KR100219732B1 - 효모 변이주를 이용한 글루코스 옥시다제의 대량생산방법 - Google Patents

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Abstract

본 발명은 효모에 유전자 재조합된 글루코스 옥시다제 유전자를 도입하여 형질변형시킨 효모로부터 글루코스 옥시다제를 생산하는 방법에 관한 것이다. 좀더 구체적으로 설명하면 아스퍼질러스 나이거 ATCC-9029호의 글루코스 옥시다제 유전자에 효모나 아스퍼질러스로부터 유래한 프로모터나 시그날시컨스를 재조합시켜 효모에서 글루코스 옥시다제가 발현될 수 있도록 발현 프라스미드를 제조하는 방법과 제조된 발현 프라스미드를 효모로 도입하여 발현시킴으로써 재조합된 효모균주 사카로마이세스 세레비제(Saccharomyces cerevisiae) GOGA(KFCC-호)를 이용 발효를 통해 글루코스 옥시다제를 대량으로 생산하는 방법에 관한 것이다.

Description

효모 변이주를 이용한 글루코스 옥시다제의 대량생산방법
본 발명은 효모에 유전자 재조합된 글루코스 옥시다제 유전자를 도입하여 형질변형시킨 효모로부터 글루코스 옥시다제를 생산하는 방법에 관한 것이다. 좀더 구체적으로 설명하면 아스퍼질러스 나이거 ATCC-9029호의 글루코스 옥시다제 유전자에 효모나 아스퍼질러스로부터 유래한 프로모터나 시그날시컨스를 재조합시켜 효모에서 글루코스 옥시다제가 발현될 수 있도록 발현 프라스미드를 제조하는 방법과 제조된 발현 프라스미드를 효모로 도입하여 발현시킴으로써 재조합된 효모균주 사카로마이세스 세레비제(Saccharomyces cerevisiae) GOGA를 이용 발효를 통해 글루코스 옥시다제를 대량으로 생산하는 방법에 관한 것이다.
글루코스 옥시다제(
Figure kpo00002
-D-Glucose-Oxygen-1-Oxidoreducatase, EC 1,1,3,4)는 독일의 뮬러가 1928년에 아스퍼질러스 나이거와 페니실리움 글라우큠의 세포 추출액으로부터 처음으로 발견하였으며[Biochem. Z. 199, 136-170], 이 효소는 베타디글루코스와 산소를 이용하여 디글루코노락튼과 과산화수소로 전환시키는데 관여하는 효소이며 이 반응을 통해서 나오는 부산물인 과산화수소는 카탈라아제에 의해 산소와 물로 전환된다.
아스퍼질러스 나이거의 글루코스 옥시다제의 분자량은 150
Figure kpo00003
180kDa이며 FAD와 결합되어 있는[Swobada, B.E.P. Biochim. Biophys. ACTA 175, 365-379(1968)] 당단백질[Pazur et al, Arch Biochim. Biophys. 111, 351-357(1965)]으로써 각각 70∼80kDa인 2개의 서브유니트로 구성되어 있고[Yoshimura et al, J. Biochem, 96, 839-846(1970)] 각 유니트는 한 분자의 FAD와 견고하게 결합되어 있으며, KD값은 1.3
Figure kpo00004
10-10이다[Tsuge et al, J. Biochem. 78. 835-843(1975)].
아스퍼질러스 나이거의 글루코스 옥시다제 유전자는 1815 뉴크레오타이드로 구성되어 있고 이것은 605개의 아미노산을 코팅하고 있으며 이 유전자안에는 인트론이 없다[Kriechbaum et al, FEBS Letters 225, 63-66(1989); Wirsed et al, Dechema Biotechnology Conference 4-VCH Verlagsgesellschaft(1990)]. 또한 글루코스 옥시다제는 22개의 아미노산으로 된 시그날시컨스가 분해된 후 활성단백질로 존재한다[Witteveen et al., Appl. Environ. Microbio. 58, 1190-1194(1992)].
글루코스 옥시다제가 존재하는 위치는 페니실리움의 경우 세포막밖에 존재하고[Kusai et al, Biochim. Biophys. Acta. 40, 555-557(1960)]이 있으나 아스퍼질러스 나이거의 경우는 세포막 밖과 안 동시에 존재한다고 알려져 있다. 라이스(Histochemie 7, 202-210(1966))와 반 다이즈칸(Europ. J. Appl. Microbiol. Biotechnol. 9, 275-283(1980))은 마이셀(mycell)의 펄옥시조멘에서 글루코스 옥시다제를 분리하였고 뮬러는 아스퍼질러스 나이거의 배양액으로부터 효소를 추출하였다.
