CN109161480A - 拟茎点霉的原生质体制备方法及基因敲除方法 - Google Patents
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Abstract
本申请公开一种拟茎点霉的原生质体制备方法及基因敲除方法，从枫香拟茎点霉菌丝体中制备原生质体，利用融合PCR和同源重组构建CRISPR‑Cas9载体，并将该技术应用于枫香拟茎点霉乳清酸脱氧核苷5'‑磷酸脱羧酶ura和丝裂原活化蛋白激酶MAPK1关键基因的敲除，本申请提供了该技术在枫香拟茎点霉基因功能研究中的应用，并为枫香拟茎点霉与植物共生，促其抗病、增产等机制研究提供了有效的技术方法和新的思路。
Description
技术领域
本申请涉及分子生物学和生物技术领域，特别是涉及一种拟茎点霉的原生质体制备方法及基因敲除方法。
背景技术
内生真菌枫香拟茎点霉是一种广谱内生真菌，能与多种植物共生(Yang B, etal., Plant Physiol Biochem. 2014, 82:172-82)，如小麦、水稻、花生等。前期研究表明，该菌在低氮条件下，可促进氮素积累，增强氮素代谢关键酶活力，从而有利于植株氮素营养的吸收，提高氮肥利用率和植株总生物量(Yang B,et al., Front Microbiol. 2015,6:982)；还能够促进花生结瘤增产(Zhang W, et al., Plant Physiol Biochem. 2016 ,98:1-11)。转录水平研究表明，该菌在共生状态时，其苯丙氨酸、酪氨酸、色氨酸合成相关基因明显上调 (Zhou J,et al., Front Plant Sci. 2017,8:121)，而这三种氨基酸是多种次级代谢产物的前体物质，在生长、再生，防御和环境响应等方面具有重要作用 (Maeda H,Dudareva N. Annu Rev Plant Biol. 2012, 63, 73–105)。抑菌实验研究发现，该菌能够抑制尖孢镰刀菌的生长，而尖孢镰刀菌是引起小麦赤霉病的重要病原病之一。目前防治植物病害的主要策略是采用化学试剂 (Figueroa M, et al., Mol Plant Pathol. 2017,doi: 10.1111/mpp.12618; 张洁，et al., 小麦赤霉病的防治技术研究进展.中国植保导刊. 2014,34(1):24-28,53)，如拜耳的戊唑醇、丙硫菌唑以及丙硫菌唑与氟吡菌酰胺复合制剂，巴斯夫的多菌灵、甲基硫菌灵、三唑酮、戊唑醇、咪鲜胺、井冈霉素等。市面上较为通用的药剂有戊唑醇与咪鲜胺的混剂以及氰烯菌酯的相关混剂产品。我国防治小麦赤霉病常用多菌灵。多菌灵能够刺激病菌产生DON毒素，尤其是使得抗药性菌株产毒能力更强 (ZhangL, et al., Mol Plant Pathol. 2016,17(1):16-28)。抗药性的产生，使得无论使用什么药剂，很难起到防治作用。除此之外，药剂的大量使用还会造成环境污染和食品安全问题。其次，防治植物病害最经济有效的措施是选用抗病品种。国内育种工作者在选育和推广抗病品种方面做了大量工作，但总体而言其抗病性和丰产性还不够理想 (Giancaspro A, etal., Front Plant Sci. 2016,7:1381)。植物转基因品种可以提高植物的抗病性，但是植物转基因品种的生物安全性备受争议 (Devos Y, et al., 2014,23(1): 1-25)，使得植物转基因品种的应用十分受限。枫香拟茎点霉在植物中的定殖不进入种子，具有良好的生物安全性，避免了植物转基因带来的争议问题，为开发新型的农业生防菌剂提供支撑。近年来研究表明，内生真菌次级代谢产物不仅揭示了内生真菌在与植物的互惠共生中的重要作用，而且可保护植物免受生物胁迫和非生物胁迫损伤 (Panaccione DG, et al., PNAS.2001, 98,12820–12825)。Lahrmann等发现内生真菌次级代谢产物是维护互惠互利的主要决定因素 (Lahrmann U,et al., PNAS. 2013,110,13965–13970)。因此，内生真菌枫香拟茎点霉与植物良好的互惠共生关系机制的研究，使得其遗传操作体系的构建显得尤为重要。迄今为止，该菌的遗传操作体系的研究及应用尚属空白。本发明旨在提供适合在枫香拟茎点霉中使用的遗传操作体系。
枫香拟茎点霉为丝状真菌，而丝状真菌遗传背景较细菌和酵母而言，更加复杂，遗传操作困难，也导致丝状真菌的分子生物学和遗传学研究进展相对缓慢。对丝状真菌进行基因敲除、敲入或阻断的限制因素主要有四个方面：（1）原生质体制备较困难；（2）同源重组效率低，例如在烟曲霉中同源重组效率低于5%；（3）可使用的筛选标记有限，目前丝状真菌主要使用的抗生素筛选标记有3种：潮霉素、草丁膦和博莱霉素等，而且有限的筛选标记并不是对所有的丝状真菌都起作用；（4）RNA干扰技术不能完全消除基因的背景影响，并且在一些丝状真菌中很难建立有效的RNA干扰系统 (李红花，刘钢. 遗传. 2017, 39(5): 355-367)。本发明提供了该菌的原生质体制备技术、转化及基因敲除技术，为解析这个独特菌株的遗传背景和深入研究枫香拟茎点霉与植物共生，次级代谢产物生物合成对植物的抗病性研究创造必要条件。
申请内容
解决的技术问题：
本申请需要解决的技术问题是现有技术中原生质体制备较困难、同源重组效率低、可使用的筛选标记有限、RNA干扰技术不能完全消除基因的背景影响等技术问题，提提供一种拟茎点霉的原生质体制备方法及基因敲除方法，主要包括原生质体制备条件的选择、转化条件、基因敲除表达框的构建策略。
技术方案：
一种拟茎点霉的原生质体制备方法，包括以下步骤：
第一步，菌种的活化：从保存于试管中的PDA固体培养基上刮取菌丝接到含有50 mLPDA液体培养基的锥形瓶中，在28 ℃、180 rpm条件下培养两天，从液体培养基中吸取2 mL菌丝液接到新的含有50 mL PDA液体培养基的锥形瓶中，继续在28 ℃、180 rpm条件下培养36 h；
第二步：使用尼龙膜过滤菌丝液获得菌丝，然后用0.6 M的MgSO4将菌丝清洗干净，取1g湿菌丝体于10 mL裂解液中孵育，孵育温度≥28℃，孵育时摇床转速≥80 rpm；
第三步：孵育≥8h后取出，3000 rpm-5000rpm先离心10 min，弃去上清液，用5 mL STC缓冲液重悬后得原生质体悬浊液，将悬浊液在3000 rpm-5000 rpm再离心10 min，用移液枪吸取顶部的原生质体于新的1.5 mL离心管中，稀释至108个·mL-1制得。
作为本申请的一种优选技术方案：所述第一步中PDA液体培养基由土豆200g/L和葡萄糖20 g/L组成。
作为本申请的一种优选技术方案：所述第二步中孵育温度为28℃，孵育时摇床转速80 rpm。
作为本申请的一种优选技术方案：所述第二步中裂解液由20 mg 的Trichoderma、20 mg的Yatalase和0.8 M 无机盐离子定容至10 mL制得，所述无机盐离子是CaCl2, NaCl或MgCl2。
作为本申请的一种优选技术方案：所述第三步中孵育时间为13 h，离心条件为先在3000 rpm下离心10min，弃去上清液，用5 mL STC缓冲液重悬后得原生质体悬浊液，将悬浊液在5000rpm再离心10 min。
作为本申请的一种优选技术方案：所述第三步中STC缓冲液由山梨醇1.2 mol L-1、CaCl2 10 mM·L-1和pH 7.5的Tris·HCl 10 mM·L-1组成。
拟茎点霉的基因敲除方法，包括以下步骤：
第一步：构建剪切元件和基因敲除表达框，所述剪切元件主要包括以下核心元件：来源于真菌的U6启动子、靶标基因的gRNA和终止子，所述剪切元件还包括以下核心元件：来源于真菌的ToxA启动子、Cas9基因及Nos终止子，基因敲除表达框包括以下核心元件：靶标基因ura上游同源臂、潮霉素抗性基因HygR和靶标基因ura下游同源臂；
第二步：将质粒转化进入原生质体的过程：制备PEG溶液和软琼脂再生培养基，取制备好的原生质体80 μL于新的1.5 mL离心管中，加入20 μL PEG溶液和5 μg质粒，用移液枪轻轻混匀，冰浴；冰浴30 min后加入900 μL PEG溶液，用移液枪轻轻混匀，室温条件下静置，热激；热激20 min后加入10 mL提前融化了的含有100 μg·mL-1潮霉素的再生培养基，混匀后倒入灭菌的平板，待培养基凝固后于28 ℃条件下倒置培养；敲除菌株在添加尿嘧啶的培养基上正常生长，而无尿嘧啶的培养基，敲除菌株不能生长；
第三步：基因敲除菌株的分子鉴定过程：倒置培养2-3天后挑选转化子单菌落提取基因组DNA，左右臂向外各延伸约100 bp后分别设计上下游引物，以转化子基因组DNA为模板扩增靶点处DNA片段，琼脂糖电泳鉴定；基因成功被敲除的菌株电泳条带比未被敲除的菌株或野生型菌株电泳条带大1.4 kb，将成功敲除的电泳条带切下测序，比对测序结果最终确定基因是否被成功敲除。
