CN113736817A

CN113736817A - 一种毕赤酵母中提高碱性脂肪酶分泌效率及酶活的方法

Info

Publication number: CN113736817A
Application number: CN202111171921.0A
Authority: CN
Inventors: 许向阳; 高晓冬; 李子杰; 宋在伟; 汪布青; 王亚森; 王鹏
Original assignee: Jienuo Enzyme Co ltd; Jiangnan University
Current assignee: Jienuo Enzyme Co ltd; Jiangnan University
Priority date: 2021-10-08
Filing date: 2021-10-08
Publication date: 2021-12-03
Anticipated expiration: 2041-10-08
Also published as: CN113736817B

Abstract

本发明属于基因工程领域，涉及一种毕赤酵母中提高碱性脂肪酶分泌效率及酶活的方法，本发明的碱性脂肪酶LIP1碱基序列如SEQ ID NO:1所示，其氨基酸序列如SEQ ID NO:2所示。本发明基于组合优化策略对脂肪酶LIP1依次经过密码子偏好性优化、基因多拷贝积累、更换分泌作用更强的信号肽以及分子伴侣共表达等优化提高其在毕赤酵母中的分泌效率及酶活，实现脂肪酶LIP1在重组酵母中高效表达和积累。

Description

一种毕赤酵母中提高碱性脂肪酶分泌效率及酶活的方法

技术领域

本发明涉及基因工程技术领域，特别涉及一种毕赤酵母中提高碱性脂肪酶分泌效率及酶活的方法。

背景技术

公开该背景技术部分的信息仅仅旨在增加对本发明的总体背景的理解，而不必然被视为承认或以任何形式暗示该信息构成已经成为本领域一般技术人员所公知的现有技术。

脂肪酶(EC 3.1.1.3)是一类广泛存在于动物、植物和微生物中的蛋白类酰基甘油水解酶，在自然条件下能够在油水混合界面催化油脂生成不同链长的游离脂肪酸、酯类和甘油等物质，而在非水相体系中参与催化酯交换、酯化、酸解和氨解等多种类型反应。由于脂肪酶具有催化效率高、反应过程温和以及对底物的特异性催化活力等特性，使其广泛应用于食品、洗涤剂、造纸、生物能源和生物医药等工业领域。如今，脂肪酶已经成为重要的工业用酶之一，它们在工业应用研究过程中发展相当迅速。

脂肪酶作为最早被研究应用的酶种之一，自1834年兔胰脂肪酶被报道到如今，对脂肪酶的认知已有百年之久。如今，利用微生物进行发酵其优势远优于从自然材料中提取，早在60年代，曲霉、根霉等菌种来源的脂肪酶已在日本实现商品化生产。而碱性脂肪酶由于其对碱性环境的偏好性，在洗涤、造纸、医药、生物能源等领域具有广泛的用途。但目前，碱性脂肪酶的工业化应用仍然存在急需解决的关键性问题：1)酶来源受限；2)自然条件下，产酶量有限，活性低；3)野生型菌株代谢产物复杂，其产物提取纯化困难，提高了经济成本。

综上所述，碱性脂肪酶的工业化应用缺陷在一定程度上减缓其工程化进程。此外，在自然条件下，野生型菌株的脂肪酶产出量有限，利用常规选育方法很难满足工业化生产的需要。

发明内容

为了克服上述问题，本发明的目的是提供一种在毕赤酵母中高效表达的碱性脂肪酶，以满足其在工业化应用中的需求。

为实现上述技术目的，本发明采用如下技术方案：

本发明的第一个方面，提供了一种毕赤酵母中提高碱性脂肪酶分泌效率及酶活的方法，包括：

构建质粒：将毕赤酵母密码子偏好性优化的基因序列人工合成并构建到质粒中，制得重组质粒，其所述的碱基序列如SEQ ID NO:1；

重组质粒的转化：将重组质粒转入毕赤酵母中；

多拷贝基因的积累：采用遗传霉素筛选多拷贝的重组酵母菌株；

信号肽优化：对重组质粒进行信号肽的优化和构建重组菌株，并验证其是否能够稳定表达；

伴侣蛋白优化：将信号肽优化完成后的菌株进行分子伴侣共表达优化，并验证其是否能够稳定表达，得到重组酵母菌株；

将所述重组酵母菌株进行发酵，即得。

巴斯德毕赤酵母(Pichiapastoris)异源表达系统由于其高效表达水平、强大的分泌能力、完善的诱导表达方法以及成熟的高密度发酵能力而广泛应用于重组蛋白的表达。因此，本发明借助毕赤酵母表达体系，利用基因工程技术提高脂肪酶的表达量，实现了脂肪酶在重组酵母中高效表达和积累，对促进其实现产业化应用具有重要意义。

