CN105039289A - 木聚糖酶突变体及其应用 - Google Patents

木聚糖酶突变体及其应用 Download PDF

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Abstract

本发明的目的是提供一种耐高温木聚糖酶突变体。所述木聚糖酶突变体的最适作用pH值均为5.5，与野生型木聚糖酶XynPF一致，但最适作用温度为60℃，且比野生型木聚糖酶具有更强的耐热性。其中，木聚糖酶突变体XynA1在65℃条件下处理5？min后能保持45%以上的酶活，在75℃、80℃条件下处理5？min后仍能保持30%和21%左右的酶活，木聚糖酶突变体XynA2和XynA3在65℃条件下处理5？min后能保持80%以上的酶活，在75℃条件下处理5？min后仍能保持40%左右的酶活，80℃条件下处理5？min后仍能保持30%左右的酶活。所述木聚糖酶突变体可广泛应用于饲料领域，前景广阔。

Description

木聚糖酶突变体及其应用
技术领域
本发明属于酶基因改造技术领域，具体涉及一种木聚糖酶突变体及其应用。
背景技术
木聚糖(xylan)广泛存在于自然界中，是半纤维素的重要组分，它是自然界中含量仅次于纤维素的第二丰富的多聚糖，几乎占地球可更新有机碳含量的三分之一。在被子植物中木聚糖占干物质重的15％～30％，在裸子植物中占干物质重的7％～12％。但木聚糖具有很强的抗营养作用，在动物的消化道内不能被消化和吸收，而且会影响其它养分的吸收利用，因而大大限制了富含木聚糖饲料(大麦、小麦、黑麦等)的应用。木聚糖酶(Xylanase)是指能专一降解半纤维素木聚糖为低聚木糖和木糖的一组酶的总称。人们对木聚糖酶的研究早在六十年代就已开始，主要研究集中在食品、饲料、造纸、能源工业等方面的木聚糖酶，已经从不同来源的微生物中分离到大量的不同类型不同功能的木聚糖酶。并分离出多种木聚糖酶基因，已工业化生产多种木聚糖酶产品。
因为目前在颗粒生产过程中有一个短暂的80～90℃的高温阶段。青霉菌来源木聚糖酶热稳定性较差，其水溶液在65℃下保温5分钟剩余酶活性低于30％，使该酶在颗粒饲料的应用受到限制。采用饲料制粒后木聚糖酶液体喷涂到饲料上的方法不仅增加设备投入，而且对酶制剂的稳定性、饲料中分布均一性都无法很好的保证。因此，提高木聚糖酶热稳定性对目前饲料用木聚糖酶具有重要的现实意义。
发明内容
本发明的目的是提供一种耐热木聚糖酶突变体及其应用。申请人通过对来源于绳状青霉(Penicilliumfuniculosum)的木聚糖酶进行蛋白质工程改造，获得了突变体蛋白，其耐热性得到显著提高，有利于其在饲料领域的广泛应用。
本发明一方面提供了一种木聚糖酶突变体，其氨基酸序列为SEQIDNO:1的木聚糖酶的第60位氨基酸由Thr突变为Arg。
上述木聚糖酶突变体的氨基酸序列为SEQIDNO:3，其一种编码核苷酸序列为SEQIDNO:4。
本发明另一方面提供了一种木聚糖酶突变体，其氨基酸序列为SEQIDNO:3的木聚糖酶突变体的第130位氨基酸由Thr突变为Pro。
上述木聚糖酶突变体的氨基酸序列为SEQIDNO:5，其一种编码核苷酸序列为SEQIDNO:6。
本发明还提供了一种木聚糖酶突变体，其氨基酸序列为SEQIDNO:5的木聚糖酶突变体的第80位氨基酸由Thr突变为Arg，第115位氨基酸由Asp突变为Glu。
上述木聚糖酶突变体的氨基酸序列为SEQIDNO:7，其一种编码核苷酸序列为SEQIDNO:8。
本发明还提供了上述木聚糖酶突变体在饲料中的应用。
本发明提供了三个木聚糖酶突变体XynA1、XynA2和XynA3，并构建得到重组表达木聚糖酶突变体的毕赤酵母工程菌XynA1、毕赤酵母工程菌XynA2和毕赤酵母工程菌XynA3，其10L发酵罐的发酵水平能分别达到8011U/ml，9340U/ml，7389U/ml。所述木聚糖酶突变体的最适作用pH值均为5.5，与野生型木聚糖酶XynPF一致，但最适作用温度为60℃，且比野生型木聚糖酶具有更强的耐热性。其中，木聚糖酶突变体XynA1在65℃条件下处理5min后能保持45％以上的酶活，在75℃、80℃条件下处理5min后仍能保持30％和21％左右的酶活，木聚糖酶突变体XynA2和XynA3在65℃条件下处理5min后能保持80％以上的酶活，在75℃条件下处理5min后仍能保持40％左右的酶活，80℃条件下处理5min后仍能保持30％左右的酶活。所述木聚糖酶突变体可广泛应用于饲料领域，前景广阔。
