CN113817620A - 一种甲酯诱导的双启动子毕赤酵母工程菌的构建方法及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种甲酯诱导的双启动子毕赤酵母工程菌的构建及其应用，其包括如下步骤：构建表达载体、插入信号肽、插入启动子、更换表达载体中的信号肽、更换表达载体中的启动子、挑选高表达菌株、获得双启动子菌株。本发明的甲酯诱导工艺简单、安全且产量高，降低了脂肪酶的生产成本，具有良好的工业化应用前景。

Description

一种甲酯诱导的双启动子毕赤酵母工程菌的构建方法及其 应用

技术领域

本发明涉及基因工程技术领域，特别是涉及一种甲酯诱导的双启动子毕赤酵母工程菌的构建及其应用。

背景技术

生物柴油是一种可代替石化柴油的可再生绿色能源，具有良好的燃烧特性，较高的安全性和发动机低温启动性能，受到广泛关注。酶法制备生物柴油具有条件温和、对原料要求低、产物易分离和环境友好等特点，是最具发展前景的生物柴油制备方法之一。

脂肪酶(E.C.3.1.1.3)也称酰基甘油水解酶，可催化水解、酯化、转酯化、醇解、氨解等多种反应，被广泛应用于食品、洗涤剂、医药、日用品、造纸、生物柴油等行业。但脂肪酶出发菌株的低产量以及高生产成本限制了其工业化应用。

巴斯德毕赤酵母(Pichia pastoris)表达系统具有遗传稳定、表达水平高、蛋白分离简单、发酵工艺成熟等优点，是目前最常用的异源表达体系之一。异源蛋白表达的影响因素包括宿主的选择、基因密码子的偏好性、基因拷贝数、启动子的转录效率、信号肽的转运效率、培养条件等。如何提高宿主分泌异源脂肪酶的能力是脂肪酶工业化应用需解决的问题。此外，为了避免菌体因甲醇积累中毒，传统的甲醇诱导方式中需严格控制甲醇添加量，通常采用低速流加甲醇的方式，操作难度大。工业化生产中，甲醇的大量储存也存在安全风险。

发明内容

本部分的目的在于概述本发明的实施例的一些方面以及简要介绍一些较佳实施例。在本部分以及本申请的说明书摘要和发明名称中可能会做些简化或省略以避免使本部分、说明书摘要和发明名称的目的模糊，而这种简化或省略不能用于限制本发明的范围。

鉴于上述和/或现有毕赤酵母工程菌中存在的问题，提出了本发明。

因此，本发明其中一个目的是，克服现有甲醇诱导的毕赤酵母工程菌的不足，提供一种甲酯诱导的双启动子毕赤酵母工程菌的构建方法及其应用。

为解决上述技术问题，根据本发明的一个方面，本发明提供了如下技术方案：一种甲酯诱导的双启动子毕赤酵母工程菌的构建方法，其包括如下步骤：

构建表达载体：根据野生型基因优化目的基因，合成后插入到载体中，获得表达载体1；

插入信号肽：优化编码信号肽的基因，合成后插入到载体中，获得载体2；

插入启动子：优化启动子，优化后的启动子合成后插入到载体上，获得载体3；

更换表达载体中的信号肽：将表达载体1和载体2进行双酶切，然后通过连接酶连接，获得加工完成的表达载体4；

更换表达载体中的启动子：将表达载体4和载体3进行双酶切，，然后通过连接酶连接，获得加工完成的表达载体5；

挑选高表达菌株：将表达载体4进行线性化后转化毕赤酵母KM71H，通过高Zeocin抗性浓度筛选得到4拷贝的毕赤酵母基因工程菌K/T0111；

获得双启动子菌株：使用线性化后的表达载体5二次转化K/T0111，获得含有双启动子的毕赤酵母基因工程菌K/T0717。

作为本发明所述甲酯诱导的双启动子毕赤酵母工程菌的构建方法的一种优选方案，其中：构建表达载体中，目的基因为TLL脂肪酶的基因protll，核苷酸序列如SEQ IDNo.1所示。