本发明的第二个方面，提供了上述的方法制备的脂肪酶活性高的重组酵母菌株。

本发明的第三个方面，提供了信号肽优化和伴侣共表达优化的组合策略在提高碱性脂肪酶分泌效率及酶活中的应用。

本发明的有益效果在于：

(1)本发明借助毕赤酵母表达体系，利用基因工程技术基于组合优化策略，最终获得一株碱性脂肪酶活性最高的菌株GS115/pPIC9K-Mss-SSA4-LIP1，其酶活达到1136U/mL，并相较于已报道的未经过组合策略优化的LIP1表达于毕赤酵母中的酶活提高了7.28倍，且相较于LIP1表达于野生型菌株杜邦嗜热菌中的酶活提高了18.9倍；此外，优化的菌株经5L高密度发酵罐培养，其酶活达到12150U/mL，相较摇瓶发酵，酶活提高10.7倍，实现了LIP1在毕赤酵母中的高效表达，这将为未来LIP1的产业化应用奠定基础。

(2)本申请的操作方法简单、表达效率高、易于规模化生产。

附图说明

构成本发明的一部分的说明书附图用来提供对本发明的进一步理解，本发明的示意性实施例及其说明用于解释本发明，并不构成对本发明的不当限定。

图1中A为重组质粒载体pPIC9K-LIP1菌落PCR验证；图1中B为毕赤酵母阳性转化子菌落PCR验证；图1中C为BMMY-罗丹明B平板筛选高酶活重组菌株。

图2中A和图2中B分别是重组碱性脂肪酶LIP1的SDS-PAGE和Western Blot分析。

图3中A是不同信号肽优化对脂肪酶蛋白表达的影响；图3中B是不同信号肽优化对脂肪酶分泌表达的酶活影响。

图4中A是不同分子伴侣共表达优化对脂肪酶蛋白表达的影响；图4中B是不同分子伴侣共表达优化对脂肪酶分泌表达的酶活影响。

图5中A显示了重组菌株高密度发酵的上清脂肪酶蛋白的表达水平；图5中B显示了高密度发酵过程中菌株OD600、细胞干重以及上清中碱性脂肪酶LIP1酶活。

具体实施方式

应该指出，以下详细说明都是示例性的，旨在对本发明提供进一步的说明。除非另有指明，本发明使用的所有技术和科学术语具有与本发明所属技术领域的普通技术人员通常理解的相同含义。

本发明的第一个方面公开了一种来自杜邦嗜热菌(Thermomycesdupontii)的碱性脂肪酶(命名为LIP1)，其含有如SEQ ID NO:2所示的氨基酸序列。

本发明的第二个方面，提供了一种经毕赤酵母密码子偏好性优化的脂肪酶LIP1的碱基序列，通过遗传霉素筛选多拷贝的重组酵母菌株，获得在毕赤酵母高效表达的碱性脂肪酶。其脂肪酶碱基序列如SEQ ID NO:1所示。

本发明的第三个方面，提供了6种信号肽序列，分别替代重组载体中的α-factor信号肽，构建出6株不同信号肽优化的重组毕赤酵母菌株。优选的，根据本发明，获得一株经信号肽优化的酶活最高重组酵母菌株GS115/pPIC9K-Mss-LIP1。

本发明的第四个方面，提供了6种已报道能促进蛋白分泌表达的分子伴侣，构建出6种分子伴侣共表达优化重组酵母菌株。优选的，根据本发明，获得一株经分子伴侣共表达优化的酶活最高重组酵母菌株GS115/pPIC9K-Mss-LIP1-SSA4。