附图说明
图1为木聚糖酶突变体XynA1、XynA2和XynA3耐热性比较图。
具体实施方式
本发明用到了遗传工程和分子生物学领域使用的常规技术和方法，例如MOLECULARCLONING:ALABORATORYMANUAL,3ndEd.(Sambrook,2001)和CURRENTPROTOCOLSINMOLECULARBIOLOGY(Ausubel,2003)中所记载的方法。这些一般性参考文献提供了本领域技术人员已知的定义和方法。但是，本领域的技术人员可以在本发明所记载的技术方案的基础上，采用本领域其它常规的方法、实验方案和试剂，而不限于本发明具体实施例的限定。
实验材料和试剂：
菌株与载体：大肠杆菌DH5α、毕赤酵母GS115、载体pPIC9K、Amp、G418购自Invitrogen公司。
酶与试剂盒：PCR酶及连接酶购买自Takara公司，限制性内切酶购自Fermentas公司，质粒提取试剂盒及胶纯化回收试剂盒购自Omega公司，GeneMorphII随机诱变试剂盒购自北京博迈斯生物科技有限公司。
培养基配方：
大肠杆菌培养基(LB培养基)：0.5％酵母提取物，1％蛋白胨，1％NaCl，pH7.0)；
LB-AMP培养基：LB培养基加100μg/mL氨苄青霉素；
酵母培养基(YPD培养基)：1％酵母提取物，2％蛋白胨，2％葡萄糖；
酵母筛选培养基(MD培养基)：2％葡萄糖，2％琼脂糖，1.34％YNB(无氨基酵母氮源)，4×10-5生物素；
BMGY培养基：2％蛋白胨，1％酵母提取物，100mM磷酸钾缓冲液(pH6.0)，1.34％YNB(无氨基酵母氮源)，4×10-5生物素，1％甘油；
BMMY培养基：2％蛋白胨，1％酵母提取物，100mM磷酸钾缓冲液(pH6.0)，1.34％YNB(无氨基酵母氮源)，4×10-5生物素，0.5％甲醇。
下面结合实施例对本发明进行详细的描述。
实施例1木聚糖酶基因的扩增
XynPF-F1：GCTGTTACATCCAACGAGACCGG
XynPF-R1：TTAAGAGACGGTAATAGTAGAAG
以绳状青霉(Penicilliumfuniculosum)基因组为模板，利用上述引物XynPF-F1和XynPF-R1进行PCR扩增，胶回收PCR产物，连接pEASY-T载体，转化至大肠杆菌DH5a中，挑取正确的转化子进行测序。测序结果显示，转化子中木聚糖酶的核苷酸序列为SEQIDNO：2，其编码的氨基酸序列为SEQIDNO：1，申请人将该木聚糖酶命名为XynPF。
实施例2木聚糖酶突变体基因的扩增及合成
为了提高木聚糖酶XynPF的耐热性，通过定向进化技术对该酶进行了大量突变的筛选，设计PCR引物XynPF-F2、XynPF-R2如下：
XynPF-F2：GGCGAATTCGCTGTTACATCCAACGAGACCGG(下划线为限制性内切酶EcoRI识别位点)
XynPF-R2：ATAGCGGCCGCTTAAGAGACGGTAATAGTAGAAG(下划线为限制性内切酶NotI识别位点)
以XynPF基因(SEQIDNO：2)为模板，利用上述引物用GeneMorphII随机突变PCR试剂盒(Stratagene)进行PCR扩增，胶回收PCR产物，EcoRI、NotI进行酶切处理后与经同样酶切后的pET21a载体连接，转化至大肠杆菌BL21(DE3)中，涂布于LB+Amp平板，37℃倒置培养，待转化子出现后，用牙签逐个挑至96孔板，每个孔中加入150ul含有0.1mMIPTG的LB+Amp培养基，37℃220rpm培养6h左右，离心弃上清，菌体用缓冲液重悬，反复冻融破壁，获得含有木聚糖酶的大肠杆菌细胞裂解液。
