CN101724573A - 一种高效表达几丁质酶编码基因和β-1,3-葡聚糖酶编码基因的木霉生防重组工程菌及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种可高效表达木霉来源几丁质酶和β-1，3-葡聚糖酶基因的木霉重组工程菌及其应用。本发明的重组菌株是通过土壤杆菌介导的含木霉来源几丁质酶编码基因chi42和β-1，3-葡聚糖酶编码基因glultr-2的T-DNA衍生载体转化具有植物病害生物防治功能的绿色木霉LTR-2获得的重组工程菌。重组菌可以在PDA培养基稳定表达几丁质酶编码基因chi42和β-1，3-葡聚糖酶编码基因glultr-2，盆栽实验表明重组工程菌对蔬菜灰霉病和小麦纹枯病具有比出发菌LTR-2，更有效的防治效果。

Description

一种高效表达几丁质酶编码基因和β-1，3-葡聚糖酶编码基因的木霉生防重组工程菌及其应用

技术领域：

本发明属于生物工程领域。具体涉及一种利用几丁质酶编码基因和β-1，3-葡聚糖酶编码基因构建木霉菌生防工程菌的方法及其应用。

背景技术：

几丁质是由N-乙酰-D-葡萄糖胺经(1-4)-β键连接的多聚体，是生物圈中含量丰富的多聚物之一。几丁质酶(裂解酶)存在于生物圈的各个角落，例如原生生物、细菌、真菌、植物、无脊椎动物及脊椎动物中，甚至包括人类。在许多生化过程中都包含有对几丁质的酶降解过程，例如自我分解过程，形态发生过程及营养吸收过程，在有机物之间，包括植物-真菌，昆虫-真菌，及真菌-真菌之间的互作中起着关键的作用。

在有效对抗R.solani的寄生作用中包括三种几丁质内切酶的表达：52kDa(CHIT52)，42kDa(CHIT42)和33kDa(CHIT33)，还有CHIT102中的N-乙酰葡糖胺酶的活性。相反，在无效对抗S.rolfsii的重寄生作用中，只有两种两种外切N-乙酰葡糖胺酶(CHIT102和CHIT73)的活性被检测到。Carsolio等在哈茨木霉IMI206040与丝核菌(R.solani)直接对峙分析中研究长约42kDa的几丁质内切酶的表达模式。结果发现CHIT42在拮抗过程中受到强烈诱导表达。在拮抗病原菌作用中哈茨木霉体内几丁质酶的表达是以特异而又精确的模式调控的，而且受特异性宿主的影响。

葡聚糖有α和β两种构象，它们都是D-葡萄糖的聚合物。α-葡聚糖和β-葡聚糖广泛存在于自然界中。葡聚糖酶降解的多聚体在自然界中以纤维素和半纤维素大量存在，其中α-1，4葡聚糖作为细胞多糖的一种基本储存模式——糖原广泛存在于除了卵菌以外的含有β-1，3-葡聚糖的真菌中。葡聚糖是真菌细胞壁的组成成分，同时也存在于胞外多糖中。

葡聚糖裂解酶广泛存在于高等植物、细菌、真菌和依靠它们生存的各种各样的寄主中。在高等植物中，葡聚糖裂解酶被认为是植物抵御病原真菌的防御系统之一(Mauch et al.，1988)。β-葡聚糖酶具有很多不同功能：细胞壁中葡聚糖的转移和饥饿状态下储存糖原；降解植物病原体的胼胝质；腐生生物的营养；包括致病机理和真菌寄生物的营养。葡聚糖酶在胞外产生或在壁间产生是高Km值、器官形成、进化发展的常见特征。另外，从绿木霉中分离出的β-1，3葡聚糖酶和β-1，4葡聚糖酶能破坏真菌细胞壁的完整及导致细胞质渗漏(Jeffries andYoung，1994)。其中，β-1，3葡聚糖是真菌细胞壁的重要成分。β-1，3葡聚糖酶(包括外切酶和内切酶)直接参与哈茨木霉菌与其寄主真菌之间的重寄生作用。Clarkson发现哈茨木霉的β-1，3葡聚糖酶有抑菌作用，β-1，3葡聚糖酶单独存在时不能在真菌细胞壁平板中产生透明水解圈，但是它能阻止病原真菌和其它的水解酶相结合。内切β-1，3葡聚糖酶的这种特殊诱导作用和裂解活性，使之被认为是木霉对抗一些病原真菌的拮抗酶。