作为本申请的一种优选技术方案：所述靶标基因为ura基因和MAPK途径的关键基因mapk1，分别编码乳清酸脱氧核苷5'-磷酸脱羧酶和丝裂原激活蛋白激酶1。
作为本申请的一种优选技术方案：所述第五步中PEG溶液由PEG 4000（60% ）、CaCl2（50 mM·L-1）和Tris·HCl（50 mM·L-1，pH 7.5）组成，软琼脂再生培养基由土豆200g·L-1、山梨醇182 g·L-1、尿苷1 g·L-1、尿嘧啶1 g·L-1和琼脂粉10 g·L-1组成。
作为本申请的一种优选技术方案：所述第五步中待培养基凝固后于28 ℃条件下倒置培养3天得到阳性克隆。
作为本申请的一种优选技术方案：所述U6启动子序列如SEQ ID No.1所示。
作为本申请的一种优选技术方案：所述ToxA启动子序列如SEQ ID No.2所示。
作为本申请的一种优选技术方案，所述Nos终止子序列如SEQ ID No.3所示。
作为本申请的一种优选技术方案：所述gRNA-ura序列如SEQ ID No.4所示。
作为本申请的一种优选技术方案：所述gRNA-mapk1序列如SEQ ID No.5所示。
作为本申请的一种优选技术方案：所述Cas9序列如SEQ ID No.6所示。
作为本申请的一种优选技术方案：所述潮霉素抗性基因序列如SEQ ID No.7所示。
附图说明：
图1为本申请所述拟茎点霉原生质体显微镜观察结果图；
图2为本申请所述构建的基因敲除载体图；
图3为本申请所述PCR验证ura基因的敲除，ura敲除原理设计图；
图4本申请所述PCR验证ura基因的敲除，PCR验证敲除后的B3菌株图；
图5本申请所述PCR验证ura基因的敲除，菌株仅在添加尿嘧啶时能生长图。
有益效果：
本申请所述一种拟茎点霉的原生质体制备方法及基因敲除方法采用以上技术方案与现有技术相比，具有以下技术效果：1、基因敲除效率高； 2、原生质体制备技术简单；3、同源重组效率高；4、增加了内生真菌拟茎点霉基因敲除的筛选标记；5、所述拟茎点霉原生质体制备和基因敲除的方法，将剪切元件和表达原件构建在同一个载体上，整合到拟茎点霉基因组中，只需对拟茎点霉进行一次转化；6、本发明可用于多个基因的敲除；7、应用本发明，成功敲除了拟茎点霉中的ura基因和mapk1基因，其中ura的敲除对表型没有任何影响，形态正常，遗传转化稳定；8、mapk1基因是与生长发育密切相关的基因，可看到表型变化, 菌株生长缓慢，菌丝细小。
具体实施方式
以下实施例进一步说明本申请的内容，但不应理解为对本申请的限制。在不背离本申请精神和实质的情况下，对本申请方法、步骤或条件所作的修改和替换，均属于本申请的范围。
若未特别指明，实施例中所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段。
实施例1:
菌种的活化：从保存于试管中的PDA固体培养基上刮取菌丝接到含有50 mL PDA液体培养基的锥形瓶中，在28 ℃、180 rpm条件下培养两天，从液体培养基中吸取2 mL菌丝液接到新的含有50 mL PDA液体培养基的锥形瓶中，继续在28 ℃、180 rpm条件下培养36 h，所述PDA液体培养基由土豆200g/L和葡萄糖20 g/L组成。
原生质体的制备过程：使用尼龙膜过滤菌丝液获得菌丝，然后用0.6 M的MgSO4将菌丝清洗干净，取1 g湿菌丝体于10 mL裂解液中孵育，孵育温度≥28℃，孵育时摇床转速≥80 rpm，所述裂解液由20 mg 的Trichoderma、20 mg的Yatalase和0.8 M 无机盐离子定容至10 mL制得，所述无机盐离子是CaCl2, NaCl或MgCl2；孵育≥8h后取出，3000 rpm-5000rpm先离心10 min，弃去上清液，用5 mL STC缓冲液重悬后得原生质体悬浊液，将悬浊液在3000rpm-5000 rpm再离心10 min，此时原生质体漂浮在离心管液面顶部，杂质则沉降到管底，用移液枪小心吸取顶部的原生质体于新的1.5 mL离心管中，稀释至108个·mL-1备用，所述STC缓冲液由山梨醇1.2 mol L-1、CaCl2 10 mM·L-1和pH 7.5的Tris·HCl 10 mM·L-1组成。
实施例2：
菌种的活化：从保存于试管中的PDA固体培养基上刮取菌丝接到含有50 mL PDA液体培养基的锥形瓶中，在28 ℃、180 rpm条件下培养两天，从液体培养基中吸取2 mL菌丝液接到新的含有50 mL PDA液体培养基的锥形瓶中，继续在28 ℃、180 rpm条件下培养36 h，所述PDA液体培养基由土豆200g/L和葡萄糖20 g/L组成。
原生质体的制备过程：使用尼龙膜过滤菌丝液获得菌丝，然后用0.6 M的MgSO4将菌丝清洗干净，取1 g湿菌丝体于10 mL裂解液中孵育，孵育温度28℃，孵育时摇床转速80rpm，所述裂解液由20 mg 的Trichoderma、20 mg的Yatalase和0.8 M 无机盐离子定容至10mL制得，所述无机盐离子是CaCl2, NaCl或MgCl2；孵育13h后取出， 3000 rpm先离心10 min，弃去上清液，用5 mL STC缓冲液重悬后得原生质体悬浊液，将悬浊液在5000rpm再离心10min，此时原生质体漂浮在离心管液面顶部，杂质则沉降到管底，用移液枪小心吸取顶部的原生质体于新的1.5 mL离心管中，稀释至108个·mL-1备用，所述STC缓冲液由山梨醇1.2mol L-1、CaCl2 10 mM·L-1和pH 7.5的Tris·HCl 10 mM·L-1组成。实验结果见说明书附图1所示。
实施例3:
拟茎点霉的基因敲除方法：根据靶标序列设计合适的gRNA序列，将U6启动子和ura的gRNA通过融合PCR融合成片段1，连接到载体pCT74上；再将ToxA启动子、Cas9和Nos终止子通过融合PCR融合成片段2，连接到载体上；将靶标序列上游序列、潮霉素抗性基因和靶标序列下游序列通过融合PCR连接成片段3，再连接到载体上，得到新的载体pCTU。
根据靶标序列设计合适的gRNA序列，将U6启动子和mapk1的gRNA通过融合PCR融合成片段1，连接到载体pCT74上；再将ToxA启动子、Cas9和Nos终止子通过融合PCR融合成片段2，连接到载体上；将靶标序列上游序列、潮霉素抗性基因和靶标序列下游序列通过融合PCR连接成片段3，再连接到载体上，得到新的载体pCTM。
取制备好的原生质体80 μL于新的1.5 mL离心管中，加入20 μL PEG溶液和5 μg质粒，用移液枪轻轻混匀，冰浴。冰浴30 min后加入900 μL PEG溶液，用移液枪轻轻混匀，室温条件下静置，热激。热激20 min后加入10 mL提前融化了的含有100 μg·mL-1潮霉素的软琼脂再生培养基，混匀后倒入灭菌的平板，待培养基凝固后于28 ℃条件下倒置培养2-3天得到阳性克隆。PEG溶液由PEG 4000（60% ）、CaCl2（50 mM·L-1）和Tris·HCl（50 mM·L-1，pH7.5）组成，软琼脂再生培养基由土豆200 g·L-1、山梨醇182 g·L-1、尿苷1 g·L-1、尿嘧啶1g·L-1和琼脂粉10 g·L-1组成。
倒置培养2-3天后挑选转化子单菌落提取基因组DNA,左右臂向外各延伸约100 bp后分别设计上下游引物，以转化子基因组DNA为模板扩增靶点处DNA片段，琼脂糖电泳鉴定。基因成功被敲除的菌株电泳条带比未被敲除的菌株或野生型菌株电泳条带大1.4 kb，将成功敲除的电泳条带切下测序，比对测序结果最终确定基因是否被成功敲除。
实施例4:
本实验说明ura基因敲除质粒的构建：
以pCT74质粒为原始质粒，从pX330质粒中PCR扩增出Cas9蛋白的CDS区，将扩增出的DNA片段无缝克隆进入pCT74质粒中荧光蛋白前，使Cas9蛋白和荧光蛋白无缝融合成一个蛋白，构建出第一个质粒pCT74-Cas9。
以烟曲霉基因组为模板PCR扩增出烟曲霉的U6启动子，以pX330为模板扩增出sgRNA骨架，将U6启动子和sgRNA骨架融合PCR成一个DNA片段后无缝克隆至第一个质粒pCT74-Cas9的XhoⅠ限制性酶切位点，构建出第二个质粒pCT74-Cas9-sgRNA。
使用网站http://zifit.partners.org/ZiFiT/CSquare9Nuclease.aspx 设计靶标基因的gRNA序列，选取互补的两条gRNA序列送去公司合成出两条单链oligos，将单链oligos混合后使用磷酸化酶对5’-端进行磷酸化，磷酸化完成后变性退火成一条互补双链oligo，最后使用DNA连接酶将互补双链oligo酶连进入第二个质粒pCT74-Cas9-sgRNA的BbsⅠ限制性酶切位点，构建出第三个质粒pCT74-Cas9-sgRNA-ura。
