CN102517268A - 一种碱性蛋白酶的生产方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种碱性蛋白酶的生产方法，其中菌株的分类命名为嗜碱芽孢杆菌Bacillus alcalophilus，保藏编号为：CGMCC No.5313，本发明中发酵方法采用清液发酵与补料分批发酵相结合，将粗料棉籽饼粉制备为棉籽饼粉酶水解液，并采用流加碳氮源的发酵方式，有效的提高了发酵酶活，7L规模发酵罐酶活力达到41000U/mL，较原始7L规模发酵罐酶活力36000U/mL提高了13.9％，同时降低了后期酶分离纯化的难度，降低了生产成本，并获得良好的经济效益。

Description

一种碱性蛋白酶的生产方法

技术领域

本发明属于微生物发酵领域，具体涉及一种碱性蛋白酶的生产方法。

背景技术

碱性蛋白酶(Alkaline Protease)属内肽酶中的丝氨酸蛋白水解酶类，可以在碱性条件下水解蛋白质肽键，其最适作用pH一般为9～11，主要应用于加酶洗涤剂工业，在制革、丝绸、饲料、医药、食品、环保等工业也有广泛的应用。

目前，在世界范围内蛋白分解酶是工业酶中用得最多的酶，约占酶总量的60％，其中碱性蛋白酶就占25％。它在商业中的巨大应用前景及在基础研究中的重要作用，吸引着国际国内的许多公司及研究单位竞相对其进行多方面的研究。

研究室的前期研究通过低能N⁺离子注入技术诱变选育得到一株高产碱性蛋白酶的嗜碱芽孢杆菌，并通过正交试验确定其最佳发酵培养基，其7L规模发酵罐酶活力达到36000U/mL。

清液发酵指培养基中不含固体不溶物，其发酵过程中传质效果要优于粗料发酵，且降低后续分离纯化的难度，可以极大降低生产成本。

补料分批发酵与不补料分批发酵相比，特点在于使发酵系统中维持较低的基质浓度。低基质浓度的优点：①可以除去快速利用碳源的阻遏效应，并维持适当的菌体浓度，使不致于加剧供氧矛盾；②避免在培养基中积累有毒代谢物，即代谢阻遏。

本发明中菌株的发酵周期55小时左右，产酶高峰期在对数生长末期，此时营养物质浓度较低，不利于产酶。采用高营养物质浓度发酵液发酵则会产生阻遏效应，抑制菌体的生长，同样不利于产酶。同时发酵培养基中氮源采用棉籽饼粉，虽利于产酶，但为粗料发酵，原料利用率低，且含有大量微小颗粒，给后期酶的分离纯化带来困难。

发明内容

本发明的目的在于克服现有技术的不足之处，提供一种碱性蛋白酶的生产方法，本发明利用碱性蛋白酶高产菌株发酵生产碱性蛋白酶，采用清液发酵与补料分批发酵相结合的方法，本方法有效提高嗜碱芽孢杆菌产碱性蛋白酶的能力。

本发明实现目的的技术方案如下：

一种碱性蛋白酶的生产方法，生产过程采用补料分批发酵的方法。

而且，发酵采用清液发酵。

而且，发酵所用微生物为嗜碱芽孢杆菌Bacillus alcalophilus Y-22，保藏编号为：CGMCCNo.5313，保藏单位为：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心。

而且，发酵步骤如下：

(1)种子的培养：从斜面上挑取一环新培养的嗜碱性芽孢杆菌Y-22接入种子培养液中(50mL种子培养基/250mL三角瓶)，200r/min，34℃培养12h；

(2)发酵罐培养：5％v/v接种量转接至液体发酵培养基；温度：34℃；转速：250～450r/min；通风量：1∶0.5～1∶1.5。发酵过程中自动流加氨水及20％v/v的盐酸，使发酵液pH值维持在7.0；

(3)补料分批发酵：在碱性蛋白酶高产菌株发酵产碱性蛋白酶的过程中按一定的比生长速率流加补料培养基，发酵10-30小时控制比生长速率0.12h^-1，30-55小时控制比生长速率0.6h^-1。

而且，所用发酵培养基配方为g/L：酵母浸粉17，麦芽糊精100g/L、柠檬酸钠3g/L、氯化钙2.6g/L、K₂HPO₄18g/L、pH自然，标准棉籽饼粉水解液150mL/L。

