CN112695054B - 一种高表达几丁质酶内生真菌枫香拟茎点霉的构建方法和应用 - Google Patents
一种高表达几丁质酶内生真菌枫香拟茎点霉的构建方法和应用 Download PDFInfo
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Abstract
本发明公开了一种高表达几丁质酶内生真菌枫香拟茎点霉的构建方法和应用，该方法从内生真菌枫香拟茎点霉基因组中克隆到内源性几丁质酶基因，将其整合到内生真菌枫香拟茎点霉基因组的高表达位点或由质粒带入表达。体外平板对峙法该工程菌具有较好的几丁质酶活性和抑制镰刀菌的作用；体内研究表明该菌具有提高植物产生几丁质酶活性及抗镰刀菌的作用。该几丁质酶内生真菌枫香拟茎点霉工程菌可应用于小麦赤霉病的预防或防治。本发明的优势在于内生真菌枫香拟茎点霉在植物中的定殖不进入种子具有良好的生物安全性，避免了植物转基因等带来的争议问题，为开发新型的农业生防菌剂提供支撑。
Description
技术领域
本发明属于农业生物技术领域，具体涉及一种高表达几丁质酶内生真菌枫香拟茎点霉的构建方法和应用。
背景技术
小麦是人类重要的粮食作物，而赤霉病是其最为严重的病害之一。我国常发区在长江中下游、江淮、黄淮南部麦区，黄淮北部麦区偏重，发生面积和防治面积在1亿亩和2亿亩次以上(Dweba CC et al.,Crop protection,2017,91:114e122)。一般而言，品种抗病性、菌源量和抽穗扬花期的天气条件是导致小麦赤霉病发生的主要原因，赤霉病发生惨重的区域出现大量白穗或黄穗，从而导致减产或绝产，小麦赤霉病病粒上面布满了红色的霉层。这些霉层含有多种毒素，如呕吐毒素、类雌性信息素等，损害人和牲畜健康，这些霉层借着风雨会继续传播。当前用于防治小麦赤霉病的产品主要是化学药剂(Figueroa M etal.,Mol Plant Pathol.,2018,19(6):1523-1536；张洁et la.,中国植保导刊,2014,34(1):24-28,53)，国际上各大跨国公司均有防治该病药剂的开发，如拜耳的戊唑醇、丙硫菌唑以及丙硫菌唑与氟吡菌酰胺复合制剂，巴斯夫的多菌灵、甲基硫菌灵、三唑酮、戊唑醇、咪鲜胺、井冈霉素等。市面上较为通用的药剂有戊唑醇与咪鲜胺的混剂以及氰烯菌酯的相关混剂产品。我国防治小麦赤霉病最常用的多菌灵对小麦赤霉病的控制起到了非常重要的作用。自上世纪70年代始，长时间单一或重复使用多菌灵等制剂，已导致赤霉病菌产生了抗药性；且多菌灵能够刺激病菌产生呕吐毒素，使得抗药性菌株产毒能力更强(Liu N,et al.,Fungal Genet Biol.2013,58-59:42-52；Zhang L,et al.,Mol Plant Pathol.2016,17(1):16-28)。
目前的发展趋向于生物防治，生物防治主要是通过产微生物抗生素的方式抑制镰刀菌，从而起到抗病的作用，主要是环脂肽类抗生素(Gu Q,et al.,Applied andenvironmental microbiology.2017,83(19)；Gong AD,et al.,PloS one.2015,10(2):e0116871)，环脂肽可以引起菌丝变形，诱导细胞壁损伤，对镰刀菌生长造成抑制。而存在于土壤的生防微生物可以产生挥发性抑菌物质，方便地作用于全株植物，帮助植物抵抗镰刀菌的入侵(Lee T,et al.,Plant pathology J.2017；33(5):499-507)。当前的研究热点是植物内生菌通过促进植物生长、与病原菌进行营养竞争等方式抑制病原菌的扩张,比传统生防菌株具有更稳定的防治效果(Sun X,et al.,Plant,cell environment.2020；43(2):358-73；Walitang DI,et al.,BMC microbiology.2017；17(1):209)。生防微生物也可以通过产胞壁酶的方式降解镰刀菌的细胞壁，其中几丁质酶是植物和生防微生物抵抗病原真菌的主要胞壁酶，在植物中表达几丁质酶能提高植物的抗病原菌能力(Zhang F,et al.ApplBiochem Biotechnol.2016,180(8):1542-1558；Dong X,et al.,Int J Mol Sci.2017,18(11):2361)。
本发明的前期研究表明，内生真菌能够与水稻和花生等作物建立稳定的共生关系，在低氮条件下提高了水稻的氮素利用率(Yang B,et al.,Plant physiology andbiochemistry.2014；82:172-82.)，增加了根瘤菌在花生根部的定殖并显着提高了花生类黄酮合成相关酶的活性(Zhang W,et al.,Plant Physiol Biochem.2016,98:1-11)，可诱导植物抗病，减少花生叶斑病和根腐病的发病率(Zhang FM,et al.,Biocontrol.2020；65(4):475-88)。