木霉菌属于半知菌亚门，丝孢纲、丝孢目，粘孢菌类，普遍存在于土壤、植物根围、叶围及种子、球茎表面等，具有重要经济意义，是目前研究最多的植物病害生防真菌。关于木霉的生防机制有一种观点就是有生防作用的木霉能产生一些蛋白质酶类(如：几丁质酶、葡聚糖酶、蛋白酶)可抑制病原菌的生长。这些木霉菌种能降解真菌细胞壁，降解真菌细胞壁主要是由于几丁质酶，葡聚糖酶和蛋白酶活性。当生防木霉粘附并盘绕到植物病原菌后，寄生菌丝开始移动，露出溶解位点，通过溶解孔渗入宿主，木霉菌在侵入或穿透寄主菌丝细胞时，产生了几丁质酶、葡聚糖酶(包括β-1，3，β-1，4，β-1，6葡聚糖酶)、纤维素酶以及蛋白酶、脂酶等一系列水解酶类，来消解病原菌的细胞壁。它们大都由多糖和真菌细胞壁诱导，并受代谢降解物如高浓度葡萄糖的阻遏。在这些细胞壁降解酶中，几丁质酶和葡聚糖酶成为目前研究的热点，被公认为是影响生防真菌重寄生能力的重要因子。

Elad等(1984)，在使用木霉生防制剂防治白绢病菌(S.rolfsii)时发现，能攻击病原菌的哈茨木霉菌株比不能攻击的菌株分泌更多的β-1，3葡聚糖酶和几丁质酶。通过这些胞壁酶活性能极为有效地攻击病原菌的活体结构，当哈茨木霉菌丝入侵白绢病菌(S.rolfsii)菌核，并在其表面留下孔洞，这些菌核最终失去正常的形状，细胞浆外泄，从而达到防治效果。据Metcalf和Wilson报道，康宁木霉可抑制洋葱根部的白腐小核菌，并发现木霉的菌丝伸人洋葱根部的表皮及皮层后破坏内部病原菌的菌丝体，但对植物组织无害。其原因是康宁木霉产生了内、外几丁质酶。Woo等发现丧失了几丁质酶基因(ech42)活性的哈茨木霉，对大豆叶片灰霉病的抗性明显下降。Kapat等发现通过增加哈茨木霉β-1，4葡聚糖酶基因拷贝数会使突变株的生防能力提高。

但是，上述关于β-1，3葡聚糖酶和几丁质酶的报道内容，仅限于探讨木霉作为对抗一些病原真菌的拮抗酶的机理探讨和试验测试阶段，只是确认了原始木霉菌具有防治真菌的功能，而原始木霉菌因其中功能基因含量不稳定，生防效果较差。目前尚未发现有关如何稳定和提高木霉中几丁质酶和β-葡聚糖酶基因、如何获得较高生防效果的木霉生防重组工程菌的文献报道。

发明内容：

为了克服现有技术的局限性，本发明人认为通过基因工程的方法，重组木霉生防工程菌，提高和稳定生防木霉几丁质酶和β-葡聚糖酶基因，将是提高其生防效果的一种有效途径。

本发明的目的是提供一种同时含有几丁质酶编码基因和β-1，3-葡聚糖酶编码基因的木霉生防重组工程菌，该重组工程菌是通过土壤杆菌介导的T-DNA转化，在原始生防木霉菌中同时引入几丁质酶编码基因和β-1，3-葡聚糖酶编码基因，实现这两种基因在重组工程菌中同时、稳定的表达，使其发挥协同作用，提高了其拮抗病原菌的能力。

本发明所述的木霉生防重组工程菌，是一种可高效表达木霉来源几丁质酶和β-1，3-葡聚糖酶基因的木霉重组工程菌，是将带有几丁质酶和β-1，3-葡聚糖酶基因的表达元件转化重组到木霉菌染色体中，使重组工程菌染色体中同时含有几丁质酶编码基因chi42和β-1，3-葡聚糖酶编码基因glultr-2。