本发明的第五个方面，提供了经上述组合优化后的重组酵母菌株的高密度发酵，为该脂肪酶进一步的工业化生产奠定了基础。

基于以上各方面的研究，本发明通过以下技术方案实现：

一种碱性脂肪酶重组菌株的制备方法,包括如下步骤：

(1)制备碱性脂肪酶表达质粒：

a.人工合成上述的碱性脂肪酶的碱基序列；

b.将上述扩增基因PCR产物经DNA纯化后，限制性内切酶EcoR I和Not I分别对纯化的基因片段和质粒pPIC9K进行双酶切消化，T₄ DNA连接，转化至大肠杆菌E.coli DH5α感受态细胞，得到脂肪酶表达质粒pPIC9K-LIP1；

(2)利用表达质粒制备重组菌株：

a.将表达质粒pPIC9K-LIP1经限制性内切酶Sal I线性化后，电转至毕赤酵母GS115中；

b.将转化液涂板于MD平板上。2-3天后将MD平板中的转化子，经遗传霉素的抗性平板筛选出含多拷贝基因的重组菌株。并将获得的重组菌株接种于BMMY-罗丹明B平板中，筛选获得脂肪酶活性高的重组酵母菌株。

所述的信号肽优化的碱性脂肪酶重组菌株的制备：

根据毕赤酵母密码子偏好性优化设计信号肽D1 signal sequence(D1ss)、D2signal sequence(D2ss)、FLD1 signal sequence(Fss)、MFH4 signal sequence(Mss)、W1signal sequence(Wss)、Glucoamylase signal sequence(Gss)的基因序列，通过设计相应信号肽引物为模板扩增出信号肽，并经过BamHI和EcoRI酶切后连接至pPIC9K-LIP1，替换该质粒中的α-factor信号肽，构建出质粒pPIC9K-D1ss-LIP1、pPIC9K-D2ss-LIP1、pPIC9K-Fss-LIP1、pPIC9K-Mss-LIP1、pPIC9K-Wss-LIP1和pPIC9K-Gss-LIP1。并参考步骤(2)的方法转化和筛选出酶活高的重组菌株。

所述的分子伴侣共表达优化的碱性脂肪酶重组菌株的制备：

根据6种分子伴侣的基因序列设计引物，以提取的毕赤酵母GS115基因组为模板，扩增出相应的分子伴侣片段。并经过BamH I和EcoR I酶切后连接至pPICZA中，构建出质粒pPICZA-BMH2、pPICZA-HAC、pPICZA-KEX2、pPICZA-SSA4、pPICZA-PDI、pPICZA-UBC1。将经毕赤酵母密码子偏好性优化、基因多拷贝优化以及信号肽优化后的脂肪酶活性最高的菌株GS115/pPIC9K-Mss-LIP1作为出发菌株，将分子伴侣的质粒载体经线性化后，电击转化至重组菌株GS115/pPIC9K-Mss-LIP1中。并参考步骤(2)的方法转化和筛选出酶活高的重组菌株。

所述的重组酵母菌株摇瓶发酵生产脂肪酶的方法：

将重组酵母菌株接种至YPD培养基中，30℃培养12h；将YPD中的菌液按4％接种量转接至BMGY培养基中，30℃摇床培养至OD₆₀₀为20左右；离心收集BMGY中的菌体，无菌水(预冷)清洗两遍后离心收集，重悬于BMMY培养基中发酵培养，每24h加入1％的甲醇诱导，同时取上清酶液采用SDS-PAGE检测LIP1的蛋白表达，以及测定上清酶活。

所述的重组酵母菌株高密度发酵生产脂肪酶的方法：

将经组合优化获得的最高酶活菌株接种于YPD培养基中，30℃培养12h；将YPD中的菌液按4％接种量转接至BMGY培养基中，30℃培养24h，作为发酵种子液。将发酵种子液接种于含2L BSM无机盐培养基的5L发酵罐中，采用50％磷酸和氨水自动流加调节pH。高密度发酵分为甘油流加培养阶段和甲醇诱导阶段。在甘油流加阶段，通过补加甘油增加菌群密度；在甲醇诱导阶段，通过甲醇检测器检测发酵液中的甲醇含量，每隔24h取样检测OD₆₀₀、细胞干重以及测定上清LIP1酶活。

