钠30.0-60.0g/L，CaCl2·6H2O10-15.0g/L，MnSO45-10g/L，MgSO45-20g/L，pH值7.2-7.5,不足部分纯净水补足；
发酵结束后离心去菌体，取上清液用流动相稀释数倍至γ-聚谷氨酸的含量在1-3g/L，通过高效液相对其分子量进行检测，分子量在100万到400万道尔顿。
有益效果：
本发明以地衣芽孢杆菌（Bacilluslicheniformis）CGMCCNO.3336为出发菌株，通过对发酵过程中通风与转速的调控，发酵后期降低转速减少剪切力对聚谷氨酸合成的影响，改变温度从而影响聚谷氨酸合成酶的活性，特别是依靠流加葡萄糖，氯化钠，CaCl2·6H2O，MnSO4，MgSO4；控制发酵pH并增加培养基中的离子强度从而得到分子量明确的聚谷氨酸，且分子量均较高，发酵结束，经检测γ-聚谷氨酸的分子量在100万-400万道尔顿。本发明工艺简单，γ-聚谷氨酸的分子量较高且相对稳定可控，可实现规模化生产。
说明书附图
图1是测定实施例1发酵液γ-聚谷氨酸分子量的GPC积分图谱
图2是测定实施例2发酵液γ-聚谷氨酸分子量的GPC积分图谱
图3是测定实施例3发酵液γ-聚谷氨酸分子量的GPC积分图谱
具体实施方式
下面通过具体的实施方案叙述本发明。除非特别说明，本发明中所用的技术手段均为本领域技术人员所公知的方法。另外，实施方案应理解为说明性的，而非限制本发明的范围，本发明的实质和范围仅由权利要求书所限定。对于本领域技术人员而言，在不背离本发明实质和范围的前提下，对这些实施方案中的物料成分和用量进行的各种改变或改动也属于本发明的保护范围。
实施例1
一种高分子量γ-聚谷氨酸的生产方法，包括如下步骤：
（1）菌种活化：将地衣芽孢杆菌CGMCCNO.3336原始菌株接种在斜面培养基上，于37℃培养16小时，如此活化2-3次，制备成熟的斜面种子；
所述斜面培养基组成为：蛋白胨10g/L，酵母粉5g/L，NaCl10g/L，琼脂20g/L，pH7.2，不足部分纯净水补足；
（2）种子液的制备：将一环活化后的斜面种子接种于装有50ml液体培养基的500ml三角瓶中，37℃，220rpm培养16小时至对数生长期；
所述种子培养基组成为：葡萄糖30g/L，酵母膏7g/L，胰蛋白胨10g/L，K2HPO40.5g/L，MgSO4·7H2O0.5g/L，pH7.2，不足部分纯净水补足；
（3）发酵罐发酵：将步骤（2）中的种子液以10%的接种量接种于发酵罐，30L发酵罐发酵培养基装液量为15L，初始发酵温度38℃，罐压0.01Mpa通风量0.5vvm，转速400rpm；当发酵液OD660在0.550时，并控制发酵温度30℃，调节转速至200rpm，通风量1.5vvm，并开始补加流加培养基，控制pH在7.2至发酵结束前2小时，发酵时间72h。
所述发酵培养基组成为：葡萄糖40g/L，酵母膏15g/L，NH4NO33.5g/L，MgSO4·6H2O0.5g/L，NaCl8.0g/L，CaCl2·6H2O1g/L，FeSO40.008g/L,谷氨酸钠70g/L,pH值7.2,不足部分纯净水补足；
所述流加培养基组成为：葡萄糖650g/L，氯化钠30.0g/L，CaCl2·6H2O10g/L，MnSO45g/L，MgSO45g/L，pH值7.2,不足部分纯净水补足；
发酵结束后离心去菌体，取上清液用流动相稀释数倍至γ-聚谷氨酸的含量在1-3g/L，通过高效液相对其分子量进行检测，分子量在140万-150万道尔顿。
实施例2
菌种活化和种子液制备同实施例1
（3）发酵罐发酵：将步骤（2）中的种子液以10%的接种量接种于发酵罐，30L发酵罐发酵培养基装液量为15L，初始发酵温度39℃，罐压0.03Mpa通风量0.7vvm，转速500rpm；当发酵液OD660在0.570时，并控制发酵温度32℃，调节转速至300rpm，通风量1.8vvm，并开始补加流加培养基，控制pH在7.4至发酵结束前4小时，发酵时间72h。
所述发酵培养基组成为：葡萄糖50g/L，酵母膏20g/L，NH4NO34.5g/L，MgSO4·6H2O1.0g/L，NaCl10g/L，CaCl2·6H2O1.2g/L，FeSO40.009g/L,谷氨酸钠75g/L,pH值7.4,不足部分纯净水补足；
所述流加培养基组成为：葡萄糖750g/L，氯化钠50.0g/L，CaCl2·6H2O12g/L，MnSO48g/L，MgSO415g/L，pH值7.4,不足部分纯净水补足；
发酵结束后离心去菌体，取上清液用流动相稀释数倍至γ-聚谷氨酸的含量在1-3g/L，通过高效液相对其分子量进行检测，分子量在390万-400万道尔顿。
实施例3
