CN112322608A

CN112322608A - 一种提高多铜氧化酶稳定性和降解生物胺能力的方法

Info

Publication number: CN112322608A
Application number: CN202011238475.6A
Authority: CN
Inventors: 方芳; 倪秀梅; 陈坚; 堵国成
Original assignee: Jiangnan University
Current assignee: Jiangnan University
Priority date: 2020-11-09
Filing date: 2020-11-09
Publication date: 2021-02-05
Anticipated expiration: 2040-11-09
Also published as: CN112322608B

Abstract

本发明公开了一种提高多铜氧化酶稳定性和降解生物胺能力的方法，属于生物工程技术领域。本发明将过氧化氢酶CAT与多铜氧化酶MCOF按顺序连接，利用大肠杆菌表达系统BL21(DE3)/pET28a，成功实现了多铜氧化酶与过氧化氢酶的融合表达，所获得的融合酶可使多铜氧化酶稳定性提高51％～68％。将融合酶用于生物胺的降解，可使多铜氧化酶对不同生物胺的降解能力有不同程度的提高。在24～48h时间内，相较于未融合CAT的多铜氧化酶MCOF，融合酶CAT&MCOF降解生物胺的能力提高了38.9～132％。

Description

一种提高多铜氧化酶稳定性和降解生物胺能力的方法

技术领域

本发明涉及一种提高多铜氧化酶稳定性和降解生物胺能力的方法，属于生物工程技术领域。

背景技术

生物胺是生物体内产生的一类低分子量含氮有机化合物的总称，是发酵食品卫生标准中的一个限制性指标。适量的生物胺可以促进人体正常的生理活动，但通过食物摄入过量生物胺则会引起偏头痛，头痛，胃和肠道问题以及假性过敏反应等不良反应，严重时可能危及生命。因此，需要将其在发酵食品中的含量降至合适的浓度。

目前用于控制和减少发酵食品中生物胺的措施主要可分为三种：1、源头减控。对生产原料进行优化，减少原料中的蛋白质，控制游离氨基酸的数量，这种方法可以减少生物胺的生成。其弊端在于这种方法极大可能会对产品风味和品质造成较大影响。其它方法如减少发酵体系中产胺的微生物一般仅适用于封闭的单菌体系发酵，对于混菌体系或者开放体系(易染菌)效果不大。2、过程减控。这涉及到改进食品加工方法，对发酵条件(如发酵温度、发酵时间、pH等条件)进行优化以及添加外源抑制剂等来减少因菌株代谢及酶促反应而生成的胺前体物质，从而达到抑制胺产生的目的。但即使改变发酵条件，依然会有生物胺生成，且产品的加工温度和盐度等因素多由食物特性决定，而低温贮藏会提高设备和能耗费用。3、末端减控，也称为酶法减控。这种方法可以消除已生成的生物胺，且基本不用调整和改变食品发酵工艺，对食品营养和风味的影响也较小，是目前最具有应用前景的方法。

多铜氧化酶是一种含铜的氧化酶，目前发现多铜氧化酶类中的某些酶可以降解生物胺，但在降解生物胺时因其稳定性不高，对生物胺的降解率低而在实际应用中受到限制。

发明内容

技术问题：

本发明的目的在于克服现有技术中的不足，提供一种能够提高多铜氧化酶稳定性和降解生物胺能力的方法。

技术方案：

本发明的第一个目的是提供一种多铜氧化酶与过氧化氢酶的融合酶，含有SEQ IDNO.5所示氨基酸序列。

本发明的第二个目的是提供编码所述融合酶的基因。

在一种实施方式中，所述基因含有SEQ ID NO.6所示序列。

本发明的第三个目的是提供携带所述基因的表达载体。

在一种实施方式中，所述表达载体为pET28a。

本发明的第四个目的是提供表达所述融合酶的微生物细胞。

在一种实施方式中，所述微生物细胞为重组大肠杆菌。

在一种实施方式中，所述重组大肠杆菌以E.coli BL21(DE3)为宿主细胞。

本发明的第五个目的是提供一种提高多铜氧化酶活性和/或稳定性的方法，所述方法是将过氧化氢酶与多铜氧化酶融合。

在一种实施方式中，所述提高多铜氧化酶活性是指提高多铜氧化酶降解生物胺的活性。

在一种实施方式中，所述过氧化氢酶的氨基酸序列如SEQ ID NO.3所示；所述多铜氧化酶的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。

在一种实施方式中，所述融合是将所述多铜氧化酶的氨基酸N端与过氧化氢酶的C端连接。

本发明的第六个目的是提供一种降解生物胺的方法，是将所述融合酶加入至含生物胺的环境中，于35～40℃反应至少8h。

在一种实施方式中，所述方法是将所述融合酶加入至生物胺含量为50～100mg/L的反应体系中，于37℃反应8～48h。

在一种实施方式中，所述生物胺包括但不限于组胺、尸胺或腐胺。

本发明还要求保护所述融合酶或表达所述融合酶的重组微生物细胞在食品领域降解生物胺方面的应用。

有益效果：

本发明通过对多铜氧化酶和过氧化氢酶的融合表达，得到一种稳定性提高的融合酶，该酶的多铜氧化酶稳定性可提高51％～68％；将该融合酶用于降解生物胺，可使多铜氧化酶对不同生物胺的降解能力有不同程度的提高，相比于未融合的酶可以提高38.9～132％。