下面结合具体的实施例，对本发明做进一步的详细说明，应该指出，所述具体实施例是对本发明的解释而不是限定。

以下实施例中，YPD固体培养基的具体组成如下：酵母提取物10g/L，蛋白胨20g/L，葡萄糖20g/L，琼脂20g/L。

BMGY培养基的具体组成如下：蛋白胨20g/L，酵母提取物10g/L，甘油10g/L，K₂HPO₄3g/L，KH₂PO₄ 11.8g/L，10mL 1×YNB，2mL 500×生物素，罗丹明B 4mg/L。

BSM无机盐培养基的具体组成如下：85％H₃PO₄ 26.7mL/L，CaSO₄·2H₂O 0.93g/L，K₂SO₄ 18.2g/L，MgSO₄·2H₂O 14.9g/L，KOH 4.13g/L，甘油40g/L，PTM1 4mL/L。

实施例1

重组脂肪酶LIP1质粒载体构建及酵母转化表达

(1)参照杜邦嗜热菌脂肪酶完整氨基酸序列(GenBank登录号：JF414585.1)，获得截短的由前体肽识别序列和成熟肽编码序列构成脂肪酶LIP1的蛋白编码序列，其氨基酸序列如SEQ ID NO:2所示；

(2)设计毕赤酵母密码子偏好性优化编码LIP1的碱基序列并进行人工合成，其碱基序列如SEQ ID NO:1所示，将其插入到毕赤酵母甲醇诱导分泌型质粒pPIC9K中，使用双酶切技术实现LIP1插入到毕赤酵母甲醇诱导分泌型质粒pPIC9K中，双酶切使用的酶分别为EcoR1和Not1，双酶切完成后进行酶连，纯化后转化至E.coli DH5α感受态细胞中。涂布于LB(蛋白胨10g/L，酵母提取物5g/L，NaCl 10g/L，含50ug/mL卡那霉素)平板，挑取阳性转化子进行菌落PCR鉴定(见图1中A)及基因测序，结果表明成功构建出质粒载体pPIC9K-LIP1。

(3)将表达载体pPIC9K-LIP1经Sal I线性化、回收和浓缩后，电击转化至毕赤酵母GS115，涂板于MD(琼脂20g/L，10mL 1×YNB，40mL 50％葡萄糖，2mL 500×生物素)平板上。2-3天后将MD平板中的转化子，逐步挑至含不同质量浓度(0.5，1.0，2.0以及3.0mg/mL)G418遗传霉素的YPD(酵母提取物10g/L，蛋白胨20g/L，葡萄糖20g/L)平板上，筛选出含多拷贝基因的重组菌株,并进行菌落PCR验证(见图1中B)，其结果与预期相符，成功的构建出重组酵母菌株GS115/pPIC9K-LIP1。将获得的阳性转化子接种于BMMY-罗丹明B(蛋白胨20g/L，酵母提取物10g/L，甘油10g/L，K₂HPO₄ 3g/L，KH₂PO₄ 11.8g/L，10mL 1×YNB，2mL 500×生物素，罗丹明B 4mg/L)定性筛选平板中进行初筛，筛选出透明圈大的菌株用于脂肪酶LIP1的表达(见图1中C)。

(4)LIP1活性检测采用碱滴定法。在50mL三角瓶中，依次加入5mL Tris-HCl(50mM，pH 10.0)和4mL橄榄油乳化液，在60℃水浴中预热5min。实验组中加入1mL稀释合适倍数的预热发酵上清酶液，空白组加入预热1mL Tris-HCl在60℃水浴中反应10min后，立即加入15mL 95％乙醇溶液终止反应。向三角瓶中滴入2滴酚酞指示剂，采用0.05M NaOH标准溶液进行滴定，直至液体呈微红色并保持30s内不褪色，记录消耗的NaOH标准溶液的体积。取三次实验的平均值。上述单位脂肪酶LIP1酶活力的定义：上述反应条件下每分钟产生1μmol游离脂肪酸的所需酶量。