（3）发酵罐发酵：将步骤（2）中的种子液以10%的接种量接种于发酵罐，30L发酵罐发酵培养基装液量为15L，初始发酵温度40℃，罐压0.05Mpa通风量1.0vvm，转速600rpm；当发酵液OD660在0.600时，并控制发酵温度35℃，调节转速至350rpm，通风量2.0vvm，并开始补加流加培养基，控制pH在7.5至发酵结束前6小时，发酵时间72h。
所述发酵培养基组成为：葡萄糖60g/L，酵母膏25g/L，NH4NO35.5g/L，MgSO4·6H2O1.2g/L，NaCl12g/L，CaCl2·6H2O1.5g/L，FeSO40.010g/L,谷氨酸钠80g/L,pH值7.5,不足部分纯净水补足；
所述流加培养基组成为：葡萄糖850g/L，氯化钠60.0g/L，CaCl2·6H2O15.0g/L，MnSO410g/L，MgSO420g/L，pH值7.5,不足部分纯净水补足；
发酵结束后离心去菌体，取上清液用流动相稀释数倍至γ-聚谷氨酸的含量在1-3g/L，通过高效液相对其分子量进行检测，分子量在100万-120万道尔顿。
Claims (1)
1.一种高分子量γ-聚谷氨酸的生产方法，其特征在于：以地衣芽孢杆菌(Bacilluslicheniformis)CGMCCNO.3336为出发菌株，通过液体深层发酵制备，包括如下步骤：
(1)菌种活化：将地衣芽孢杆菌CGMCCNO.3336原始菌株接种在斜面培养基上，于37℃培养16小时，如此活化2-3次，制备成熟的斜面种子；
所述斜面培养基组成为：蛋白胨10g/L，酵母粉5g/L，NaCl10g/L，琼脂20g/L，pH7.2，不足部分纯净水补足；
(2)种子液的制备：将一环活化后的斜面种子接种于装有50ml液体培养基的500ml三角瓶中，37℃，220rpm培养16小时至对数生长期；
所述种子培养基组成为：葡萄糖30g/L，酵母膏7g/L，胰蛋白胨10g/L，K2HPO40.5g/L，MgSO4·7H2O0.5g/L，pH7.2，不足部分纯净水补足；
(3)发酵罐发酵：将步骤(2)中的种子液以10％的接种量接种于发酵罐，30L发酵罐发酵培养基装液量为15L，初始发酵温度38-40℃，罐压0.01-0.05Mpa通风量0.5-1.0vvm，转速400-600rpm；当发酵液OD660在0.550-0.600时，控制发酵温度30-35℃，调节转速至200-350rpm，通风量1.5-2.0vvm，并开始补加流加培养基，控制pH在7.2-7.5至发酵结束前2-6小时，发酵时间72h；
所述发酵培养基组成为：葡萄糖40-60g/L，酵母膏15-25g/L，NH4NO33.5-5.5g/L，MgSO4·6H2O0.5-1.2g/L，NaCl8.0-12g/L，CaCl2·6H2O1-1.5g/L，FeSO40.008-0.010g/L,谷氨酸钠70-80g/L,pH值7.2-7.5,不足部分纯净水补足；
所述流加培养基组成为：葡萄糖750g/L，氯化钠50.0g/L，CaCl2·6H2O12g/L，MnSO48g/L，MgSO415g/L，pH值7.4,不足部分纯净水补足。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN201310749440.2A CN103710404B (zh) | 2013-12-27 | 2013-12-27 | 一种高分子量γ- 聚谷氨酸的生产方法 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN201310749440.2A CN103710404B (zh) | 2013-12-27 | 2013-12-27 | 一种高分子量γ- 聚谷氨酸的生产方法 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| CN103710404A CN103710404A (zh) | 2014-04-09 |
| CN103710404B true CN103710404B (zh) | 2015-11-18 |
Family
ID=50403758
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| CN201310749440.2A Active CN103710404B (zh) | 2013-12-27 | 2013-12-27 | 一种高分子量γ- 聚谷氨酸的生产方法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| CN (1) | CN103710404B (zh) |
Families Citing this family (12)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN104694437B (zh) * | 2015-03-23 | 2018-04-27 | 领先生物农业股份有限公司 | 一株地衣芽孢杆菌及其在生产γ-聚谷氨酸中的用途 |