附图说明

图1为MCOF与CAT融合酶的不同的连接方式；

图2为不同MCOF与CAT融合酶的表达效果；

图3为CAT酶对MCOF酶活的影响；

图4为H₂O₂对MCOF酶活力的影响；

图5为融合表达CAT对MCOF酶活的影响；A为融合酶的CAT酶活性和MCOF酶活性；B为在含20mmol/L H₂O₂的环境中多融合酶的多铜氧化酶催化活性；C为融合酶对于H₂O₂的耐受性；

图6为胺体系中MCOF与CAT酶活力随时间的变化；

图7为融合表达CAT对MCOF降解生物胺的影响；其中，A为融合酶CAT&MCOF对组胺的降解率；B为融合酶CAT&MCOF对腐胺的降解率；C为融合酶CAT&MCOF对尸胺的降解率。

具体实施方式

材料与方法：

LB培养基(g·L^-1)：蛋白胨10，酵母粉5，NaCl 10。固体培养基加20g·L^-1琼脂粉。

TB培养基(g·L^-1)：蛋白胨12，酵母粉24，甘油5，KH₂PO₄·3H₂O 2.3，K₂HPO₄·12H₂O16.4。

使用的商业化质粒和菌株为：pET28a、E.coli BL21(DE3)

多铜氧化酶酶活的测定方法：采用可见光吸收法，即以2,2′-联氮-双-3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸(ABTS)为底物，通过检测酶氧化ABTS的量计算多铜氧化酶酶活。反应时间为1min，反应体系为50μL酶液、0.95mL含1mmol/L ABTS和1mmol/L CuCl₂的柠檬酸钠缓冲液。将每分钟氧化1μmol ABTS所需的酶量定义为一个酶活力单位(U)。

过氧化氢酶的酶活测定方法：

采用可见光吸收法测定多铜氧化酶活力：反应体系为1mL，将50μL待测酶液样品快速加入0.95mL含10mmol/L H₂O₂的50mmol/L KH₂PO₄-K₂HPO₄缓冲液中，用UV-2450型紫外-可见光分光光度计于240nm处测定H₂O₂的分解速率。将每分钟分解1μmol H₂O₂所需的酶量为一个酶活单位(U)。

实施例1：MCOF和CAT融合表达的构建与表达

以SEQ ID NO.2所示的多铜氧化酶MCOF的基因和SEQ ID NO.4所示的过氧化氢酶CAT的基因为模板，将两个相应基因以直接的顺序融合和在两个基因之间分别插入不同linker：GGGGS、(GGGGS)₂、EAAAK、(EAAAK)₂；分别设计构建编码融合酶MCOF、CAT的特异性引物，然后用特异性引物分别対MCOF和CAT的基因进行PCR扩增。按照Primer STAR HS DNAPolymerase(TAKARA)试剂盒说明书配制50μL反应体系，扩增条件：98℃3min1个循坏,98℃10s,55℃15s,72℃1min 30s,30个循坏,72℃5min一个循坏。PCR产物采用1％琼脂糖凝胶电泳进行验证，将获得的条带单一的目的片段进行柱回收，回收方法参照柱回收试剂盒(thermoscientific)说明书进行。将获得的片段与线性化载体pET28a按照Gibson组装方法进行连接，转入宿主感受态细胞E.coli BL21(DE3)中。通过菌落PCR验证，将与目的条带大小符合的重组菌送至无锡天霖测序公司测定核苷酸序列。

表1本发明所用引物

引物名称	引物序列
		环p-28a-L	5’-caaagcccgaaaggaagctgag-3’
环p-28a-R	5’-ggtatatctccttcttaaagttaa-3’
		28a-MCOF-L	5’-aactttaagaaggagatatacc-ATGAATGAACCAGTTTTCGATTC-3’
28a-MCOF-R	5’-ctcagcttcctttcgggctttg-TTACATGTGCATCCCCATCTTC-3’
		28a-CAT-L	5’-aactttaagaaggagatatacc-ATGAGTTCAAATAAACTGACAACTA-3’
28a-CAT-R	5’-ctcagcttcctttcgggctttg-TTAAGAATCTTTTTTAATCGGC-3’

按照上述方法执行，成功构建了重组多铜氧化酶MCOF、重组过氧化氢酶CAT和8种不同方式连接的融合酶并分别命名(图1)；重组酶蛋白的表达情况如图2所示。其中，MCOF&CAT表示将MCOF酶和CAT酶的编码基因直接连接，转录翻译后获得的融合酶；MCOF-GGGGS-CAT表示将MCOF酶和CAT酶之间通过GGGGS连接肽连接获得的融合酶；MCOF-(GGGGS)₂-CAT表示将MCOF酶和CAT酶之间通过2个GGGGS连接肽连接获得的融合酶；MCOF-EAAAK-CAT表示将MCOF酶和CAT酶之间通过EAAAK连接肽连接获得的融合酶；MCOF-(EAAAK)₂--CAT表示将MCOF酶和CAT酶之间通过2个EAAAK连接肽连接获得的融合酶；CAT&MCOF表示将CAT酶和MCOF酶的编码基因直接连接，转录翻译后获得的融合酶；CAT-GGGGS-MCOF表示将CAT酶和MCOF酶之间通过GGGGS连接肽连接获得的融合酶；CAT-(GGGGS)₂-MCOF表示将CAT酶和MCOF酶之间通过2个GGGGS连接肽连接获得的融合酶。

