CN116121217B - 木糖氧化能力提高的葡萄糖氧化酶突变体及其应用 - Google Patents

木糖氧化能力提高的葡萄糖氧化酶突变体及其应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种木糖氧化能力提高的葡萄糖氧化酶突变体及其制备方法与应用，其中所述突变体是对氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示的野生型葡萄糖氧化酶的底物结合口袋进行改造，对第110位和第414位氨基酸进行点突变获得，并且实现了对其底物特异性的改造。实验证实与野生型酶相比，本发明提供的突变体对木糖的氧化活性是其6.7倍，在催化以木糖为原料生产木糖酸的应用中前景广阔，同时还有望应用于建筑、饲料、化工、食品、医药、农业、检测等行业。

Description

木糖氧化能力提高的葡萄糖氧化酶突变体及其应用
技术领域
本发明涉及一种葡萄糖氧化酶突变体及其应用，尤其涉及一种木糖氧化能力提高的葡萄糖氧化酶突变体及其制备方法与应用。属于基因工程技术领域。
背景技术
葡萄糖氧化酶(简称GOX，EC 1.1.3.4)在有氧条件下利用氧气分子作为电子受体，催化β-D-葡萄糖生成D-葡萄糖酸内酯和过氧化氢，随后D-葡萄糖酸内酯可自发水解成葡萄糖酸和水。葡萄糖氧化酶通常使用黑曲霉、青霉等真菌生产，被广泛应用于食品、饲料、生物传感器等领域。葡萄糖酸及葡萄糖酸盐可用作蛋白凝固剂、钢铁和玻璃清洗剂、水泥减水剂和缓凝剂等。
木糖酸是木糖的氧化产物，与葡萄糖酸具有相似结构，曾被美国能源部评为最具有潜力的30种生物基化学品之一。在建筑行业，木糖酸盐可作为高效水泥添加剂，替代葡萄糖酸盐发挥减水剂和缓凝剂作用。此外，木糖酸也可作为合成1,2,4-丁三醇等化学品的前体物质，是一种重要的平台化合物。由于木糖是植物生物质中含量仅次于葡萄糖的单糖，储量巨大，因此以木糖为原料生产木糖酸对于缓解资源问题和实现绿色可持续发展具有重要意义。
文献报道的木糖酸的生产方式主要有化学法和生物法两类。其中，生物法包括微生物发酵法和酶法两种(Toivari et al.,Appl Microbiol Biotechnol,2012,96:1–8)。微生物发酵法生产使用的菌种包括葡萄糖氧化杆菌、恶臭假单胞菌等自身表达木糖脱氢酶的细菌，以及异源表达木糖脱氢酶的酵母、大肠杆菌等工程菌株。与微生物发酵法相比，基于氧化酶的体外酶法生产以氧气作为电子受体，具有工艺简单、稳定性好等优势。然而，目前尚未见到天然的木糖氧化酶的报道。
黑曲霉来源的葡萄糖氧化酶底物专一性强，对木糖仅有很低的活性，已有的报道通过延长催化时间、增加酶剂量等方式，虽然使用该酶能够实现木糖的酶法氧化，但效率低下。因此，有必要使用蛋白质工程手段对葡萄糖氧化酶的底物特异性进行改造，实现能够高效氧化木糖，用于木糖酸的酶法生产等领域。经检索，有关通过对野生型葡萄糖氧化酶的底物结合口袋进行改造，对其氨基酸进行点突变，实现对其底物木糖氧化能力提高的特异性的改造还未见报道。
发明内容
针对现有葡萄糖氧化酶对木糖的氧化能力较低的问题，本发明的目的是提供一种木糖氧化能力提高的葡萄糖氧化酶突变体及其制备方法与应用。
本发明所述的木糖氧化能力提高的葡萄糖氧化酶突变体，其特征在于：所述突变体分别命名为T110V、T110I、T110V/F414L；其中：所述T110V是将氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示的野生型葡萄糖氧化酶GOX的第110位氨基酸T突变为V得到，其氨基酸序列如SEQIDNO:2所示；所述T110I是将氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示的野生型葡萄糖氧化酶GOX的第110位氨基酸T突变为I得到，其氨基酸序列如SEQ ID NO:3所示；所述T110V/F414L是将氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示的野生型葡萄糖氧化酶GOX的第110位氨基酸T突变为V且第414位氨基酸F突变为L得到，其氨基酸序列如SEQ ID NO:4所示。