순수한 글루코스 옥시다제나 글루코스 옥시다제/카탈라제 혼합물은 공업적으로 중요한 곳에 많이 쓰인다. 특히 글루코스에 높은 친화력을 가지고 있어 인체내 혈당의 농도 측정 진단 시약에 주로 사용된다. 또한 글루코스 옥시다제의 산화반응에 산소가 부반응물로 필요하기 때문에 산화반응으로 인한 식품의 맛이나 색깔 변화 방지등 많은 생활 식료품이나 청량음료수의 산화방지에 쓰이며 또한 일본이나 유럽에서는 레미콘차에 콘크리트 운반시 콘크리트 응고 지연제로 많이 쓰이는 글루콘산도 글루코스 옥시다제를 이용해서 생산된다.
효소나 프로테인등 많은 생물공학물질의 대량생산에 있어서 유전자 조작에 의한 DNA 재조합 방법을 이용하여, 즉 여러 가지 프로모터와 터미네이터, 구조유전자의 합성을 통하여 의약품이나 효소 등 목적산물의 생산성을 높이고 있다. 또한 세포막 내의 프로테인을 시그날시컨스를 이용하여 세포막외로 분비시킴으로써 정제과정을 줄일 수 있어 회수율의 향상과 생산비의 절감을 가져올 수 있다. 일반적으로 재조합 단백질의 생산은 대장균이나 곰팡이, 효모를 이용하고 있지만 대장균에서의 발효시 엔도톡신 물질 생성이 수반되고 당쇄현상이 전혀 일어나지 않고 분비가 되지 않는 단점이 있으며 곰팡이의 경우에는 당쇄현상과 분비가 효과적이나 성장기간이 긴 단점이 있다. 그러나 효모 내에서의 발현은 효과적이고 분비가 잘 되는 장점을 가지고 있으며 당쇄현상이 일어나고 성장기간이 짧아서 당단백질의 대량생산에 많이 이용되고 있다.
글루코스 옥시다제 생산은 아스퍼질러스속이나 페니실리움속을 이용하여 주로 추출을 하고 있으며 이의 생산성을 향상시키기 위해서 유전자조작 후 아스퍼질러스속에서 생산하기도 한다. 이 경우 아스퍼질러스 퍼티더스의 글루코스 옥시다제 유전자를 글루코아밀라제의 프로모터와 재조합시켜 아스퍼질러스 퍼티더스에 도입하였다(유럽특허 제0 665 291 A1호). 호스트 균주로 효모를 사용한 경우로는 아스퍼질러스 나이거의 글루코스 옥시다제 유전자를 ADH2/GAP 프로모터와 효모의 알파인자 시그날시컨스에 연결시킨 후 효모 발현 벡터에 도입하여 이용하였다(미국특허 제5,266,688호).
본 발명에서는 아스퍼질러스 나이거 유래의 글루코스 옥시다제 유전자를 효모내에서 대량 발현시키기 위해서 강한 프로모터로 알려진 프로모터들과 분비 조절에 관여하는 아스퍼질러스 유래의 시그날시컨스 혹은 효모 유래의 시그날시컨스를 연결하여 적절한 효모용 에피조말 프라스미드를 제조하였다. 제조된 플라스미드를 효모에 도입한 후 형질전환된 효모를 적절한 배지에서 배양한 결과 글루코스 옥시다제의 발현 및 분비가 아스퍼질러스보다 현저히 증가되었음을 확인할 수 있었다.
제1도는 본 발명의 프라스미드 pGAL-GO2의 유전자 조합을 나타낸 도면이다.
따라서 본 발명은 아스퍼질러스 나이거에서 분리된 글루코스 옥시다제 유전자에 사카로마이세스 세레비제의 GAL10 프로모터와 아스퍼질러스 오라이제의 알파아밀라제 시그날시컨스 및 터미네이터를 조립하여 발현벡터 pGAL-GO2를 제조하고 이를 숙주균주 사카로마이세스 세레비제에 도입하여 재조합된 균주 사카로마이세스 세레비제 GOGA와 이를 발효시켜 글루코스 옥시다제를 대량으로 생산하는 방법에 관한 것이다. 본 발명의 재조합 균주 사카로마이세스 세레비제 GOGA는 1997년 1월 10일 한국종균협회내의 한국미생물보존센터에 기탁번호 KFCC-10946호로 기탁하였다.