作为本发明所述甲酯诱导的双启动子毕赤酵母工程菌的构建方法的一种优选方案，其中：构建表达载体中，使用的载体为载体pPICZαA。

作为本发明所述甲酯诱导的双启动子毕赤酵母工程菌的构建方法的一种优选方案，其中：信号肽基因为MFΔ，所述MFΔ的核苷酸序列如SEQ ID No.2所示

作为本发明所述甲酯诱导的双启动子毕赤酵母工程菌的构建方法的一种优选方案，其中：启动子为AOX1或GCW14。

作为本发明所述甲酯诱导的双启动子毕赤酵母工程菌的构建方法的一种优选方案，其中：GCW14启动子如SEQ ID No.3所示。

作为本发明所述甲酯诱导的双启动子毕赤酵母工程菌的构建方法的一种优选方案，其中：所述更换信号肽和更换启动子中，使用的连接酶为T4 DNA连接酶。

作为本发明所述甲酯诱导的双启动子毕赤酵母工程菌的构建方法的一种优选方案，其中：更换表达载体中的信号肽中，双酶切使用的内切酶分别为BstBⅠ和EcoRⅠ，所述更换表达载体中的启动子中，双酶切使用的内切酶分别为BglⅡ和BstBⅠ。

作为本发明所述甲酯诱导的双启动子毕赤酵母工程菌的构建方法的一种优选方案，其中：构建表达载体中，protll基因插入的位点位于EcoRⅠ和KpnⅠ之间，所述更换信号肽中，信号肽插入到BstBⅠ和EcoRⅠ之间，所述更换启动子中，启动子插入到BglⅡ和BstBⅠ之间。

本发明的另一个目的是，提供一种双启动子毕赤酵母工程菌的应用。

为解决上述技术问题，根据本发明的一个方面，本发明提供了如下技术方案：一种甲酯诱导的双启动子毕赤酵母工程菌的构建方法的一种优选方案，其中：获得的表达载体4和5的在毕赤酵母中进行顺序表达。

本发明提供的毕赤酵母工程菌，通过优化编码脂肪酶基因protll的密码子，更换信号肽，增加表达盒拷贝数，获得一株能够在甲醇诱导下高效表达脂肪酶的毕赤酵母重组菌K/T0111；以含有组成型启动子GCW14的表达载体转化K/T0111，获得一株能够在甲酯诱导下高效表达脂肪酶的双启动子毕赤酵母重组菌K/T0717。发酵过程中一次性加入甲酯，在组成型启动子GCW14的控制下表达的脂肪酶TLL水解甲酯，缓慢且持续释放甲醇，激活诱导型启动子的同时减缓了对菌体的抑制，而脂肪酸可以作为碳源被利用。摇瓶发酵192h，胞外酶活达到8700U/mL，较优化前提高了8.94倍。在无溶剂体系中，直接以发酵上清液催化制备生物柴油，得率达到99％。较传统的甲醇诱导方式，甲酯诱导工艺简单、安全且产量高，降低了脂肪酶的生产成本，具有良好的工业化应用前景。

附图说明

为了更清楚地说明本发明实施例的技术方案，下面将对实施例描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动性的前提下，还可以根据这些附图获得其它的附图。其中：

图1为表达载体pPICZMFΔA/tll和pGCW14ZMFΔA/tll的构建流程图；

图2为含有双启动子的毕赤酵母重组菌在甲酯诱导下表达脂肪酶的示意图；

图3为毕赤酵母工程菌K/T0111和K/T0717产酶能力的比较；

图4为毕赤酵母工程菌K/T0717在不同浓度的油酸甲酯和生物柴油诱导下的摇瓶发酵结果；

图5为脂肪酶基因protll与已公开的疏棉状嗜热丝孢菌脂肪酶基因的核苷酸序列对比图；

图6为本发明制得的生物柴油实物图。

具体实施方式

为使本发明的上述目的、特征和优点能够更加明显易懂，下面结合说明书实施例对本发明的具体实施方式做详细的说明。

在下面的描述中阐述了很多具体细节以便于充分理解本发明，但是本发明还可以采用其他不同于在此描述的其它方式来实施，本领域技术人员可以在不违背本发明内涵的情况下做类似推广，因此本发明不受下面公开的具体实施例的限制。