上述的木糖氧化能力提高的葡萄糖氧化酶突变体，优选的实施方式是：所述突变体是T110V/F414L，其是将氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示的野生型葡萄糖氧化酶GOX的第110位氨基酸T突变为V且第414位氨基酸F突变为L得到，其氨基酸序列如SEQ ID NO:4所示。
编码上述木糖氧化能力提高的葡萄糖氧化酶突变体的基因，其特征在于：所述编码木糖氧化能力提高的葡萄糖氧化酶突变体T110V基因的核苷酸序列如SEQ ID NO:6所示；所述编码木糖氧化能力提高的葡萄糖氧化酶突变体T110I基因的核苷酸序列如SEQ ID NO:7所示；所述编码木糖氧化能力提高的葡萄糖氧化酶突变体T110V/F414L基因的核苷酸序列如SEQ ID NO:8所示。
本发明提供了包含上述的木糖氧化能力提高的葡萄糖氧化酶突变体基因的重组载体，其特征在于：所述重组载体分别命名为pPIC9K-T110V、pPIC9K-T110I、pPIC9K-T110V/F414、pRS416-T110V、pRS416-T110I、pRS416-T110V/F414。
本发明还提供了包含上述的木糖氧化能力提高的葡萄糖氧化酶突变体基因的重组菌株，其特征在于：所述重组菌株是权利要求4所述的重组载体pPIC9K-T110V、pPIC9K-T110I或pPIC9K-T110V/F414转化毕赤酵母得到的重组菌株；或是权利要求4所述的重组载体pRS416-T110V、pRS416-T110I或pRS416-T110V/F414转化酿酒酵母得到的重组菌株。
进一步优选：所述重组菌株是将重组载体pPIC9K-GOX-T110I、pPIC9K-GOX-T110V、或pPIC9K-GOX-T110V/F414L转化巴斯德毕赤酵母GS115分别得到的重组菌株GS115-GOX-T110I、GS115-GOX-T110V、GS115-GOX-T110V/F414L。
本发明所述木糖氧化能力提高的葡萄糖氧化酶突变体的制备方法，步骤是：
(1)构建上述木糖氧化能力提高的葡萄糖氧化酶突变体基因的重组载体；
(2)将构建的重组载体转化至宿主细胞，获得重组菌株；
(3)对所得到的重组菌株进行发酵培养，回收木糖氧化能力提高的葡萄糖氧化酶突变体产物即葡萄糖氧化酶。
上述木糖氧化能力提高的葡萄糖氧化酶突变体的制备方法中：所述宿主细胞优选毕赤酵母或酿酒酵母。
上述木糖氧化能力提高的葡萄糖氧化酶突变体的制备方法，优选的实施方式是：所述重组载体是pPIC9K-GOX-T110V/F414L，所述宿主细胞为巴斯德毕赤酵母GS115，所述重组菌株是GS115-GOX-T110V/F414L。
本发明所述木糖氧化能力提高的葡萄糖氧化酶突变体在催化制备木糖酸中的应用。
本发明提供的木糖氧化能力提高的葡萄糖氧化酶突变体，具体可以应用于木糖酸的酶法或发酵法生产，生产出的木糖酸及木糖酸盐可应用于建筑、化工、食品、医药、农业等领域。木糖氧化能力提高的葡萄糖氧化酶突变体本身也可直接应用于饲料添加、木糖与阿拉伯糖等其他糖类的分离、木糖浓度测定传感器的制造等领域。