이때 숙주세포로는 사카로마이세스 세레비제 ATCC-2805호를 사용하는 것이 가장 바람직하였고, 형질전환된 균주는 선별배지인 YNBD 배지를 통해 형질전환된 효모균주를 선택하였다. 재조합된 균주는 발현배지를 통해 발현의 정도를 확인할 수 있었고, 이때 생성된 H2O2의 농도에 따라 O-디아니시딘을 첨가 발현배지에서 그 양을 정성분석할 수 있었고, 글루코스 옥시다제의 활성은 ABTS와 인산 나트륨 완충용액을 이용하여 측정하였다.
이하 본 발명을 상세히 설명하면 다음과 같다.
아스퍼질러스 나이거의 글루코스 옥시다제 유전자는 아스퍼질러스 나이거 ATCC-9029호 mRNA로부터 만든 cDNA 라이브러리로부터 분리하였다. 효모내에서 이 아스퍼질러스 나이거 유래의 글루코스 옥시다제 유전자의 효과적인 발현을 유도하기 위해서 효모내의 강한 프로모터인 알코올 디하이드로지나제(ADH1) 혹은 갈락토스 디하이드로지나제(GAL10) 프로모터를 분리된 글루코스 옥시다제 유전자와 결합시키고 발현된 글루코스 옥시다제의 분비를 향상시키기 위해서 글루코스 옥시다제의 시그날시컨스를 제거한 뒤 효모 유래의 알파인자 시그날시컨스 혹은 아스퍼질러스 오라이제 유래의 알파아밀라제 시그날시컨스를 결합시켰다. 터미네이터로는 갈락토스 디하이드로지나제(GAL7) 터미네이터를 사용하여 효과적인 발현을 유도하였다. 이렇게 제조된 하이브리드 유전자를 적절한 효모용 프라스미드를 이용 효모에 도입시켜 글루코스 옥시다제를 분비시키도록 유도하였다. 이때에 사용된 유전자 절단, 결합, PCR(폴리머라제 체인 반응) 형질전환 등의 유전자조작에 관련된 방법은 Molecular Cloning(Maniatis et al., Cold Spring Harbor, 1989)에 기술되어 있는 방법 또는 제조자의 설명에 따라 사용하였다. 본 발명에 의해 제조된 하이브리드 유전자와 그 유전자를 포함하고 있는 효모용 프라스미드 및 이로부터 형질전환된 숙주효모는 신규한 것이다.
[실시예 1]
[GAL10 프로모터와 MF 알파인자 시그날시컨스 또는 ADH1 프로모터와 MF 알파인자 시그날시컨스를 포함하는 프라스미드 pGAL-GO1 또는 pADH-GO1의 제작]
a) PCR에 의한 고유의 시그날시컨스가 제외된 글루코스 옥시다제 유전자의 조립
공지되어 있는 아스퍼질러스 나이거 ATCC-9029호 글루코스 유전자 염기서열을 이용하여 합성 프라이머 1,2를 제조하였다. 이때 프라이머 1은 글루코스 옥시다제 유전자 서열중 시그날시컨스를 제외한 5프라임 구역에 존재하는 42개의 염기서열로 구성되어 있고 프라이머 2는 글루코스 옥시다제의 3프라임 구역에 존재하는 39개의 염기서열로 구성되어 있다. 각 프라이머의 염기서열과 제한효소가 작용하는 부위는 다음과 같다.
Figure kpo00005
Figure kpo00006
이들 프라이머들과 Taq DNA 폴리머라제 및 템프레이트 DNA로 아스퍼질러스 나이거 DNA를 이용하여 썰머사이클러에서 공지의 방법인 PCR을 실시하였다. 25번의 사이클을 통해 얻은 생성물 1을 제한효소 지도로 확인한 결과 고유의 시그날시컨스가 배제된 글루코스 옥시다제 유전자임을 알 수 있었다.
b) GAL10과 MF 알파인자와의 결합 및 발현 프라스미드로의 삽입
효모용 발현 프라스미드 pYGMF는 효모 에피조말 프라스미드 YEP에서 유래한 프라스미드로 GAL10 프로모터, MF 알파인자 시그날시컨스, GAL7 터미네이터 유전자가 연결되어 있고 Amp'과 URA3 유전자가 표시인자로써 포함되어 있다. MF 알파인자 시그날시컨스와 GAL7 터미네이터 사이에는 클로닝장소로 제한효소인 XbaI과 SaLI 인식부위가 존재한다. 프라이머 1과 2에 의해서 만들어진 글루코스 옥시다제 유전자를 제한효소 XbaI과 XhoI으로 절단한 뒤 절단된 DNA 단편을 공지의 프라스미드인 블루스크립트 KS에 삽입시켜 숙주균주로 E. coil DH5 알파에 형질전환하여 증폭시켜 이용하였다. 같은 제한효소로 절단된 프라스미드 pYGMF는 1
Figure kpo00007
아가로스 젤을 이용하여 목적 유전자 절편을 분리하였다. 분리된 유전자 절편들은 T4 DNA 라이가제를 이용 공지의 방법에 의하여 결합시켰다. 이렇게 제조된 프라스미드는 pGAL-GO1이라 명명하였다.