实施例2：外源添加过氧化氢酶提高多铜氧化酶的稳定性

设置实验组：分别将不同浓度的过氧化氢酶溶液与多铜氧化酶酶溶液等体积混合，使过氧化氢酶溶液终浓度为200、400、800、1200、1600、3200U/L，然后按照所述多铜氧化酶酶活测定方法测定多铜氧化酶的酶活。对照组将过氧化氢酶溶液换成等体积缓冲液，其余条件相同。结果如图3所示，过氧化氢酶能够提高多铜氧化酶的酶活，且随着过氧化氢酶浓度的增加，多铜氧化酶酶活也在随之逐渐增加(图3)。

由于多铜氧化酶降解生物胺的过程中产生的H₂O₂可能会影响多铜氧化酶的酶活，因此，向含有1mmol/L ABTS和1mmol/L CuCl₂的柠檬酸钠缓冲液中加入不同浓度的H₂O₂验证其对多铜氧化酶酶活的影响。结果显示，在H₂O₂存在下，多铜氧化酶的酶活受到严重的抑制，H₂O₂浓度越高，对反应的抑制效果越明显，而添加过氧化氢酶可以缓解这种抑制作用(图4)。

实施例3：融合表达CAT提高多铜氧化酶MCOF对过氧化氢的耐受性

按照实施例1的方法分别构建不同的CAT-MCOF融合酶，将表达融合酶的重组大肠杆菌在37℃、220rpm条件下于LB培养基中培养12h，再按照2％的接种量转入TB培养基中在37℃、220rpm条件下培养至OD＝0.6，加入终浓度为0.1mmol IPTG和1mmol Cu²⁺在20℃下诱导表达20h。诱导表达结束用PBS洗涤两次后再重新悬浮菌体，破壁离心，收集上清液，即获得MCOF和8种不同方式连接的MCOF-CAT融合酶的粗酶液，用于进行多铜氧化酶和过氧化氢酶的酶活的测定。

测定结果如图5A所示，8种融合酶均显示出多铜氧化酶和过氧化氢酶活性，证明8种融合表达酶体系均成功构建，融合表达后的MCOF酶活和CAT酶活与融合表达前差别不大，这说明融合表达对MCOF与CAT酶活影响不大。

向含有1mmol/L ABTS和1mmol/L CuCl₂的柠檬酸钠缓冲液中添加20mmol/L H₂O₂，以不加H₂O₂作为对照，分别加入2000U/L的多铜氧化酶MCOF及本实施例3中的方法制备的CAT-MCOF融合酶，再测定各融合酶的多铜氧化酶酶活，测定结果表明(图5B)，融合表达CAT对多铜氧化酶MCOF抵御H₂O₂的能力有明显提高(35％～55％)。

对H₂O₂耐受性的考察：将酶液在含有20mM H₂O₂缓冲液中放置2h后测定残余酶活活力，孵育前测定初始酶活，残余酶活比上初始酶活即为相对酶活。结果显示(图5C)，融合表达CAT对多铜氧化酶MCOF的耐受性有显著提高，分别可提高51％～68％。

实施例4：融合表达CAT提高多铜氧化酶MCOF降解生物胺的稳定性

将4000U·L^-1多铜氧化酶MCOF和实施例3的方法制备的不同的CAT-MCOF融合酶分别加入至终浓度为100mg/L的组胺溶液中，于37℃、pH为4.5的条件下反应，每隔8h对多铜氧化酶进行酶活测定。

结果显示，融合酶CAT&MCOF的多铜氧化酶酶稳定性最好。相较于没有融合CAT的多铜氧化酶MCOF，融合酶CAT&MCOF的多铜氧化酶酶稳定性增加了10～17％(图6)。反应48h时，融合酶CAT&MCOF的多铜氧化酶酶活力依然能保持起始水平的67.4％，此时测得过氧化氢酶残余酶活为35.9％。相较于没有融合CAT的多铜氧化酶MCOF(多铜氧化酶残余酶活力仅保持了起始水平的57.5％)，融合酶CAT&MCOF的多铜氧化酶酶稳定性提高了17％。

实施例5：融合表达CAT提高多铜氧化酶MCOF降解生物胺的能力

将融合酶用于生物胺的降解，分别控制反应体系中组胺、腐胺、尸胺起始浓度为50mg/L，在pH为4.5，温度为37℃的条件下应用实施例3制备的CAT-MCOF融合酶进行组胺降解，CAT-MCOF融合酶的添加量为2000U/L。由图可知，组胺的含量随着时间的变化逐渐减少。48h后，添加融合酶CAT&MCOF的组胺降解率为57.8％，添加MCOF的组胺降解率为42.3％，融合酶CAT&MCOF对组胺的降解能力较MCOF提高了38.9％(图7A)，对腐胺的降解能力较MCOF提高了132％(图7B)，对尸胺的降解能力较MCOF提高了45.7％(图7C)。

虽然本发明已以较佳实施例公开如上，但其并非用以限定本发明，任何熟悉此技术的人，在不脱离本发明的精神和范围内，都可做各种的改动与修饰，因此本发明的保护范围应该以权利要求书所界定的为准。