实验证实，本发明的有益效果是：与黑曲霉来源野生型葡萄糖氧化酶GOX相比，本发明提供的突变体氧化木糖的能力明显提高。对重组菌发酵上清液中的重组酶进行分离纯化后测定木糖氧化酶的比活力，可知双突变的葡萄糖氧化酶突变体T110V/F414L的木糖氧化酶比活力是野生型的葡萄糖氧化酶GOX的6.7倍。预示本发明提供的葡萄糖氧化酶突变体能够高效催化木糖氧化制备木糖酸，具有广阔的应用前景。
附图说明
图1显示氨基酸残基Thr110和Phe414在黑曲霉葡萄糖氧化酶三维结构中的位置。
图2显示重组表达野生型葡萄糖氧化酶GOX，以及突变体T110V、F414L、T110V/F414L的巴斯德毕赤酵母发酵液的木糖氧化酶活力变化曲线。
图3显示纯化的野生型葡萄糖氧化酶GOX，以及突变体T110V、T110I、F414L、T110V/F414L的木糖氧化酶比活力。
图4显示纯化的野生型葡萄糖氧化酶GOX，以及突变体T110V、T110I、F414L、T110V/F414L的葡萄糖氧化酶比活力。
具体实施方式
以下现详细说明本发明的多种示例性实施方式，该详细说明不应认为是对本发明的限制，而应理解为是对本发明的某些方面、特性和实施方案的更详细的描述。应理解本发明中所述的术语仅仅是为描述特别的实施方式，并非用于限制本发明。
除非另有说明，否则本发明使用的所有技术和科学术语具有本发明所述领域的常规技术人员通常理解的相同含义。虽然本发明仅描述了优选的方法和材料，但是在本发明的实施或测试中也可以使用与本发明所述相似或等同的任何方法和材料。
在不背离本发明的范围或精神的情况下，可对本发明说明书的具体实施方式做多种改进和变化，这对本领域技术人员而言是显而易见的。本发明说明书和实施例仅是示例性的。
本发明提供的示例实施方式使用的野生型葡萄糖氧化酶GOX来自黑曲霉，在具体实施中，还可能包括来自尼崎青霉、产黄青霉、阿达青霉、扩展青霉、黄孢原毛平革菌等，与黑曲霉GOX序列相似的糖氧化酶。
本发明提供的示例实施方式使用的宿主细胞包括酿酒酵母和巴斯德毕赤酵母，在具体实施中，还可能包括大肠杆菌、枯草芽孢杆菌、马克斯克鲁维酵母、解脂耶氏酵母、黑曲霉、米曲霉、里氏木霉等。
一般性说明：
实施例所用的实验材料：
菌株：蛋白质表达宿主酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)CEN.PK2-1C，来自德国Euroscarf保藏中心(保藏号30000A)；巴斯德毕赤酵母(Pichia pastoris)GS115，来自Invitrogen公司。
载体：pRS416自主复制型低拷贝质粒载体(GenBank登录号U03450)，携带URA3标记基因、TEF1启动子、CYC1终止子，用于酿酒酵母宿主表达；pPIC9K整合型质粒载体，用于毕赤酵母宿主表达，来自Invitrogen公司。
实施例所用的培养基：
LB：蛋白胨10g/L、酵母提取物5g/L、NaCl 10g/L，用于大肠杆菌的培养。
YPD：酵母粉10g/L、蛋白胨20g/L、葡萄糖20g/L。
MD：葡萄糖20g/L、YNB(含硫酸铵)13.4g/L、生物素0.0004g/L
SD：YNB(含硫酸铵)6.7g/L、葡萄糖20g/L、酵母合成Drop-out培养基补充物(不含尿嘧啶)1.3g/L，pH调节至5.8。
酿酒酵母筛选培养基：YNB(含硫酸铵)6.7g/L、果糖20g/L、酵母合成Drop-out培养基补充物(不含尿嘧啶)1.3g/L，pH调节至5.8。
BMGY：酵母粉10g/L、蛋白胨20g/L、YNB(不含硫酸铵)3.4g/L、硫酸铵10g/L、磷酸二氢钾11.8g/L、磷酸氢二钾3g/L、1％甘油(v/v)、生物素0.0004g/L，pH调节至5.8。