分别取出30ul裂解液至两块新的96孔板；将其中一块于75℃处理5min；然后将两块96孔板都加入30ul底物，于37℃反应30min后，DNS法测定生成的还原糖，计算不同突变子高温处理后的酶活水平。实验结果表明，有些突变对木聚糖酶的耐热性没有影响，有些突变甚至使其耐热性或酶活变得更差了；另外还有些突变，虽然能提高木聚糖酶对温度的耐受性，但突变后其酶学性质发生了显著的变化，这些均不符合要求。最终，申请人得到既能显著提高木聚糖酶XynPF的耐热性，又不会影响其酶活及原有酶学性质的突变位点及位点的组合：T60R单点突变，T60R、T130P两点突变，以及T60R、T80R、D115E和T130P四点突变。
将含T60R单点突变的木聚糖酶突变体命名为XynA1，其氨基酸序列为SEQIDNO：3，编码核苷酸序列为SEQIDNO：4；含T60R、T130P两点突变的木聚糖酶突变体命名为XynA2，其氨基酸序列为SEQIDNO：5，编码核苷酸序列为SEQIDNO：6；含T60R、T80R、D115E和T130P四点突变的木聚糖酶突变体命名为XynA3，其氨基酸序列为SEQIDNO：7，编码核苷酸序列为SEQIDNO：8。以上核苷酸序列由上海捷瑞生物公司合成。
用引物XynPF-F2、XynPF-R2对上述三个突变体进行PCR扩增，引物两端引入EcoRI、NotI位点。PCR反应条件为：94℃变性5min；然后94℃变性30s，56℃复性30s，72℃延伸1min，30个循环后，72℃保温10min。琼脂糖凝胶电泳结果显示，XynA1、XynA2、XynA3的基因片段大小均为570bp。
通过上述同样的PCR方法扩增得到野生型木聚糖酶XynPF的基因片段。
实施例3毕赤酵母工程菌株的构建
将上述克隆得到的木聚糖酶突变体基因XynA1、XynA2和XynA3片段，通过EcoRI和NotI位点与表达载体pPIC9K相连接，构建表达载体pPIC9K-XynA1、pPIC9K-XynA2、pPIC9K-XynA3。
将突变体表达质粒用SalI进行线性化，表达质粒线性化片段通过电穿孔法转化毕赤酵母GS115，在MD平板上分别筛选得到毕赤酵母重组菌株GS115/pPIC9K-XynA1、GS115/pPIC9K-XynA2和GS115/pPIC9K-XynA3，然后分别在含不同浓度遗传霉素的YPD平板上筛选多拷贝的转化子。
将筛选得到的重组表达木聚糖酶突变体XynA1、XynA2、XynA3的阳性转化子分别命名为毕赤酵母XynA1(PichiapastorisXynA1)、毕赤酵母XynA2(PichiapastorisXynA2)和毕赤酵母XynA3(PichiapastorisXynA3)，然后分别转接于BMGY培养基中，30℃、250rpm振荡培养1d；再转入BMMY培养基中，30℃、250rpm振荡培养；每天添加0.5％的甲醇，诱导表达4d；离心去除菌体，分别得到含木聚糖酶突变体XynA1、XynA2和XynA3的发酵上清液；将其进行SDS-PAGE电泳检测分析，结果显示上述发酵上清液中木聚糖酶突变体的分子量大小约为20kDa。
通过上述同样的酶切连接方法将野生型木聚糖酶基因XynPF克隆到毕赤酵母GS115宿主中，构建得到重组表达野生型木聚糖酶XynPF的毕赤酵母工程菌，命名为毕赤酵母XynPF(PichiapastorisXynPF)。摇瓶水平发酵毕赤酵母XynPF，30℃、250rpm振荡培养；每天添加0.5％的甲醇，诱导表达4d；离心去除菌体，得到含野生型木聚糖酶XynPF的发酵上清液。
(1)木聚糖酶活单位的定义
在37℃、pH值为5.5的条件下，每分钟从浓度为5mg/ml的木聚糖溶液中释放1μmol还原糖所需要的酶量即为一个酶活力单位U。
(2)酶活测定方法
取2ml浓度为1％的木聚糖底物(pH5.5乙酸-乙酸钠缓冲液配制)，加入到比色管中，37℃平衡10min，再加入2ml经pH5.5乙酸-乙酸钠缓冲液适当稀释并经37℃平衡好的酸性木聚糖酶酶液，混匀于37℃精确保温反应30min。反应结束后，加入5mlDNS试剂，混匀以终止反应。然后沸水浴煮沸5min，用自来水冷却至室温，加蒸馏水定容至25ml，混匀后，以标准空白样为空白对照，在540nm处测定吸光值AE。
酶活计算公式：
XD＝[(AE－AB)×K+C0]×N×1000/(M×t)
