CN102517281B - 几丁质酶的四膜虫表达载体及其在表达几丁质酶中的应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种几丁质酶的四膜虫表达载体及其在表达几丁质酶中的应用。本发明提供了一种表达盒，包括序列1自5’末端第9至1126位核苷酸所示HSP70-2基因启动子、序列2所示几丁质酶的编码基因和序列1自5’末端第3835至4312位核苷酸所示HSP70-1基因终止信号。本发明还提供了含有所述表达盒的重组质粒。该重组质粒电转到四膜虫后，在巴龙霉素药物筛选作用下，能替换掉四膜虫体内原有的大部分rDNA，使外源基因在四膜虫体内大量倍增，实现目标基因的遗传转化，在热激条件下，HSP70-2强启动子启动CBD3基因的高效表达，而且表达的几丁质酶具有生物活性(能水解几丁质)。综上所述，本发明具有广泛的应用前景。

Description

几丁质酶的四膜虫表达载体及其在表达几丁质酶中的应用

技术领域

本发明涉及一种几丁质酶的四膜虫表达载体及其在表达几丁质酶中的应用。

背景技术

几丁质(Chitin)又称甲壳素或壳多糖，是以N-乙酰-D-氨基葡萄糖(GlcNAc)为单体，通过β-1，4糖苷键连接而成的生物多聚体，是自然界中除纤维素外储量最大的生物多聚糖，每年生物合成量达100亿吨。几丁质至今已陆续在微生物、植物、动物中发现，尤其是在真菌细胞壁、节肢动物外骨骼、甲壳类动物的外壳中，几丁质维系其稳定的结构物质，是绝大部分真菌细胞壁的结构物质，占细胞壁干重的40％-60％。

几丁质具有良好的生物相容性、生物降解性，在生物化工、食品、环保、农药等各种领域中有着广泛的应用前景。几丁质同时也具有抗菌、降胆固醇和抗肿瘤的活性。几丁质及相关材料也被应用于污水处理、药物输送、伤口的治愈以及作日常的膳食纤维。但因为分子量大、晶体结构紧密、不溶于水和普通溶剂，限制了几丁质的应用。目前一般用化学降解的方法来制取几丁质的降解产物，但该方法造成较严重的环境污染，而用几丁质酶降解法能克服这个缺点，而且能控制降解的程度。

广义的几丁质酶是指所有与几丁质降解有关的酶，除了狭义的几丁质酶，还包括脱乙酰酶、壳聚糖酶、几丁寡糖酶、几丁二糖酶等。狭义的几丁质酶是指催化水解至少含有一个N2乙酰葡萄糖胺基团糖苷键的酶，包括几丁内切酶和几丁外切酶。几丁质酶(Chitinases)广泛的存在于病毒、细菌、真菌、昆虫、高等植物和动物中，并且发挥着作不同的作用。从微生物中分离筛选几丁质酶产生菌的报道最近越来越多，绝大多数的细菌性几丁质酶属于第18家族，其主要功能是分解周围环境中的几丁质，以满足其自身对营养的需求，而对真菌的抑制能力较弱或无。植物产生的几丁质酶大部分为第19族糖基化水解酶类，其功能主要是抑制病原真菌的生长，进行自我防御。

现有的表达系统很多。动物细胞表达系统因成本高，使其应用受到限制。常用的大肠杆菌表达系统和酵母表达系统中，大肠杆菌表达系统虽然具有外源基因表达水平高等优点，但是因其缺乏真核生物转录后加工及翻译后加工等功能，其表达的产物往往活性不高或是无活性等，特别是用其表达真核蛋白时。酵母表达系统与动物细胞一样具有真核生物转录、翻译后的多种加工过程，能够表达出多种具有活性的外源蛋白而备受关注，但也存在着明显的局限，如以酿酒酵母为主体的表达系统中缺乏强有力的启动子、分泌效率差、质粒不稳定、难以达到很高发酵密度、只能分泌少量蛋白、表达的蛋白质容易降解、其翻译后加工与高等真核生物有所不同等。