本发明提供的用于转化的木霉菌可以是哈茨木霉(Trichoderma harzianum)、绿色木霉(Trichoderma viride)、长枝木霉(Trichoderima longibrachiatum)、康宁木霉(Trichoderma.koningii)或黄绿木霉(Trichoderma aureoviride)。

其中，优选哈茨木霉(Trichoderma harzianum)LTR-2。对番茄灰霉病具有较好生防效果。

本发明选用几丁质酶编码基因chi42，来源于本申请人实验室分离的哈茨木霉，Genbank登陆号为EF635427。

本发明选用的β-1，3葡聚糖酶编码基因glultr-2来源于本实验室分离的哈茨木霉，Genbank登陆号为EF176582。

本发明提供了通过土壤杆菌介导的T-DNA转化所需的一系列质粒载体，包括p1300-chi42、p1302-chi42和p1302-chi42-glultr-2。

本发明木霉生防重组工程菌是通过土壤杆菌介导的T-DNA转化方法(Agrobacteriumtumefaciens-mediated transformation，ATMT)获得的，具体包括木霉几丁质酶Chi42和β-1，3葡聚糖酶编码基因glultr-2的克隆，质粒1300-chi42、p1302-chi42和p1302-chi42-glultr-2的构建，通过土壤杆菌介导T-DNA插入突变构建重组木霉工程菌及工业化培养发酵生产重组工程菌生防产品。

本发明所述的木霉生防重组工程菌中的几丁质酶编码基因和β-1，3-葡聚糖酶编码基因，是通过利用p1300-chi42、p1302-chi42或p1302-chi42-glultr-2中所含CAMV35启动子和polyA site构建的表达框实现表达。其中由p1302-chi42-glultr-2载体通过土壤杆菌介导的T-DNA转化法转化木霉菌LTR-2后获得菌株LTR-2/CG23是对番茄灰霉病生防效果最好的菌株。能稳定表达几丁质酶编码基因chi42和β-1，3-葡聚糖酶编码基因glultr-2。

本发明所述的木霉生防重组工程菌的生产方法是一种工业规模化生产重组工程菌的生产方法，其特征是将通过土壤杆菌介导的T-DNA转化法获得的重组菌株LTR-2/CG23进行种子培养、工业规模化液相发酵或液-固联合发酵，制备液体发酵产品或固体发酵产品。

上述培养发酵过程中可使用PDA培养基，其配方和制备方法如下：

将200g马铃薯去皮，切成小块，于锅中加水1000mL煮沸半个小时，用双层纱布过滤，取其滤液加葡萄糖15g，琼脂15g；去离子水定容至1000mL

本发明所述工业化发酵生产的木霉生防重组工程菌可以单独使用，也可以与其他生物生防成分或植物生长激素或诱导因子及微量元素和肥料等复合使用；可添加相应的助剂和其他辅料制备多种单一或复合生防制剂，例如：水分散粒剂、可分散液剂、混悬剂、颗粒剂、微粒剂、微胶囊等。

应用本发明所述工业化发酵生产的木霉生防重组工程菌可以制成的多种生防制剂，用于蔬菜、粮食、果树、经济作物以及其他植物真菌病害的生物防治，例如用于蕃茄、黄瓜等蔬菜霜霉病、白粉病，烟草青枯病、小麦纹枯病、赤霉病等植物病害的防治。

本发明的稳定表达几丁质酶编码基因chi42和β-1，3-葡聚糖酶编码基因glultr-2重组工程菌株也可用于发酵生产几丁质酶、葡聚糖酶等酶制剂等方面。

本发明提供了液固联合发酵法大规模发酵生产重组工程菌株LTR-2/CG23，并提供了利用重组工程菌株LTR-2/CG23发酵产生的分生孢子制备木霉水分散性微粒剂的制备方法。