其次，此处所称的“一个实施例”或“实施例”是指可包含于本发明至少一个实现方式中的特定特征、结构或特性。在本说明书中不同地方出现的“在一个实施例中”并非均指同一个实施例，也不是单独的或选择性的与其他实施例互相排斥的实施例。

实施例1

使用疏棉状嗜热丝孢菌脂肪酶基因的氨基酸序列(Genbank登录号：AF054513.1)，对其脂肪酶基因protll(如SEQ ID NO.1所示)，进行突变，将27位的天冬氨酸突变为精氨酸，使得R27和E56之间形成氢键，提高了蛋白质结构刚性和溶剂耐受性。采用了毕赤酵母中的高频密码子替换原有的低频密码子，降低了mRNA二级结构的复杂性，优化了基因中的GC含量，去除了影响表达的反式作用元件、潜在的提前终止信号和不必要的限制性酶切位点，设计出适合在毕赤酵母中高效表达的脂肪酶基因序列。已公开的疏棉状嗜热丝孢菌脂肪酶基因的核苷酸序列如SEQ ID No.4所示。

实施例2

将实施例1得到的脂肪酶基因protll插入到载体pPICZαA的酶切位点EcoRⅠ和KpnⅠ之间，获得表达载体pPICZαA/tll；编码MFΔ信号肽和GCW14启动子的基因遵循相同优化原则，合成后分别插入到载体pPICZαA的酶切位点BstBⅠ和EcoRⅠ之间以及酶切位点BglⅡ和BstBⅠ之间，获得载体pPICZMFΔA和pGCW14ZαA。表达载体的合成由上海捷瑞生物工程有限公司完成。

将表达载体pPICZαA/tll和pPICZMFΔA分别用BstBⅠ和EcoRⅠ双酶切，电泳，胶回收pPICZαA/tll载体和MFΔ片段，通过T4 DNA连接酶连接，连接产物转化大肠杆菌Top10感受态细胞，37℃过夜培养，按照Axygen的质粒小提试剂盒使用说明提取表达载体pPICZMFΔA/tll。测序由生工生物工程有限公司完成。表达载体构建流程图如图2所示。酶切体系：20μL质粒，24μL ddH₂O，5μL 10×Cutsmart Buffer，1μL Q.cut BstBⅠ，65℃保温30min；酶切产物经过PCR清洁后，取20μL，加入24μL ddH₂O，5μL 10×H Buffer,1μL EcoRⅠ，37℃保温3h。连接体系：2μL pPICZαA/tll载体片段，6μL MFΔ片段，1μL 10×T4 DNA ligase Buffer，1μL T4 DNA连接酶，16℃过夜连接。

将载体pGCW14ZαA和pPICZMFΔA/tll分别用BglⅡ和BstBⅠ双酶切，电泳，胶回收pPICZMFΔA/tll载体和GCW14片段，通过T4 DNA连接酶连接，连接产物转化大肠杆菌Top10感受态细胞，37℃过夜培养，按照Axygen的质粒小提试剂盒使用说明提取表达载体pGCW14ZMFΔA/tll。测序由生工生物工程有限公司完成。表达载体构建流程图如图2所示。酶切体系：20μL质粒，24μL ddH₂O，5μL 10×Cutsmart Buffer，1μL Q.cut BstBⅠ，65℃保温30min；酶切产物经过PCR清洁后，取20μL，加入24μL ddH₂O，5μL 10×Buffer 3.1,1μL BglⅡ，37℃保温30min。连接体系：2μL pPICZMFΔA/tll载体片段，6μL GCW14片段，1μL 10×T4DNA ligase Buffer，1μL T4 DNA连接酶，16℃过夜连接。所用限制性内切酶BglⅡ和BstBⅠ购自NEB公司，EcoRⅠ购自Takara公司。