(5)将筛选出的重组酵母菌株接种于5mL的YPD培养基中，30℃培养12h；将YPD中的菌液按4％接种量转接至50mL的BMGY培养基中，30℃摇床培养至OD₆₀₀为20左右；离心收集BMGY中的菌体，使用50mL无菌水(预冷)洗两遍并离心收集，重悬于50mL的BMMY培养基中发酵培养，每24h加入1％的甲醇诱导，同时取上清酶液采用SDS-PAGE和Western Blot检测LIP1的蛋白表达，其结果如图2所示，且脂肪酶LIP1的酶活达到576U/mL。

实施例2

信号肽对脂肪酶在毕赤酵母中表达水平的影响

(1)如下表所示，选取六种毕赤酵母同源的分泌型信号肽：D1 signal sequence(D1ss)、D2 signal sequence(D2ss)、FLD1 signal sequence(Fss)、MFH4 signalsequence(Mss)、W1 signal sequence(Wss)、Glucoamylase signal sequence(Gss)，通过设计相应信号肽引物为模板扩增出信号肽，并经过BamH I和EcoR I酶切后连接至pPIC9K-LIP1，替换该质粒中的α-factor信号肽，构建出质粒pPIC9K-D1ss-LIP1、pPIC9K-D2ss-LIP1、pPIC9K-Fss-LIP1、pPIC9K-Mss-LIP1、pPIC9K-Wss-LIP1和pPIC9K-Gss-LIP1。

(2)参考实施例1中酵母转化和筛选出酶活高的重组菌株的方法，成功构建出6种信号肽优化的重组酵母菌株GS115-pPIC9K-D1ss-LIP1、GS115-pPIC9K-D2ss-LIP1、GS115-pPIC9K-Fss-LIP1、GS115-pPIC9K-Mss-LIP1、GS115-pPIC9K-Wss-LIP1和GS115-pPIC9K-Gss-LIP1。

(3)参考实施例1中酵母表达方法，进行不同信号肽优化的重组酵母菌株的表达，其插入不同信号肽优化的LIP1表达水平如图3所示。由图3可知，信号肽Mss的分泌效果最强，可将LIP1的分泌酶活提高至835U/mL，为出发菌株的1.45倍。

(4)通过本实施例获到了一株脂肪酶活性最高的菌株GS115/pPIC9K-Mss-LIP1，并选择它进行下一步的优化研究。

实施例3

分子伴侣对脂肪酶在毕赤酵母中表达水平的影响

(1)通过在NCBI网站中获得分子伴侣BMH2(GenBank登录号：XM_002490942.1)、HAC(GenBank登录号：XP_002490039.1)、KEX2(GenBank登录号：XM_002491154.1)、SSA4(GenBank登录号：XM_002493814.1)、PDI(GenBank登录号：CAC33588.1)和UBC1(GenBank登录号：XM_002492398.1)的基因序列，并依据基因序列设计引物，以提取的毕赤酵母GS115基因组为模板，扩增出相应的分子伴侣片段。并经过BamH I和EcoR I酶切后连接至pPICZA中，构建出质粒pPICZA-BMH2、pPICZA-HAC、pPICZA-KEX2、pPICZA-SSA4、pPICZA-PDI、pPICZA-UBC1。

(2)将经毕赤酵母密码子偏好性优化、基因多拷贝优化以及信号肽优化后的脂肪酶活性最高的菌株GS115/pPIC9K-Mss-LIP1作为出发菌株。采用Sal I线性化pPICZA-BMH2、pPICZA-KEX2、pPICZA-SSA4和pPICZA-UBC1，Sac I线性化pPICZA-HAC和pPICZA-PDI，回收和浓缩后，电击转化至重组菌株GS115/pPIC9K-Mss-LIP1中。

(3)参考实施例1中酵母表达方法，对不同分子伴侣共表达优化的重组酵母菌株进行表达，其共表达不同分子伴侣优化的LIP1表达水平如图4所示。由图4可知，信号肽SSA4的分泌效果最强，可将LIP1的分泌酶活提高至1136U/mL，为出发菌株的1.36倍。

(4)通过本实施例获得的一株重组酵母菌GS115/pPIC9K-Mss-SSA4-LIP1，其基于组合优化策略，依次经过密码子偏好性优化、目的基因多拷贝、信号肽优化以及分子伴侣共表达优化使其酶活达到1136U/mL，相较于已报道的LIP1表达于毕赤酵母中的酶活提高了7.28倍，实现了碱性脂肪酶LIP1在毕赤酵母中的高效表达。