| KR102496383B1 (ko) * | 2016-12-19 | 2023-02-06 | 주식회사 비엘 | 폴리감마글루탐산을 함유하는 아토피성 피부 증상 개선용 조성물 |
| CN106699419A (zh) * | 2017-02-25 | 2017-05-24 | 史丹利农业集团股份有限公司 | 添加γ‑聚谷氨酸的生物炭基水稻专用肥及其制备方法 |
| CN107760732A (zh) * | 2017-11-16 | 2018-03-06 | 天津北洋百川生物技术有限公司 | 一种农业级γ‑聚谷氨酸的生产方法 |
| CN107699594A (zh) * | 2017-11-22 | 2018-02-16 | 天津北洋百川生物技术有限公司 | 一种利用地衣芽孢杆菌生产γ‑聚谷氨酸的方法 |
| CN107974472A (zh) * | 2017-12-26 | 2018-05-01 | 天津北洋百川生物技术有限公司 | 一种添加甲硫氨酸提高γ-聚谷氨酸产量的制备方法 |
| CN107815476A (zh) * | 2017-12-26 | 2018-03-20 | 天津北洋百川生物技术有限公司 | 一种利用地衣芽孢杆菌生产γ 聚谷氨酸的方法 |
| CN109161567A (zh) * | 2018-10-09 | 2019-01-08 | 四川省食品发酵工业研究设计院 | 一种提高γ-聚谷氨酸产量的方法 |
| CN109182404A (zh) * | 2018-10-15 | 2019-01-11 | 天津科技大学 | 一种利用地衣芽孢杆菌发酵时流加蔗糖生产γ-聚谷氨酸的方法 |
| CN110643646A (zh) * | 2019-10-30 | 2020-01-03 | 广州市博之越精细化工有限公司 | 一种γ-聚谷氨酸钠溶液制备方法 |
| CN111876364B (zh) * | 2020-09-10 | 2021-07-23 | 南京轩凯生物科技股份有限公司 | 一种枯草芽孢杆菌及调控发酵产物γ-聚谷氨酸分子量的方法 |
| CN112175982B (zh) * | 2020-09-29 | 2022-02-22 | 江南大学 | 一种γ-PGA聚合酶基因重组菌株及其构建方法与应用 |
Citations (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2001090395A1 (en) * | 2000-05-20 | 2001-11-29 | Korea Advanced Institute Of Science And Technology | A method for manufacturing highly-concentrated polyglutamic acid with additional supply of saccharides |
| CN102367431A (zh) * | 2011-11-11 | 2012-03-07 | 中国科学院过程工程研究所 | 一种地衣芽孢杆菌及其应用 |
| CN102533885A (zh) * | 2012-01-09 | 2012-07-04 | 东莞理工学院 | 发酵过程中添加NaCl生产γ-聚谷氨酸的方法 |
-
2013
- 2013-12-27 CN CN201310749440.2A patent/CN103710404B/zh active Active
Patent Citations (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2001090395A1 (en) * | 2000-05-20 | 2001-11-29 | Korea Advanced Institute Of Science And Technology | A method for manufacturing highly-concentrated polyglutamic acid with additional supply of saccharides |
| CN102367431A (zh) * | 2011-11-11 | 2012-03-07 | 中国科学院过程工程研究所 | 一种地衣芽孢杆菌及其应用 |
| CN102533885A (zh) * | 2012-01-09 | 2012-07-04 | 东莞理工学院 | 发酵过程中添加NaCl生产γ-聚谷氨酸的方法 |
Non-Patent Citations (1)
| Title |
|---|