实施例3

1、毕赤酵母KM71H感受态细胞的制备

取出在-80℃保存的KM71H甘油菌，在YPD平板上划线，于30℃培养2-3天；挑取生长良好的单菌落，接种于含有2mL YPD液体培养基的摇管中，于30℃，250rpm培养约12h；取0.5mL菌液转接至200mL YPD液体培养基中，于30℃，250rpm培养至OD₆₀₀为1.3～1.5。1500×g离心5min并收集细胞，用200mL预冷的无菌超纯水于冰上重悬细胞；1500×g离心5min并收集细胞，用100mL预冷的无菌超纯水于冰上重悬细胞；1500×g离心5min并收集细胞，用20mL预冷的1mol/L山梨醇于冰上重悬细胞；1500×g离心5min，管底剩余约0.5mL的山梨醇悬浮细胞，分装至无菌EP管中，每管80-100μL。

2、用SacⅠ线性化表达载体pPICZαA/tll，酶切体系：43.5μL质粒，5μL10×Q.cutbuffer，1.5μL Q.cut SacⅠ，37℃保温30min。按照Axygen的PCR清洁试剂盒使用说明回收线性化载体。取10μg线性化载体加入80μL上述制备的酵母感受态细胞中，转入预冷的电转杯中，冰置5min。2000V，5ms电击一次，立即加入1mL 1mol/L的预冷山梨醇溶液，30℃孵育1h。取400μL转化液涂布YPDS平板(含100μg/mL Zeocin抗性)，30℃培养2-3天。挑取饱满、形态较好的单菌落于2mL YPD摇管中，30℃，250rpm培养16-20h，按照生工生物的酵母基因组提取试剂盒的说明书提取基因组DNA。按照擎科生物的T5 Fast qPCR Mix试剂盒进行荧光定量PCR，经测定，得到单拷贝的毕赤酵母基因工程菌，命名为K/T0820，该重组菌为未进行优化的原始表达菌株。

3、用SacⅠ线性化后的表达载体pPICZMFΔA/tll转化赤酵母KM71H感受态细胞，挑取在含有高浓度抗性(1000μg/mL Zeocin)的YPDS平板上生长良好的单菌落，经筛选获得一株4拷贝高效表达脂肪酶的重组菌，命名为K/T0111。

表1荧光定量PCR引物列表

4、将毕赤酵母基因工程菌K/T0111制成感受态细胞，用SacⅠ线性化后的表达载体pGCW14ZMFΔA/tll二次转化K/T0111感受态细胞，获得含有双启动子的毕赤酵母基因工程菌，命名为K/T0717。

实施例4

1、将上述毕赤酵母基因工程菌K/T0717甘油菌接种于2mL YPD摇管，30℃，250rpm培养16-20h后接入50mL BMGY培养基，30℃，250rpm培养24h后加入培养基总体积比1％的油酸甲酯或生物柴油，以加入培养液总体积1％的甲醇的发酵体系作对照，相同条件继续培养，每隔24h取样，测定其细胞密度(OD₆₀₀)和胞外的TLL脂肪酶酶活。

2、使用NaOH滴定法测定TLL脂肪酶酶活，酶活定义为在测定条件下，每分钟释放1μmol脂肪酸所需的酶量。具体步骤按照国标GB/T 23535-2009的说明进行：