四膜虫(Tetrahymena)隶属于原生动物亚门、纤毛亚门、寡膜纲、膜口目、四膜科属，是单细胞真核生物。

发明内容

本发明的目的是提供一种几丁质酶的四膜虫表达载体及其在表达几丁质酶中的应用。

本发明提供的DNA片段(几丁质酶的编码基因的表达盒)，自5’至3’方向依次包括HSP70-2基因启动子、几丁质酶的编码基因和HSP70-1基因终止信号；所述HSP70-2基因启动子如序列表的序列1自5’末端第9至1126位核苷酸所示；所述HSP70-1基因终止信号如序列表的序列1自5’末端第3835至4304位核苷酸所示；所述几丁质酶如序列表的序列2所示。四膜虫的HSP70-2基因启动子能高效启动几丁质酶的编码基因(CBD3基因)的表达。

所述几丁质酶的编码基因具体可如序列表的序列1自5’末端第1142至3820位核苷酸所示。

所述DNA片段具体可如序列表的序列1自5’末端第9至4304位核苷酸所示。

含有所述DNA片段的重组表达载体、转基因细胞系或重组菌均属于本发明的保护范围。

可用现有的表达载体构建含有所述基因的重组表达载体。所述表达载体还可包含外源基因的3’端非翻译区域，即包含聚腺苷酸信号和任何其它参与mRNA加工或基因表达的DNA片段。所述聚腺苷酸信号可引导聚腺苷酸加入到mRNA前体的3’端。使用所述基因构建重组表达载体时，在其转录起始核苷酸前可加上任何一种增强型启动子或组成型启动子，它们可单独使用或与其它的启动子结合使用；此外，使用本发明的基因构建重组表达载体时，还可使用增强子，包括翻译增强子或转录增强子，这些增强子区域可以是ATG起始密码子或邻接区域起始密码子等，但必需与编码序列的阅读框相同，以保证整个序列的正确翻译。所述翻译控制信号和起始密码子的来源是广泛的，可以是天然的，也可以是合成的。翻译起始区域可以来自转录起始区域或结构基因。为了便于鉴定及筛选，可对所用表达载体进行加工，如加入编码可产生颜色变化的酶或发光化合物的基因、具有抗性的抗生素标记物或是抗化学试剂标记基因等。

所述重组表达载体具体可为在质粒pD5H8的多克隆位点插入所述DNA片段得到的重组质粒(几丁质酶的四膜虫rDNA表达载体)。该重组质粒电转到四膜虫后，在巴龙霉素药物筛选作用下，能替换掉四膜虫体内原有的大部分rDNA，使外源基因在四膜虫体内大量倍增，实现目标基因的遗传转化，在热激条件下(39℃热激诱导1小时)，HSP70-2强启动子启动CBD3基因的高效表达，而且表达的几丁质酶具有生物活性(能水解几丁质)。

所述转基因细胞系具体可为将所述重组质粒导入四膜虫得到的转基因四膜虫。

所述转基因四膜虫具体可通过如下方法得到：将分别饥饿处理18-24小时的嗜热四膜虫B2086株系和嗜热四膜虫CU428株系按等数量混合结合10小时后与所述重组质粒混匀，进行电击转化，得到表达所述几丁质酶的转基因四膜虫。

所述电击转化的具体参数为300V，25μF，50Ω。

所述重组表达载体或所述转基因四膜虫可用于生产几丁质酶。

本发明还保护一种制备几丁质酶的方法，是培养所述转基因四膜虫，使所述转基因四膜虫表达几丁质酶。所述方法中还包括热激处理的步骤，具体可为39℃热激1小时。所述方法具体可包括如下步骤：将所述转基因四膜虫在SPP培养基中培养至细胞密度达2×10⁵个/ml，然后39℃热激1小时，收集细胞并超声波破碎(超声破碎的具体参数为：Φ2探头，功率200W，破碎10s、间歇30s，共超声破碎5min)，过滤并收集滤液，即为含有几丁质酶的溶液。

本发明提供的制备几丁质酶的方法，具有如下优点：

(1)四膜虫广泛分布于全球各地的淡水环境中，以摄取水中的细菌与其他有机质维生，尚未发现对造成人体疾病或对人类健康造成危害，以四膜虫为表达系统，安全性可靠。

(2)嗜热四膜虫作为真核生物，具有原核大肠杆菌表达系统所缺乏的真核生物转录后加工及翻译后加工等功能。

(3)与其它细胞系(如哺乳动物体细胞)相比，四膜虫为单细胞生物，作为第一种实现细胞同步化的真核生物可以进行无菌纯培养，培养更简单、快速和经济，操作精确度和可控制性强；实验室中，四膜虫营养生长快速(2-3小时一代)；同时四膜虫生活周期短且具备真核生物基本生命过程，并且不具有类似于酵母的复杂胞壁结构，却含有可观的细胞膜转运蛋白系统；四膜虫中表达蛋白只有简单的N-糖基化，不存在如酵母中丰富的甘露糖残基修饰，植物中丰富的木糖残基修饰等非哺乳动物中的修饰类型，其独特的生物学使其能够作为理想的表达系统。