SEQUENCE LISTING

<110> 江南大学

<120> 一种提高多铜氧化酶稳定性和降解生物胺能力的方法

<130> BAA201053A

<160> 12

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 512

<212> PRT

<213> 人工序列

<400> 1

Met Asn Glu Pro Val Phe Asp Ser Tyr Phe Tyr Asp Glu Gln Ala Phe

1 5 10 15

Asn Leu His Asp Ala Ala Tyr Lys Pro Leu Lys Gln Ala Gln Ala Pro

20 25 30

Ala Thr Pro Leu Asn Ile Pro Pro Leu Leu Thr Pro Asp Lys Val Asp

35 40 45

Gly Asp Asp Val Tyr Tyr Thr Val Thr Ala Gln Ala Gly Ala Thr Gln

50 55 60

Leu Leu Pro Gly Glu Lys Thr Lys Thr Trp Gly Phe Asn Ala Ser Met

65 70 75 80

Leu Gly Gln Thr Val Val Phe Glu Arg Gly Lys Thr Tyr His Met His

85 90 95

Leu Val Asn His Leu Pro Glu Val Thr Thr Phe His Trp His Gly Leu

100 105 110

Glu Ile Pro Gly Pro Ile Glu Asp Gly Gly Cys His Ala Pro Val Tyr

115 120 125

Pro Gly Glu Ala Arg Asp Val Thr Phe Lys Ile Ile Gln Pro Ala Ala

130 135 140

Thr Ala Trp Leu His Ala His Pro Cys Pro Glu Thr Ala Tyr Gln Val

145 150 155 160

Trp Gln Gly Leu Ala Thr Met Ala Ile Ile His Asp Gln Glu Glu Ala

165 170 175

Ser Leu Pro Leu Pro His Thr Tyr Gly Val Asp Asp Leu Pro Leu Ile

180 185 190

Leu Gln Asp Arg Asn Phe His Ala Gly Asn Gln Phe Asp Tyr Arg Ala

195 200 205

Asp Tyr Asp Pro Asp Gly Val Gln Gly Asp Thr Ala Val Ile Asn Ala

210 215 220

Thr Val Asn Pro Tyr Phe Asp Val Thr Thr Gln Arg Leu Arg Leu Arg

225 230 235 240

Ile Leu Asn Gly Ser Asn Arg Arg Glu Tyr Arg Leu His Phe Ser Asp

245 250 255

Asp Leu Thr Phe Thr Gln Ile Gly Ser Asp Leu Ser Phe Leu Pro His

260 265 270

Pro Val Lys Leu Lys Lys Leu Met Thr Thr Cys Ala Glu Arg Gln Glu

275 280 285

Ile Val Val Asp Phe Ala Gly Tyr Gln Pro Gly Asp Thr Val Thr Leu

290 295 300

Tyr Ser Asp Asp Ser Pro Leu Val Glu Phe Arg Ile His Glu Phe Thr

305 310 315 320

Pro Ala Gly Glu Glu Leu Pro Thr Thr Leu Thr Lys Ile Asp Tyr Pro

325 330 335

Thr Pro Asp Pro Ser Leu Pro Val Lys Gln Val Val Met Ser Gly Met

340 345 350

Asp Glu Thr Val Met Ile Asp Gly Lys Lys Phe Gln Met Asp Arg Ile

355 360 365

Asp Tyr Thr Met Pro Met Gly Lys Cys Gln Leu Trp Asp Ile Thr Asn

370 375 380

Thr Asn Asp Met Asn Gly Gly Met Ile His Pro Phe His Met His Gly

385 390 395 400

Cys Ala Phe Glu Ile Val Ser Arg Asn Gly Gln Glu Pro Tyr Pro Phe

405 410 415

Glu His Gly Leu Asn Asp Thr Val Ala Val Asn Pro Gly Glu His Val

420 425 430

Ile Ile Lys Val Tyr Phe Gln Val Pro Gly Val Phe Met Tyr His Cys

435 440 445

His Ile Ile Glu His Glu Asp Gly Gly Met Met Ala Gln Leu Lys Val

450 455 460

Val Asp Pro Ala Ala Pro Asp Arg Glu Tyr His Leu Leu Asn His Met

465 470 475 480

Thr Leu Met Glu Ala Phe Ala Lys Glu Arg Gly Val Thr Met Asp Glu

485 490 495

Leu Trp Leu Gly Gly Met Asp Ser Tyr Lys Lys Met Gly Met His Met

500 505 510

<210> 2

<211> 1539

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 2

atgaatgaac cagttttcga ttcctacttt tacgatgagc aagccttcaa ccttcacgat 60

gcggcctaca agccactgaa gcaggctcaa gcacccgcga cgcccctcaa cattccgccc 120

ctgttaaccc cagacaaggt ggacggcgac gacgtgtact acaccgttac cgcccaggcg 180

ggggcaaccc agctattgcc gggggaaaag accaagacct ggggctttaa cgcctcaatg 240

ctggggcaga cggtggtctt tgagcgcggc aagacttacc acatgcacct ggtcaaccac 300

ctaccggaag tgacgacctt ccactggcac ggactagaga ttcccgggcc aattgaagac 360

ggcggctgcc acgccccggt ttacccgggc gaggcccgcg acgtgacctt taagatcatt 420

cagccggccg ccaccgcctg gctccacgcc cacccctgcc cggaaacggc ctaccaggtt 480

tggcagggac tggcgacgat ggcgatcatt cacgaccaag aagaagctag tttgcccctg 540

ccgcacactt acggagttga tgacctgccg ttgatcttgc aggaccgcaa cttccacgcg 600

ggcaaccagt ttgattaccg ggccgattac gaccctgatg gcgtccaggg tgacacggcg 660