以枫香拟茎点霉基因组为模板，分别PCR扩增出ura基因靶点上游1kb DNA片段（左臂）和下游1kb DNA片段（右臂），以pCT74质粒为模板PCR扩增出潮霉素抗性基因HygR，将上游左臂、潮霉素抗性基因HygR、右臂按顺序融合PCR成一个DNA片段。使用限制内切酶SalⅠ对第三个质粒pCT74-Cas9-sgRNA-ura进行酶切，最后将前面融合好的DNA片段无缝克隆至酶切后质粒的SalⅠ限制性酶切位点构建出最后一个质粒pCT74-Cas9-sgRNA-ura-donor, 即pCTU；采用同样的方法得到敲除质粒pCTM。
载体构建实验结果见说明书附图2所示。所构建的载体可同时表达Cas9基因，gRNA基因及敲除基因上下游同源臂。
实施例5
本实验说明将质粒转化进入原生质体的过程：
取制备好的原生质体80 μL于新的1.5 mL离心管中，加入20 μL PEG溶液和5 μg质粒，用移液枪轻轻混匀，冰浴。冰浴30 min后加入900 μL PEG溶液，用移液枪轻轻混匀，室温条件下静置，热激。热激20 min后加入10 mL提前融化了的含有100 μg·mL-1潮霉素的软琼脂再生培养基，混匀后倒入灭菌的平板，待培养基凝固后于28 ℃条件下倒置培养2-3天得到阳性克隆。PEG溶液由PEG 4000（60% ）、CaCl2（50 mM·L-1）和Tris·HCl（50 mM·L-1，pH7.5）组成，软琼脂再生培养基由土豆200 g·L-1、山梨醇182 g·L-1、尿苷1 g·L-1、尿嘧啶1g·L-1和琼脂粉10 g·L-1组成。
成功敲除菌株实验结果如附图3所示。PDA+Δura,指敲除菌株在PDA培养基中不能生长； PDA+uu，敲除菌株可在添加有尿嘧啶的培养基中生长；PDA+WT，指野生型菌株的对照。
实施例6：
本实验说明ura基因敲除菌株的分子鉴定过程：
倒置培养2-3天后挑选转化子单菌落提取基因组DNA,左右臂向外各延伸约100 bp后分别设计上下游引物，以转化子基因组DNA为模板扩增靶点处DNA片段，琼脂糖电泳鉴定。基因成功被敲除的菌株电泳条带比未被敲除的菌株或野生型菌株电泳条带大1.4 kb，将成功敲除的电泳条带切下测序，比对测序结果最终确定基因是否被成功敲除。
实验结果如附图4所示。左侧为基因敲除时同源臂的设计原理示意图，右侧为PCR实验验证目标基因敲除前后所得到的目标片段大小，野生型基因片段约2200bp,目标基因敲除后片段大小为3600bp。
U6启动子序列SEQ ID No.1：
CCCAGTAGCGAAAATGCCACTCCAGACTTATCCGCGTTTGGCGGTACTGGCATACCACTGGGAGGGTATGATCTGGGAATGACGGGAATGAATCAAAGGTCCCATCGGTGATGGGTATTGCTCCTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTCTCTCTTTGCGAGCGGTTCTGGTTGGGCGAATATGGTGTCTTGGAAAAGGGTGGGGGGTTCACGACTTCTATATGCTCTGTATGCTGAACTGTTTGTGTAACTGAGTTGTATATCCCTGCTTTACTCCGTACTCTGATCCATTACTTTCTTTGTCTGTGTCGTCTAATCTCGTTGCCATACTGACCCGCTTACCGACCAATCATGCCACTGGAAATTCCTTTATAGTTCATTCTAATGTCTTCACAAGT
ToxA启动子序列SEQ ID No.2：
ATCGATTGGAATGCATGGAGGAGTTCTGTACGCGCAATTCCGCTCTCCGTAAGGATGCTTCGGAGGTGCACATGGTCTCATACATGTAGGCCCGACGAGGATCGAGTCGGTTCCGAAGTAGGATCGTCTCGATTGTTGGGCATCATTGCATGGACATTCAGAGGGCCTACTGATACCTGGAATCCGCACCGTCCGGCTACCTAGCAATAAGATTCTGTGTATATAAAGGGCTAAGGTGTCCGTCCTTGATAAAACCACCACCCTCAACAACTTACCTCGACTATCAGCATCCCGTCCTATCTAACAATCGTCCATCGGTATCCAACTCCAACTCTATTCGCAGGGTCCTAGAATCGTAAGTACACGCTTATATCTTGTTGCCAGCGATAGCTGACAATGAATGAATATAGGCC
Nos终止子序列SEQ ID No.3：
GCGGCCGCCCGGCTGCAGATCGTTCAAACATTTGGCAATAAAGTTTCTTAAGATTGAATCCTGTTGCCGGTCTTGCGATGATTATCATATAATTTCTGTTGAATTACGTTAAGCATGTAATAATTAACATGTAATGCATGACGTTATTTATGAGATGGGTTTTTATGATTAGAGTCCCGCAATTATACATTTAATACGCGATAGAAAACAAAATATAGCGCGCAAACTAGGATAAATTATCGCGCGCGGTGTCATCTATGTTACTAGATCCGATGATAAGCTGTCAAACATGAGAATTCCTGCAGCCCGGGGGATCCACTAGTTCTAGAGCGGCCGC
gRNA-ura序列SEQ ID No.4：
GCTTCCTGATCTTCGAGGAT
gRNA-MAPK1序列SEQ ID No.5：
GGGGCGTTCATCATGGGGAC
Cas9序列SEQ ID No.6：
ATGGACTATAAGGACCACGACGGAGACTACAAGGATCATGATATTGATTACAAAGACGATGACGATAAGATGGCCCCAAAGAAGAAGCGGAAGGTCGGTATCCACGGAGTCCCAGCAGCCGACAAGAAGTACAGCATCGGCCTGGACATCGGCACCAACTCTGTGGGCTGGGCCGTGATCACCGACGAGTACAAGGTGCCCAGCAAGAAATTCAAGGTGCTGGGCAACACCGACCGGCACAGCATCAAGAAGAACCTGATCGGAGCCCTGCTGTTCGACAGCGGCGAAACAGCCGAGGCCACCCGGCTGAAGAGAACCGCCAGAAGAAGATACACCAGACGGAAGAACCGGATCTGCTATCTGCAAGAGATCTTCAGCAACGAGATGGCCAAGGTGGACGACAGCTTCTTCCACAGACTGGAAGAGTCCTTCCTGGTGGAAGAGGATAAGAAGCACGAGCGGCACCCCATCTTCGGCAACATCGTGGACGAGGTGGCCTACCACGAGAAGTACCCCACCATCTACCACCTGAGAAAGAAACTGGTGGACAGCACCGACAAGGCCGACCTGCGGCTGATCTATCTGGCCCTGGCCCACATGATCAAGTTCCGGGGCCACTTCCTGATCGAGGGCGACCTGAACCCCGACAACAGCGACGTGGACAAGCTGTTCATCCAGCTGGTGCAGACCTACAACCAGCTGTTCGAGGAAAACCCCATCAACGCCAGCGGCGTGGACGCCAAGGCCATCCTGTCTGCCAGACTGAGCAAGAGCAGACGGCTGGAAAATCTGATCGCCCAGCTGCCCGGCGAGAAGAAGAATGGCCTGTTCGGAAACCTGATTGCCCTGAGCCTGGGCCTGACCCCCAACTTCAAGAGCAACTTCGACCTGGCCGAGGATGCCAAACTGCAGCTGAGCAAGGACACCTACGACGACGACCTGGACAACCTGCTGGCCCAGATCGGCGACCAGTACGCCGACCTGTTTCTGGCCGCCAAGAACCTGTCCGACGCCATCCTGCTGAGCGACATCCTGAGAGTGAACACCGAGATCACCAAGGCCCCCCTGAGCGCCTCTATGATCAAGAGATACGACGAGCACCACCAGGACCTGACCCTGCTGAAAGCTCTCGTGCGGCAGCAGCTGCCTGAGAAGTACAAAGAGATTTTCTTCGACCAGAGCAAGAACGGCTACGCCGGCTACATTGACGGCGGAGCCAGCCAGGAAGAGTTCTACAAGTTCATCAAGCCCATCCTGGAAAAGATGGACGGCACCGAGGAACTGCTCGTGAAGCTGAACAGAGAGGACCTGCTGCGGAAGCAGCGGACCTTCGACAACGGCAGCATCCCCCACCAGATCCACCTGGGAGAGCTGCACGCCATTCTGCGGCGGCAGGAAGATTTTTACCCATTCCTGAAGGACAACCGGGAAAAGATCGAGAAGATCCTGACCTTCCGCATCCCCTACTACGTGGGCCCTCTGGCCAGGGGAAACAGCAGATTCGCCTGGATGACCAGAAAGAGCGAGGAAACCATCACCCCCTGGAACTTCGAGGAAGTGGTGGACAAGGGCGCTTCCGCCCAGAGCTTCATCGAGCGGATGACCAACTTCGATAAGAACCTGCCCAACGAGAAGGTGCTGCCCAAGCACAGCCTGCTGTACGAGTACTTCACCGTGTATAACGAGCTGACCAAAGTGAAATACGTGACCGAGGGAATGAGAAAGCCCGCCTTCCTGAGCGGCGAGCAGAAAAAGGCCATCGTGGACCTGCTGTTCAAGACCAACCGGAAAGTGACCGTGAAGCAGCTGAAAGAGGACTACTTCAAGAAAATCGAGTGCTTCGACTCCGTGGAAATCTCCGGCGTGGAAGATCGGTTCAACGCCTCCCTGGGCACATACCACGATCTGCTGAAAATTATCAAGGACAAGGACTTCCTGGACAATGAGGAAAACGAGGACATTCTGGAAGATATCGTGCTGACCCTGACACTGTTTGAGGACAGAGAGATGATCGAGGAACGGCTGAAAACCTATGCCCACCTGTTCGACGACAAAGTGATGAAGCAGCTGAAGCGGCGGAGATACACCGGCTGGGGCAGGCTGAGCCGGAAGCTGATCAACGGCATCCGGGACAAGCAGTCCGGCAAGACAATCCTGGATTTCCTGAAGTCCGACGGCTTCGCCAACAGAAACTTCATGCAGCTGATCCACGACGACAGCCTGACCTTTAAAGAGGACATCCAGAAAGCCCAGGTGTCCGGCCAGGGCGATAGCCTGCACGAGCACATTGCCAATCTGGCCGGCAGCCCCGCCATTAAGAAGGGCATCCTGCAGACAGTGAAGGTGGTGGACGAGCTCGTGAAAGTGATGGGCCGGCACAAGCCCGAGAACATCGTGATCGAAATGGCCAGAGAGAACCAGACCACCCAGAAGGGACAGAAGAACAGCCGCGAGAGAATGAAGCGGATCGAAGAGGGCATCAAAGAGCTGGGCAGCCAGATCCTGAAAGAACACCCCGTGGAAAACACCCAGCTGCAGAACGAGAAGCTGTACCTGTACTACCTGCAGAATGGGCGGGATATGTACGTGGACCAGGAACTGGACATCAACCGGCTGTCCGACTACGATGTGGACCATATCGTGCCTCAGAGCTTTCTGAAGGACGACTCCATCGACAACAAGGTGCTGACCAGAAGCGACAAGAACCGGGGCAAGAGCGACAACGTGCCCTCCGAAGAGGTCGTGAAGAAGATGAAGAACTACTGGCGGCAGCTGCTGAACGCCAAGCTGATTACCCAGAGAAAGTTCGACAATCTGACCAAGGCCGAGAGAGGCGGCCTGAGCGAACTGGATAAGGCCGGCTTCATCAAGAGACAGCTGGTGGAAACCCGGCAGATCACAAAGCACGTGGCACAGATCCTGGACTCCCGGATGAACACTAAGTACGACGAGAATGACAAGCTGATCCGGGAAGTGAAAGTGATCACCCTGAAGTCCAAGCTGGTGTCCGATTTCCGGAAGGATTTCCAGTTTTACAAAGTGCGCGAGATCAACAACTACCACCACGCCCACGACGCCTACCTGAACGCCGTCGTGGGAACCGCCCTGATCAAAAAGTACCCTAAGCTGGAAAGCGAGTTCGTGTACGGCGACTACAAGGTGTACGACGTGCGGAAGATGATCGCCAAGAGCGAGCAGGAAATCGGCAAGGCTACCGCCAAGTACTTCTTCTACAGCAACATCATGAACTTTTTCAAGACCGAGATTACCCTGGCCAACGGCGAGATCCGGAAGCGGCCTCTGATCGAGACAAACGGCGAAACCGGGGAGATCGTGTGGGATAAGGGCCGGGATTTTGCCACCGTGCGGAAAGTGCTGAGCATGCCCCAAGTGAATATCGTGAAAAAGACCGAGGTGCAGACAGGCGGCTTCAGCAAAGAGTCTATCCTGCCCAAGAGGAACAGCGATAAGCTGATCGCCAGAAAGAAGGACTGGGACCCTAAGAAGTACGGCGGCTTCGACAGCCCCACCGTGGCCTATTCTGTGCTGGTGGTGGCCAAAGTGGAAAAGGGCAAGTCCAAGAAACTGAAGAGTGTGAAAGAGCTGCTGGGGATCACCATCATGGAAAGAAGCAGCTTCGAGAAGAATCCCATCGACTTTCTGGAAGCCAAGGGCTACAAAGAAGTGAAAAAGGACCTGATCATCAAGCTGCCTAAGTACTCCCTGTTCGAGCTGGAAAACGGCCGGAAGAGAATGCTGGCCTCTGCCGGCGAACTGCAGAAGGGAAACGAACTGGCCCTGCCCTCCAAATATGTGAACTTCCTGTACCTGGCCAGCCACTATGAGAAGCTGAAGGGCTCCCCCGAGGATAATGAGCAGAAACAGCTGTTTGTGGAACAGCACAAGCACTACCTGGACGAGATCATCGAGCAGATCAGCGAGTTCTCCAAGAGAGTGATCCTGGCCGACGCTAATCTGGACAAAGTGCTGTCCGCCTACAACAAGCACCGGGATAAGCCCATCAGAGAGCAGGCCGAGAATATCATCCACCTGTTTACCCTGACCAATCTGGGAGCCCCTGCCGCCTTCAAGTACTTTGACACCACCATCGACCGGAAGAGGTACACCAGCACCAAAGAGGTGCTGGACGCCACCCTGATCCACCAGAGCATCACCGGCCTGTACGAGACACGGATCGACCTGTCTCAGCTGGGAGGCGACAAAAGGCCGGCGGCCACGAAAAAGGCCGGCCAGGCAAAAAAGAAAAAG
潮霉素抗性基因序列SEQ ID No.7：
GTTAACTGGTTCCCGGTCGGCATCTACTCTATTCCTTTGCCCTCGGACGAGTGCTGGGGCGTCGGTTTCCACTATCGGCGAGTACTTCTACACAGCCATCGGTCCAGACGGCCGCGCTTCTGCGGGCGATTTGTGTACGCCCGACAGTCCCGGCTCCGGATCGGACGATTGCGTCGCATCGACCCTGCGCCCAAGCTGCATCATCGAAATTGCCGTCAACCAAGCTCTGATAGAGTTGGTCAAGACCAATGCGGAGCATATACGCCCGGAGGCGCGGCGATCCTGCAAGCTCCGGATGCCTCCGCTCGAAGTAGCGCGTCTGCTGCTCCATACAAGCCAACCACGGCCTCCAGAAGAGGATGTTGGCGACCTCGTATTGGGAATCCCCGAACATCGCCTCGCTCCAGTCAATGACCGCTGTTATGCGGCCATTGTCCGTCAGGACATTGTTGGAGCCGAAATCCGCATGCACGAGGTGCCGGACTTCGGGGCAGTCCTCGGCCCAAAGCATCAGCTCATCGAGAGCCTGCGCGACGGACGCACTGACGGTGTCGTCCATCACAGTTTGCCAGTGATACACATGGGGATCAGCAATCGCGCATATGAAATCACGCCATGTAGTGTATTGACCGATTCCTTGCGGTCCGAATGGGCCGAACCCGCTCGTCTGGCTAAGATCGGCCGCAGCGATCGCATCCATGGCCTCCGCGACCGGCTGGAGAACAGCGGGCAGTTCGGTTTCAGGCAGGTCTTGCAACGTGACACCCTGTGCACGGCGGGAGATGCAATAGGTCAGGCTCTCGCTGAACTCCCCAATGTCAAGCACTTCCGGAATCGGGAGCGCGGCCGATGCAAAGTGCCGATAAACATAACGATCTTTGTAGAAACCATCGGCGCAGCTATTTACCCGCAGGACATATCCACGCCCTCCTACATCGAAGCTGAAAGCACGAGATTCTTCGCCCTCCGAGAGCTGCATCAGGTCGGAGACGCTGTCGAACTTTTCGATCAGAAACTTCTCGACAGACGTCGCGGTGAGTTCAGGCTTTTTCATTTGGATGCTTGGGTAGAATAGGTAAGTCAGATTGAATCTGAAATAAAGGGAGGAAGGGCGAACTTAAGAAGGTATGACCGGGTCGTCCACTTACCTTGCTTGACAAACGCACCAAGTTATCGTGCACCAAGCAGCAGATGATAATAATGTCCTCGTTCCTGTCTGCTAATAAGAGTCACACTTCGAGCGCCGCCGCTACTGCTACAAGTGGGGCTGATCTGACCAGTTGCCTAAATGAACCATCTTGTCAAACGACACAAATTTTGTGCTCACCGCCTGGACGACTAAACCAAAATAGGCATTCATTGTTGACCTCCACTAGCTCCAGCCAAGCCCAAAAAATGCTCCTTCAATATCAGTTAAC