附图说明：

图1含几丁质酶编码基因chi42和β-1，3葡聚糖酶编码基因glultr-2表达框质粒载体构建示意图

图2含几丁质酶编码基因chi42和β-1，3葡聚糖酶编码基因glultr-2表达框质粒载体的酶切分析电泳图

1质粒p1302-chi42-glultr-2的SpeI酶切结果

2质粒p1302-chi42-glultr-2的EcoRI酶切结果

3质粒pCAMBIA1302的SpeI酶切结果

4质粒pCAMBIA1302的EcoRI酶切结果

M 1kbDNAmarker(10000，8000，7000，6000，5000，4000，3000，2000，1000)bp

图3重组工程菌株的Southern鉴定分析结果

1-5分别是使用hph基因为探针对重组工程菌株LTR-2/CG3、LTR-2/CG11、LTR-2/CG23、LTR-2/CG26、LTR-2/CG29基因组DNA经EcoRI酶切的Southern bloting结果

6使用hph基因为探针对出发菌LTR-2基因组DNA经EcoRI酶切的Southern bloting结果

具体实施方式：

下面用实施例对本发明进行详细说明，实施例不对本发明构成任何限制。

实施例1：木霉几丁质酶Chi42和β-1，3葡聚糖酶编码基因glultr-2的克隆

将绿色木霉LTR-2分生孢子接种在在PDB培养基中(配方为：马铃薯200g；葡萄糖15g；去离子水定容至1000mL，将马铃薯去皮，切成小块，于锅中加水1000mL煮沸半个小时，用双层纱布过滤，取其滤液加糖，并加水补足1000mL)，培养48-72h，提取基因组DNA，电泳方法检查DNA纯度和定量。以基因组DNA为模板，使用上游引物Chi42XhoI-F：5’GCCTCGAGATGTTGGGCTTCCTCGG 3’(划线部分为XhoI酶切位点)下游引物Chi42XhoI-R：5’GCCTCGAGCTTGTCGAACAAGCTTCTAGTTGAGACC 3’(划线部分为XhoI酶切位点)进行PCR扩增。在50μL反应体系中分别加入10×Taq DNA聚合酶buffer 5μL，上下游引物至20μM，dNTP 100μM，MgCl2 1mM，模板DNA 10ng/μL，0.5μL rTaqDNA聚合酶，加灭菌的去离子水补足到50μL，充分混匀并离心。放入PCR仪(GeneAmp PCR System9600)中，94℃充分变性min；30个循环：94℃变性1min，47℃退火1.5min，72℃延伸2min；72℃延伸10min。得到约1.5kb的DNA片段，琼脂糖电泳后该片段凝胶回收纯化，与载体pMD18-T直接连接，转化大肠杆菌DH5α，在含IPTG和X-gal的筛选培养基平板上挑选白色菌落，得到阳性克隆，所携带的质粒命名为：pMChi42。重组质粒pMChi42送上海生工生物技术公司进行测序。即得到木霉几丁质酶chi42。

将绿色木霉LTR-2分生孢子接种在在PDB培养基中，培养48-72h，提取基因组DNA，电泳方法检查DNA纯度和定量。以基因组DNA为模板，使用上游引物glultr-2F：CGGAATTCATGTTGAAGCTCACGGCG(划线部分为EcoR I酶切位点)glultr-2R：CGGAATTCGTATAACGGGCAACGTCACCACCTCC(划线部分为EcoR I酶切位点)进行PCR扩增。50μL PCR反应体系为：10×Taq DNA buffer 5μL，上下游引物20μM，dNTP 100μM，MgCl₂1mM，模板DNA 10ng/μL，0.5μL rTaqDNA聚合酶，ddH₂O补足到50μL。反应条件为：94℃预变性5min；94℃变性1min，58℃退火1.5min，72℃延伸2min，30个循环；72℃延伸10min。回收PCR产物并连接pMD18-T Vector，转化E.coli Top10F′，获得重组质粒pMD18-T-glultr-2，测序鉴定。测序工作由上海生工公司完成。即得到木霉β-1，3葡聚糖酶编码基因glultr-2。

实施例2：p1302-chi42的构建

利用pCAMBIA1300的潮霉素基因hph的CaMV35S启动子和终止子作为42kDa几丁质酶基因启动子和终止子，然后插入到表达载体pCAMBIA1302中。构建获得p1302-chi42。具体方法如下：