发明内容
针对现有技术的不足，本发明提供一种高表达几丁质酶内生真菌枫香拟茎点霉的构建方法和应用，其优势在于几丁质酶来源于内生真菌本身，避免了基因异源表达宿主不相容性的问题，该内生真菌在植物中的定殖不进入种子具有良好的生物安全性，避免了植物转基因带来的争议问题，为农业可持续发展和抗病机理奠定理论基础，对小麦赤霉病的防治具有重要的指导意义。
本发明是通过以下技术方案实现的：
一种高表达几丁质酶内生真菌枫香拟茎点霉的构建方法，包括以下步骤：
(1-1)过表达质粒的构建：将几丁质酶基因连接到pCT74载体ToxA启动子下，转染入枫香拟茎点霉中，在含有潮霉素抗性的PDA中培养获得过表达质粒；所述几丁质酶基因序列如SEQ ID No.1所示；
(2)吸取枫香拟茎点霉野生型菌株菌液2mL接种于50mL PDA液体培养基上，28℃、180r·min-1条件下培养36h；
(3)用尼龙膜过滤获得菌丝，然后用0.6M的MgSO4溶液充分洗涤菌丝，取1g湿菌丝体加入10mL酶解液中，28℃、80r·min-1酶解13h；
(4)将酶解液转移至15mL离心管中，4℃、1250g离心10min，弃上清液，加入5mL STC溶液重悬，转入2mL离心管中2500g离心10min；用移液器吸取顶部的原生质体悬浊液，转入1.5mL离心管中，用STC溶液稀释，调整原生质体数的终浓度为107～108个·mL-1，得到原生质体；
(5)在1.5mL离心管中混合20μL PTC、50μg步骤(1-1)制得的过表达质粒、80μL原生质体，冰浴30min；向混合液中加入900μL PTC，混匀，移入15mL离心管，室温热激20min；
(6)在热激完成的离心管中加入再生培养基10mL，加入潮霉素至终浓度50μg·mL-1，混匀，倾倒至无菌平板，28℃培养72h，即得。
一种高表达几丁质酶内生真菌枫香拟茎点霉的构建方法，包括以下步骤：
(1-2)整合表达质粒的构建：将几丁质酶基因采用CRISPR-Cas9的方法置于选定高表达基因启动子之后构建整合表达质粒；所述几丁质酶基因序列如SEQ ID No.1所示；
(2)吸取枫香拟茎点霉△Ku70菌株菌液接种于50mL PDA液体培养基上，28℃、180r·min-1条件下培养36h；
(3)用尼龙膜过滤获得菌丝，然后用0.6M的MgSO4溶液充分洗涤菌丝，取1g湿菌丝体加入10mL酶解液中，28℃、80r·min-1酶解13h；
(4)将酶解液转移至15mL离心管中，4℃、1250g离心10min，弃上清液，加入5mL STC溶液重悬，转入2mL离心管中2500g离心10min；用移液器吸取顶部的原生质体悬浊液，转入1.5mL离心管中，用STC溶液稀释，调整原生质体数的终浓度为107～108个·mL-1，得到原生质体；
(5)在1.5mL离心管中混合20μL PTC、50μg步骤(1-2)制得的整合表达质粒、80μL原生质体，冰浴30min；向混合液中加入900μL PTC，混匀，移入15mL离心管，室温热激20min；
(6)在热激完成的离心管中加入再生培养基10mL，加入苯菌灵至终浓度0.5μg·mL-1，混匀，倾倒至无菌平板，28℃培养72h，即得。
优选地，步骤(1-1)所述过表达质粒的构建方法如下：
(a)采用限制性内切酶NcoI消化质粒pCT74，获得表达载体的骨架结构，载体上由于NcoI限制性内切酶切割导致丢失的HygR-ToxA片段以pCT74为模板进行克隆回补，引物为：F-HT及R-HT；几丁质酶基因片段通过PCR扩增从枫香拟茎点霉基因组获取，引物为F-Chi及R-Chi；
所述F-HT具有如SEQ ID No.2所示的序列；
所述R-HT具有如SEQ ID No.3所示的序列；
所述F-Chi具有如SEQ ID No.4所示的序列；
所述R-Chi具有如SEQ ID No.5所示的序列；
(b)将酶切骨架和PCR产物分别进行切胶回收后，将骨架：几丁质酶基因片段：HygR-ToxA片段按5:1:1的摩尔比混合，加入NovoRec重组酶，50℃反应15min；连接产物加入100μL DH5α感受态细胞中，冰浴30min；42℃水浴热激45s，冰浴3min；加入500μL LB液体培养基，37℃孵育60min；5000rpm离心3min，收集菌体涂板培养12h，获得转化子即得。
优选地，步骤(1-2)所述整合表达质粒的构建方法如下：
(A)采用限制性内切酶SalI消化质粒pCT74-Cas9-sgRNA，获得整合载体的骨架结构；左右两条同源臂从基因组上获取，引物分别为：F-LA:R-LA，F-RA:R-RA；苯菌灵抗性片段从质粒pBen-RFP上获取，引物为：F-Ben，R-Ben；几丁质酶基因片段通过PCR扩增从枫香拟茎点霉基因组获取，引物为F-ChiB及R-ChiB；
所述F-LA具有如SEQ ID No.8所示的序列；
所述R-LA具有如SEQ ID No.9所示的序列；