BMMY：酵母粉10g/L、蛋白胨20g/L、YNB(不含硫酸铵)3.4g/L、硫酸铵10g/L、磷酸二氢钾11.8g/L、磷酸氢二钾3g/L、1％甲醇(v/v)、生物素0.0004g/L，pH调节至5.8。
实施例所用试剂来源：
南京诺唯赞公司Max Super-Fidelity DNA Polymerase、2×Taq Master Mix以及ClonExpress II One Step Cloning Kit；OMEGA公司质粒提取及琼脂糖胶回收试剂盒；北京全式金生物技术有限公司pEASY-Basic Seamless Cloning and Assembly Kit；鼎国昌盛生物科技有限公司GoldViewTM核酸染料；阿拉丁公司3,3’-二甲氧基联苯胺；麦克林公司辣根过氧化物酶；北京索莱宝科技有限公司过氧化氢酶等。
实施例所用的仪器：
PCR仪(BIO-GENER)；高速冷冻离心机(Eppendorf)；琼脂糖凝胶紫外成像系统(Major Science)；叠加式振荡培养箱(旻泉)；超微量分光光度计(Quawell)；加热磁力搅拌器；电热恒温水浴槽；pH计(Sartorius)；电泳仪(北京六一生物科技有限公司)；微孔板分光光度计(BioTeK)；高压灭菌锅(德强仪器)；电热鼓风干燥箱；循环水式多用真空泵(拓赫机电科技)；lexCap Q 6FF层析柱(天地人和生物科技有限公司)；25层析系统(GEHealthcare)；高效液相色谱(岛津公司)。
实施例1葡萄糖氧化酶突变体文库的制备
根据黑曲霉(Aspergillus niger)葡萄糖氧化酶GOX(氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示)的三维结构，选择底物结合口袋的Thr110位点(图1)进行突变。
以上游连有酿酒酵母alpha因子信号肽编码区的黑曲霉葡萄糖氧化酶GOX编码基因(核苷酸序列如SEQ ID NO:5所示)为模板，采用定点突变的方法对Thr110位点进行饱和突变。以上突变方法以及克隆方法参考文献(Williams et al.(2014)Site-SaturationMutagenesis by Overlap Extension PCR.Methods Mol Biol,1179:83–101)，所用引物如下表所示：
Primer Sequence(5’to 3’)
T110-F CTACTTTGGTTAATGGTGGTNNKTGGACTAGACCACATAAAGC
T110-R ACCACCATTAACCAAAGTAGAACCACCCAAACCATTACCAG
将PCR获得的线性片段通过一步克隆的方式整合到经过双酶切线性化的质粒载体pRS416上，转化到大肠杆菌DH5α感受态细胞中，涂布于LB培养基(含50μg/mL氨苄青霉素)进行筛选，构建得到突变体质粒文库。
提取重组质粒文库，使用醋酸锂化学转化(R Daniel Gietz,Robin A Woods.(2002)
Transformation of yeast by lithium acetate/single-stranded carrierDNA/polyethylene glycol method.Methods Enzymol,350:87-96)的方法将重组质粒转化进入酿酒酵母CEN.PK2-1C中，涂布在SD固体培养基上，培养2-3天后长出转化子。
在T110V突变体基础上，进一步选择底物结合口袋的Phe414位点(图1)进行突变。
以上游连有酿酒酵母alpha因子信号肽编码区的葡萄氧化酶突变体T110V编码基因(核苷酸序列如SEQ ID NO:6所示，氨基酸序列如SEQ ID NO:2所示)为模板，参照本实施例中Thr110位点的定点突变的方法，对Phe414位点进行饱和突变，并使用同样的方法转化大肠杆菌构建突变体质粒文库，转化入酿酒酵母CEN.PK2-1C中，涂布在SD固体培养基上，培养2-3天后长出转化子。所用引物如下表所示：