靶标基因ura序列SEQ ID No.8：
ATGTCGGCACCAAGGCATTCCAGTTTAACGAGTAGCTACGGCGACCGGGCAGCGGGCGCGACACACCCGTTGACAAACTACCTCCTTCGCTTAATGGAACTCAAACAATCCAACTTGTGCGTGTCTGCCGATGTACACAGCGCACGGGAACTCTTGTCTCTGGCCGACAAGGTCGGCCCCTCGATCGTCGTCCTCAAAACGCACTACGACCTCGTCATGGGCTGGGACTTCAACCCTCAAACGGGCACGGGAGCGTACCTTGCCGCCCTGGCCAGAAAACACGGCTTCCTGATCTTCGAGGATCGGAAGTACTGCGACATTGGCAGCACGGTGCAGATGCAGTATGTTAGTGGAACCGCGAGGGTCATAGATTGGGCGCACATCGTCAACGCGAACATCTCAGCGGGAAAGCCAATGGTGGGGGCAATGGCCGAGGCAGCGGCCAAATGGCGGGAAAGAATCAATTACGAGGTGCGCACGAGCGTCACAGTTGGAACACCCGTGAGCGACGGTTTCGAGAGTGAGTCCGACGAGATGGACGAGACGGAGGACGAGAATGCTGGTGCTCTCGGCAACAACGGGCAGAGGAAGCCCTCCGCCGCGCTGGAGGCCAGGGACATCAACATGATGGCGCCGCCGCCACCACCTCGAGACGCCGATGGGCGCAAGGGCAGTATCGTCAGCATCACCACGGTGACACAATCTTTCGAGCCGGCCGACTCCCCACGCCTGTCCAAGAGCCTTTCCGACGTTGACGACATCGTCTACCCCGGAATTGAGGAGGCACCACTCGAGAGGGGCCTGCTGCTCCTGGCACAAATGTCCAGCAGCGGCAATCTCATGGACGCCCGCTACACAAACGCTTGCATCGAGGCAGCGAGGGAGAACAAGGATTTCGTGATGGGTTACGTGGCACAGGAGAGCCTGAACTCAGAACCTGATGACAACTTTATCCACATGACTCCAGGCTGCAAGCTGCCGCCAGAGGGCGAGGAGGAGAATGGCGAAGGAATGCAGGGCGATGGAATGGGTCAACAGTACAACACGCCAGCGAAGCTGATTGGAATATGCGGCACGGATATCGTCATCGTAGGAAGGGGTATCATCAAGGCGGGAGATCCGCAGGGGGAGGCAGAGAGATACCGGGTGAGGGCATGGAAGGCCTACCAGGCAAGGCTG
靶标基因MAPK1序列SEQ ID No.9：
ATGCTCTCCCAGTCTCCAAATCCTGTCCCCATGATGAACGCCCCAGCGCCTCTCCTTCGACCCGCCATACCAGGTGCAAGAGGCGGCGGCGCCCGTACACCTCGCCTGGGACTCGCTATACCACCCTCACCGAATGTCAAGCCTGTGGGCGCCGGCGCCGGCGGTGTCGGCCAGCCCTCTCGTCCGCCCCTACCCAAGCTCAACCTCGCCACTCCTATGGGCACGTCTGTGGCCCCTCAAGAACATCAACCCTCGCGTGGCTCACAACCGGGTCACAGCGCCAGTGGCGGCAGCGAGAGCAGCGCTGCACACAGCCGGACGGGCAGCTTCGGGCCGCTGGACGGCAGAGGCAGCAACCCAACCTCGGCAGGCTCGCAGTACTCGGCGCTCTCCTTCGCATCCCAGTACGGCCTGGGCGGCGCAAAACCACATGGCACTCCCGATCCCGTAAGTGCCGTGGGCTCGCTCTATTCGAACGCCAGCGAGGGCGGTGCCGGCATGGAGCGCGAGGGCAGCATGCACGGCTTGGAAGCATCCTTTGATAAGATGAGCTTGGAGAAGGCCAGGACGCTTGACGCAGAGGACCTCGATGACGAGGGCTGGCGGATTGTGAGCATGGAGAATCGAATTGTCGAGCTTGGTGGCCTCGGTGAGGGTGCTGGAGGTGCCGTCACGAGGTGCAAGCTCAAAGGAGGCAAGACTGTTTTTGCTCTCAAGGTGATCACCACAAACCCGGATCCGGATGTGAAGAAGCAGATTCTGCGAGAAATCAACTTCAACAAGGGCTGCGCGTCGGAACACATCTGCAGGTATTACGGCGGTTTCCTCGAGCCTTCTACTGCCACCATCTCCATTGCAATGGAGTTCTGCGAGGGTGGGTCGCTCGACAGCATTTACAAGGAGGTGAAGAGGCTCGGAGGCCGGACGGGCGAGAAAGTCCTGGGCAAGATTGCCGAGGGCGTGTTGCAAGGCCTGACCTATCTCGAAGCCAAGCGCATCCTCCATCGCGACATCAAGCCGTCCAATATCCTCCTCTGCCGCAACGGCGAGGTCAAGCTGTGCGACTTCGGTGTGTCTGGTGATTTCGGTACCAAGGGCGAGGCCAACACCTTCATCGGCACAAGCTACTACATGGCGCCAGAGCGGATCACGGGCCAGACATATACTATTACTTCGGACGTCTGGTCTACAGGCGTGACGCTGCTCGAGGTGGCGCAGCACCGCTTCCCATTCCCGGCAGATGGCACAGAGATGCAGCCTAGGGCCGGTCTGATCGACCTGTTGACGTACATCGTCCAACAGCCCATTCCTAAGCTGAAGGATGAGCCCGACGCGGGCATTTTCTGGAGTGATAACTTCAAGCATTTCATCGAAAGCTGCCTAGAAAAGAACCCCAAGCGCCGCGGTATGCCGTGGAAGATGCTCGAGCACCCATGGATGACTGAGCTCAAGACGAAGCGTGTCAACATGGGCAAGTACCTGTCCCAAGTATGGGGCTGGGACGACGCCAAGGGGTCAAAGTGA
序列表
<110> 南京师范大学
<120> 拟茎点霉的原生质体制备方法及基因敲除方法
<160> 9
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 400
<212> DNA
<213> 人工序列(2 Ambystoma laterale x Ambystoma jeffersonianum)
<400> 1
cccagtagcg aaaatgccac tccagactta tccgcgtttg gcggtactgg cataccactg 60
ggagggtatg atctgggaat gacgggaatg aatcaaaggt cccatcggtg atgggtattg 120
ctcctttttt tttttttttt tttttttttt tctctctttg cgagcggttc tggttgggcg 180
aatatggtgt cttggaaaag ggtggggggt tcacgacttc tatatgctct gtatgctgaa 240
ctgtttgtgt aactgagttg tatatccctg ctttactccg tactctgatc cattactttc 300
tttgtctgtg tcgtctaatc tcgttgccat actgacccgc ttaccgacca atcatgccac 360
tggaaattcc tttatagttc attctaatgt cttcacaagt 400
<210> 2
<211> 413
<212> DNA
<213> 人工序列(2 Ambystoma laterale x Ambystoma jeffersonianum)
<400> 2