c) ADH1과 MF 알파인자와의 결합 및 발현 프라스미드로의 삽입
효모용 발현 프라스미드인 pYAMF는 pYGMF와 마찬가지로 YEP에서 유래된 프라스미드로 GAL10 프로모터 대신에 ADH1 프로모터만 치환되어 있다. pYAMF로 글루코스 옥시다제의 PCR 생성물 1을 삽입시키는 방법은 b)에 설명된 방법과 같은 방법으로 제한효소 XbaI과 XhoI 인식부위를 이용하였다. 이렇게 제조된 프라스미드를 pADH-GO2이라 명명하였다.
[실시예 2]
[GAL10 프로모터와 알파아밀라제 시그날시컨스 또는 ADH1 프로모터와 알파아밀라제 시그날시컨스를 포함하는 하이브리드 프라스미드 pGAL-GO2 또는 pADH-GO2 제조]
a) PCR에 의한 알파아밀라제 시그날시컨스와 결합된 글루코스 옥시다제 유전자의 5프라임 부위 제작
실시예 1의 a)와 같은 방법에 의해 프라스미드 aP*p4.13(Nael)-Sal를 이용하여 알려진 DNA 염기서열로부터 프라이머 3과 프라이머 4를 제조하였다. 프라이머 3는 아스퍼질러스 오라이제의 알파아밀라제의 시그날시컨스 서열에서 나온 것으로 제한효소 인식부위로는 EcoRI과 NcoI을 포함하고 트랜스레이션 시작위치를 포함하고 있는 33개의 뉴클레오타이드로 형성되어 있다. 프라이머 4는 글루코스 옥시다제 유전자내에 존재하는 2개의 제한효소 SalI 위치중 5프라임에 근접한 SalI 위치를 포함하고 있는 24개의 뉴클레오타이드로 이들 프라이머들을 이용해서 만든 PCR 생성물 2는 알파아밀라제 시그날시컨스와 고유의 시그날시컨스가 제거된 글루코스 옥시다제의 5프라임 유전자 단편이 연결되어 있다. 각각의 프라이머의 염기서열은 다음과 같다.
Figure kpo00008
Figure kpo00009
b) 발현 프라스미드 pGAL-GO2 제조
프라이머 3과 프라이머 4에 의해 제조된 PCR 생성물 2를 제한효소 EcoRI과 SalI으로 절단하고 동시에 실시예 1의 b)에 설명된 프라스미드 pYGMF를 같은 방법으로 절단하였다. 절단 된 프라스미드와 PCR 생성물 2를 T4 DNA 라이가제로 결합시켰다. 이렇게 결합된 프라스미드에는 글루코스 옥시다제 유전자중 5프라임 부분에서 SalI 사이의 부분만 포함되어 있다. 나머지 글루코스 옥시다제 유전자를 결합시키기 위해서 실시예 1에서 제조된 PCR 생성물 1을 제한효소 SalI으로 절단하고 절단된 SalI DNA 단편을 위해 언급된 프라스미드의 SalI 위치에 삽입하여 결합시킨다. 이렇게 제조된 발현 프라스미드를 pGAL-GO2이라 명명하고 GAL10 프로모터, 알파아밀라제 시그날시컨스와 고유의 시그날시컨스가 배제된 모든 글루코스 옥시다제 유전자가 연결되어 있다.
c) 발현 프라스미드 pADH-GO2 제조
실시예 1의 c)에서 사용한 프라스미드 pYAMF를 이용하여 실시예 2의 b)에서 사용한 방법으로 EcoRI과 SalI의 제한효소 위치에서 pYAMF, PCR 생성물 2와 PCR 생성물 1을 결합시켰다. 이렇게 제조된 발현 프라스미드는 pADH-GO2이라 명명하였고 ADH1 프로모터, 알파아밀라제 시그날시컨스와 고유의 시그날시컨스가 배제된 글루코스 옥시다제 유전자가 연결되어 있다.