Primer Sequence(5’to 3’)
F414-F CAATGTTGCTTATTCTGAATTGNNKTTGGATACTGCTGGTGTTG
F414-R CAATTCAGAATAAGCAACATTGTGATTGACGATCCAATCTCTA
实施例2木糖氧化能力提高的葡萄糖氧化酶突变体的筛选
挑取SD平板上的96个酿酒酵母转化子，接种到装有1ml酿酒酵母筛选培养基的1.5ml离心管中。在200rpm，30℃条件下，在摇床中震荡培养48h。将发酵后的菌液8000rpm，10min离心，取离心后的上清液于1.5ml离心管中测定木糖氧化酶活力。
木糖氧化酶活力的测定方法参考文献(Bankar et al.(2009)Optimization ofAspergillus niger Fermentation for the Production of Glucose Oxidase.FoodBioprocess Technol,2:344)，略作改动，具体步骤如下：
配制以下溶液：(1)0.1M磷酸氢二钠-磷酸二氢钠缓冲液(pH 6.0)；(2)邻联茴香胺甲醇溶液缓冲液：1g邻联茴香胺加在100ml甲醇溶液中制备成浓缩液；取0.1ml加入到上述磷酸氢二钠-磷酸二氢钠缓冲液12ml中混匀；(3)15％(w/v)木糖溶液；(4)辣根过氧化物酶液100U/ml。
在1.5ml离心管中依次加入500μL邻联茴香胺溶液、60μL木糖溶液、20μL辣根过氧化物酶，35℃预热5min，加入60μL酶液，在35℃孵育10小时后加入400μL 2M硫酸溶液，在500nm处测定吸光值。将每分钟氧化木糖生成1μmol过氧化氢所需的酶量定义为一个活力单位(U)。
选取木糖氧化酶活力较高的转化子提取DNA，酿酒酵母DNA小量提取的方法为：
(1)取100μL液体培养液(OD600＝0.4-1.0)与200μL裂解缓冲液(醋酸锂20g/L，SDS10g/L)混合；
(2)使用旋涡振荡器上7档，震荡10分钟，每隔2分钟取出弹下管壁上残留的液体；
(3)加入300μL的96％乙醇沉淀DNA，瞬时涡旋混合；
(4)10000rpm离心3min收集DNA；
(5)弃上清液，加入500μL 70％乙醇，10000rpm离心1min，弃废液；再离心20s，用200μL的枪尖吸掉多余的酒精；
(6)打开盖子挥发酒精，将沉淀悬浮于50μL ddH2O中溶解。
将提取的基因组进一步进行PCR扩增，引物如下表所示：
将PCR产物送至生工生物工程有限公司进行测序，确定木糖氧化酶活力提高的突变体的核苷酸序列。
经过测序后发现，在Thr110位点突变的木糖氧化酶活力较高的转化子中，编码110位苏氨酸的核苷酸序列ACT突变为了GTG或GTT(缬氨酸)、ATT(异亮氨酸)、AAG(亮氨酸)、CAT(组氨酸)、CCA(脯氨酸)、GAT(天冬氨酸)。将Thr110突变为缬氨酸的GOX突变体命名为T110V，其氨基酸序列如SEQ ID NO:2所示；将Thr110突变为异亮氨酸的GOX突变体命名为T110I，其氨基酸序列如SEQ ID NO:3所示。
在T110V突变体基础上进一步对第414位苯丙氨酸突变后，对木糖氧化酶活力较高的突变体进行测序发现，编码414位苯丙氨酸的核苷酸序列TTT突变为了CTG或TTG或CTT(亮氨酸)。将Phe414突变为亮氨酸的T110V突变体命名为T110V/F414L，其氨基酸序列如SEQ IDNO:4所示。
实施例3葡萄糖氧化酶GOX及其突变体在巴斯德毕赤酵母中的表达