atcgattgga atgcatggag gagttctgta cgcgcaattc cgctctccgt aaggatgctt 60
cggaggtgca catggtctca tacatgtagg cccgacgagg atcgagtcgg ttccgaagta 120
ggatcgtctc gattgttggg catcattgca tggacattca gagggcctac tgatacctgg 180
aatccgcacc gtccggctac ctagcaataa gattctgtgt atataaaggg ctaaggtgtc 240
cgtccttgat aaaaccacca ccctcaacaa cttacctcga ctatcagcat cccgtcctat 300
ctaacaatcg tccatcggta tccaactcca actctattcg cagggtccta gaatcgtaag 360
tacacgctta tatcttgttg ccagcgatag ctgacaatga atgaatatag gcc 413
<210> 3
<211> 337
<212> DNA
<213> 人工序列(2 Ambystoma laterale x Ambystoma jeffersonianum)
<400> 3
gcggccgccc ggctgcagat cgttcaaaca tttggcaata aagtttctta agattgaatc 60
ctgttgccgg tcttgcgatg attatcatat aatttctgtt gaattacgtt aagcatgtaa 120
taattaacat gtaatgcatg acgttattta tgagatgggt ttttatgatt agagtcccgc 180
aattatacat ttaatacgcg atagaaaaca aaatatagcg cgcaaactag gataaattat 240
cgcgcgcggt gtcatctatg ttactagatc cgatgataag ctgtcaaaca tgagaattcc 300
tgcagcccgg gggatccact agttctagag cggccgc 337
<210> 4
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(2 Ambystoma laterale x Ambystoma jeffersonianum)
<400> 4
gcttcctgat cttcgaggat 20
<210> 5
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(2 Ambystoma laterale x Ambystoma jeffersonianum)
<400> 5
ggggcgttca tcatggggac 20
<210> 6
<211> 4269
<212> DNA
<213> 人工序列(2 Ambystoma laterale x Ambystoma jeffersonianum)
<400> 6
atggactata aggaccacga cggagactac aaggatcatg atattgatta caaagacgat 60
gacgataaga tggccccaaa gaagaagcgg aaggtcggta tccacggagt cccagcagcc 120
gacaagaagt acagcatcgg cctggacatc ggcaccaact ctgtgggctg ggccgtgatc 180
accgacgagt acaaggtgcc cagcaagaaa ttcaaggtgc tgggcaacac cgaccggcac 240
agcatcaaga agaacctgat cggagccctg ctgttcgaca gcggcgaaac agccgaggcc 300
acccggctga agagaaccgc cagaagaaga tacaccagac ggaagaaccg gatctgctat 360
ctgcaagaga tcttcagcaa cgagatggcc aaggtggacg acagcttctt ccacagactg 420
gaagagtcct tcctggtgga agaggataag aagcacgagc ggcaccccat cttcggcaac 480
atcgtggacg aggtggccta ccacgagaag taccccacca tctaccacct gagaaagaaa 540
ctggtggaca gcaccgacaa ggccgacctg cggctgatct atctggccct ggcccacatg 600
atcaagttcc ggggccactt cctgatcgag ggcgacctga accccgacaa cagcgacgtg 660
gacaagctgt tcatccagct ggtgcagacc tacaaccagc tgttcgagga aaaccccatc 720
aacgccagcg gcgtggacgc caaggccatc ctgtctgcca gactgagcaa gagcagacgg 780
ctggaaaatc tgatcgccca gctgcccggc gagaagaaga atggcctgtt cggaaacctg 840
attgccctga gcctgggcct gacccccaac ttcaagagca acttcgacct ggccgaggat 900
gccaaactgc agctgagcaa ggacacctac gacgacgacc tggacaacct gctggcccag 960
atcggcgacc agtacgccga cctgtttctg gccgccaaga acctgtccga cgccatcctg 1020
ctgagcgaca tcctgagagt gaacaccgag atcaccaagg cccccctgag cgcctctatg 1080
atcaagagat acgacgagca ccaccaggac ctgaccctgc tgaaagctct cgtgcggcag 1140
cagctgcctg agaagtacaa agagattttc ttcgaccaga gcaagaacgg ctacgccggc 1200
tacattgacg gcggagccag ccaggaagag ttctacaagt tcatcaagcc catcctggaa 1260
aagatggacg gcaccgagga actgctcgtg aagctgaaca gagaggacct gctgcggaag 1320
cagcggacct tcgacaacgg cagcatcccc caccagatcc acctgggaga gctgcacgcc 1380
attctgcggc ggcaggaaga tttttaccca ttcctgaagg acaaccggga aaagatcgag 1440
aagatcctga ccttccgcat cccctactac gtgggccctc tggccagggg aaacagcaga 1500
ttcgcctgga tgaccagaaa gagcgaggaa accatcaccc cctggaactt cgaggaagtg 1560
gtggacaagg gcgcttccgc ccagagcttc atcgagcgga tgaccaactt cgataagaac 1620
ctgcccaacg agaaggtgct gcccaagcac agcctgctgt acgagtactt caccgtgtat 1680
aacgagctga ccaaagtgaa atacgtgacc gagggaatga gaaagcccgc cttcctgagc 1740
ggcgagcaga aaaaggccat cgtggacctg ctgttcaaga ccaaccggaa agtgaccgtg 1800
aagcagctga aagaggacta cttcaagaaa atcgagtgct tcgactccgt ggaaatctcc 1860
ggcgtggaag atcggttcaa cgcctccctg ggcacatacc acgatctgct gaaaattatc 1920
aaggacaagg acttcctgga caatgaggaa aacgaggaca ttctggaaga tatcgtgctg 1980
accctgacac tgtttgagga cagagagatg atcgaggaac ggctgaaaac ctatgcccac 2040
ctgttcgacg acaaagtgat gaagcagctg aagcggcgga gatacaccgg ctggggcagg 2100