| 地衣芽孢杆菌P-104发酵生产γ-聚谷氨酸条件优化;张业伟等;《过程工程学报》;20120430;第12卷(第2期);摘要 * |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| CN103710404A (zh) | 2014-04-09 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| CN103710404B (zh) | 一种高分子量γ- 聚谷氨酸的生产方法 | |
| CN103937838B (zh) | 利用地衣芽孢杆菌同时合成两种不同成分生物絮凝剂的方法 | |
| CN103204732B (zh) | 含聚谷氨酸高产菌的复合微生物肥料及其制备方法和应用 | |
| CN103695485B (zh) | 一种高效生产γ‑聚谷氨酸的方法 | |
| CN101948785B (zh) | 一株γ-聚谷氨酸产生菌及利用其制备γ-聚谷氨酸及其盐的方法 | |
| CN102978134B (zh) | 一种乳杆菌及利用其发酵生产d-乳酸的方法 | |
| CN102268465B (zh) | 一种大量生产γ-聚谷氨酸的方法 | |
| CN103409480B (zh) | 一种生产不同分子量普鲁兰多糖的方法 | |
| CN101486977B (zh) | 枯草芽孢杆菌及用该菌株制备γ-聚谷氨酸的方法 | |
| CN102911974B (zh) | 枯草芽孢杆菌高温发酵生产γ-聚谷氨酸的方法 | |
| CN102226159B (zh) | 一株阴沟肠杆菌及其在制备2，3-丁二醇中的应用 | |
| CN102533885B (zh) | 发酵过程中添加NaCl生产γ-聚谷氨酸的方法 | |
| CN101851656A (zh) | 一种生产纤维素乙醇的方法 | |
| CN105441498A (zh) | γ-聚谷氨酸的发酵制备方法 | |
| CN101671645A (zh) | 一种制备β-甘露聚糖酶的方法及其专用菌株 | |
| CN108753642A (zh) | 一株产褐藻胶裂解酶菌株约氏黄杆菌 | |
| CN103820508A (zh) | 稀土元素在地衣芽孢杆菌发酵产生γ-聚谷氨酸中的应用 | |
| CN102286600B (zh) | 一种利用木薯渣同时发酵生产乙醇和氢气的方法 | |
| CN108220352A (zh) | 一种生料发酵生产γ-聚谷氨酸的方法 | |
| CN107760732A (zh) | 一种农业级γ‑聚谷氨酸的生产方法 | |
| CN104531798A (zh) | 一种提高四烯大环内酯类抗生素产量的方法 | |
| CN114456980B (zh) | 一种γ-聚谷氨酸高产菌株及应用 | |
| CN102719501A (zh) | 一种生产聚谷氨酸的方法 | |
| CN102268389B (zh) | 一种甲基营养芽孢杆菌及其发酵生产γ-聚谷氨酸的方法 | |
| CN103013863A (zh) | 一种鞘氨醇单胞菌及其在制备鼠李糖胶中的应用 |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| C06 | Publication | ||
| PB01 | Publication | ||
| C10 | Entry into substantive examination | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| C14 | Grant of patent or utility model | ||
| GR01 | Patent grant | ||
| TR01 | Transfer of patent right |
Effective date of registration: 20200825 Address after: No.79 Xingxin Road, Chengdu cross strait science and Technology Industry Development Park, Wenjiang District, Chengdu, Sichuan 610000 Patentee after: Sichuan Baichuan Jinkai Bioengineering Co., Ltd Address before: 300457 Tianjin prime Binhai Economic and Technological Development Zone, Road No. 29 Patentee before: TIANJIN PEIYANG BIOTRANS BIOTECH Co.,Ltd. |
|
| TR01 | Transfer of patent right |