(4)只需将含有外源蛋白编码基因的四膜虫表达载体经电穿孔法转染到四膜虫体内即可。

综上所述，本发明具有广泛的应用前景。

附图说明

图1为质粒pD5H8的结构示意图。

图2为重组质粒pD5H8-CBD3的琼脂糖凝胶电泳图。

图3为重组质粒pD5H8-CBD3的结构示意图。

图4为转基因四膜虫的PCR鉴定电泳图。

图5为葡萄糖标准曲线。

具体实施方式

以下的实施例便于更好地理解本发明，但并不限定本发明。下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的试验材料，如无特殊说明，均为自常规生化试剂商店购买得到的。以下实施例中的定量试验，均设置三次重复实验，结果取平均值。实施例中采用Beckman库尔特细胞计数仪计算细胞密度。实施例中均采用水平转子离心机(湘仪TDZ5-WS多管架自动平衡离心机)进行四膜虫细胞的离心。实施例中所用的Tris缓冲液为10mM、pH7.5的Tris缓冲液。实施例中所用的Hepes缓冲液为10mM、pH7.5的Hepes缓冲液(Sigma公司产品)。四膜虫中密码子TAA、TAG非终止子，均编码谷氨酰胺。

质粒pD5H8(结构示意图见图1)：嗜热四膜虫的rDNA载体；参考文献：Gaertig J，Gorovsky MA.Efficient mass transformation of Tetrahymena thermophila byelectroporation of conjugants.Proc Natl Acad Sci USA.1992，89(19)：9196-9200。

嗜热四膜虫(Tetrahymena thermophila)B2086株系和嗜热四膜虫(Tetrahymenathermophila)CU428株系：参考文献：Hamilton与Orias(Hamilton EP，Orias E.Genetic crosses：setting up crosses，testing progeny，and isolating phenotypicassortants.Method Cell Biol：Tetrahymena thermophila.Academicpress.2000，vol 62：219-228)。

SPP培养基配方参考Orias等(Orias E，Hamilton EP，Orias JD.Tetrahymena asa laboratory organism：useful strains，cell culture，and cell line maintenance.Method Cell Biol：Tetrahymena thermophila.Academic press.2000.vol 62：194.。SPP培养基由溶质和溶剂组成；溶剂为水；溶质及其在SPP培养基中的浓度如下：1％(质量比)Proteose peptore(Difco公司产品)、0.1％(质量比)yeast extract(Oxoid公司产品)、0.2％(质量比)glucose(分析纯，广州化学试剂厂产品)、0.003％Ferriccitrate(Sigma公司产品)。

电穿孔技术方法参考Gaertig J等(Gaertig J，Gorovsky MA.Gene transfer byelectroporation in Tetrahymena.Methods Mol Biol.1995；47：331-48；J Gaertig，L Gu，B Hai，and M A Gorovsky.High frequency vector-mediated transformationand gene replacement in Tetrahymena.Nucleic Acids Res.1994 December 11；22(24)：5391-5398.)。

四膜虫细胞的固定、计数方法参考章宗涉、黄祥飞编著的《淡水浮游生物研究方法》(北京：科学出版社。1991：334-339。)。

实施例1、重组表达载体的构建

1、制备序列表的序列1所示的DNA片段(4312bp)，用限制性内切酶Not I酶切并回收酶切产物。

序列表的序列1所示的DNA片段中，自5’末端第1至8位核苷酸为Not I酶切识别序列、第9至1126位核苷酸为HSP70-2基因启动子(HSP70-25’UTR)、第1142至3820位核苷酸为几丁质酶的编码基因(CBD3基因)、第3835至4304位核苷酸为HSP70-1基因终止信号(HSP70-13’UTR)、第4305至4312位核苷酸为Not I酶切识别序列。