gtgattaacg ccaccgtcaa tccttacttt gacgtcacca cccagcgcct gcggttgcga 720

attttaaacg gctctaaccg ccgcgagtac cggctccact tctcggacga cttaaccttc 780

acccaaattg gctcggacct gagctttttg ccccacccgg tcaagttaaa gaagctgatg 840

actacctgtg ccgagcgcca ggagatcgtg gtcgactttg ccggctacca gccgggcgac 900

acggttaccc tgtactccga cgacagtccg ctggtcgagt tccggatcca cgagtttacg 960

ccggcaggag aggagttgcc caccaccctg accaagattg attacccgac cccagacccg 1020

agcctacccg tcaagcaggt ggtgatgtct gggatggacg agacggtgat gattgacggc 1080

aagaagttcc agatggaccg gatcgattac acgatgccga tgggcaagtg ccagctttgg 1140

gacattacca acaccaacga catgaatggc gggatgattc accccttcca catgcacggc 1200

tgcgcctttg agatcgtctc ccgtaacggc caggaaccct acccgtttga acacggactt 1260

aacgacaccg tcgccgttaa cccgggcgaa cacgtcatca tcaaggtcta cttccaagta 1320

ccgggggtct ttatgtacca ttgtcacatt atcgaacacg aagatggcgg gatgatggcc 1380

caactaaagg ttgtcgaccc ggccgccccg gaccgggagt accacttgct caaccatatg 1440

accctgatgg aggcctttgc caaggagcgg ggcgtcacga tggatgaact ctggcttggt 1500

gggatggact cctacaagaa gatggggatg cacatgtaa 1539

<210> 3

<211> 483

<212> PRT

<213> 人工序列

<400> 3

Met Ser Ser Asn Lys Leu Thr Thr Ser Trp Gly Ala Pro Val Gly Asp

1 5 10 15

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20 25 30

Asp Val His Leu Leu Glu Lys Leu Ala His Phe Asn Arg Glu Arg Val

35 40 45

Pro Glu Arg Val Val His Ala Lys Gly Ala Gly Ala His Gly Tyr Phe

50 55 60

Glu Val Thr Asn Asp Val Thr Lys Tyr Thr Lys Ala Ala Phe Leu Ser

65 70 75 80

Glu Val Gly Lys Arg Thr Pro Leu Phe Ile Arg Phe Ser Thr Val Ala

85 90 95

Gly Glu Leu Gly Ser Ala Asp Thr Val Arg Asp Pro Arg Gly Phe Ala

100 105 110

Val Lys Phe Tyr Thr Glu Glu Gly Asn Tyr Asp Ile Val Gly Asn Asn

115 120 125

Thr Pro Val Phe Phe Ile Arg Asp Ala Ile Lys Phe Pro Asp Phe Ile

130 135 140

His Thr Gln Lys Arg Asp Pro Lys Thr His Leu Lys Asn Pro Thr Ala

145 150 155 160

Val Trp Asp Phe Trp Ser Leu Ser Pro Glu Ser Leu His Gln Val Thr

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Ile Leu Met Ser Asp Arg Gly Ile Pro Ala Thr Leu Arg His Met His

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Gly Phe Gly Ser His Thr Phe Lys Trp Thr Asn Ala Glu Gly Glu Gly

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Val Trp Ile Lys Tyr His Phe Lys Thr Glu Gln Gly Val Lys Asn Leu

210 215 220

Asp Val Asn Thr Ala Ala Lys Ile Ala Gly Glu Asn Pro Asp Tyr His

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Thr Glu Asp Leu Phe Asn Ala Ile Glu Asn Gly Asp Tyr Pro Ala Trp

245 250 255

Lys Leu Tyr Val Gln Ile Met Pro Leu Glu Asp Ala Asn Thr Tyr Arg

260 265 270

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Leu Ile Glu Val Gly Arg Met Val Leu Asp Arg Asn Pro Glu Asn Tyr

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Gln Met Arg Phe Asp Asp Asn Gly Gly Gly Ser Val Tyr Tyr Glu Pro

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Asn Ser Phe Gly Gly Pro Lys Glu Ser Pro Glu Asp Lys Gln Ala Ala

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Lys Glu Glu Ile Lys Leu Arg Gln Ile Glu His Phe Tyr Lys Ala Asp

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gcccatttca accgagaacg tgttcctgaa cgtgttgttc acgccaaagg agcaggcgca 180

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gaagtcggca aacgcacacc gttgttcatc cgtttctcaa cagttgccgg tgaacttggc 300

tctgctgaca cagttcgcga cccgcgcgga tttgctgtta aattttatac tgaagaagga 360

aactacgaca tcgtcggcaa caatacgcct gtattcttta tccgcgatgc gattaagttc 420

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ccggaaaact actttgcaga ggtagaacaa gcgacatttt cacctggaac actcgtgcct 960