而且，所用补料培养基配方为：麦芽糊精600g/L、柠檬酸钠3g/L、氯化钙2.6g/L、K₂HPO₄18g/L、pH自然，标准棉籽饼粉水解液800mL/L。

而且，所述标准棉籽饼粉水解液为棉籽饼粉经物理作用及酶水解后得到的上清液。

而且，所述标准棉籽饼粉水解液的制备方法步骤如下：

(1)棉籽饼粉加干重2-5倍的水，高压蒸煮20-30分钟，除去对菌体生长有害的棉酚；

(2)加入棉籽饼粉干重1-3％(w/w)复合酶制剂，45℃，120r/min，搅拌处理120分钟；

(3)板框过滤，滤液即为棉籽饼粉酶水解液；

(4)将棉籽饼粉酶水解液中蛋白浓度稀释为25g/L，即为标准棉籽饼粉酶水解液。

而且，所述复合酶制剂为蛋白酶、纤维素酶、木聚糖酶和果胶酶的混合物。

而且，所述复配比例为蛋白酶∶纤维素酶∶木聚糖酶∶果胶酶＝3∶1.5∶2.5∶2。

本发明的优点及积极效果是：

1、本发明提供一种碱性蛋白酶的生产方法，采用清液发酵与补料分批发酵相结合的方法，本方法有效提高嗜碱芽孢杆菌产碱性蛋白酶的能力，7L规模发酵罐酶活力达到41000U/mL，较原始7L规模发酵罐酶活力36000U/mL提高了13.9％。

2、本发明采用补料分批发酵可以减少底物抑制，解除底物的分解代谢物阻遏作用，减少抑制性副产物的形成，增加细胞浓度；同时产酶高峰期处于菌体对数生长末期，碳氮源浓度成为碱性蛋白酶生成的限制因素，因此流加碳氮源，适当提高发酵液中碳氮源浓度，可以提高其产酶活力，减少发酵时间。

3、本发明首先通过高压蒸煮的物理方法除去棉酚，然后使用蛋白酶、纤维素酶、木聚糖酶、果胶酶经严格配比而成的复合酶制剂，可最大限度的水解棉籽饼粉，使其营养物质充分溶于水中，同时减少后期分离纯化的难度，降低了生产成本，获得良好的经济效益。

附图说明

图1为本发明碱性蛋白酶高产菌株的7L发酵罐发酵产酶曲线；

图2为本发明碱性蛋白酶高产菌株的7L发酵罐清液发酵与补料分批发酵相结合发酵产酶曲线。

具体实施方式

下面通过具体实施例对本发明作进一步详述，以下实施例只是描述性的，不是限定性的，不能以此限定本发明的保护范围。

本发明采用补料分批发酵可以减少底物抑制，解除底物的分解代谢物阻遏作用，减少抑制性副产物的形成，增加细胞浓度；同时产酶高峰期处于菌体对数生长末期，碳氮源浓度成为碱性蛋白酶生成的限制因素，因此流加碳氮源，适当提高发酵液中碳氮源浓度，可以提高其产酶活力。

本发明同时采用清液发酵的方法，用棉籽饼粉酶水解液替代棉籽饼粉粗料，减少发酵液中不溶固体颗粒含量，有利于发酵传质，提高原料的利用率，并减少下游分离纯化的难度，降低生产成本。棉籽饼粉成分较为复杂，含有丰富的蛋白质及木质纤维素，使用单一水解酶水解较为困难，且含有一定量的棉酚，不利于菌体生长。本发明首先通过高压蒸煮的物理方法除去棉酚，然后使用蛋白酶、纤维素酶、木聚糖酶、果胶酶经严格配比而成的复合酶制剂，可最大限度的水解棉籽饼粉，使其营养物质充分溶于水中。

具体步骤如下：

1、水解棉籽饼粉复合酶的制备：

复合蛋白酶复配比例为蛋白酶∶纤维素酶∶木聚糖酶∶果胶酶＝3∶1.5∶2.5∶2。

根据不同产地的棉籽饼粉所含物质的差别，可适当调节调节蛋白酶、纤维素酶、木聚糖酶、果胶酶比例，制成可最佳水解棉籽饼粉的复合酶制剂。

2、棉籽饼粉酶水解液的制备：

(1)根据棉籽饼粉干重加2-5倍重量的水，高压蒸煮25分钟，除去对菌体生长有害的棉酚。

(2)加入棉籽饼粉干重1-3％(w/w)的复合酶制剂，45℃，120r/min，搅拌处理120分钟。

(3)板框过滤，滤液即为棉籽饼粉酶水解液。

(4)使用凯氏定氮法测定棉籽饼粉酶水解液中蛋白浓度，加适量水稀释，将棉籽饼粉酶水解液中蛋白浓度稀释为25g/L，即为标准棉籽饼粉酶水解液。

3、培养基

(1)保藏/活化培养基(g/L)：牛肉膏8，酵母浸粉2，多聚蛋白胨5，NaCl 2，琼脂17，酪蛋白4，K₂HPO₄18，pH自然。

(2)种子培养基(g/L)：酵母浸粉5，胰蛋白胨5，葡萄糖，K₂HPO₄18，pH自然。

(3)液体发酵培养基(g/L)：酵母浸粉17，麦芽糊精100，柠檬酸钠3，氯化钙2.6，K₂HPO₄18，pH自然，其中添加标准棉籽饼粉酶水解液150(mL/L)。

(4)补料培养基(g/L)：麦芽糊精600，柠檬酸钠3，氯化钙2.6，K₂HPO₄18，pH自然，其中添加标准棉籽饼粉酶水解液800(mL/L)。

4、菌株：本发明使用的菌种为嗜碱芽孢杆菌Bacillus alcalophilus，保藏编号为：CGMCC No.5313，保藏单位为：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心。