序列表的序列1所示的DNA片段可以人工合成。

序列表的序列1所示的DNA片段也可以按如下方法制备：

(1)构建重组质粒T-HSP702-HGFP

①以质粒Pet23a-hgfp(湖北大学马立新教授惠赠)为模板，用hgfp-F和hgfp-R组成的引物对PCR扩增，回收PCR扩增产物并用限制性内切酶Bgl II和Xhol I双酶切，回收约1.2kb的HGFP片段。

hgfp-F：5’-CGGAAGATCTACCAAACCTGACTTGGCTGCAGAATTGTGAGCGCTCTAGAGGATACT-3’；

hgfp-R：5’-CCGCCGCTCGAGTCAGCCAAACCTCACTTGGCGATCCCGCGAAATTAATACG-3’。

②限制性内切酶Bgl II和Xhol I双酶切HSP702-GFP-Bgl II载体(实验室构建)，回收约4.7kb的载体骨架。

③将步骤①的HGFP片段和步骤②的载体骨架连接，转化大肠杆菌，通过绿色荧光筛选标记筛选得到重组质粒T-HSP702-HGFP。

(2)构建重组质粒T-HSP702-CBD3

①用限制性内切酶以XcmI酶切重组质粒T-HSP702-HGFP，回收约4.7kb的DNA片段；

②以质粒pET-30a(+)-CBD3(中国科学院饲料研究所周志刚老师构建)为模板，用CBD3-F和CBD3-R组成的引物对进行PCR扩增，回收约2.7kp的CBD3片段。

CBD3-F：5’-ATGCACCATCATCATCATCATTGGAAGCCCTATGGTGGCGA-3’；

CBD3-R：5’-TCAGGCCTTGTAGGCCGCC-3’。

③将步骤①的DNA片段和步骤②的CBD3片段连接，转化大肠杆菌，通过绿色荧光筛选标记筛选得到重组质粒T-HSP702-CBD3。

(3)序列表的序列1所示的DNA片段的获得

用限制性内切酶Not I单酶切处理重组质粒T-HSP702-CBD3，回收酶切产物，即约4.3kb的Not I-HSP70-2 5’UTR-CBD3-HSP70-1 3’UTR-Not I片段，即序列表的序列表的序列1所示的DNA片段。

2、用限制性内切酶Not I酶切质粒pD5H8，回收载体骨架(约13.8kb)。

3、将步骤1的酶切产物和去磷酸化处理后的步骤2的载体骨架连接，得到重组质粒pD5H8-CBD3(几丁质酶的四膜虫转基因表达载体)。

4、将重组质粒pD5H8-CBD3进行琼脂糖凝胶电泳，电泳图见图2(泳道1为λ-EcoT14 Idigest DNA maker，其条带大小依次为19329bp，7743bp，6223bp，4254bp，3472bp，2690bp，1882bp，1489bp，925bp；泳道2-6为重组质粒pD5H8-CBD3，约为17.8kb)。

5、将重组质粒pD5H8-CBD3进行测序。根据测序结果，对重组质粒pD5H8-CBD3进行结构描述如下：在质粒pD5H8的Not I酶切位点插入了序列表的序列1所示的DNA。重组质粒pD5H8-CBD3的结构示意图见图3。

实施例2、利用四膜虫表达几丁质酶

一、将重组质粒pD5H8-CBD3转染四膜虫

1、四膜虫的饥饿处理

(1)将嗜热四膜虫(嗜热四膜虫B2086株系或CU428株系)转接到50ml SPP培养基(250ml的锥形瓶内)，在转速为160rpm的摇床上30℃培养至细胞密度达到3-5×10⁵个/ml(约18小时)。

(2)将步骤(1)的培养体系(50ml)转到50ml离心管内，30℃下1000g离心2min，收集沉淀(四膜虫)，用50ml 30℃温育过的Tris缓冲液清洗2次。

(3)向50ml离心管中(含步骤(2)的沉淀)加入少量30℃温育过的Tris缓冲液，轻缓振荡开沉淀，然后将管内液体及四膜虫全部转移到无菌锥形瓶中，用30℃温育过的Tris缓冲液调整细胞密度至3×10⁵个/ml；30℃恒温水浴静置2小时后，再次进行细胞计数，并用30℃温育过的Tris缓冲液调整细胞密度至2×10⁵个/ml，即为四膜虫悬液。

分别得到B2086株系悬液和CU428株系悬液，饥饿处理总时间为18-24小时。

2、将B2086株系悬液和CU428株系悬液按等细胞个数置于同一个2L锥形瓶内混合，混合均匀后30℃下静置培养(静置1h后细胞开始配对)，静置培养4小时后定时取样用鲁哥染色液固定后在光镜下检查配对率(配对率达到80％以上)，静置培养10小时后30℃下1000g离心2min，收集配对的四膜虫。

