CN101173230B - 一种嗜碱芽孢杆菌及其产生的内切葡聚糖酶和应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种嗜碱芽孢杆菌，是从造纸厂碱性淤泥中筛选得到的产内切葡聚糖酶菌株。本发明还公开了上述嗜碱芽孢杆菌产生的中性内切葡聚糖酶和碱性内切葡聚糖酶，两种内切葡聚糖酶均可在洗涤剂或纺织品等工业中应用。本发明的嗜碱芽孢杆菌属于嗜碱的极端微生物，与当前工业用酶菌株相比，其可在高碱性条件下培养，具有可有效抑制杂菌污染，有利于大规模的发酵生产的特点。

Description

一种嗜碱芽孢杆菌及其产生的内切葡聚糖酶和应用

技术领域

本发明属于生物技术领域，特别涉及一种嗜碱芽孢杆菌及其产生的内切葡聚糖酶和应用。

背景技术

内切葡聚糖酶(β-1，4-内切葡聚糖酶，Endoglucanase/Endo-1，4-β-Glucanase，EC3.2.1.4)是纤维素酶酶系的重要组分，可将纤维素分子从内部即在β-1，4糖苷键将其切断。按催化反应的最适pH值，内切葡聚糖酶可以分为酸性内切葡聚糖酶(最适pH3～5)、中性内切葡聚糖酶(最适pH6～8)和碱性内切葡聚糖酶(最适pH8～10)。酸性内切葡聚糖酶主要由丝状真菌产生，其产生菌主要包括里氏木霉、康宁木霉、黑曲霉等。酸性内切葡聚糖酶研究最早，然而，随着工业应用范围的不断扩展和应用研究的不断深入，酸性内切葡聚糖酶也显现出诸多不足。如中碱性条件下酶活性较低或根本没有活性、稳定性较差、pH值适应范围窄，而且在酸性条件下处理纺织品后会产生退色现象等，这极大限制了内切葡聚糖酶在碱性洗涤剂、纺织品酶洗整理等工业中的应用。

由细菌产生的内切葡聚糖酶主要是中性和碱性内切葡聚糖酶，在中性和碱性条件下均具有一定的酶活性及稳定性。与由真菌产生的酸性内切葡聚糖酶相比，中性和碱性内切葡聚糖酶具有pH值适应范围广、稳定性好、可耐受高温等优点。作为洗涤用酶可使衣物经多次洗涤后手感、外观等保持鲜艳，不易造成纺织品退色等，在纺织、洗涤剂等工业中应用前景广阔。因此，就洗涤剂、纺织等工业而言，由细菌产生的中性和碱性内切葡聚糖酶有着传统酸性内切葡聚糖酶无可比拟的优越性。

目前，对细菌产内切葡聚糖酶的分离纯化研究相对较少，而对细菌产中性内切葡聚糖酶的分离纯化的研究尚未见报道。当前，对于碱性内切葡聚糖酶的研究主要存在菌株产酶能力和酶比活力低或耐金属离子和表面活性剂及热等能力差等诸多不足。同时，嗜碱芽孢杆菌主要产生一些碱性酶类，迄今尚未见嗜碱菌产生中性内切葡聚糖酶的报道。

发明内容

为了解决上述现有技术存在的不足之处，本发明的首要目的在于提供一种嗜碱芽孢杆菌Bacillus sp.III-3。该嗜碱芽孢杆菌可产生一种中性内切葡聚糖酶和一种碱性内切葡聚糖酶。

本发明的另一目的在于提供上述嗜碱芽孢杆菌Bacillus sp.III-3产生的优质中性内切葡聚糖酶和碱性内切葡聚糖酶。它们均具有pH适应范围广、热稳定性好、耐金属离子和表面活性剂等适用于纺织和洗涤剂等工业的优良酶学特性。

本发明的再一目的在于提供上述中性内切葡聚糖酶和碱性内切葡聚糖酶的应用。

本发明的目的通过下述技术方案实现：一种嗜碱芽孢杆菌，是从造纸厂碱性淤泥中筛选得到的产内切葡聚糖酶菌株Bacillus sp.III-3。所述菌株保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏日：2007年8月22日，保藏号：CGMCC No.2138。菌种形态特征：菌落圆形，浅黄色，半透明，革兰氏染色阳性，显微镜下观察个体形态为较细长杆状，次端生芽孢。该菌株的培养基配方(下述均为质量百分比)：1％复合蛋白胨，0.5％酵母粉，0.5％NaCl，0.1％KH₂PO₄，0.25％Na₂HPO₄·12H₂O，2％CMC-Na，0.5％Na₂CO₃(分开灭菌)，固体培养基加1.5％的琼脂，培养pH值：7～10，培养温度：30～37℃。