所述F-RA具有如SEQ ID No.10所示的序列；
所述R-RA具有如SEQ ID No.11所示的序列；
所述F-Ben具有如SEQ ID No.12所示的序列；
所述R-Ben具有如SEQ ID No.13所示的序列；
所述F-ChiB具有如SEQ ID No.14所示的序列；
所述R-ChiB具有如SEQ ID No.15所示的序列；
(B)将酶切骨架和PCR产物分别进行切胶回收后，将骨架：左同源臂：几丁质酶基因片段：右同源臂：苯菌灵抗性片段按5:1:1:1:1的摩尔比混合，加入NovoRec重组酶，50℃反应15min；连接产物加入100μL DH5α感受态细胞中，冰浴30min；42℃水浴热激45s，冰浴3min；加入500μL LB液体培养基，37℃孵育60min；5000rpm离心3min，收集菌体涂板培养12h，获得转化子即得。
上述的高表达几丁质酶内生真菌枫香拟茎点霉的构建方法构建的工程菌在拮抗镰刀菌上的应用。
优选地，在MSM培养基上培养几丁质酶工程菌，在PDA培养基上镰刀菌；平板对峙实验时，过表达菌株两株和整合表达菌株一株，及枫香拟茎点霉野生型菌株一株能够拮抗平板中镰刀菌的生长。
优选地，所述MSM培养基成分为：2.0g NaNO3，1.31g K2HPO4·3H2O，0.5g KCl，1.0gMgSO4·7H2O，0.018g FeSO4·7H2O，1.12mg MnSO4，0.078mg CuSO4·5H2O，15g蔗糖，20mL几丁质胶体，25g琼脂；所述镰刀菌为尖孢镰刀菌、层出镰刀菌或禾谷镰刀菌。
上述的高表达几丁质酶内生真菌枫香拟茎点霉的构建方法构建的工程菌在抗小麦赤霉病中的应用。
优选地，小麦种子使用1％过氧化氢消毒后置于无菌蛭石中，滴加以蒸馏水洗涤后的几丁质酶过表达菌株，18℃光照培养10天后，取其根部，表面处理及消毒后，可检测到内生真菌在小麦根部的定殖。
优选地，小麦培养至4天时，每株滴加浓度1×105禾谷镰刀菌孢子悬液0.5mL，继续培养至10天时，每株滴加以蒸馏水洗涤后的几丁质酶过表达菌株1％0.5mL；继续培养10天后，可检测到几丁质酶菌株对小麦赤霉病病原菌的抗性作用。
本发明的有益效果如下：
(1)本发明旨在提供一种高产几丁质酶内生真菌拮抗小麦赤霉病病原菌的技术，所使用的内生真菌为枫香拟茎点霉，具有促生和抗病功能的内生真菌。
(2)本发明所构建的两株工程菌，一株为几丁质酶基因过表达菌株OE:Chi，另一株为几丁质酶基因整合表达菌株IN-Chi。通过平板对峙实验鉴定工程菌株对镰刀菌的抑制作用，能够在小麦中稳定定殖，通过盆栽实验鉴定工程菌株对发病率有降低作用。
(3)本发明选择的几丁质酶来源于工程菌自身，没有异源基因表达导致宿主不相容的问题，内生真菌可定殖与小麦根部，不进入植物种子，避免了植物转基因带来的争议问题，可降低小麦赤霉病发病率，为农业可持续发展和抗病机理奠定理论基础，对小麦赤霉病的防治具有重要的指导意义。
附图说明
图1为实施例1的过表达质粒图谱；
图2为实施例2的整合质粒图谱及整合原理；
图3为实施例3的过表达菌株的PCR鉴定图谱；
图4为实施例3的整合表达菌株的PCR鉴定图谱；
图5为几丁质酶内生真菌枫香拟茎点霉工程菌对三种镰刀菌的抑制效果图；
图5中：(a)为尖孢镰刀菌；(b)为层出镰刀菌；(c)为禾谷镰刀菌；
图6为几丁质酶内生真菌枫香拟茎点霉工程菌在小麦根部的定殖分析电泳图谱；
图7为实施例6中几丁质酶内生真菌枫香拟茎点霉工程菌接种小麦减轻禾谷镰刀菌对小麦抑制的数据图；
图7中：(a)为小麦株高的数据图；(b)为小麦根长的数据图；(c)为小麦鲜重的数据图。
具体实施方式
下面结合附图与具体实施例对本发明做进一步详细说明。需要说明的是，以下实施例仅为进一步说明本发明的内容，但不应理解为对本发明的限制。在不背离本发明精神和实质的情况下，对本发明方法、步骤或条件所作的修改和替换，均属于本发明的范围。若未特别指明，实施例中所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段。
一种高表达几丁质酶内生真菌枫香拟茎点霉的构建方法，具体步骤如下：
(1-1)过表达质粒的构建：将几丁质酶基因连接到pCT74载体ToxA启动子下，转染入枫香拟茎点霉中，在含有潮霉素抗性的PDA中培养获得过表达质粒；所述几丁质酶基因序列如SEQ ID No.1所示。
(1-2)整合表达质粒的构建：将几丁质酶基因采用CRISPR-Cas9的方法置于选定高表达基因启动子之后构建整合表达质粒；所述几丁质酶基因序列如SEQ ID No.1所示。
(2)吸取枫香拟茎点霉野生型菌株(过表达质粒)或枫香拟茎点霉△Ku70菌株(整合表达质粒)的菌液接种于50mL PDA液体培养基上，28℃、180r·min-1条件下培养36h。
(3)用尼龙膜过滤获得菌丝，然后用0.6M的MgSO4溶液充分洗涤菌丝，取1g湿菌丝体加入10mL酶解液中，28℃、80r·min-1酶解13h。