首先是质粒pCAMBIA1300和几丁质酶基因的连接，利用42kDa几丁质酶基因的PCR扩增产物两端含有XhoI酶切位点，PCR扩增产物直接经XhoI酶切后与经XhoI酶切后去磷酸化pCAMBIA1300载体用T4连接酶连接后转化大肠杆菌。由于单酶切存在正反向的问题，因此我们采用PCR和SacI酶切鉴定的方法。正向连接，两酶切位点之间序列约有2.4kb，反向连接约有1.1kb，用SacI酶切PCR筛选出的阳性克隆，得了一条2.4kb左右的条带，可以确定其为正向连接质粒，连接产物命名为p1300-chi42。利用载体中35S启动子和35S-polyA终止子序列设计另外一对引物，引入酶切位点EcoR I，上游引物35SPEcoRI-F 5’GCGAATTCCGACACTCTCGTCTACTCC-3’下游引物35PolyEcoRI-R 5’CGAATTCTGTACTGAATTAACGCCGAAT-3’，从p1300-chi42中扩增与35S启动子和35S-polyA终止子正向连接的几丁质酶基因，退火温度为60℃。琼脂糖凝胶电泳回收PCR产物，包括35S启动子和35S-polyA终止子，获得几丁质酶基因表达框大小约为2.4kb。EcoRI酶切42kDa几丁质酶基因片段和经去磷酸化处理后的EcoRI酶切的pCAMBIA1302载体连接后转化大肠杆菌。通过菌落PCR筛选阳性克隆，提取质粒，利用EcoRI酶切，酶切后，出现一条约为2.4kb的条带，确定此为p1302-chi42重组质粒。

实施例3：p1302-chi42-glultr-2的构建

以重组质粒pMD18-T-glultr-2为模板，进行PCR扩增。50μL PCR反应体系为：10×pyrobestbufferII 5μL，上下游引物20μM，dNTP 100μM，MgCl2 1mM，模板1μL，pyrobest DNA Polymerase0.5μL，ddH₂O补足到50μL。引物序列如下

gluEZF5′CTCTTGACCATGGTAGATCTGACTAGTATGTTGAAGCTCACGGCGCTCG

(划线部分为与经SpeI线性化pCAMBIA1302载体一端相同的核酸序列)

gluEZR5′GTGAAAAGTTCTTCTCCTTTACTAGTAGTAGTATAACGGGCAACGTCACCACCTCC(划线部分为与经SpeI线性化pCAMBIA1302载体另一端相同的核酸序列)反应条件为：94℃预变性5min；94℃变性1min，58℃退火1.5min，72℃延伸2min，30个循环；72℃延伸10min。回收PCR产物并利用

重组克隆试剂盒(南京金瑞斯)与SpeI线性化p1302-chi42载体反应。反应条件如下：

线性化p1302-chi42载体(100-200ng/μl)6μl，纯化的glultr-2PCR产物(100-200ng/μl)6μl，10X CloneEZ Buffer 2μl，CloneEZ Enzyme 2μl，去离子水补足20μl；将其混合物在25℃保持30分钟，之后在冰上保持5分钟，转化大肠杆菌。通过菌落PCR筛选阳性克隆，提取质粒，利用SpeI酶切检测，酶切后，出现一条约为2.4kb的条带，确定此为p1302-chi42-glultr-2重组质粒。

实施例4：通过土壤杆菌介导T-DNA插入突变构建重组木霉工程菌

利用土壤杆菌EHA105介导的T-DNA法转化哈茨木霉LTR-2，获得重组木霉工程菌，具体步骤如下：

挑取EHA105的单菌落(含p1302-chi42-glultr-2质粒)在LB培养基中28℃、200rpm培养过夜后，将培养物用IM(诱导培养基)液体培养基稀释至OD₆₆₀为0.15，在AS含量为200μM的IM液体培养基中诱导培养6h，至OD₆₆₀值为0.6-0.7时，与10⁶个/ml的木霉分生孢子液等体积混匀，吸取0.4ml的混合菌液涂布在pH为6.0、AS浓度为200μM共培养培养基的平板上，28℃条件下培养48h，然后在IM培养基平板上覆盖一层含100μg/mL潮霉素的PDA培养基(含有50μg/mL的四环素以杀死根癌土壤杆菌)。继续培养4-7d，将长出的转化子挑到含潮霉素培养基上进行筛选培养。将抗性菌转接到含药培养基上继续培养，提取基因组DNA，通过PCR扩增和Southern杂交来鉴定筛选疑似转化子以及插入T-DNA的拷贝数。