实施例4

(1)将基于组合优化获得的最高酶活菌株GS115/pPIC9K-Mss-SSA4-LIP1接种于10mL的YPD培养基中，30℃培养12h；将YPD中的菌液按4％接种量转接至200mL的BMGY培养基中，30℃培养24h，作为发酵种子液。将发酵种子液接种于含2L BSM无机盐培养基的5L发酵罐中，采用50％磷酸和氨水自动流加调节pH。在甘油流加培养阶段，调节pH至5.5，调节温度至30℃。采用DO-star方式流加甘油，待湿重达到220g/L以上时，停止甘油流加并饥饿处理30min后，进入流加甲醇诱导阶段。此时，调节pH至6.0，调节温度至27℃，将甲醇缓慢流加至培养液中，通过甲醇检测器检测发酵液中的甲醇含量，每隔24h取样检测OD₆₀₀、细胞干重以及测定上清LIP1酶活。

(2)重组菌株高密度发酵结果如图5所示，随着诱导时间增加，重组LIP1的产量逐渐增加，当诱导时间达到144h时，LIP1的酶活最高，达到12150U/mL，相较摇瓶发酵，酶活提高10.7倍，实现了LIP1在重组酵母中高效表达和积累。并且随着发酵时间的增加，重组工程菌株的DO₆₀₀和细胞干重也在不断增加，在诱导发酵时间为168h时，细胞干重达到最大为120.5g/L。由于毕赤酵母GS115在发酵阶段很少分泌内源蛋白到胞外，因而发酵上清酶液中基本都是重组LIP1(如图5中A)，有利于碱性脂肪酶LIP1进一步产业化生产的分离和纯化。

最后应该说明的是，以上所述仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，尽管参照前述实施例对本发明进行了详细的说明，对于本领域的技术人员来说，其依然可以对前述实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分进行等同替换。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