采用PCR的方法扩增野生型黑曲霉葡萄糖氧化酶GOX成熟肽编码区，引物如下表所示：
Primer Sequence(5’to 3’)
Pp-GOx-Pp F AGGCTGAAGCTTACGTAGAATTCTCTAATGGTATTGAAGCTTCTTTG
Pp-GOx-Pp R TTAATTCGCGGCCGCCCTAGGGTTATTGCATAGAAGCATAATC
使用限制性内切酶EcoRⅠ切割pPIC9K空质粒载体，获得线性化的质粒载体。借助一步克隆试剂盒将GOX基因整合到pPIC9K质粒载体上，转化到大肠杆菌DH5α感受态细胞中，涂布于LB培养基(含50μg/mL氨苄青霉素)进行筛选。待测序正确后，提取质粒，利用SalI限制性内切酶将重组质粒pPIC9K-GOX进行酶切，回收酶切产物。
使用线性化的重组质粒电击转化巴斯德毕赤酵母GS115感受态细胞，具体步骤为：
(1)将甘油管中的GS115菌在YPD固体平板上划单克隆，30℃培养3天；
(2)挑取单菌落到装有5mL YPD的试管中，30℃，200rpm培养12-14小时；
(3)转接2.5ml菌液到装有50mL YPD的摇瓶中，30℃，200rpm培养10-12小时；
(4)取适量菌液转接到装有100mL YPD的摇瓶中，调整菌液的起始OD600为0.1，30℃，200rpm培养过夜，至OD600达到1.0-1.3；
(5)取100mL菌液于4℃,1500g离心5分钟，用50mL冰预冷的无菌水将菌体沉淀重悬；
(6)按步骤(5)离心，用50mL冰预冷的无菌水将菌体沉淀重悬；
(7)按步骤(5)离心，用5mL冰预冷的1M山梨醇溶液将菌体重悬；
(8)按步骤(5)离心，用200μL的冰预冷的1M山梨醇溶液将菌体沉淀重悬；
(9)将步骤(8)制取的80μL巴斯德毕赤酵母感受态细胞与5-20μg线性化DNA混匀，并将其转移到0.2cm的冰预冷的电转杯中；
(10)电转仪在电压2000V，电容25μF，电阻200Ω的条件下进行电击转化；
(11)电击完毕后，迅速加入1mL冰预冷的山梨醇溶液将菌体混匀，转至1.5mL离心管；
(12)在30℃静置恒温培养1-2小时，使细胞复苏；
(13)将200μL菌体悬液涂布于MD平板，30℃培养。
培养2-3天后，通过PCR验证得到重组表达菌株GS115-GOX。类似的，将pPIC9K空质粒转化到GS115中，得到菌株GS115-pPIC9K，作为对照。
根据实施例2中确定的突变体T110V、T110I和T110V/F414L的氨基酸序列设计定点突变引物，构建突变体编码基因。其中所述编码突变体T110V基因的核苷酸序列如SEQ IDNO:6所示；所述编码突变体T110I基因的核苷酸序列如SEQ ID NO:7所示；所述编码突变体
T110V/F414L基因的核苷酸序列如SEQ ID NO:8所示。
同时，也构建Thr110不突变，而Phe414突变为亮氨酸的单位点突变体，命名为F414L。定点突变的引物如下表所示：
采用与本实施例中构建野生型GOX表达菌株GS115-GOX类似的方法，将GOX突变体基因在巴斯德毕赤酵母中进行表达。首先，通过转化大肠杆菌分别获得重组质粒pPIC9K-GOX-T110I、pPIC9K-GOX-T110V、pPIC9K-GOX-F414L、pPIC9K-GOX-T110V/F414L，然后转化巴斯德毕赤酵母GS115分别得到重组菌株GS115-GOX-T110I、GS115-GOX-T110V、GS115-GOX-F414L和GS115-GOX-T110V/F414L。
实施例4表达葡萄糖氧化酶GOX及其突变体的巴斯德毕赤酵母发酵液上清的酶活力测定