5、种子的培养：从斜面上挑取一环新培养的嗜碱性芽孢杆菌接入种子培养液中(50mL种子培养基/250mL三角瓶)，200r/min，34℃培养12h。

6、发酵过程：

(1)7L发酵罐装液量4L。

(2)5％(v/v)接种量转接至液体发酵培养基。

(3)温度：34℃；转速：250～450r/min；通风量：1∶0.5～1∶1.5。发酵过程中自动流加氨水及20％(v/v)的盐酸，使发酵液pH值维持在7.0。

(4)补料发酵：发酵10-30小时控制比生长速率0.13h^-1，30-55小时控制比生长速率0.8h^-1。

流加速率F(mL/h)由指数方程确定：

$F=\frac{\mathrm{\μ}{\left(\mathrm{VX}\right)}_0}{Y_{X/S}(S_F-S)}\exp \left({\mathrm{\μ}}_t\right)$

X和S分别为发酵罐中细胞和底物质量浓度，g/L；μ为生长速率，h^-1；V为发酵液体积，L；S_F为补加底物的质量浓度，g/L；Y_X/S为细胞对底物的得率系数；(VX)₀为培养体系的初始细胞量，g。

7、碱性蛋白酶活力的测定

取发酵液，6000r/min离心，取上清液测定酶活。

采用《中华人民共和国轻工业标准》QB/T 1803-1993工业酶制剂通用实验方法，即福林(Folin)法。

7L规模发酵罐不补料发酵及补料发酵过程酶活分别如附图1、附图2所示。可以发现采用补料分批发酵与清液发酵相结合的发酵方法，可以提前产酶期，提高单位发酵酶活。且发酵液中不含不溶性固体颗粒，为后期分离纯化提供便利。

Claims (10)

1.一种碱性蛋白酶的生产方法，其特征在于：生产过程采用补料分批发酵的方法。

2.根据权利要求1所述的碱性蛋白酶的生产方法，其特征在于：发酵采用清液发酵。

3.根据权利要求1所述的碱性蛋白酶的生产方法，其特征在于：发酵所用微生物为嗜碱芽孢杆菌Bacillus alcalophilus Y-22，保藏编号为：CGMCC No.5313，保藏单位为：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心。

4.根据权利要求3所述的碱性蛋白酶的生产方法，其特征在于：发酵步骤如下：

(1)种子的培养：从斜面上挑取一环新培养的嗜碱性芽孢杆菌Y-22接入种子培养液中(50mL种子培养基/250mL三角瓶)，200r/min，34℃培养12h；

(2)发酵罐培养：5％v/v接种量转接至液体发酵培养基；温度：34℃；转速：250～450r/min；通风量：1∶0.5～1∶1.5。发酵过程中自动流加氨水及20％v/v的盐酸，使发酵液pH值维持在7.0；

(3)补料分批发酵：在碱性蛋白酶高产菌株发酵产碱性蛋白酶的过程中按一定的比生长速率流加补料培养基，发酵10-30小时控制比生长速率0.12h^-1，30-55小时控制比生长速率0.6h^-1。

5.根据权利要求4所述的碱性蛋白酶的生产方法，其特征在于：所用发酵培养基配方为g/L：酵母浸粉17，麦芽糊精100g/L、柠檬酸钠3g/L、氯化钙2.6g/L、K₂HPO₄18g/L、pH自然，标准棉籽饼粉水解液150mL/L。

6.根据权利要求4所述的碱性蛋白酶的生产方法，其特征在于：所用补料培养基配方为：麦芽糊精600g/L、柠檬酸钠3g/L、氯化钙2.6g/L、K₂HPO₄18g/L、pH自然，标准棉籽饼粉水解液800mL/L。

7.根据权利要求5或6所述的碱性蛋白酶的生产方法，其特征在于：所述标准棉籽饼粉水解液为棉籽饼粉经物理作用及酶水解后得到的上清液。

8.根据权利要求7所述的碱性蛋白酶的生产方法，其特征在于：所述标准棉籽饼粉水解液的制备方法步骤如下：

(1)棉籽饼粉加干重2-5倍的水，高压蒸煮20-30分钟，除去对菌体生长有害的棉酚；

(2)加入棉籽饼粉干重1-3％w/w复合酶制剂，45℃，120r/min，搅拌处理120分钟；

(3)板框过滤，滤液即为棉籽饼粉酶水解液；

(4)将棉籽饼粉酶水解液中蛋白浓度稀释为25g/L，即为标准棉籽饼粉酶水解液。

9.根据权利要求7所述的碱性蛋白酶的生产方法，其特征在于：所述复合酶制剂为蛋白酶、纤维素酶、木聚糖酶和果胶酶的混合物。

10.根据权利要求9所述的碱性蛋白酶的生产方法，其特征在于：所述复合酶制剂的复配比例为蛋白酶∶纤维素酶∶木聚糖酶∶果胶酶＝3∶1.5∶2.5∶2。

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