ggtattgatg tttcaccgga taaaatgctt caaggccgac tgtttgctta tcatgatgca 1020

caccgctacc gtgtcggtgc aaaccatcaa gcgctgccaa tcaaccgtgc ccgcaacaaa 1080

gtaaacaatt atcagcgtga tggacaaatg cgttttgacg ataacggcgg cggatctgtg 1140

tattacgagc ctaacagctt cggcggtcca aaagagtcac ctgaggataa gcaagcagca 1200

tatccggtac aaggcatcgc tgacagcgta agctacgatc acaacgatca ctacactcaa 1260

gccggtgatc tgtatcgttt aatgagtgaa gatgaacgta cccgccttat tgaaaatatt 1320

gttaatgcta tgaagccggt agaaaaagaa gaaatcaagc tgcgccaaat cgagcacttc 1380

tacaaagcgg atcctgaata cggaaaacgc gtggcagaag gccttggatt gccgattaaa 1440

aaagattctt aa 1452

<210> 5

<211> 995

<212> PRT

<213> 人工序列

<400> 5

Met Ser Ser Asn Lys Leu Thr Thr Ser Trp Gly Ala Pro Val Gly Asp

1 5 10 15

Asn Gln Asn Ser Met Thr Ala Gly Ser Arg Gly Pro Thr Leu Ile Gln

20 25 30

Asp Val His Leu Leu Glu Lys Leu Ala His Phe Asn Arg Glu Arg Val

35 40 45

Pro Glu Arg Val Val His Ala Lys Gly Ala Gly Ala His Gly Tyr Phe

50 55 60

Glu Val Thr Asn Asp Val Thr Lys Tyr Thr Lys Ala Ala Phe Leu Ser

65 70 75 80

Glu Val Gly Lys Arg Thr Pro Leu Phe Ile Arg Phe Ser Thr Val Ala

85 90 95

Gly Glu Leu Gly Ser Ala Asp Thr Val Arg Asp Pro Arg Gly Phe Ala

100 105 110

Val Lys Phe Tyr Thr Glu Glu Gly Asn Tyr Asp Ile Val Gly Asn Asn

115 120 125

Thr Pro Val Phe Phe Ile Arg Asp Ala Ile Lys Phe Pro Asp Phe Ile

130 135 140

His Thr Gln Lys Arg Asp Pro Lys Thr His Leu Lys Asn Pro Thr Ala

145 150 155 160

Val Trp Asp Phe Trp Ser Leu Ser Pro Glu Ser Leu His Gln Val Thr

165 170 175

Ile Leu Met Ser Asp Arg Gly Ile Pro Ala Thr Leu Arg His Met His

180 185 190

Gly Phe Gly Ser His Thr Phe Lys Trp Thr Asn Ala Glu Gly Glu Gly

195 200 205

Val Trp Ile Lys Tyr His Phe Lys Thr Glu Gln Gly Val Lys Asn Leu

210 215 220

Asp Val Asn Thr Ala Ala Lys Ile Ala Gly Glu Asn Pro Asp Tyr His

225 230 235 240

Thr Glu Asp Leu Phe Asn Ala Ile Glu Asn Gly Asp Tyr Pro Ala Trp

245 250 255

Lys Leu Tyr Val Gln Ile Met Pro Leu Glu Asp Ala Asn Thr Tyr Arg

260 265 270

Phe Asp Pro Phe Asp Val Thr Lys Val Trp Ser Gln Lys Asp Tyr Pro

275 280 285

Leu Ile Glu Val Gly Arg Met Val Leu Asp Arg Asn Pro Glu Asn Tyr

290 295 300

Phe Ala Glu Val Glu Gln Ala Thr Phe Ser Pro Gly Thr Leu Val Pro

305 310 315 320

Gly Ile Asp Val Ser Pro Asp Lys Met Leu Gln Gly Arg Leu Phe Ala

325 330 335

Tyr His Asp Ala His Arg Tyr Arg Val Gly Ala Asn His Gln Ala Leu

340 345 350

Pro Ile Asn Arg Ala Arg Asn Lys Val Asn Asn Tyr Gln Arg Asp Gly

355 360 365

Gln Met Arg Phe Asp Asp Asn Gly Gly Gly Ser Val Tyr Tyr Glu Pro

370 375 380

Asn Ser Phe Gly Gly Pro Lys Glu Ser Pro Glu Asp Lys Gln Ala Ala

385 390 395 400

Tyr Pro Val Gln Gly Ile Ala Asp Ser Val Ser Tyr Asp His Asn Asp

405 410 415

His Tyr Thr Gln Ala Gly Asp Leu Tyr Arg Leu Met Ser Glu Asp Glu

420 425 430

Arg Thr Arg Leu Ile Glu Asn Ile Val Asn Ala Met Lys Pro Val Glu

435 440 445

Lys Glu Glu Ile Lys Leu Arg Gln Ile Glu His Phe Tyr Lys Ala Asp

450 455 460

Pro Glu Tyr Gly Lys Arg Val Ala Glu Gly Leu Gly Leu Pro Ile Lys

465 470 475 480

Lys Asp Ser Met Asn Glu Pro Val Phe Asp Ser Tyr Phe Tyr Asp Glu

485 490 495

Gln Ala Phe Asn Leu His Asp Ala Ala Tyr Lys Pro Leu Lys Gln Ala

500 505 510

Gln Ala Pro Ala Thr Pro Leu Asn Ile Pro Pro Leu Leu Thr Pro Asp

515 520 525

Lys Val Asp Gly Asp Asp Val Tyr Tyr Thr Val Thr Ala Gln Ala Gly

530 535 540

Ala Thr Gln Leu Leu Pro Gly Glu Lys Thr Lys Thr Trp Gly Phe Asn

545 550 555 560

Ala Ser Met Leu Gly Gln Thr Val Val Phe Glu Arg Gly Lys Thr Tyr

