CN1202245C - 发酵生产高碱碱性蛋白酶的方法 - Google Patents

Abstract

发酵生产高碱碱性蛋白酶的方法，属于由嗜碱性枯草芽孢杆菌，生产高碱碱性蛋白酶的方法。它解决了我国碱性蛋白酶活力低及成本较高的问题。其技术方案是由嗜碱性枯草芽孢杆菌为菌种、以廉价原料为培养基，采取流加碱或酸、调节pH控制发酵，得到具有高酶活力的粗酶液。该法工艺简单，易推广，降低了生产成本，适合工业化生产；为洗涤剂行业提供优质、廉价的酶制剂，促进其在洗涤剂中的大量应用，为酶制剂、洗涤剂工业的发展提供了有效途径。具有经济效益和社会效益。该产品在改善人民生活质量、降低劳动强度、保护环境等方面发挥了重要作用。它还可广泛用于日用化工、食品、环保、医药及一些新兴产业中，发展前景极其广阔。

Description

发酵生产高碱碱性蛋白酶的方法

技术领域

本发明属于发酵生产高碱碱性蛋白酶的工艺方法，特别涉及一种由嗜碱性枯草芽孢杆菌发酵生产高碱碱性蛋白酶的方法。

背景技术

近些年来，洗涤剂行业发展迅速，目前洗涤剂的用量以每年5％的速度递增，而且随着人们生活水平的提高，含磷洗涤剂逐渐被淘汰，取而代之的是加酶洗涤剂的大量使用，洗涤剂加酶已成为国际发展趋势，加酶洗涤剂的市场份额将越来越大。洗涤剂是由表面活性剂、纯碱、水玻璃(硅酸盐)、三磷酸盐等配制而成，洗涤时的水溶液显示出较高的碱性，其pH一般在9～11之间。在这种碱性条件下，只有碱性蛋白酶才可以发挥作用，将污物中的蛋白质催化水解，使复杂的蛋白质分解成结构简单、相对分子量较小的水溶性肽，或者进一步分解为氨基酸。因此，碱性蛋白酶的最大用途就是作为添加剂生产加酶洗涤剂。目前我国碱性蛋白酶的生产水平较低，主要是其发酵活力低，大多维持在10000u/ml，由于单位产量较低，这就使得其生产成本较高，远远满足不了洗涤剂行业的需求。因此，提高发酵液的酶活力，降低碱性蛋白酶的生产成本势在必行。

 发明内容

本发明解决了我国目前碱性蛋白酶的发酵活力低及其所使用的培养基造价较高的问题，提供了一种由嗜碱性枯草芽孢杆菌为菌种、价格低廉的原料为培养基的发酵生产高碱碱性蛋白酶的方法。该方法降低了碱性蛋白酶的生产成本，非常适合大规模工业化生产，使碱性蛋白酶在洗涤剂中的大量应用成为可能。

技术方案：

发酵生产高碱碱性蛋白酶的方法，采用嗜碱性枯草芽孢杆菌为菌种，发酵培养基主要成分以廉价的麦芽糊精、棉籽饼粉为原料，经过一级液体培养、二级液体培养、发酵罐发酵、离心工序，并采取流加适量的碱或酸调节发酵液pH来控制发酵，得到具有高酶活力的粗酶液。