(4)将酶解液转移至15mL离心管中，4℃、1250g离心10min，弃上清液，加入5mL STC溶液重悬，转入2mL离心管中2500g离心10min；用移液器吸取顶部的原生质体悬浊液，转入1.5mL离心管中，用STC溶液稀释，调整原生质体数的终浓度为107～108个·mL-1，得到原生质体。
(5)在1.5mL离心管中混合20μL PTC、50μg过表达质粒或整合表达质粒、80μL原生质体，冰浴30min；向混合液中加入900μL PTC，混匀，移入15mL离心管，室温热激20min。
(6)在热激完成的离心管中加入再生培养基10mL，加入潮霉素至终浓度50μg·mL-1(过表达质粒)，或加入苯菌灵至终浓度0.5μg·mL-1(整合表达质粒)，混匀，倾倒至无菌平板，28℃培养72h，即得。
实施例1过表达质粒pCT74-chi的构建
所用培养基为：LB培养基(1L)：10g蛋白胨，5g酵母提取物，10g氯化钠，固体培养基需加20g琼脂。使用时加入氨苄青霉素至50μg·mL-1。
采用限制性内切酶NcoI消化质粒pCT74，获得表达载体的骨架结构，载体上由于NcoI限制性内切酶切割导致丢失的HygR-ToxA片段以pCT74为模板进行克隆回补，引物为：F-HT(SEQ ID No.2)及R-HT(SEQ ID No.3)。几丁质酶基因片段通过PCR扩增从枫香拟茎点霉基因组获取，引物为F-Chi(SEQ ID No.4)及R-Chi(SEQ ID No.5)。
酶切法获得骨架片段的反应体系如表1所示，几丁质酶基因片段及HygR-ToxA片段的PCR扩增体系分别如表2、表3所示。
表1实施例1获得骨架片段酶切反应体系
表2实施例1几丁质酶基因扩增PCR反应体系
表3 HygR-ToxA片段扩增PCR反应体系
将酶切骨架和PCR产物分别进行切胶回收后，将骨架：几丁质酶基因片段：HygR-ToxA片段按5:1:1的摩尔比混合，加入NovoRec重组酶，50℃反应15min。连接产物加入100μLDH5α感受态细胞中，冰浴30min。42℃水浴热激45s，冰浴3min。加入500μL LB液体培养基，37℃孵育60min。5000rpm离心3min收集菌体。将一定量的菌体均匀涂布在含氨苄青霉素平板上，挑取转化子，使用引物F-Tox(SEQ ID No.6):R-Nos(SEQ ID No.7)进行菌液PCR验证，获得表达质粒pCT74-chi。质粒图谱如图1所示。
实施例2整合表达质粒pChi-in的构建
所用培养基为：LB培养基(1L)：10g蛋白胨，5g酵母提取物，10g氯化钠，固体培养基需加20g琼脂。使用时加入氨苄青霉素至50μg·mL-1。
采用限制性内切酶SalI消化质粒pCT74-Cas9-sgRNA，获得整合载体的骨架结构。左右两条同源臂从基因组上获取，引物分别为：F-LA(SEQ ID No.8):R-LA(SEQ ID No.9)，F-RA(SEQ ID No.10):R-RA(SEQ ID No.11)。苯菌灵抗性片段从质粒pBen-RFP上获取，引物为：F-Ben(SEQ ID No.12)，R-Ben(SEQ ID No.13)。几丁质酶基因片段通过PCR扩增从枫香拟茎点霉基因组获取，引物为F-ChiB(SEQ ID No.14)及R-ChiB(SEQ ID No.15)。
酶切法获得骨架片段的反应体系如表4所示，几丁质酶基因片段、同源臂片段及苯菌灵抗性片段的PCR扩增体系分别如表5、表6、表7所示。
表4实施例2获得骨架片段酶切反应体系
表5实施例2几丁质酶基因扩增PCR反应体系
表6同源臂片段扩增PCR反应体系
表7苯菌灵抗性片段扩增PCR反应体系
将酶切骨架和PCR产物分别进行切胶回收后，将骨架：左同源臂：几丁质酶基因片段：右同源臂：苯菌灵抗性片段按5:1:1:1:1的摩尔比混合，加入NovoRec重组酶，50℃反应15min。连接产物加入100μL DH5α感受态细胞中，冰浴30min。42℃水浴热激45s，冰浴3min。加入500μL LB液体培养基，37℃孵育60min。5000rpm离心3min收集菌体。将一定量的菌体均匀涂布在含氨苄青霉素平板上，挑取转化子，使用引物F-LA(SEQ ID No.8):R-Ben(SEQ IDNo.13)进行菌液PCR验证，获得表达质粒pChi-in。质粒图谱及整合原理如图2所示。
实施例3几丁质酶内生真菌枫香拟茎点霉工程菌的构建
所用培养基为：再生培养基：普通PDA培养基中加入山梨醇至181g·L-1，加入精细琼脂至10g·L-1。
所用试剂为：STC溶液：1.2mol·L-1山梨醇、10mmol·L-1Tris-HCl(pH 7.5)、50mmol·L-1CaCl2。PTC溶液：40％PEG4000、10mmol·L-1Tris-HCl(PH 7.5)、50mmol·L- 1CaCl2。
原生质体的制备，具体步骤如下：