ctgagccgga agctgatcaa cggcatccgg gacaagcagt ccggcaagac aatcctggat 2160
ttcctgaagt ccgacggctt cgccaacaga aacttcatgc agctgatcca cgacgacagc 2220
ctgaccttta aagaggacat ccagaaagcc caggtgtccg gccagggcga tagcctgcac 2280
gagcacattg ccaatctggc cggcagcccc gccattaaga agggcatcct gcagacagtg 2340
aaggtggtgg acgagctcgt gaaagtgatg ggccggcaca agcccgagaa catcgtgatc 2400
gaaatggcca gagagaacca gaccacccag aagggacaga agaacagccg cgagagaatg 2460
aagcggatcg aagagggcat caaagagctg ggcagccaga tcctgaaaga acaccccgtg 2520
gaaaacaccc agctgcagaa cgagaagctg tacctgtact acctgcagaa tgggcgggat 2580
atgtacgtgg accaggaact ggacatcaac cggctgtccg actacgatgt ggaccatatc 2640
gtgcctcaga gctttctgaa ggacgactcc atcgacaaca aggtgctgac cagaagcgac 2700
aagaaccggg gcaagagcga caacgtgccc tccgaagagg tcgtgaagaa gatgaagaac 2760
tactggcggc agctgctgaa cgccaagctg attacccaga gaaagttcga caatctgacc 2820
aaggccgaga gaggcggcct gagcgaactg gataaggccg gcttcatcaa gagacagctg 2880
gtggaaaccc ggcagatcac aaagcacgtg gcacagatcc tggactcccg gatgaacact 2940
aagtacgacg agaatgacaa gctgatccgg gaagtgaaag tgatcaccct gaagtccaag 3000
ctggtgtccg atttccggaa ggatttccag ttttacaaag tgcgcgagat caacaactac 3060
caccacgccc acgacgccta cctgaacgcc gtcgtgggaa ccgccctgat caaaaagtac 3120
cctaagctgg aaagcgagtt cgtgtacggc gactacaagg tgtacgacgt gcggaagatg 3180
atcgccaaga gcgagcagga aatcggcaag gctaccgcca agtacttctt ctacagcaac 3240
atcatgaact ttttcaagac cgagattacc ctggccaacg gcgagatccg gaagcggcct 3300
ctgatcgaga caaacggcga aaccggggag atcgtgtggg ataagggccg ggattttgcc 3360
accgtgcgga aagtgctgag catgccccaa gtgaatatcg tgaaaaagac cgaggtgcag 3420
acaggcggct tcagcaaaga gtctatcctg cccaagagga acagcgataa gctgatcgcc 3480
agaaagaagg actgggaccc taagaagtac ggcggcttcg acagccccac cgtggcctat 3540
tctgtgctgg tggtggccaa agtggaaaag ggcaagtcca agaaactgaa gagtgtgaaa 3600
gagctgctgg ggatcaccat catggaaaga agcagcttcg agaagaatcc catcgacttt 3660
ctggaagcca agggctacaa agaagtgaaa aaggacctga tcatcaagct gcctaagtac 3720
tccctgttcg agctggaaaa cggccggaag agaatgctgg cctctgccgg cgaactgcag 3780
aagggaaacg aactggccct gccctccaaa tatgtgaact tcctgtacct ggccagccac 3840
tatgagaagc tgaagggctc ccccgaggat aatgagcaga aacagctgtt tgtggaacag 3900
cacaagcact acctggacga gatcatcgag cagatcagcg agttctccaa gagagtgatc 3960
ctggccgacg ctaatctgga caaagtgctg tccgcctaca acaagcaccg ggataagccc 4020
atcagagagc aggccgagaa tatcatccac ctgtttaccc tgaccaatct gggagcccct 4080
gccgccttca agtactttga caccaccatc gaccggaaga ggtacaccag caccaaagag 4140
gtgctggacg ccaccctgat ccaccagagc atcaccggcc tgtacgagac acggatcgac 4200
ctgtctcagc tgggaggcga caaaaggccg gcggccacga aaaaggccgg ccaggcaaaa 4260
aagaaaaag 4269
<210> 7
<211> 1418
<212> DNA
<213> 人工序列(2 Ambystoma laterale x Ambystoma jeffersonianum)
<400> 7
gttaactggt tcccggtcgg catctactct attcctttgc cctcggacga gtgctggggc 60
gtcggtttcc actatcggcg agtacttcta cacagccatc ggtccagacg gccgcgcttc 120
tgcgggcgat ttgtgtacgc ccgacagtcc cggctccgga tcggacgatt gcgtcgcatc 180
gaccctgcgc ccaagctgca tcatcgaaat tgccgtcaac caagctctga tagagttggt 240
caagaccaat gcggagcata tacgcccgga ggcgcggcga tcctgcaagc tccggatgcc 300
tccgctcgaa gtagcgcgtc tgctgctcca tacaagccaa ccacggcctc cagaagagga 360
tgttggcgac ctcgtattgg gaatccccga acatcgcctc gctccagtca atgaccgctg 420
ttatgcggcc attgtccgtc aggacattgt tggagccgaa atccgcatgc acgaggtgcc 480
ggacttcggg gcagtcctcg gcccaaagca tcagctcatc gagagcctgc gcgacggacg 540
cactgacggt gtcgtccatc acagtttgcc agtgatacac atggggatca gcaatcgcgc 600
atatgaaatc acgccatgta gtgtattgac cgattccttg cggtccgaat gggccgaacc 660
cgctcgtctg gctaagatcg gccgcagcga tcgcatccat ggcctccgcg accggctgga 720
gaacagcggg cagttcggtt tcaggcaggt cttgcaacgt gacaccctgt gcacggcggg 780
agatgcaata ggtcaggctc tcgctgaact ccccaatgtc aagcacttcc ggaatcggga 840
gcgcggccga tgcaaagtgc cgataaacat aacgatcttt gtagaaacca tcggcgcagc 900
tatttacccg caggacatat ccacgccctc ctacatcgaa gctgaaagca cgagattctt 960
cgccctccga gagctgcatc aggtcggaga cgctgtcgaa cttttcgatc agaaacttct 1020