具体包括以下内容：

(一)培养基

●斜面培养基：牛肉膏     5.0～9.5g

              酵母浸粉   0.5～5.0g

              氯化钠     1.0～4.0g

              酪素       4.0～8.0g

              多聚蛋白胨 4.5～8.5g

              琼脂       18～20g

              水         1000ml

●种子培养基：胰蛋白胨    3～7g

              酵母浸粉    3～7g

              葡萄糖      5～15g

              水          1000ml

●发酵培养基：酵母浸粉    13～20g

              棉籽饼粉    30～50g

              麦芽糊精    100～150g

              柠檬酸钠    2～5g

              氯化钙      2～5g

              水          1000ml

(二)发酵工艺方法

●  工序：菌种→一级液体培养→二级液体培养→发酵罐发酵→离心。

其具体方法如下：

●一级液体培养：将平板上单菌落接入种子培养基，30～37℃摇床培养8～14小时，进行一级液体培养。

●二级液体培养：以2～5％的接种量接种于新鲜种子培养基，30～37℃摇床培养6～14小时，进行二级液体培养。

●发酵罐发酵：以2～5％的接种量接种于发酵培养基，30～37℃培养40～60小时，进行液体深层发酵培养。在发酵过程中，采取调节pH的方法控制发酵，即：将种子接种于发酵培养基后，使发酵液初始pH为7.0～7.5；在发酵期间，当发酵液酸性逐渐增加时，应控制发酵液pH不低于6.0；随后，当发酵液碱性逐渐增加时，应控制发酵液pH不高于8.0。为此，调节pH的方法分别是：初始pH的调节，可以通过添加浓度为1.0％～2.5％的磷酸缓冲液实现。发酵期间pH的调节，视发酵液pH的具体情况，并根据发酵需要，通过流加碱或酸溶液实现。也就是说，在发酵期间，如果当发酵液pH符合某一相应阶段pH要求，此时则可以不加碱或酸。

需要说明的是，在发酵过程中，控制发酵液pH，可以是使发酵液在发酵第25～35小时前pH维持在6.5～6.8，在发酵第25～35小时后维持在7.0～7.8。

调节pH的方法是，在发酵过程中，视发酵液pH的具体情况，并根据发酵需要，采用间歇补料方式流加碱或酸溶液；所用碱如氨水或尿素、所用酸如磷酸溶液。

●离心：将发酵液进行离心，上清液即为粗酶液。

发酵所得粗酶液以Folin试剂显色法进行测定，使酶促反应在40℃、pH11的条件下进行。将该条件下每分钟水解酪蛋白产生1μg酪氨酸所需的酶量定义为一个活力单位，以u/ml表示。本发明生产所得粗酶液，其碱性蛋白酶活力不低于32000u/ml。

有益效果：

本发明充分利用了微生物发酵技术，依靠微生物繁殖快、易培养、代谢能力强等优点，以价格低廉的原料制作培养基，通过特定的发酵工艺进行发酵控制，从而得到单位产量较高的粗酶液。本发明主要优点：

1.由价格低廉的原料制作培养基，降低了其生产成本；

2.发酵工艺控制简单，易推广；

3.本发酵工艺所得粗酶液酶活力较高，其活力不低于32000u/ml，为进一步的提取、精制提供了方便，本工艺适合大规模工业化生产。

以上不难看出，本发明提供了一种具有较高单位产量的粗酶液的发酵工艺；解决了我国目前碱性蛋白酶发酵活力低及培养基造价较高的问题；为洗涤剂行业提供优质、廉价的酶制剂，使碱性蛋白酶在洗涤剂中的大量应用成为可能；从而促进其在洗涤剂中的大量应用，为酶制剂工业、洗涤剂工业的发展提供了有效途径。具有巨大的市场潜力，发展前景极其广阔。具有较大的经济效益和社会效益。本发明提供的产品，在改善人民生活质量、降低劳动强度、节约原料和能源、保护环境等方面发挥了重要作用。该发酵工艺所生产的碱性蛋白酶具有较高的应用价值，还可广泛地用于皮革加工、饲料添加剂、纺织及食品和医药制品加工等诸多领域