565 570 575

His Met His Leu Val Asn His Leu Pro Glu Val Thr Thr Phe His Trp

580 585 590

His Gly Leu Glu Ile Pro Gly Pro Ile Glu Asp Gly Gly Cys His Ala

595 600 605

Pro Val Tyr Pro Gly Glu Ala Arg Asp Val Thr Phe Lys Ile Ile Gln

610 615 620

Pro Ala Ala Thr Ala Trp Leu His Ala His Pro Cys Pro Glu Thr Ala

625 630 635 640

Tyr Gln Val Trp Gln Gly Leu Ala Thr Met Ala Ile Ile His Asp Gln

645 650 655

Glu Glu Ala Ser Leu Pro Leu Pro His Thr Tyr Gly Val Asp Asp Leu

660 665 670

Pro Leu Ile Leu Gln Asp Arg Asn Phe His Ala Gly Asn Gln Phe Asp

675 680 685

Tyr Arg Ala Asp Tyr Asp Pro Asp Gly Val Gln Gly Asp Thr Ala Val

690 695 700

Ile Asn Ala Thr Val Asn Pro Tyr Phe Asp Val Thr Thr Gln Arg Leu

705 710 715 720

Arg Leu Arg Ile Leu Asn Gly Ser Asn Arg Arg Glu Tyr Arg Leu His

725 730 735

Phe Ser Asp Asp Leu Thr Phe Thr Gln Ile Gly Ser Asp Leu Ser Phe

740 745 750

Leu Pro His Pro Val Lys Leu Lys Lys Leu Met Thr Thr Cys Ala Glu

755 760 765

Arg Gln Glu Ile Val Val Asp Phe Ala Gly Tyr Gln Pro Gly Asp Thr

770 775 780

Val Thr Leu Tyr Ser Asp Asp Ser Pro Leu Val Glu Phe Arg Ile His

785 790 795 800

Glu Phe Thr Pro Ala Gly Glu Glu Leu Pro Thr Thr Leu Thr Lys Ile

805 810 815

Asp Tyr Pro Thr Pro Asp Pro Ser Leu Pro Val Lys Gln Val Val Met

820 825 830

Ser Gly Met Asp Glu Thr Val Met Ile Asp Gly Lys Lys Phe Gln Met

835 840 845

Asp Arg Ile Asp Tyr Thr Met Pro Met Gly Lys Cys Gln Leu Trp Asp

850 855 860

Ile Thr Asn Thr Asn Asp Met Asn Gly Gly Met Ile His Pro Phe His

865 870 875 880

Met His Gly Cys Ala Phe Glu Ile Val Ser Arg Asn Gly Gln Glu Pro

885 890 895

Tyr Pro Phe Glu His Gly Leu Asn Asp Thr Val Ala Val Asn Pro Gly

900 905 910

Glu His Val Ile Ile Lys Val Tyr Phe Gln Val Pro Gly Val Phe Met

915 920 925

Tyr His Cys His Ile Ile Glu His Glu Asp Gly Gly Met Met Ala Gln

930 935 940

Leu Lys Val Val Asp Pro Ala Ala Pro Asp Arg Glu Tyr His Leu Leu

945 950 955 960

Asn His Met Thr Leu Met Glu Ala Phe Ala Lys Glu Arg Gly Val Thr

965 970 975

Met Asp Glu Leu Trp Leu Gly Gly Met Asp Ser Tyr Lys Lys Met Gly

980 985 990

Met His Met

995

<210> 6

<211> 2988

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 6

atgagttcaa ataaactgac aactagctgg ggcgctccgg ttggagataa tcaaaactca 60

atgactgccg gttctcgcgg accaacttta attcaagatg tacatttact cgaaaaattg 120

gcccatttca accgagaacg tgttcctgaa cgtgttgttc acgccaaagg agcaggcgca 180

cacggatatt ttgaagtgac aaacgacgta acaaaataca cgaaagccgc tttcctttct 240

gaagtcggca aacgcacacc gttgttcatc cgtttctcaa cagttgccgg tgaacttggc 300

tctgctgaca cagttcgcga cccgcgcgga tttgctgtta aattttatac tgaagaagga 360

aactacgaca tcgtcggcaa caatacgcct gtattcttta tccgcgatgc gattaagttc 420

cctgatttca tccatacaca aaaaagagat cctaaaacac acctgaaaaa ccctacggct 480

gtatgggatt tctggtcact ttcaccagag tcacttcacc aagtgacaat cctgatgtct 540

gaccgcggaa ttcctgcaac acttcgccac atgcacggct tcggaagcca tacattcaaa 600

tggacaaatg ccgaaggcga aggcgtatgg attaaatatc actttaaaac ggaacaaggc 660

gtgaaaaacc ttgatgtcaa tacggcagca aaaattgccg gtgaaaaccc tgattaccat 720

acagaagacc ttttcaatgc aatcgaaaac ggtgattatc ctgcatggaa actatatgtg 780

caaatcatgc ctttagaaga tgcaaacacg taccgtttcg atccgtttga tgtcacaaaa 840

gtttggtctc aaaaagacta cccgttaatc gaggtcggac gcatggttct agacagaaat 900

ccggaaaact actttgcaga ggtagaacaa gcgacatttt cacctggaac actcgtgcct 960

ggtattgatg tttcaccgga taaaatgctt caaggccgac tgtttgctta tcatgatgca 1020

caccgctacc gtgtcggtgc aaaccatcaa gcgctgccaa tcaaccgtgc ccgcaacaaa 1080