(1)底物溶液：量取150mL 4％(w/v)聚乙烯醇溶液，加50mL橄榄油，用高速匀浆机处理6min；

(2)磷酸缓冲液(pH＝7.5)：称取磷酸二氢钾1.96g，十二水磷酸氢二钠39.62g，溶解后定容至500mL，调pH至7.5±0.05；

(3)NaOH标准溶液：称取11g NaOH于10mL无CO₂水中，注入聚乙烯容器中静置，取上层清液2.7mL用无CO₂水稀释，定容至100mL；称取干燥至恒重的邻苯二甲酸氢钾3.6g，加入80mL无CO₂水，加入2滴酚酞指示剂，标定出NaOH溶液的浓度，准确稀释10倍后使用；

(4)取5mL磷酸缓冲液和4mL底物溶液混合后于40℃预热5min，加入1mL适当稀释的酶液，反应15min后立即加入15mL 95％乙醇，采用电位滴定法，滴定至反应液pH＝10.3，空白对照在预热时即加入15mL 95％乙醇。

3、毕赤酵母基因工程菌K/T0717摇瓶发酵192h，以1％(v/v)生物柴油为诱导剂时，胞外酶活达到8700U/mL；以1％(v/v)油酸甲酯为诱导剂时，胞外酶活为6732U/mL；以1％(v/v)甲醇为诱导剂时，胞外酶活为5009U/mL。此外，未进行优化的原始表达菌株K/T0820以1％(v/v)甲醇为诱导剂时，胞外酶活为973U/mL，毕赤酵母基因工程菌K/T0717脂肪酶胞外表达水平比原始表达菌株提高了8.94倍。

实施例5

1、收集发酵液，8000rpm离心30min，收集上清液。

2、于25mL茄形瓶中加入5g麻疯树籽油，适当稀释的发酵上清液，采用不同的甲醇添加方式加入一定量甲醇，置于水浴摇床中，40℃，200rpm反应72h。其中，分别测试了脂肪酶添加量(10-100U/g)、含水量(10-80％)、醇油比(3:1-6:1)和甲醇添加方式对生物柴油得率的影响。

3、生物柴油得率采用气相色谱(GC，Aglilent 7890A)分析，取50μL产物与50μL10mg/mL的十七烷酸甲酯内标物和400μL正己烷混合，分析条件为：PEG-20M极性毛细管柱，FID检测器，载气为高纯氮气，流速为30mL/min。进样量1μl，分流比50:1，进样口和检测器温度分别设为250℃和260℃，初始温度180℃，保温2min，然后以3℃/min升至240℃，保温10min。

测得的K/T0717菌株在不同浓度的油酸甲酯和生物柴油诱导下的摇瓶发酵结果如图5所示。

分别测试了脂肪酶添加量、含水量、醇油比和甲醇添加方式对生物柴油得率的影响。结果表明，当脂肪酶添加量为30U/g，含水量为20％，醇油摩尔比为4:1时生物柴油的得率最高。在反应初始加入醇油比为1:1的甲醇，8h后加入醇油比为2:1的甲醇，16h后加入醇油比为1:1的甲醇，反应60h，生物柴油得率达到99％。

脂肪酶基因protll与已公开的疏棉状嗜热丝孢菌脂肪酶基因的核苷酸序列对比图如图5所示，由图5可得，存在些微的差别。

应说明的是，以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非限制，尽管参照较佳实施例对本发明进行了详细说明，本领域的普通技术人员应当理解，可以对本发明的技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本发明技术方案的精神和范围，其均应涵盖在本发明的权利要求范围当中。