3、用30℃温育过的Hepes缓冲液(10mM，PH7.5)清洗步骤2中收集的配对的四膜虫1次，然后悬浮于125μl 30℃温育过的Hepes缓冲液。

4、将步骤3的悬浮液与30℃温育的50μg重组质粒pD5H8-CBD3混匀，迅速转移到30℃温育的0.2cm电击杯(Bio-Rad公司产品)中，用Bio-Rad电穿孔仪进行电击(电击参数为：300V，25μF，50Ω)，电击后的电击杯于室温静置1min。

二、转染后四膜虫的培养及筛选

转染后四膜虫的培养及筛选的环境为30℃恒温箱内、无菌操作，具体步骤如下：

1、将电击杯内的四膜虫用粗口吸管轻缓转移到30℃温育的装有24ml SPP培养基的锥形瓶中，30℃恒温静置1小时，然后均匀分装到96孔一次性培养皿中。

2、电击12-16小时后加巴龙霉素(Sigma公司产品)，使每孔内的巴龙霉素浓度达到100μg/ml。

3、电击后第3天，观察培养皿内细胞生长情况，转移至新的96孔一次性培养皿中(每孔20μl)，每孔加200μl SPP培养基(含200μg/ml巴龙霉素)。

4、电击后第4天，转移至新的96孔一次性培养皿中(每孔20μl)，每孔加200μlSPP培养基(含400μg/ml巴龙霉素)。

5、电击后第5天，转移至新的96孔一次性培养皿中(每孔20μl)，每孔加200μlSPP培养基(含600μg/ml巴龙霉素)。

6、电击后第6天，转移至新的96孔一次性培养皿中(每孔20μl)，每孔加200μlSPP培养基(含800μg/ml巴龙霉素)。

7、电击后第7天，转移至新的96孔一次性培养皿中(每孔20μl)，每孔加200μlSPP培养基(含1000μg/ml巴龙霉素)。

8、电击后第8天，在解剖镜(Zeiss)下，用微毛细吸管(Sigma-Aldrich公司产品)挑取单个四膜虫到96孔一次性培养皿(CellStar公司产品)中，每孔一个四膜虫，每孔加200μl SPP培养基(含1000μg/ml巴龙霉素)，30℃恒温培养。

9、步骤8培养3天后，用微毛细吸管挑取单个四膜虫到96孔一次性培养皿中，每孔一个四膜虫，每孔加200μl SPP培养基(含1000μg/ml巴龙霉素)，30℃恒温培养。

三、转基因四膜虫的PCR鉴定

1、取200ul步骤二的培养皿中的细胞悬液，离心收集细胞，用100ul 1×BufferK(2mM Mg²⁺)悬浮，55℃孵育1小时，99℃变性20分钟，得到裂解物。

1×Buffer K(2mM Mg²⁺)：每毫升由10×PCR Buffer 100ul、MgCl₂(25mM)80ul、Proteinase K(10mM)30ul和H₂0790ul组成。

2、将裂解物作为模板，用CBD3-F和CBD3-R组成的引物对进行PCR扩增，得到PCR扩增产物。

CBD3-F：5’-ATGCACCATCATCATCATCATTGGAAGCCCTATGGTGGCGA-3’；

CBD3-R：5’-TCAGGCCTTGTAGGCCGCC-3’。

PCR体系(25ul)：20ul裂解物，0.5ul 10×PCR Buffer，1.4ul MgCl₂(25mM)，0.5uldNTP(10uM)，1ul CBD3-F(10uM)，1ul CBD3-R(10uM)，0.2ul Taq DNA聚合酶，0.4ulH₂O。

PCR扩增条件：94℃2min；94℃30sec、56℃1min、68℃3min，30个循环(25-35个循环均可)；68℃10min。

PCR扩增产物的电泳图见图4(泳道5为λ-EcoT14 Idigest DNA maker，其条带大小依次为19329bp、7743bp、6223bp、4254bp、3472bp、2690bp、1882bp、1489bp、925bp；泳道1-4为裂解物的PCR扩增产物)。结果表明，能够扩增得到约2.7kb目的片段，即得到了转基因四膜虫。