(1)使用5mL注射器吸取枫香拟茎点霉野生型菌株(用于过表达菌株构建)或枫香拟茎点霉△Ku70菌株(用于整合表达菌株构建)的菌液2mL接种于50mL PDA液体培养基，28℃、180r·min-1摇瓶培养36h。
(2)用灭菌的尼龙膜过滤获得菌丝，然后用预冷的0.6M MgSO4溶液充分洗涤菌丝两遍。
(3)取1g湿菌丝体加入10mL酶解液，于50mL灭菌三角瓶中28℃、80r·min-1酶解13h。
(4)将酶解液转移至灭菌的15mL离心管，4℃、1250g离心10min。
(5)弃上清液，加入5mL STC溶液重悬，转入灭菌的2mL离心管2500g离心10min。
(6)此时原生质体会漂浮在离心管中液体表面，用移液器收集后转入灭菌的1.5mL离心管中，在光学显微镜下计数，用STC溶液稀释，调整原生质体数的终浓度为107～108个·mL-1。置于冰浴备用。
热激转化，具体步骤如下：
(1)在灭菌的1.5mL离心管中混合20μL PTC、50μg实施例1或实施例2构建的质粒、80μL原生质体，冰浴30min。
(2)向混合液中加入900μL PTC，混匀，移入灭菌的15mL离心管，室温热激20min。
(3)在热激完成的离心管中加入再生培养基10mL，加入潮霉素至终浓度50μg·mL-1(用于过表达菌株构建)，或加入苯菌灵至终浓度0.5μg·mL-1(用于整合表达菌株构建)，混匀，倾倒至无菌平板。28℃培养72h。
挑取转化子，接种于含50μg·mL-1潮霉素(用于过表达菌株构建)或0.5μg·mL-1苯菌灵(用于整合表达菌株构建)的PDA固体培养基上，28℃培养48h，用无菌牙签切下菌块，提取真菌基因组，使用pCT74特异性引物F-Tox(SEQ ID No.6):R-Nos(SEQ ID No.7)，或基因组test引物F-gtest(SEQ ID No.16):R-gtest(SEQ ID No.17)进行PCR验证，获得几丁质酶内生真菌枫香拟茎点霉工程菌。验证结果如图3、图4所示。
实施例4几丁质酶内生真菌抑制镰刀菌能力的鉴定
所用培养基为：PDA培养基(1L)：200g马铃薯的浸出液，20g葡萄糖，20g琼脂。诱导性MSM培养基(1L)：2.0g NaNO3，1.31g K2HPO4·3H2O，0.5g KCl，1.0g MgSO4·7H2O，0.018gFeSO4·7H2O，1.12mg MnSO4，0.078mg CuSO4·5H2O，15g蔗糖，20mL几丁质胶体，25g琼脂。
在诱导性MSM固体培养基上活化几丁质酶工程菌和枫香拟茎点霉野生型菌株。在普通PDA平板中央接种镰刀菌菌块，直径5mm，28℃培养48h。在镰刀菌周围逆时针分别接种两株过表达菌株，一株整合表达菌株，一株野生型菌株，直径5mm，28℃培养48h，查看抑菌效果。如图5所示，结果表明几丁质酶工程菌对三种镰刀菌(尖孢镰刀菌、层出镰刀菌、禾谷镰刀菌)有强烈抑制作用。
实施例5几丁质酶内生真菌定殖小麦的鉴定
所用培养基为：PDB培养基(1L)：200g马铃薯的浸出液，20g葡萄糖。
锥形瓶中添加50mL PDB培养基，接种2mL工程菌或野生型菌株种子液，28℃摇床中180r培养2天，过滤出菌丝，以蒸馏水将培养基冲洗干净，使用100mL蒸馏水对1g菌丝进行重悬获得接种小麦所需的菌悬液。
小麦种子使用1％双氧水浸泡24h消毒，消毒后的种子腹沟向下置于无菌蛭石中，接种菌悬液，每株0.5mL。在18℃、16h光照下培养10天。
小麦培养10天后从蛭石中取出，以清水将根部洗净，使用植物DNA提取试剂盒提供的方法提取根部总DNA，使用ITS引物以总DNA为模板进行PCR鉴定，引物为ITS-F(SEQ IDNo.18)，ITS-R(SEQ ID No.19)。如图6所示，电泳结果显示野生型菌株和工程菌株均能在小麦根部定殖。
表8载体构建过程中所用引物序列表
实施例6几丁质酶内生真菌增强小麦对赤霉病的抗性
所用培养基：绿豆汤培养基(1L)：40g绿豆的浸出液。
锥形瓶中添加50mL绿豆汤培养基，接种禾谷镰刀菌菌丝，28℃摇床中180r培养7天，30目尼龙膜过滤，滤液中包含孢子，以蒸馏水洗净，用蒸馏水重悬至孢子浓度1×105获得接种小麦所需的孢子悬液。
小麦按照实施例5的方法进行种植，培养至4天时每株接种禾谷镰刀菌孢子悬液0.5mL。按照实施例5的方法制作工程菌和野生型菌株的菌悬液，小麦培养至10天时接种菌悬液。继续培养10天，测定小麦的株高、根长和鲜重。如图7所示，图7中：PC为不接种工程菌和禾谷镰刀菌的对照；NC为仅接种禾谷镰刀菌的对照；OE为接种过表达工程菌和禾谷镰刀菌的实验组；IN为接种整合表达工程菌和禾谷镰刀菌的实验组。接种工程菌的小麦株高、根长和鲜重都显著高于仅接种镰刀菌的对照，其中株高和鲜重能够恢复到阳性对照水平。结果说明几丁质酶工程菌特别是过表达菌株具有显著的减轻禾谷镰刀菌抑制力的效果。
序列表
<110> 南京师范大学
<120> 一种高表达几丁质酶内生真菌枫香拟茎点霉的构建方法和应用