具体实施方式

实施例1：

以嗜碱性枯草芽孢杆菌为生产菌种。菌种所用培养基配方如下：

斜面培养基：牛肉膏     5g

            酵母浸粉   1g

            氯化钠     2g

            酪  素     5g

            多聚蛋白胨 5g

            琼脂       18g

            水         1000ml

种子培养基：胰蛋白胨   3g

            酵母浸粉   3g

            葡萄糖     5g

            水         1000ml

发酵培养基：酵母浸粉   10g

            棉籽饼粉   40g

            麦芽糊精   130g

            柠檬酸钠   3.5g

            氯化钙     3.5g

            水         1000ml

具体方法如下：

●一级液体培养：将平板上单菌落接入种子培养基，35℃摇床培养8小时，进行一级液体培养。

●二级液体培养：以2％的接种量接种于新鲜种子培养基，35℃摇床培养6小时，进行二级液体培养。

●发酵培养：将已灭菌的磷酸氢二钾溶液加入发酵培养基，使其终浓度为1.0％、培养基初始pH为7，以2％的接种量将二级种子液接种于上述发酵培养基，35℃培养，发酵至48小时，进行液体深层发酵培养。在此发酵期间，当发酵液酸性逐渐增加时，流加氨水调节发酵液pH，使其不低于6，随后，发酵液碱性逐渐增加，但不高于8，符合该阶段pH要求，此时则可以不流加酸溶液。

●离心：将发酵液以8000r/min离心10min，上清液即为粗酶液。

发酵所得粗酶液以Folin试剂显色法进行测定，其酶活力可达33568u/ml。

实施例2：

菌种所用培养基配方如下：

斜面培养基：牛肉膏      7g

            酵母浸粉    4g

            氯化钠      3g

            酪  素      6g

            多聚蛋白胨  6g

            琼  脂      18g

            水          1000ml

种子培养基：胰蛋白胨    4g

            酵母浸粉    4g

            葡萄糖      8g

            水          1000ml

发酵培养基：酵母浸粉    15g

            棉籽饼粉    40g

            麦芽糊精    150g

            柠檬酸钠    2g

            氯化钙      2g

            水          1000ml

发酵至52小时，进行液体深层发酵培养。在此发酵过程中，即在30小时之前，流加氨水调节发酵液pH，使其维持在6.5～6.8，30小时后，发酵液碱性逐渐增加，但不高于8，符合该阶段pH要求，此时则可以不流加酸溶液。其它同

实施例1。

发酵所得粗酶液以Folin试剂显色法进行测定，其酶活力可达32884u/ml。

实施例3：

发酵培养基：酵母浸粉    20g

            棉籽饼粉    50g

            麦芽糊精    100g

            柠檬酸钠    5g

 氯化钙    5g

 水        1000ml

发酵至56小时，进行液体深层发酵培养。在此发酵过程中，即在27小时之前，流加氨水调节发酵液pH，使其维持在6.5～6.8，27小时后，发酵液碱性逐渐增加，但不高于8，符合该阶段pH要求，此时则可以不流加酸溶液。其它同实施例1。

发酵所得粗酶液以Folin试剂显色法进行测定，其酶活力可达32167u/ml。

实施例4：

一级液体培养、二级液体培养、发酵培养温度均为32℃。发酵至54小时，进行液体深层发酵培养。菌种、培养基及其它同实施例1。

发酵所得粗酶液以Folin试剂显色法进行测定，其酶活力可达33136u/ml。

实施例5：

一级液体培养、二级液体培养、发酵培养温度均为37℃。发酵至46小时，进行液体深层发酵培养。菌种、培养基及其它同实施例1。

发酵所得粗酶液以Folin试剂显色法进行测定，其酶活力可达33842u/ml。

实施例6：

发酵培养：发酵50小时，进行液体深层发酵培养。在此发酵过程中，即在27小时之前，采用间歇补料方式流加尿素调节发酵液pH，使其维持在6.5～6.8，27小时后，发酵液碱性逐渐增加，但不高于8，符合该阶段pH要求，此时则可以不流加酸溶液。菌种、培养基及其它同实施例1。