四、转空载体四膜虫的获得

将质粒pD5H8代替重组质粒pD5H8-CBD3进行步骤一至三，得到转空载体四膜虫。

五、应用转基因四膜虫表达几丁质酶

1、胶体几丁质(底物)的制备

(1)在4℃下将10g几丁质(SIGMA公司生产、分析纯)放入研钵中，加入40ml丙酮研磨10min，边研磨边缓缓加入冷浓HCl 400ml，充分研磨至糊状，4℃放置24h后用玻璃棉过滤，收集滤液。

(2)将步骤(1)的滤液缓缓加入到盛有2000ml 50％(体积比)乙醇水溶液的烧杯中，边加边剧烈搅拌，然后静置至胶态几丁质析出，收集胶态几丁质，用蒸馏水冲洗至pH7，用蒸馏水定容至1000ml，即为1％胶体几丁质，冷藏备用。

2、标准曲线的绘制

将0.01g葡萄糖(分析纯)用蒸馏水配制成100μg/ml的葡萄糖母液，用蒸馏水依次稀释为如下五种浓度的葡萄糖稀释液：20、40、60、80、100μg/ml。取六支干净的试管，分别加入水(0浓度)和五种葡萄糖稀释液lml，再加入1m1 DNS溶液，100℃水浴10min，冷却至室温，以蒸馏水为空白对照，在540nm处测吸光度，以吸光度的减少量(各浓度吸光度与0浓度的吸光度之差)为横坐标，葡萄糖浓度(μg/ml)为纵坐标绘制标准曲线，见图5。标准曲线方程为：y＝454.3x+1.4508，R²＝0.9997。

3、转染质粒pD5H8-CBD3的四膜虫中表达的几丁质酶的酶活测定

(1)粗酶液的制备

将步骤三获得的转基因四膜虫和步骤四获得的转空载体四膜虫分别进行如下步骤：将四膜虫在SPP培养基中培养至细胞密度达2×10⁵个/ml，均分成2份，1份热激处理(39℃热激1小时)作为第一组，另1份不作热激处理作为第二组；然后收集细胞，用PBS(pH7.4)缓冲液悬浮，得到悬浮液(10⁷个/ml)，超声波破碎5min(Φ2探头，功率200W，破碎10s、间歇30s)，用玻璃棉过滤并收集滤液，即为粗酶液。

(2)采用DNS比色法测还原糖

取4支试管，分别加入0.5mL粗酶液和0.5mL 1％几丁质胶体，其中三支试管于40℃水浴60min(样品管)，另外一支于4℃放置(对照管)；水浴2h后，在样品和对照中均加入1.5mL DNS，沸水浴10min，离心取上清夜在540nm测定其OD值。样品管内溶液的OD值平均值-对照管内溶液的OD值＝样品管内溶液的修正后OD值。将样品管内溶液的修正后OD值对照标准曲线，计算酶活。

进行三次重复试验，结果取平均值。

几丁质酶酶活力单位定义：在上述酶反应体系中，每小时分解胶体几丁质释放出1μg的还原糖定义为一个酶活力单位(U)。

DNS比色法中所测到的还原糖可能包括粗酶液中本身的单糖、由四膜虫自身表达的能降解几丁质为单糖的酶产生的单糖和载体pD5H8-CBD3所表达的几丁质酶CBD3降解几丁质产生的单糖(采用转空载体四膜虫得到的粗酶液所测到的还原糖中不含有载体pD5H8-CBD3所表达的几丁质酶CBD3产生的单糖)。

表1粗酶液的酶活检测结果

Claims (9)

1.一种DNA片段，如序列表的序列1自5’末端第9至4304位核苷酸所示。

2.含有权利要求1所述DNA片段的重组表达载体。

3.如权利要求2所述的重组表达载体，其特征在于：所述重组表达载体是在质粒pD5H8的多克隆位点插入权利要求1所述DNA片段得到的重组质粒。

4.含有权利要求1所述DNA片段的转基因细胞系。

5.如权利要求4所述的转基因细胞系，其特征在于：所述转基因细胞系为将权利要求3所述重组质粒导入四膜虫得到的转基因四膜虫。

6.含有权利要求1所述DNA片段的重组菌。

7.权利要求5所述转基因四膜虫在生产几丁质酶中的应用。

8.一种制备几丁质酶的方法，是培养权利要求5所述转基因四膜虫，得到几丁质酶。

9.如权利要求8所述的方法，其特征在于：所述方法中还包括热激处理的步骤。

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