cgacagacgt cgcggtgagt tcaggctttt tcatttggat gcttgggtag aataggtaag 1080
tcagattgaa tctgaaataa agggaggaag ggcgaactta agaaggtatg accgggtcgt 1140
ccacttacct tgcttgacaa acgcaccaag ttatcgtgca ccaagcagca gatgataata 1200
atgtcctcgt tcctgtctgc taataagagt cacacttcga gcgccgccgc tactgctaca 1260
agtggggctg atctgaccag ttgcctaaat gaaccatctt gtcaaacgac acaaattttg 1320
tgctcaccgc ctggacgact aaaccaaaat aggcattcat tgttgacctc cactagctcc 1380
agccaagccc aaaaaatgct ccttcaatat cagttaac 1418
<210> 8
<211> 1179
<212> DNA
<213> 人工序列(2 Ambystoma laterale x Ambystoma jeffersonianum)
<400> 8
atgtcggcac caaggcattc cagtttaacg agtagctacg gcgaccgggc agcgggcgcg 60
acacacccgt tgacaaacta cctccttcgc ttaatggaac tcaaacaatc caacttgtgc 120
gtgtctgccg atgtacacag cgcacgggaa ctcttgtctc tggccgacaa ggtcggcccc 180
tcgatcgtcg tcctcaaaac gcactacgac ctcgtcatgg gctgggactt caaccctcaa 240
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gatcggaagt actgcgacat tggcagcacg gtgcagatgc agtatgttag tggaaccgcg 360
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gagacggagg acgagaatgc tggtgctctc ggcaacaacg ggcagaggaa gccctccgcc 600
gcgctggagg ccagggacat caacatgatg gcgccgccgc caccacctcg agacgccgat 660
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<210> 9
<211> 1524
<212> DNA
<213> 人工序列(2 Ambystoma laterale x Ambystoma jeffersonianum)
<400> 9
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cccgccatac caggtgcaag aggcggcggc gcccgtacac ctcgcctggg actcgctata 120
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gaacatcaac cctcgcgtgg ctcacaaccg ggtcacagcg ccagtggcgg cagcgagagc 300
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gataagatga gcttggagaa ggccaggacg cttgacgcag aggacctcga tgacgagggc 600
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ggaggtgccg tcacgaggtg caagctcaaa ggaggcaaga ctgtttttgc tctcaaggtg 720
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gacgacgcca aggggtcaaa gtga 1524
Claims (10)
1.一种拟茎点霉的原生质体制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
第一步，菌种的活化：从保存于试管中的PDA固体培养基上刮取菌丝接到含有50 mLPDA液体培养基的锥形瓶中，在28 ℃、180 rpm条件下培养两天，从液体培养基中吸取2 mL菌丝液接到新的含有50 mL PDA液体培养基的锥形瓶中，继续在28 ℃、180 rpm条件下培养36 h；
第二步：使用尼龙膜过滤菌丝液获得菌丝，然后用0.6 M的MgSO4将菌丝清洗干净，取1 g湿菌丝体于10 mL裂解液中孵育，孵育温度≥28℃，孵育时摇床转速≥80 rpm；
第三步：孵育≥8h后取出，3000 rpm-5000rpm先离心10 min，弃去上清液，用5 mL STC缓冲液重悬后得原生质体悬浊液，将悬浊液在3000 rpm-5000 rpm再离心10 min，用移液枪吸取顶部的原生质体于新的1.5 mL离心管中，稀释至108个·mL-1制得。
2.根据权利要求1所述拟茎点霉的原生质体制备方法，其特征在于：所述第一步中PDA液体培养基由土豆200g/L和葡萄糖20 g/L组成。
3.根据权利要求1所述拟茎点霉的原生质体制备方法，其特征在于：所述第二步中孵育温度为28℃，孵育时摇床转速80 rpm。
4.根据权利要求1所述拟茎点霉的原生质体制备方法，其特征在于：所述第二步中裂解液由20 mg 的Trichoderma、20 mg的Yatalase和0.8 M 无机盐离子定容至10 mL制得，所述无机盐离子是CaCl2, NaCl或MgCl2。
5.根据权利要求1所述拟茎点霉的原生质体制备方法，其特征在于：所述第三步中孵育时间为13 h，离心条件为先在3000 rpm下离心10min，弃去上清液，用5 mL STC缓冲液重悬后得原生质体悬浊液，将悬浊液在5000rpm再离心10 min。
6.根据权利要求1所述拟茎点霉的原生质体制备方法，其特征在于：所述第三步中STC缓冲液由山梨醇1.2 mol L-1、CaCl2 10 mM·L-1和pH 7.5的Tris·HCl 10 mM·L-1组成。
7.权利要求1所述制备方法制备的拟茎点霉的基因敲除方法，其特征在于包括以下步骤：
第一步：构建剪切元件和基因敲除表达框，所述剪切元件主要包括以下核心元件：来源于真菌的U6启动子、靶标基因的gRNA和终止子，所述剪切元件还包括以下核心元件：来源于真菌的ToxA启动子、Cas9基因及Nos终止子，基因敲除表达框包括以下核心元件：靶标基因ura上游同源臂、潮霉素抗性基因HygR和靶标基因ura下游同源臂；
第二步：将质粒转化进入原生质体的过程：制备PEG溶液和软琼脂再生培养基，取制备好的原生质体80 μL于新的1.5 mL离心管中，加入20 μL PEG溶液和5 μg质粒，用移液枪轻轻混匀，冰浴；冰浴30 min后加入900 μL PEG溶液，用移液枪轻轻混匀，室温条件下静置，热激；热激20 min后加入10 mL提前融化了的含有100 μg·mL-1潮霉素的再生培养基，混匀后倒入灭菌的平板，待培养基凝固后于28 ℃条件下倒置培养；敲除菌株在添加尿嘧啶的培养基上正常生长，而无尿嘧啶的培养基，敲除菌株不能生长；
第三步：基因敲除菌株的分子鉴定过程：倒置培养2-3天后挑选转化子单菌落提取基因组DNA，左右臂向外各延伸约100 bp后分别设计上下游引物，以转化子基因组DNA为模板扩增靶点处DNA片段，琼脂糖电泳鉴定；基因成功被敲除的菌株电泳条带比未被敲除的菌株或野生型菌株电泳条带大1.4 kb，将成功敲除的电泳条带切下测序，比对测序结果最终确定基因是否被成功敲除。
8.根据权利要求7所述拟茎点霉的基因敲除方法，其特征在于：所述靶标基因为ura基因和MAPK途径的关键基因mapk1，分别编码乳清酸脱氧核苷5'-磷酸脱羧酶和丝裂原激活蛋白激酶1。
9.根据权利要求7所述拟茎点霉的基因敲除方法，其特征在于：所述第二步中PEG溶液由PEG 4000（60% ）、CaCl2（50 mM·L-1）和Tris·HCl（50 mM·L-1，pH 7.5）组成，软琼脂再生培养基由土豆200 g·L-1、山梨醇182 g·L-1、尿苷1 g·L-1、尿嘧啶1 g·L-1和琼脂粉10g·L-1组成。
10.根据权利要求7所述拟茎点霉的基因敲除方法，其特征在于：所述第二步中待培养基凝固后于28 ℃条件下倒置培养2-3天得到阳性克隆。
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