<160> 19
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 1382
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
atgccagata gaggccgcct gttatccata atatccgtct tcctcctctt tataagtctc 60
gtcctcttca tccaggccca gcagatacct cttcttcaac acaacattca ggaatttgac 120
aactcttact cccaaggcct caacacgcaa cacctacaat ccccaaacga caccatgggc 180
ggaggaccag taacaaaagg ctaccgaagc gtggcatact tcgtcaactg ggccatttac 240
ggacgcaaac acttcccgtg ggagctgcca gtcgagaatc tcacacacgt cctctacgca 300
tttgccaatg ttcggcccga ttcgggtgaa gtctacctga ctgacagctg ggccgattcg 360
gaaatccact gggatggtga caagtgggag gacggccaca agctctacgg ctgcctcaag 420
caactcaacc ttctcaagcg ccgcaaccgc aacttgaagg ttctactctc catcggcggt 480
tggacctact cttccaattt ccgacagcca gcatcaacac cccagggccg agcaaacttt 540
gccaggtcgg ccgttaagat tttgaagaac tacggcttcg acgggctcga catagattgg 600
gagtacccgc agaactcatc agaggccgcc gactgggtgg ccctgctgaa ggcctgccga 660
gaggagatgg acgcctacgc ccggacactc cccccagagc caggctacgg cggcccccac 720
cacttcgagc tgaccgtcgc ctgccccgcg ggtccccaga actacgagaa gctggacctg 780
cgcggcatgg accgctacct ggacttctgg aacctcatgg cgtacgacta cgccgggtcc 840
tgggaccagg tcgcgggcca ccaggcgaac ctgtacccga accgggccca ccccaacacg 900
acgcccttca gcaccgccaa ggccctggag cactacacgc ggcacgtgca cccgtccaag 960
atcgtggtgg gcatgccgct gtacgggcgc gccttcgaga acacggacgg cgtggggcgg 1020
ccgtacaatg gcatcggcga gggcagctgg gagcgggggg tctacgacta caaggcgctc 1080
cccctcgccg gcgcgcgcga gttctacgac cacgacagcg gcgccagcta cagctacgac 1140
ccggcccgga ggatgatggt cagctacgac acgctgccca tggcgaggga caaggccggg 1200
tacatcaaga accacggcct cggcggcggc atgtggtggg agagctcgtc ggaccgcaag 1260
ggcagggaga gcctgatcga gaacgtggtc gacgtgtttg gtgggcccgg cgccctgcgg 1320
agggatatca atcagctgga gtgccccgag agcgagtggg agaacctgag aaacgggttt 1380
ag 1382
<210> 2
<211> 40
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
tcggccgcag cgatcgcatc catggcctcc gcgaccggct 40
<210> 3
<211> 40
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
aggcggcctc tatctggcat gcctatattc attcattgtc 40
<210> 4
<211> 40
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 4
gacaatgaat gaatataggc atgccagata gaggccgcct 40