GOX及其突变体的诱导表达：将实施例3得到的重组巴斯德毕赤酵母菌株GS115-GOX、GS115-pPIC9K、GS115-GOX-T110I、GS115-GOX-T110V、GS115-GOX-F414L和GS115-GOX-T110V/F414L分别接种在YPD平板上生长。
分别将各重组菌的菌落接种于1ml YPD液体培养基中，200rpm，30℃培养24h后，以1％的接种量接种至50mL BMGY培养基中进行种子液培养，200rpm，30℃培养24h后，以8000rpm离心10min弃上清，将沉淀全部转接至100mL BMMY培养基中，200rpm，30℃，每24h补加1％的甲醇进行诱导表达，共培养120h。
对分别获得的表达葡萄糖氧化酶GOX及其突变体的巴斯德毕赤酵母GS115的发酵液8000rpm，10min离心，收集上清液进行木糖氧化酶活力的测定。
酶活力测定方法与实施例2中的方法相同，但反应时间为10min。测定结果显示，各突变体表达菌株的酶活力均高于转化pPIC9K空载体的对照菌株，双突变体T110V/F414L的木糖氧化酶活力最高(图2)。
实施例5葡萄糖氧化酶GOX及其突变体的纯化与比活力测定
分别将诱导表达后的巴斯德毕赤酵母GS115发酵液8000rpm，10min离心，收集上清液后用30kDa的超滤浓缩离心管(PALL)进行浓缩，将浓缩后的粗酶液用lexCap Q 6FF阴离子柱纯化，纯化用A液为0.2mM Tris-HCl缓冲液(pH 8.0)，B液为0.2mM Tris-HCl+1M NaCl缓冲液，以1ml/min的流速梯度洗脱15min，收集洗脱液获得纯化后的蛋白。
对纯化后的野生型葡萄糖氧化酶GOX和突变体的木糖氧化酶、葡萄糖氧化酶比活力进行测定。木糖氧化酶活力的测定方法与实施例4中的描述相同。葡萄糖氧化酶活力的测定也使用相同方法，但将底物由15％(w/v)木糖溶液替换为18％(w/v)葡萄糖溶液，反应时间为5min。蛋白质浓度使用Bradford方法测定，根据牛血清白蛋白绘制的标准曲线计算样品的蛋白浓度。糖氧化酶活力与蛋白质浓度的比值为酶的比活力。
结果如图3所示，野生型葡萄糖氧化酶GOX的木糖氧化酶比活力为1.46U/mg，突变体T110I、T110V和T110V/F414L的木糖氧化酶比活力分别为2.33、3.17和9.73U/mg，分别为野生型GOX的1.6、2.2和6.7倍。F414L单独突变时，对木糖氧化能力影响不大。如图4所示，除了突变体F414L外，突变体T110I、T110V和T110V/F414L的葡萄糖氧化酶比活力与野生酶相比均显著下降，说明其底物偏好性发生了改变。
实施例6木糖氧化能力提高的葡萄糖氧化酶GOX突变体在制备木糖酸中的应用
将实施例4中获得的巴斯德毕赤酵母GS115表达的葡萄糖氧化酶GOX突变体T110V/F414L粗酶液进行超滤浓缩，与商品过氧化氢酶共同用于木糖的转化。反应在INFORSMultifors生物反应器中进行，罐体积为1L，装液量为0.6L。分别按10U/g和1000U/g木糖的用量加入T110V/F414L酶液和过氧化氢酶，设定反应温度为40℃，反应过程中流加浓度为100g/L的NaOH溶液调节控制pH在6.0。搅拌速度为150rpm，通风量为1VVM。反应24h后取样，使用高效液相色谱测定其成分。其中色谱柱HPX-87H(Bio-Rad)，柱温60℃，使用0.005M的硫酸为流动相以0.5mL/min的速度进行洗脱。经测定，24h后反应体系中木糖浓度由初始的15g/L降为6.5g/L，与标准品比对信号峰，确认实现了木糖到木糖酸的转化。
以上实验证明，本发明提供的木糖氧化能力提升、底物特异性发生改变的葡萄糖氧化酶GOX突变体特别是突变体T110V/F414L可以应用于氧化木糖生成过氧化氢和木糖酸的反应。进一步的本发明提供的GOX突变体在建筑、饲料、化工、木糖的分析检测等领域具有广阔的应用前景。