[실시예 3]
[효모로의 형질전환]
제조된 네가지 발현 프라스미드인 pGAL-GO1, pGAL-GO2, pADH-GO1과 pADH-GO2는 변형된 1to의 방법에 따라 사카로마이세스 세레비제 ATCC-2805호에 형질전환시켰다. 형질전환을 시키기 위해서는 사카로마이세스 세레비제 ATCC-2805호를 0.1M 리튬클로라이드 용액으로 처리하여 콤피턴트 효모로 만들었다. 프라스미드와 콤피턴트 효모를 잘 섞은 후 리튬클로라이드가 함유된 40
Figure kpo00010
PEG 4000를 첨가하여 섭씨 42도에서 10분간 배양하였다. 처리를 거친 후 선별배지인 YNBD 배지(0.67
Figure kpo00011
Yeast nitrogen base without amino acid, 0.5
Figure kpo00012
Casamino acid, 2
Figure kpo00013
Glucose, 1.5
Figure kpo00014
Agar)를 통해 형질전환된 효모를 선택하였다.
[실시예 4]
[형질전환된 효모에서의 글루코스 옥시다제의 발현]
a) 정성분석
형질전환된 효모들중 글루코스 옥시다제의 발현이 높은 개체를 선택하기 위하여 O-디이니시딘이 첨가된 배지에 배양시켜 발현 및 분비되어 나오는 글루코스 옥시다제에 의해 생기는 갈색의 둥근 환의 크기를 비교하였고 이때 GAL10 프로모터를 유발하기 위해서 배양배지에 갈락토스를 첨가하였다.
b) 정량분석
정성분석에서 선별된 글루코스 옥시다제 발현이 우수한 각각의 형질전환된 효모들은 플라스크 배양을 통해서 배지내 분지된 글루코스 옥시다제 활성을 분석하여 발현능력과 분비능력을 서로 비교하였다. 각각의 발현 프라스미드가 도입된 효모를 적절한 배지에서 현탁배양 후 시간별로 시료를 채취하였다. 원심분리 후 상등액을 분리하여 상등액속에 글루코스 옥시다제의 활성을 분석하기 위해서 ABTS와 소디움 포스페이트 완충용액을 이용하였다. 분비정도를 확인하기 위해서 효모내부에 있는 효소의 활성과 외부로 분비된 즉 배지에 있는 효소의 활성을 비교하였다. 효모내부에 존재하는 효소의 활성을 분석하기 위해서 배양 후 원심분리하여 세포를 얻은 후 소디움 포스페이트 용액으로 세척하였다. 동일한 용액으로 현탁시킨 후 동량의 그래스비드(glass bead)를 넣어 세포를 분쇄한다. 분쇄된 세포현탁액을 원심분리하여 상등액을 수집 글루코스 옥시다제 활성을 같은 방법으로 분석하였다. 각 발현 프라스미드가 삽입된 재조합 효모들의 글루코스 옥시다제 활성은 다음과 같다.
Figure kpo00015
각 하이브리드 프라스미드를 함유하고 있는 형질전환된 효모가 생산하는 글루코스 옥시다제 활성을 분석한 결과 총 글루코스 옥시다제 생산은 GAL10 프로모터와 아스퍼질러스 오라이제의 알파아밀라제 시그날시컨스가 연결된 pGAL-GO2에서 가장 우수하였다. pGAL-GO2가 도입된 재조합 효모균주 사카로마이세스 세레비제 GOGA가 분비하는 글루코스 옥시다제 활성은 8.7Unit/mL이며, 이는 아스퍼질러스 나이거 와일드 균주가 보여주는 0.03Unit/mL보다 현저히 증가되었다.
본 발명의 형질전환 재조합 균주 사카로마이세스 세레비제 GOGA를 이용하여 종래의 아스퍼질러스속이나 페니실리움속의 균주를 발효 추출시켜 글루코스 옥시다제 생산방법보다 훨씬 높은 생산성으로 글루코스 옥시다제를 생산할 수 있었다.

Claims (1)

  1. 아스퍼질러스 나이거에서 분리된 글루코스 옥시다제 유전자에 사카로마이세스 세레비제의 GAL10 프로모터와 아스퍼질러스 오라이제의 알파아밀라제 시그날시컨스 및 터미네이터를 조립하여 제조된 발현벡터 pGAL-GO2를 숙주균주 사카로마이세스 세레비제에 도입하여 재조합된 글루코스 옥시다제를 대량으로 생산하는 균주 사카로마이세스 세레비제 GOGA.(KFCC-10946호)
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