<210> 5
<211> 40
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 5
tcctcgccct tgctcaccat gaacccgttt ctcaggttct 40
<210> 6
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 6
ggaatgcatg gaggagttct 20
<210> 7
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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<211> 40
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 13
ttccaatcga taccgtcgac gaatctaaac agacattatc 40
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<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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catttcatca ccacagtcac catgccagat agaggccg 38
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<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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<400> 16
accactttaa ggcaggaacc 20
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<400> 17
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<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 18
ctggccccct cggggtccct gg 22
<210> 19
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 19
tttcagggcc tgccctttta caggc 25
Claims (10)
1.一种高表达几丁质酶内生真菌枫香拟茎点霉的构建方法，其特征在于，包括以下步骤：
(1-1)过表达质粒的构建：将几丁质酶基因连接到pCT74载体ToxA启动子下，转染入枫香拟茎点霉中，在含有潮霉素抗性的PDA中培养获得过表达质粒；所述几丁质酶基因序列如SEQ ID No.1所示；
(2)吸取枫香拟茎点霉野生型菌株菌液2mL接种于50mL PDA液体培养基上，28℃、180r·min-1条件下培养36h；
(3)用尼龙膜过滤获得菌丝，然后用0.6M的MgSO4溶液充分洗涤菌丝，取1g湿菌丝体加入10mL酶解液中，28℃、80r·min-1酶解13h；
(4)将酶解液转移至15mL离心管中，4℃、1250g离心10min，弃上清液，加入5mL STC溶液重悬，转入2mL离心管中2500g离心10min；用移液器吸取顶部的原生质体悬浊液，转入1.5mL离心管中，用STC溶液稀释，调整原生质体数的终浓度为107～108个·mL-1，得到原生质体；
(5)在1.5mL离心管中混合20μL PTC、50μg步骤(1-1)制得的过表达质粒、80μL原生质体，冰浴30min；向混合液中加入900μL PTC，混匀，移入15mL离心管，室温热激20min；
(6)在热激完成的离心管中加入再生培养基10mL，加入潮霉素至终浓度50μg·mL-1，混匀，倾倒至无菌平板，28℃培养72h，即得。
2.一种高表达几丁质酶内生真菌枫香拟茎点霉的构建方法，其特征在于，包括以下步骤：
(1-2)整合表达质粒的构建：将几丁质酶基因采用CRISPR-Cas9的方法置于选定高表达基因启动子之后构建整合表达质粒；所述几丁质酶基因序列如SEQ ID No.1所示；
(2)吸取枫香拟茎点霉△Ku70菌株菌液接种于50mL PDA液体培养基上，28℃、180r·min-1条件下培养36h；
(3)用尼龙膜过滤获得菌丝，然后用0.6M的MgSO4溶液充分洗涤菌丝，取1g湿菌丝体加入10mL酶解液中，28℃、80r·min-1酶解13h；
(4)将酶解液转移至15mL离心管中，4℃、1250g离心10min，弃上清液，加入5mL STC溶液重悬，转入2mL离心管中2500g离心10min；用移液器吸取顶部的原生质体悬浊液，转入1.5mL离心管中，用STC溶液稀释，调整原生质体数的终浓度为107～108个·mL-1，得到原生质体；