发酵所得粗酶液以Folin试剂显色法进行测定，其酶活力可达32884u/ml。

实施例7：

发酵培养：发酵58小时，进行液体深层发酵培养。在此发酵过程中，由于发酵液酸性逐渐增加，但不低于6，符合该阶段pH要求，此时可以不流加碱溶液。随后，发酵液碱性逐渐增加，此期间以间歇补料方式流加6mol/L的磷酸溶液调节发酵液pH，使其不高于8。菌种、培养基及其它同实施例1。

发酵所得粗酶液以Folin试剂显色法进行测定，其酶活力可达33781u/ml。

实施例8：

发酵罐发酵：将已灭菌的磷酸氢二钾溶液加入发酵培养基，使其终浓度为1.5％、培养基初始pH为7.5，以3％的接种量将二级种子液接种于上述发酵培养基，37℃培养，发酵42小时，进行液体深层发酵培养。在此发酵过程中，即在35小时之前，采用间歇补料方式流加氨水调节发酵液pH，使其维持在6.5～6.8；35小时后，发酵液碱性逐渐增加，采用间歇补料方式改用6mol/L的磷酸溶液调节发酵液pH，使其维持在7.0～7.8。菌种、培养基及其它同实施例1。

发酵所得粗酶液以Folin试剂显色法进行测定，其酶活力可达34218u/ml。

Claims (3)

1.发酵生产高碱碱性蛋白酶的方法，其特征在于采用嗜碱性枯草芽孢杆菌为菌种，并采用以下发酵培养基：

●斜面培养基：牛肉膏            5.0～9.5g

              酵母浸粉          0.5～5.0g

              氯化钠            1.0～4.0g

              酪素              4.0～8.0g

              多聚蛋白胨        4.5～8.5g

              琼脂              18～20g

              水                1000ml

●种子培养基：胰蛋白胨          3～7g

              酵母浸粉          3～7g

              葡萄糖            5～15g

              水                1000ml

●发酵培养基：酵母浸粉          13～20g

              棉籽饼粉          30～50g

              麦芽糊精          100～150g

              柠檬酸钠          2～5g

              氯化钙            2～5g

              水                1000ml

通过流加碱或酸调节溶液pH来控制发酵，得到具有酶活力的酶液，具体包括以下步骤：

(1).一级液体培养：将平板上单菌落接入种子培养基，30～37℃摇床培养8～14小时，进行一级液体培养；

(2).二级液体培养：以2～5％的接种量接种于新鲜种子培养基，30～37℃摇床培养6～14小时，进行二级液体培养；

(3).发酵罐发酵：以2～5％的接种量接种于发酵培养基，30～37℃培养40～60小时，进行液体深层发酵培养；在发酵过程中，采取调节pH的方法控制发酵，即：将种子接种于发酵培养基后，使发酵液初始pH为7.0～7.5；在发酵期间，当发酵液酸性逐渐增加时，控制发酵液pH不低于6.0；随后，当发酵液碱性逐渐增加时，控制发酵液pH不高于8.0；为此，调节pH的方法分别是：初始pH的调节，通过添加浓度为1.0％～2.5％的磷酸缓冲液实现，发酵期间pH的调节，通过流加碱或酸溶液实现；

(4).离心：将发酵液进行离心，上清液即为粗酶液；

发酵所得粗酶液以Folin试剂显色法进行测定，使酶促反应在40℃、pH11的条件下进行，其酶活力不低于32000u/ml。

2.按照权利要求1所述的发酵生产高碱碱性蛋白酶的方法，其特征在于在发酵过程中，控制发酵液pH，是使发酵液在发酵第25～35小时前pH维持在6.5～6.8，在发酵第25～35小时后维持在7.0～7.8。

3.按照权利要求1或2所述的发酵生产高碱碱性蛋白酶的方法，其特征在于调节pH的方法是，在发酵过程中，采用间歇补料方式流加碱或酸溶液；所用碱为氨水或尿素、所用酸为磷酸溶液。