SEQUENCE LISTING

<110> 枣庄市杰诺生物酶有限公司、江南大学

<120> 一种毕赤酵母中提高碱性脂肪酶分泌效率及酶活的方法

<130> 2021.8.31

<160> 2

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 836

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 1

atgtccccag tcaggagaga ggtgtcacag gacttatttg accaatttaa cctttttgct 60

cagtattctg ctgcagccta ttgcgctaag aataatgacg caccagcagg tgccaacgtc 120

acgtgtaggg gttccatttg ccccgaggta gaaaaggcag acgccacttt tttatattcc 180

tttgaggatt ccggtgttgg agatgtgaca ggctttttgg ctcttgataa tacgaatagg 240

ctgatagtgt taagtttcag gggttcaaga tcattggaga attggatagg caatattaac 300

ctggatttaa agggtatcga tgacatttgt tccggttgta aaggccatga tggctttaca 360

tcttcttggc gtagtgtggc taacacgctg acccaacagg tgcagaacgc cgttcgtgaa 420

catccagatt acagggtcgt gttcactgga cacagtttag gaggtgccct tgcaacagtc 480

gctggcgcat cactgcgtgg aaatggctac gacatagacg tattttctta cggagcacct 540

agagtcggta acagggcctt cgctgtcttt ctaacggccc aaaccggagg tacactgtac 600

aggataacgc acacgaatga tattgtccca cgtttgccac caagagagct gggctattcc 660

cactcctccc ctgaatattg gatcacatca ggcacactgg tccctgtcac aaagaacgat 720

attgtcaaag tcgaaggcat agatagtaca gacggaaata accagcccaa cacccctgac 780

attgcagcac acttgtggta tttcggcctg attggaacct gcttatgagc ggccgc 836

<210> 2

<211> 270

<212> PRT

<213> 人工序列

<400> 2

Met Glu Val Ser Gln Asp Leu Phe Asp Gln Phe Asn Leu Phe Ala Gln

1 5 10 15

Tyr Ser Ala Ala Ala Tyr Cys Ala Lys Asn Asn Asp Ala Pro Ala Gly

20 25 30

Ala Asn Val Thr Cys Arg Gly Ser Ile Cys Pro Glu Val Glu Lys Ala

35 40 45

Asp Ala Thr Phe Leu Tyr Ser Phe Glu Asp Ser Gly Val Gly Asp Val

50 55 60

Thr Gly Phe Leu Ala Leu Asp Asn Thr Asn Arg Leu Ile Val Leu Ser

65 70 75 80

Phe Arg Gly Ser Arg Ser Leu Glu Asn Trp Ile Gly Asn Ile Asn Leu

85 90 95

Asp Leu Lys Gly Ile Asp Asp Ile Cys Ser Gly Cys Lys Gly His Asp

100 105 110

Gly Phe Thr Ser Ser Trp Arg Ser Val Ala Asn Thr Leu Thr Gln Gln

115 120 125

Val Gln Asn Ala Val Arg Glu His Pro Asp Tyr Arg Val Val Phe Thr

130 135 140

Gly His Ser Leu Gly Gly Ala Leu Ala Thr Val Ala Gly Ala Ser Leu

145 150 155 160

Arg Gly Asn Gly Tyr Asp Ile Asp Val Phe Ser Tyr Gly Ala Pro Arg

165 170 175

Val Gly Asn Arg Ala Phe Ala Val Phe Leu Thr Ala Gln Thr Gly Gly

180 185 190

Thr Leu Tyr Arg Ile Thr His Thr Asn Asp Ile Val Pro Arg Leu Pro

195 200 205

Pro Arg Glu Leu Gly Tyr Ser His Ser Ser Pro Glu Tyr Trp Ile Thr

210 215 220

Ser Gly Thr Leu Val Pro Val Thr Lys Asn Asp Ile Val Lys Val Glu

225 230 235 240

Gly Ile Asp Ser Thr Asp Gly Asn Asn Gln Pro Asn Thr Pro Asp Ile

245 250 255

Ala Ala His Leu Trp Tyr Phe Gly Leu Ile Gly Thr Cys Leu

260 265 270

Claims

1.一种毕赤酵母中提高碱性脂肪酶分泌效率及酶活的方法，其特征在于，包括：

重组质粒的转化：将重组质粒转入毕赤酵母中；

将所述重组酵母菌株进行发酵，即得。

2.如权利要求1所述的毕赤酵母中提高碱性脂肪酶分泌效率及酶活的方法，其特征在于，所述信号肽为D1 signal sequence、D2 signal sequence、FLD1 signal sequence、MFH4 signal sequence、W1 signal sequence、或Glucoamylase signal sequence，优选为MFH4 signal sequence。

3.如权利要求1所述的毕赤酵母中提高碱性脂肪酶分泌效率及酶活的方法，其特征在于，所述分子伴侣为BMH2、HAC、KEX2、SSA4、PDI或UBC1，优选为SSA4。

4.如权利要求1所述的毕赤酵母中提高碱性脂肪酶分泌效率及酶活的方法，其特征在于，所述碱性脂肪酶氨基酸序列如SEQ ID NO:2所示。

5.如权利要求1所述的毕赤酵母中提高碱性脂肪酶分泌效率及酶活的方法，其特征在于，所述重组质粒的转化中，将重组质粒采用电击法转入毕赤酵母中。

6.如权利要求1所述的毕赤酵母中提高碱性脂肪酶分泌效率及酶活的方法，其特征在于，所述构建质粒中，使用限制性核酸内切酶SalI线性化质粒。

7.如权利要求1所述的毕赤酵母中提高碱性脂肪酶分泌效率及酶活的方法，其特征在于，所述多拷贝的重组酵母菌株，使用BMMY-罗丹明B筛选平板，获得脂肪酶活性高的菌株。

8.如权利要求1所述的毕赤酵母中提高碱性脂肪酶分泌效率及酶活的方法，其特征在于，所述重组酵母菌株在表达脂肪酶时，最适的温度为28℃，最适pH为6，最佳诱导发酵时间为144h；

或，所述发酵采用高密度发酵。

9.权利要求1-8任一项所述的方法制备的脂肪酶活性高的重组酵母菌株。

10.信号肽优化和伴侣共表达优化的组合策略在提高碱性脂肪酶分泌效率及酶活中的应用。