Claims (9)

1.一种木糖氧化能力提高的葡萄糖氧化酶突变体，其特征在于：所述突变体分别命名为T110V、T110I、T110V/F414L；其中：所述T110V是将氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示的野生型葡萄糖氧化酶GOX的第110位氨基酸T突变为V得到，其氨基酸序列如SEQ ID NO:2所示；所述T110I是将氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示的野生型葡萄糖氧化酶GOX的第110位氨基酸T突变为I得到，其氨基酸序列如SEQ ID NO:3所示；所述T110V/F414L是将氨基酸序列如SEQID NO:1所示的野生型葡萄糖氧化酶GOX的第110位氨基酸T突变为V且第414位氨基酸F突变为L得到，其氨基酸序列如SEQ ID NO:4所示。
2.编码权利要求1所述的木糖氧化能力提高的葡萄糖氧化酶突变体的基因，其特征在于：所述编码木糖氧化能力提高的葡萄糖氧化酶突变体T110V基因的核苷酸序列如SEQ IDNO:6所示；所述编码木糖氧化能力提高的葡萄糖氧化酶突变体T110I基因的核苷酸序列如SEQ ID NO:7所示；所述编码木糖氧化能力提高的葡萄糖氧化酶突变体T110V/F414L基因的核苷酸序列如SEQ ID NO:8所示。
3.包含权利要求2所述的木糖氧化能力提高的葡萄糖氧化酶突变体基因的重组载体，其特征在于：所述重组载体分别命名为pPIC9K-T110V、pPIC9K-T110I、pPIC9K-T110V/F414、pRS416-T110V、pRS416-T110I、pRS416-T110V/F414。
4.包含权利要求2所述的木糖氧化能力提高的葡萄糖氧化酶突变体基因的重组菌株，其特征在于：所述重组菌株是权利要求3所述的重组载体pPIC9K-T110V、pPIC9K-T110I或pPIC9K-T110V/F414转化毕赤酵母得到的重组菌株；或是权利要求3所述的重组载体pRS416-T110V、pRS416-T110I或pRS416-T110V/F414转化酿酒酵母得到的重组菌株。
5.根据权利要求4所述的木糖氧化能力提高的葡萄糖氧化酶突变体基因的重组菌株，其特征在于：所述重组菌株是将重组载体pPIC9K-GOX-T110I、pPIC9K-GOX-T110V、或pPIC9K-GOX-T110V/F414L转化巴斯德毕赤酵母GS115分别得到的重组菌株GS115-GOX-T110I、GS115-GOX-T110V、GS115-GOX-T110V/F414L。
6.权利要求1所述的木糖氧化能力提高的葡萄糖氧化酶突变体的制备方法，步骤是：
(1)构建权利要求3所述的木糖氧化能力提高的葡萄糖氧化酶突变体基因的重组载体；
(2)将构建的重组载体转化至宿主细胞，获得重组菌株；
(3)对所得到的重组菌株进行发酵培养，回收木糖氧化能力提高的葡萄糖氧化酶突变体产物即葡萄糖氧化酶。
7.根据权利要求6所述木糖氧化能力提高的葡萄糖氧化酶突变体的制备方法，其特征在于：所述宿主细胞为毕赤酵母或酿酒酵母。
8.根据权利要求6所述木糖氧化能力提高的葡萄糖氧化酶突变体的制备方法，其特征在于：所述重组载体是pPIC9K-GOX-T110V/F414L，所述宿主细胞为巴斯德毕赤酵母GS115，所述重组菌株是GS115-GOX-T110V/F414L。
9.权利要求1所述木糖氧化能力提高的葡萄糖氧化酶突变体在催化制备木糖酸中的应用。
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