序列表

<110> 南京林业大学

<120> 一种甲酯诱导的双启动子毕赤酵母工程菌的构建方法及其应用

<160> 4

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 822

<212> DNA/RNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

tcccctatta gaagagaagt ttctcaagat ttgtttaacc aatttaactt gtttgctcaa 60

tactccgctg ctgcttactg tggtaagaac aacagagccc cagctggaac taacattact 120

tgtactggaa acgcttgtcc agaagttgaa aaggctgatg ctactttttt gtactccttt 180

gaagattcag gagttggtga tgttactgga tttttggctt tggataacac taacaagttg 240

attgttttgt cctttagagg atctcgctct attgaaaact ggattggtaa cttgaacttt 300

gatttgaagg aaattaacga tatttgttcc ggatgtagag gacatgatgg ttttacttct 360

tcatggagat ccgttgctga tactttgaga caaaaggttg aagatgctgt tagagaacca 420

gattacagag ttgtttttac tggtcattcc ttgggaggtg ctttggctac tgttcatgct 480

ggagctgatt tgagaggtaa cggttacgat attgatgttt tttcatacgg tgctccaaga 540

gttggaaaca gagcttttgc tgaatttttg actgttcaaa ctggaggaac tttgtacaga 600

attactcata ctaacgatat tgttcctaga ttgccaccta gagaatttgg ttactcccat 660

tcttcacctg aatactggat taagtccgga actttggttc cagttactag aaacgatatt 720

gttaagattg aaggtattga tgctactggt ggtaacaacc aaccaaacat tcctgatatt 780

ccagctcatt tgtggtactt tggattgatt ggaacttgtt tg 822

<210> 2

<211> 237

<212> DNA/RNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

ttcgaaatga gatttccttc aatttttact gctgttttat tcgcagcatc ctccgcatta 60

gctgctccag tcaacactac aacagaagat gaaacggcac aaattccggc tgaagctgtc 120

atcggttact cagatttaga aggggatttc gatgttgctg ttttgccatt ttccgccagc 180

attgctgcta aagaagaagg ggtatctctc gagaaaagag aggctgaagc tgaattc 237

<210> 3

<211> 828

<212> DNA/RNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

agatctcagg tgaacccacc taactatttt taactgggat ccagtgagct cgctgggtga 60

aagccaacca tcttttgttt cggggaaccg tgctcgcccc gtaaagttaa tttttttttc 120

ccgcgcagct ttaatctttc ggcagagaag gcgttttcat cgtagcgtgg gaacagaata 180

atcagttcat gtgctataca ggcacatggc agcagtcact attttgcttt ttaaccttaa 240

agtcgttcat caatcattaa ctgaccaatc agattttttg catttgccac ttatctaaaa 300

atacttttgt atctcgcaga tacgttcagt ggtttccagg acaacaccca aaaaaaggta 360

tcaatgccac taggcagtcg gttttatttt tggtcaccca cgcaaagaag cacccacctc 420

ttttaggttt taagttgtgg gaacagtaac accgcctaga gcttcaggaa aaaccagtac 480

ctgtgaccgc aattcaccat gatgcagaat gttaatttaa acgagtgcca aatcaagatt 540

tcaacagaca aatcaatcga tccatagtta cccattccag ccttttcgtc gtcgagcctg 600

cttcattcct gcctcaggtg cataactttg catgaaaagt ccagattagg gcagattttg 660

agtttaaaat aggaaatata aacaaatata ccgcgaaaaa ggtttgttta tagcttttcg 720