gtaaacaatt atcagcgtga tggacaaatg cgttttgacg ataacggcgg cggatctgtg 1140

tattacgagc ctaacagctt cggcggtcca aaagagtcac ctgaggataa gcaagcagca 1200

tatccggtac aaggcatcgc tgacagcgta agctacgatc acaacgatca ctacactcaa 1260

gccggtgatc tgtatcgttt aatgagtgaa gatgaacgta cccgccttat tgaaaatatt 1320

gttaatgcta tgaagccggt agaaaaagaa gaaatcaagc tgcgccaaat cgagcacttc 1380

tacaaagcgg atcctgaata cggaaaacgc gtggcagaag gccttggatt gccgattaaa 1440

aaagattcta tgaatgaacc agttttcgat tcctactttt acgatgagca agccttcaac 1500

cttcacgatg cggcctacaa gccactgaag caggctcaag cacccgcgac gcccctcaac 1560

attccgcccc tgttaacccc agacaaggtg gacggcgacg acgtgtacta caccgttacc 1620

gcccaggcgg gggcaaccca gctattgccg ggggaaaaga ccaagacctg gggctttaac 1680

gcctcaatgc tggggcagac ggtggtcttt gagcgcggca agacttacca catgcacctg 1740

gtcaaccacc taccggaagt gacgaccttc cactggcacg gactagagat tcccgggcca 1800

attgaagacg gcggctgcca cgccccggtt tacccgggcg aggcccgcga cgtgaccttt 1860

aagatcattc agccggccgc caccgcctgg ctccacgccc acccctgccc ggaaacggcc 1920

taccaggttt ggcagggact ggcgacgatg gcgatcattc acgaccaaga agaagctagt 1980

ttgcccctgc cgcacactta cggagttgat gacctgccgt tgatcttgca ggaccgcaac 2040

ttccacgcgg gcaaccagtt tgattaccgg gccgattacg accctgatgg cgtccagggt 2100

gacacggcgg tgattaacgc caccgtcaat ccttactttg acgtcaccac ccagcgcctg 2160

cggttgcgaa ttttaaacgg ctctaaccgc cgcgagtacc ggctccactt ctcggacgac 2220

ttaaccttca cccaaattgg ctcggacctg agctttttgc cccacccggt caagttaaag 2280

aagctgatga ctacctgtgc cgagcgccag gagatcgtgg tcgactttgc cggctaccag 2340

ccgggcgaca cggttaccct gtactccgac gacagtccgc tggtcgagtt ccggatccac 2400

gagtttacgc cggcaggaga ggagttgccc accaccctga ccaagattga ttacccgacc 2460

ccagacccga gcctacccgt caagcaggtg gtgatgtctg ggatggacga gacggtgatg 2520

attgacggca agaagttcca gatggaccgg atcgattaca cgatgccgat gggcaagtgc 2580

cagctttggg acattaccaa caccaacgac atgaatggcg ggatgattca ccccttccac 2640

atgcacggct gcgcctttga gatcgtctcc cgtaacggcc aggaacccta cccgtttgaa 2700

cacggactta acgacaccgt cgccgttaac ccgggcgaac acgtcatcat caaggtctac 2760

ttccaagtac cgggggtctt tatgtaccat tgtcacatta tcgaacacga agatggcggg 2820

atgatggccc aactaaaggt tgtcgacccg gccgccccgg accgggagta ccacttgctc 2880

aaccatatga ccctgatgga ggcctttgcc aaggagcggg gcgtcacgat ggatgaactc 2940

tggcttggtg ggatggactc ctacaagaag atggggatgc acatgtaa 2988

<210> 7

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 7

caaagcccga aaggaagctg ag 22

<210> 8

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 8

ggtatatctc cttcttaaag ttaa 24

<210> 9

<211> 45

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 9

aactttaaga aggagatata ccatgaatga accagttttc gattc 45

<210> 10

<211> 44

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 10

ctcagcttcc tttcgggctt tgttacatgt gcatccccat cttc 44

<210> 11

<211> 47

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 11

aactttaaga aggagatata ccatgagttc aaataaactg acaacta 47

<210> 12

<211> 44

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 12

ctcagcttcc tttcgggctt tgttaagaat cttttttaat cggc 44

Claims

1.一种融合酶，其特征在于，含有SEQ ID NO.5所示氨基酸序列。

2.编码权利要求1所述融合酶的基因。

3.携带权利要求2所述基因的表达载体。

4.表达权利要求1所述融合酶的微生物细胞。

5.一种重组大肠杆菌，其特征在于，以E.coliBL21(DE3)为宿主细胞，表达权利要求1所述的融合酶。

6.如SEQ ID NO.3所示的过氧化氢酶在提高多铜氧化酶活性和/或稳定性方面的应用。

7.根据权利要求6所述的应用，其特征在于，将SEQ ID NO.3所示的过氧化氢酶与SEQID NO.1所示的多铜氧化酶融合表达，以提高融合酶对生物胺的催化能力。

8.一种降解生物胺的方法，其特征在于，将权利要求1所述的融合酶加入至含生物胺的环境中，于35～40℃反应至少8h。

9.根据权利要求8所述的方法，其特征在于，所述生物胺包括但不限于组胺、腐胺、尸胺中的至少一种。

10.权利要求1所述的融合酶或权利要求5所述的重组大肠杆菌在食品领域降解生物胺方面的应用。