以重组木霉菌DNA为模板，以HPH-F：5’CCGGTTTCCACTATCGGCGA3’和HPH-R：5’CAAAGCCTGAACTCACCGC3’为引物PCR扩增潮霉素抗性基因hph，扩增的片断大小约1kb左右。扩增产物经琼脂糖凝胶电泳检测，结果显示以重组木霉菌DNA为模板可以扩增出大小为1kb左右的片段，而未转化的出发菌株基因组DNA为模板没有条带出现，这表明hph基因插入到重组木霉菌染色体基因组内。绿色木霉LTR-2及其重组工程菌基因组DNA经过EcoR I酶切之后，然后电泳、转膜与以重组质粒p1302-chi42-glultr-2质粒为模板，HPH-F和HPH-R作为引物，扩增潮霉素抗性基因hph制备生物素标记探针杂交和BCIP/NBT显色，杂交结果显示在经过EcoR I酶切的重组工程菌基因组DNA中出现了杂交带，而LTR-2中没有出现，这证明了hph基因在重组工程菌的存在。同时证明T-DNA随机插入到染色体基因组中，并进一步表明含有几丁质酶编码基因chi42和β-1，3葡聚糖酶编码基因glultr-2表达框的p1302-chi42-glultr-2整合到木霉LTR-2基因组中。

实施例5：重组木霉菌的几丁质酶和β-1，3葡聚糖酶活性测定

将获得的转化木霉菌株进行液体发酵，发酵培养基为PDB培养基，发酵96h后，抽滤后取上清测定菌液中几丁质酶和β-1，3葡聚糖酶活性。测定方法如下：

几丁质酶活性测定：取4支试管，分别加入0.5mL滤液(即粗酶液)和0.5mL几丁质胶体，其中三支试管于40℃水浴60min，另外一支于4℃放置，作为对照；水浴6Omin后，在样品和对照中均加入0.5mLDNS，沸水浴10min；在样品中加入4.5mL蒸馏水，对照中加入13mL蒸馏水，离心取上清于540nm测定吸光度。定义1min内产生1μmol还原糖定为1个酶活力单位(U)。

β-1，3葡聚糖酶活性测定：采用砷钼酸法测定β-1，3-葡聚糖酶的活性.以昆布多糖为底物，测定时，取1.0ml酶液，加0.4ml的1mg/ml昆布多糖柠檬酸-磷酸氢二钠缓冲液溶液(pH5.6)，37℃水浴15min后，加入0.5ml铜试剂，100℃沸水浴10min，置冰水浴中迅速冷却。加入0.5ml砷钼酸试剂，摇匀后呈蓝色。加3ml蒸馏水，混匀后于660nm下比色测透光率。重复测定三次，取平均值。在0～1300μg/ml之间设置葡萄糖浓度梯度，在与样品同样的条件下测定透光率。根据葡萄糖标准曲线计算酶活。用蒸馏水代替酶液做对照。实际酶活是测量值减去对照值。定义1min内产生1μg葡萄糖的酶量定为1个酶单位(U)。

通过活性测定我们筛选获得了可在PDB培养基稳定表达几丁质酶编码基因chi42和β-1，3葡聚糖酶编码基因glultr-2的重组工程菌株LTR-2/CG23，其发酵液中几丁质酶和β-1，3葡聚糖酶活性分别为0.761U/mL和310U/mL。

实施例6：重组工程菌株LTR-2/CG23液固发酵及其分生孢子的水分散性微粒剂制备方法

刮取PDA培养基中的重组工程菌株LTR-2/CG23分生孢子，配制成10⁷个/mL的孢子悬液，按1％接种于装液量为200mL的500mL三角瓶中，液体培养基配方为：玉米粉2％，葡萄糖1％，豆饼粉1％，磷酸氢二钾0.2％，磷酸二氢钾0.3％，碳酸钙1％，pH6.0，150转/分，25-28℃条件下培养24-48h。然后，按30％接种于固体培养基中，固体培养基配方为：麸皮∶玉米粉∶稻壳＝7∶2∶1，含硫酸亚铁100ppM，含水量70％。在培养温度25-28℃，湿度30-40％条件下，发酵72-96h至固体发酵培养料变成绿色即可收获，作为有效杀菌成分使用。