式中：XD为稀释酶液中木聚糖酶的活力，U/ml；AE为酶反应液的吸光度；AB为酶空白液的吸光度；K为标准曲线的斜率；C0为标准曲线的截距；M为木糖的摩尔质量，150.2g/mol；t为酶解反应时间，min；N为酶液稀释倍数；1000为转化因子，1mmol＝1000μmol。
(3)酶活测定结果
按照上述方法分别检测上述毕赤酵母XynPF、毕赤酵母XynA1、毕赤酵母XynA2和毕赤酵母XynA3发酵上清液中木聚糖酶酶活。结果显示：毕赤酵母XynPF发酵上清液的酶活为245U/ml，而毕赤酵母XynA1、毕赤酵母XynA2和毕赤酵母XynA3发酵上清液的酶活分别为260U/mL，271U/mL和254U/mL。
实施例4发酵验证
在10升发酵罐上分别进行毕赤酵母XynPF、毕赤酵母XynA1、毕赤酵母XynA2和毕赤酵母XynA3的发酵，发酵使用的培养基配方为：硫酸钙1.1g/L、磷酸二氢钾5.5g/L、磷酸二氢铵55g/L、硫酸钾20.3g/L、硫酸镁16.4g/L、氢氧化钾1.65g/L、消泡剂0.05％。
发酵生产工艺：pH值5.0、温度30℃、搅拌速率300rpm、通风量1.0～1.5(v/v)、溶氧控制在20％以上。
整个发酵过程分为三个阶段：第一阶段为菌体培养阶段，按7％比例接入种子，30℃培养24～26h，以补完葡萄糖为标志；第二阶段为饥饿阶段，当葡萄糖补完之后，不流加任何碳源，当溶氧上升至80％以上表明该阶段结束，为期约30～60min；第三阶段为诱导表达阶段，流加甲醇诱导，并且保持溶氧在20％以上，培养时间在150～180h之间。发酵结束后，发酵液通过板框过滤机处理后获得粗酶液。
采用实施例3所述木聚糖酶酶活测定方法对上述粗酶液进行检测，结果显示，重组表达野生型木聚糖酶的毕赤酵母XynPF最终的发酵酶活为7650U/ml，而重组表达木聚糖酶突变体的毕赤酵母XynA1、毕赤酵母XynA2和毕赤酵母XynA3最终的发酵酶活分别为8011U/ml，9340U/ml，7389U/ml。
实施例5木聚糖酶的酶学性质测定
1、最适作用pH分析
采用pH值分别为2.0、2.5、3.0、4.0、4.5、5.0、5.5、6.0、7.0、8.0的磷酸氢二钠-柠檬酸缓冲液，将实施例4发酵获得的粗酶液进行稀释测定，木聚糖底物也分别用对应pH值的缓冲液配制，在37℃下进行木聚糖酶活力测定，计算酶活，以最高酶活为100％，计算相对酶活，结果显示，本发明提供的木聚糖酶突变体XynA1、XynA2和XynA3的最适作用pH值均为5.5，与野生型木聚糖酶XynPF一致。
2、最适反应温度分析
分别在30℃、35℃、40℃、45℃、50℃、55℃、60℃、65℃、70℃、75℃，pH5.5条件下，对实施例4发酵获得的粗酶液进行木聚糖酶酶活测定，以最高酶活为100％，计算相对酶活，结果显示，野生型木聚糖酶XynPF的最适作用温度为50℃；而本发明提供的木聚糖酶突变体XynA1、XynA2和XynA3的最适作用温度为60℃。
3、耐热性分析
将实施例4发酵获得的粗酶液分别用pH5.5的乙酸-乙酸钠缓冲液稀释至约20U/ml，在65℃、75℃和80℃条件下分别处理5min后，测定其残留酶活，以未处理样品的酶活为100％，计算酶活残留率。
结果如图1所示，野生型木聚糖酶XynPF在65℃条件下处理5min后，仅能保持28％左右的酶活，在75℃、80℃条件下处理5min后，酶活残留率几乎为0；而木聚糖酶突变体XynA1在65℃条件下处理5min后能保持45％以上的酶活，在75℃、80℃条件下处理5min后仍能保持30％和21％左右的酶活，木聚糖酶突变体XynA2和XynA3在65℃条件下处理5min后能保持80％以上的酶活，在75℃条件下处理5min后仍能保持40％左右的酶活，80℃条件下处理5min后仍能保持30％左右的酶活。上述结果表明，与野生型相比，本发明提供的木聚糖酶突变体的耐热性得到显著提高。
综上所述，本发明提供的木聚糖酶突变体XynA1、XynA2和XynA3的最适作用温度为60℃，且比野生型木聚糖酶具有更强的耐热性，因此更适合广泛应用于饲料加工领域，前景广阔。