(5)在1.5mL离心管中混合20μL PTC、50μg步骤(1-2)制得的整合表达质粒、80μL原生质体，冰浴30min；向混合液中加入900μL PTC，混匀，移入15mL离心管，室温热激20min；
(6)在热激完成的离心管中加入再生培养基10mL，加入苯菌灵至终浓度0.5μg·mL-1，混匀，倾倒至无菌平板，28℃培养72h，即得。
3.根据权利要求1所述的一种高表达几丁质酶内生真菌枫香拟茎点霉的构建方法，其特征在于，步骤(1-1)所述过表达质粒的构建方法如下：
(a)采用限制性内切酶NcoI消化质粒pCT74，获得表达载体的骨架结构，载体上由于NcoI限制性内切酶切割导致丢失的HygR-ToxA片段以pCT74为模板进行克隆回补，引物为：F-HT及R-HT；几丁质酶基因片段通过PCR扩增从枫香拟茎点霉基因组获取，引物为F-Chi及R-Chi；
所述F-HT具有如SEQ ID No.2所示的序列；
所述R-HT具有如SEQ ID No.3所示的序列；
所述F-Chi具有如SEQ ID No.4所示的序列；
所述R-Chi具有如SEQ ID No.5所示的序列；
(b)将酶切骨架和PCR产物分别进行切胶回收后，将骨架：几丁质酶基因片段：HygR-ToxA片段按5:1:1的摩尔比混合，加入NovoRec重组酶，50℃反应15min；连接产物加入100μLDH5α感受态细胞中，冰浴30min；42℃水浴热激45s，冰浴3min；加入500μL LB液体培养基，37℃孵育60min；5000rpm离心3min，收集菌体涂板培养12h，获得转化子即得。
4.根据权利要求2所述的一种高表达几丁质酶内生真菌枫香拟茎点霉的构建方法，其特征在于，步骤(1-2)所述整合表达质粒的构建方法如下：
(A)采用限制性内切酶SalI消化质粒pCT74-Cas9-sgRNA，获得整合载体的骨架结构；左右两条同源臂从基因组上获取，引物分别为：F-LA:R-LA，F-RA:R-RA；苯菌灵抗性片段从质粒pBen-RFP上获取，引物为：F-Ben，R-Ben；几丁质酶基因片段通过PCR扩增从枫香拟茎点霉基因组获取，引物为F-ChiB及R-ChiB；所述F-LA具有如SEQ ID No.8所示的序列；
所述R-LA具有如SEQ ID No.9所示的序列；
所述F-RA具有如SEQ ID No.10所示的序列；
所述R-RA具有如SEQ ID No.11所示的序列；
所述F-Ben具有如SEQ ID No.12所示的序列；
所述R-Ben具有如SEQ ID No.13所示的序列；
所述F-ChiB具有如SEQ ID No.14所示的序列；
所述R-ChiB具有如SEQ ID No.15所示的序列；
(B)将酶切骨架和PCR产物分别进行切胶回收后，将骨架：左同源臂：几丁质酶基因片段：右同源臂：苯菌灵抗性片段按5:1:1:1:1的摩尔比混合，加入NovoRec重组酶，50℃反应15min；连接产物加入100μL DH5α感受态细胞中，冰浴30min；42℃水浴热激45s，冰浴3min；加入500μL LB液体培养基，37℃孵育60min；5000rpm离心3min，收集菌体涂板培养12h，获得转化子即得。
5.权利要求1-4任一项所述的高表达几丁质酶内生真菌枫香拟茎点霉的构建方法构建的工程菌在拮抗镰刀菌上的应用。
6.根据权利要求5所述的应用，其特征在于，在MSM培养基上培养几丁质酶工程菌，在PDA培养基上镰刀菌；平板对峙实验时，过表达菌株两株和整合表达菌株一株，及枫香拟茎点霉野生型菌株一株能够拮抗平板中镰刀菌的生长；所述MSM培养基成分为：2.0g NaNO3，1.31g K2HPO4·3H2O，0.5g KCl，1.0gMgSO4·7H2O，0.018g FeSO4·7H2O，1.12mg MnSO4，0.078mg CuSO4·5H2O，15g蔗糖，20mL几丁质胶体，25g琼脂。
7.根据权利要求6所述的应用，其特征在于，所述镰刀菌为尖孢镰刀菌、层出镰刀菌或禾谷镰刀菌。
8.权利要求1-4任一项所述的高表达几丁质酶内生真菌枫香拟茎点霉的构建方法构建的工程菌在抗小麦赤霉病中的应用。
9.根据权利要求8所述的应用，其特征在于，小麦种子使用1％过氧化氢消毒后置于无菌蛭石中，滴加以蒸馏水洗涤后的几丁质酶过表达菌株，18℃光照培养10天后，取其根部，表面处理及消毒后，可检测到内生真菌在小麦根部的定殖。
10.根据权利要求9所述的应用，其特征在于，小麦培养至4天时，每株滴加浓度1×105禾谷镰刀菌孢子悬液0.5mL，继续培养至10天时，每株滴加以蒸馏水洗涤后的几丁质酶过表达菌株1％0.5mL；继续培养10天后，可检测到几丁质酶菌株对小麦赤霉病病原菌的抗性作用。
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