将固体发酵后长满重组工程菌株LTR-2/CG23分生孢子的固体发酵培养料，添加相应的辅料，混合均匀，在35-40℃下干燥，制成水分散性微粒剂。

所说的辅料包括具有分散剂，崩解剂、防脱水、防紫外线、稳定剂、乳化剂、润湿剂、营养物质、诱导剂、黏结剂功能的多种添加剂。

本发明人优选的水分散性微粒剂具体组分及重量份数如下：

分生孢子(10⁸cfu/g)20.0份

淀粉或玉米粉      80～85份

SDS               2.5份

几丁质            0.3份

黄原胶            1.0份

聚黄腐酸钠        0.1份

乙二醇            1.0份

上述重组菌生防制剂通过拌种或作物生长期间通过穴施、混土、灌根等方式，可以直接用于防治蕃茄灰霉病、小麦纹枯病等植物真菌病害。盆栽实验表明重组工程菌对蕃茄灰霉病和小麦纹枯病具有比出发菌LTR-2有更显著的防治效果。

Claims (10)

1.一种可高效表达木霉来源几丁质酶chi42和β-1，3-葡聚糖酶基因的木霉重组工程菌，其特征在于通过将带有几丁质酶和β-1，3-葡聚糖酶基因的表达元件转化重组到木霉菌染色体中，获得的同时含有几丁质酶编码基因chi42和β-1，3-葡聚糖酶编码基因glultr-2的重组工程菌。

2.如权利要求1种所述的重组工程菌，其特征在于用于转化重组的木霉菌可以是哈茨木霉(Trichoderma harzianum)、绿色木霉(Trichoderma viride)、长枝木霉(Trichoderimalongibrachiatum)、康宁木霉(Trichoderma.koningii)或黄绿木霉(Trichoderma aureoviride)。

3.如权利要求1所述的重组工程菌，其特征在于所述的几丁质酶编码基因chi42和β-1，3-葡聚糖酶编码基因在Genbank序列号分别为EF635427和EF176582。

4.如权利要求1所述的重组工程菌的制备方法，其特征在于通过土壤杆菌介导的T-DNA转化方法制备，具体步骤包括：木霉几丁质酶Chi42和β-1，3葡聚糖酶编码基因glultr-2的克隆，质粒p1302-chi42和p1302-chi42-glultr-2的构建，通过土壤杆菌介导T-DNA插入突变构建重组木霉工程菌及工业化培养发酵生产重组工程菌生防产品。

5.如权利要求4所述的重组工程菌的制备方法，其特征在组工程菌中的几丁质酶编码基因和β-1，3-葡聚糖酶编码基因，是通过利用p1300-chi42、p1302-chi42或p1302-chi42-glultr-2中所含CAMV35启动子和polyA site构建的表达框实现表达。其中由p1302-chi42-glultr-2载体通过土壤杆菌介导的T-DNA转化法转化木霉菌LTR-2后，获得菌株LTR-2/CG23。

6.如权利要求4所述的重组工程菌的制备方法，其特征在于所说的发酵生产方法是利用液-固联合发酵法。

7.如权利要求1所述的重组工程菌的应用，其特征在于所说的重组工程菌可以单独或与其他组分复合制备生防制剂。

8.如权利要求1或7所述的重组工程菌的应用，其特征在于应用所说的重组工程菌为有效杀菌成分制备用于防治植物真菌病害的水分散性微粒剂。

9.如权利要求1或7所述的重组工程菌的应用，其特征在于所说的重组工程菌生防制剂用于蔬菜、粮食、果树、经济作物以及其他植物真菌病害的生物防治。

10.如权利要求1所述的重组工程菌的应用，其特征在于所说的重组工程菌用于发酵生产几丁质酶和/或葡聚糖酶。

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