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。
SEQUENCELISTING
<110>青岛蔚蓝生物集团有限公司
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GlyAsnTyrSerThrSerTrpArgAsnThrGlyAspPheThrSerGly
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LysGlyTrpAsnProAlaAsnAlaGlnThrValArgTyrSerGlyGlu
505560
PheAsnProSerGlyAsnAlaTyrLeuAlaValTyrGlyTrpThrArg
65707580
AspProLeuValGluTyrTyrIleLeuGluSerTyrGlyThrTyrAsn
859095
ProSerSerGlyLeuThrSerLeuGlyGlnValThrSerAspGlyGly
100105110
ThrTyrGluIleTyrSerThrGlnArgValAsnGlnProSerIleGlu
115120125
GlyProSerThrPheAsnGlnTyrTrpSerValArgThrGluLysArg
130135140
ValGlyGlyThrValThrThrAlaAsnHisPheAlaAlaTrpLysAla
145150155160
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gctgttacatccaacgagaccgggtaccacgacgggtacttctactcgttctggaccgac60
gcgcccggaacggtctccatggagctgggccctggcggaaactacagcacctcttggcgt120
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tattctggagagttcaacccatctggaaatgcctacttggctgtctacggatggactaga240
gaccctttggttgagtattacatcttggagtcttatggtacatacaacccttcttctgga300
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accgagaagagagtcggaggtacagtcactactgctaaccatttcgcagcatggaaggct480
ttgggtttggagatgggaacctacaactacatgatcgtttctaccgagggttacgagtct540
tctggatcttctactattaccgtctcttaa570

Claims (10)

1.一种木聚糖酶突变体，其特征在于，所述的木聚糖酶突变体的氨基酸序列为SEQIDNO：3。
2.一种基因，其特征在于，所述的基因编码权利要求1所述的木聚糖酶突变体。
3.如权利要求2所述的基因，其特征在于，所述的基因的核苷酸序列为SEQIDNO：4。
4.一种木聚糖酶突变体，其特征在于，所述的木聚糖酶突变体是权利要求1所述的木聚糖酶突变体的第130位氨基酸由Thr突变为Pro。
5.一种基因，其特征在于，所述的基因编码权利要求4所述的木聚糖酶突变体。
6.一种木聚糖酶突变体，其特征在于，所述的木聚糖酶突变体是权利要求4所述的木聚糖酶突变体的第80位氨基酸由Thr突变为Arg，第115位氨基酸由Asp突变为Glu。
7.一种基因，其特征在于，所述的基因编码权利要求6所述的木聚糖酶突变体。
8.一种重组质粒，其特征在于，所述的重组质粒用于在宿主细胞内表达权利要求1、4或6所述的木聚糖酶突变体。
9.一种重组宿主细胞，其特征在于，所述的重组宿主细胞为携带有权利要求8所述的重组质粒的宿主细胞。
10.如权利要求9所述的重组宿主细胞，其特征在于，所述的宿主细胞为毕赤酵母。
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