cctggtgccg tacgctataa atacatactc tcctcccccc cctggttctc tttttctttt 780

gttacttaca ttttaccgtt ccgtcactcg cttcactcaa caacaaaa 828

<210> 4

<211> 822

<212> DNA/RNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 4

agtcctattc gtcgagaggt ctcgcaggat ctgtttaacc agttcaatct ctttgcacag 60

tattctgcag ccgcatactg cggaaaaaac aatgatgccc cagctggtac aaacattacg 120

tgcacgggaa atgcctgccc cgaggtagag aaggcggatg caacgtttct ctactcgttt 180

gaagactctg gagtgggcga tgtcaccggc ttccttgctc tcgacaacac gaacaaattg 240

atcgtcctct ctttccgtgg ctctcgttcc atagagaact ggatcgggaa tcttaacttc 300

gacttgaaag aaataaatga catttgctcc ggctgcaggg gacatgacgg cttcacttcg 360

tcctggaggt ctgtagccga tacgttaagg cagaaggtgg aggatgctgt gagggagcat 420

cccgactatc gcgtggtgtt taccggacat agcttgggtg gtgcattggc aactgttgcc 480

ggagcagacc tgcgtggaaa tgggtatgat atcgacgtgt tttcatatgg cgccccccga 540

gtcggaaaca gggcttttgc agaattcctg accgtacaga ccggcggaac actctaccgc 600

attacccaca ccaatgatat tgtccctaga ctcccgccgc gcgaattcgg ttacagccat 660

tctagcccag agtactggat caaatctgga acccttgtcc ccgtcacccg aaacgatatc 720

gtgaagatag aaggcatcga tgccaccggc ggcaataacc agcctaacat tccggatatc 780

cctgcgcacc tatggtactt cgggttaatt gggacatgtc tt 822

Claims (10)

1.一种甲酯诱导的双启动子毕赤酵母工程菌的构建方法，其特征在于：包括如下步骤：

构建表达载体：根据野生型基因优化目的基因，合成后插入到载体中，获得表达载体1；

插入信号肽：优化编码信号肽的基因，合成后插入到载体中，获得载体2；

插入启动子：优化启动子，优化后的启动子合成后插入到载体上，获得载体3；

更换表达载体中的信号肽：将表达载体1和载体2进行双酶切，然后通过连接酶连接，获得加工完成的表达载体4；

更换表达载体中的启动子：将表达载体4和载体3进行双酶切，，然后通过连接酶连接，获得加工完成的表达载体5；

挑选高表达菌株：将表达载体4进行线性化后转化毕赤酵母KM71H，通过高Zeocin抗性浓度筛选得到4拷贝的毕赤酵母基因工程菌K/T0111；

获得双启动子菌株：使用线性化后的表达载体5二次转化K/T0111，获得含有双启动子的毕赤酵母基因工程菌K/T0717。

2.根据权利要求1中所述的甲酯诱导的双启动子毕赤酵母工程菌的构建方法，其特征在于：所述构建表达载体中，目的基因为TLL脂肪酶的基因protll，核苷酸序列如SEQ IDNo.1所示。

3.根据权利要求1中所述的甲酯诱导的双启动子毕赤酵母工程菌的构建方法，其特征在于：所述构建表达载体中，使用的载体为载体pPICZαA。

4.根据权利要求1中所述的甲酯诱导的双启动子毕赤酵母工程菌的构建方法，其特征在于：信号肽基因为MFΔ，所述MFΔ的核苷酸序列如SEQ ID No.2所示。

5.根据权利要求1中所述的甲酯诱导的双启动子毕赤酵母工程菌的构建方法，其特征在于：所述启动子为AOX1或GCW14。

6.根据权利要求1中所述的甲酯诱导的双启动子毕赤酵母工程菌的构建方法，其特征在于：所述GCW14启动子如SEQ ID No.3所示。

7.根据权利要求1中所述的甲酯诱导的双启动子毕赤酵母工程菌的构建方法，其特征在于：所述更换信号肽和更换启动子中，使用的连接酶为T4 DNA连接酶。

8.根据权利要求1中所述的甲酯诱导的双启动子毕赤酵母工程菌的构建方法，其特征在于：所述更换表达载体中的信号肽中，双酶切使用的内切酶分别为BstBⅠ和EcoRⅠ，所述更换表达载体中的启动子中，双酶切使用的内切酶分别为BglⅡ和BstBⅠ。

9.根据权利要求1中所述的甲酯诱导的双启动子毕赤酵母工程菌的构建方法，其特征在于：所述构建表达载体中，protll基因插入的位点位于EcoRⅠ和KpnⅠ之间，所述更换信号肽中，信号肽插入到BstBⅠ和EcoRⅠ之间，所述更换启动子中，启动子插入到BglⅡ和BstBⅠ之间。

10.根据权利要求1中所述的甲酯诱导的双启动子毕赤酵母工程菌的应用，其特征在于：所述获得的表达载体4和5的在毕赤酵母中进行顺序表达。

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