所述嗜碱芽孢杆菌Bacillus sp.III-3产生的碱性内切葡聚糖酶III-3-A，按下述方法制得：

(1)菌种液体发酵培养：

将嗜碱芽孢杆菌Bacillus sp.III-3菌种接到50mL液体发酵培养基中，于30～35℃、150r/min条件下培养48h；将48h发酵液以14000r/min的转速冷冻离心20min，上清液加入四倍体积的pH 8.0Tris-HCl缓冲液，即得粗酶液。

(2)III-3-A酶蛋白的分离纯化：

(a)离子交换层析

将50mL的粗酶液加到预先用pH8.0 Tris-HCl缓冲液充分平衡的DEAE-Sepharose CL-6B层析柱，依次用含0.4M、0.45M、1M NaCl的pH8.0Tris-HCl缓冲液进行梯度洗脱，并收集有酶活的洗脱峰，将此酶活峰收集、合并、透析、浓缩后进行SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳检测。

(b)凝胶过滤层析

将DEAE-Sepharose CL-6B离子交换层析所得的酶活峰透析浓缩，通过Hiload 16/60Superdex 200pg预装柱进行凝胶过滤层析。先用两倍柱体积的pH8.0Tris-HCl缓冲液平衡层析柱，待基线稳定后取10mL样品上样，收集凝胶过滤层析的酶活峰并通过透析浓缩，得到碱性内切葡聚糖酶III-3-A酶蛋白。

所述III-3-A酶蛋白编码的氨基酸序列如下：MMLRKKTKQLISSTLILVLLLSLFPTALAAEGNTREDNFNHLLGNDNVKRPSEAGALQLQ EVDGQMTLVDQDGEKIQLRGMSTHGLQWFPEILNDNAYKALTNDWESNMIRLAMYVG ENGYASNPDLIKSRVIKGIDLAIENDMYVIVDWHVHAPGDPRDPVYAGAEDFFREIAALY PNNPHIIYELANEPSSNNNGGAGIPNNEEGWNAVKEYADPIVEMLRESGNADDNIIIVGSP NWSQRPDLAADNPIDDHHTMYTVHFYTGSHAASTESYPPETPNSERGNVMSNTRYALEN GVAVFATEWGTSQASGDGGPYFDEADVWIEFLNENNISWANWSLTNKNEVSGAFTPFEL GKSNATNLDPGPDHVWAPEELSLSGEYVRARIKGVNYEPIDRTKYTKVLWDFNDGTKQG FGVNGDSPNKELIAVDNENNTLKISGLDVSNDVSDGNYWANARLSANGWGKSVDILGA EKLTMDVIVDEPTTVAIAAIPQGPSANWINPICAVKVEPTDFVPFGDKFKAELTITTADSPAI EAIAMHAENNNMNNIILFVGTDAADVIYLDNIKVIGTEVEIPVVHNPKGEAVLPSNFEDG TRQGWDWAGESGVKTALTIEEANGSNALSWEFGYPEVKPSDNWATAPRLDFWKSDLVR GENDYVAFDFYLDPVRATEGAMNINLVFQPPTNGYWVQAPQTFTVDFEELDQANQVDG LYHYEVKINVRDITNVQDDTLLRNMMIIFADVQSDFAGRVFVDNVRFEVAATGPIEPEPV DPGEEAPPVDEKEAAKEEREAARGAEKEEREAVKAEREVAREAAKEERETAKEEKKEAT KK-。

所述碱性内切葡聚糖酶III-3-A酶蛋白的MALDI-TOF质谱分析得到质荷比分别为1355.6392、1449.6802、1484.7736、1531.7273、1582.8152、1754.8843、1874.9072、2062.0493、2126.0027、2211.0094、2367.2075、2953.2473、3428.5294的特征峰。碱性内切葡聚糖酶III-3-A蛋白分子量约为89kD，等电点约为4.3，比活力约为420U/mL；最适pH为8.0～10.0左右；在pH 6～11的范围内，酶活性均可保持80％以上；最适反应温度为40～50℃左右；具有耐Na⁺、K⁺、Mg²⁺、Cu²⁺、Fe²⁺或Ca²⁺等金属离子的良好特性，SDS对III-3-A的酶活性有部分抑制作用，但螯合剂EDTA或EGTA对酶活性影响甚微。将碱性内切葡聚糖酶III-3-A置于终浓度为0.1％的洗涤剂(立白洗衣粉)中保存10min后其残余酶活高达到80％以上，表明III-3-A酶性质优良，符合洗涤剂和纺织等工业用酶的基本要求。

所述嗜碱芽孢杆菌Bacillus sp.III-3产生的中性内切葡聚糖酶III-3-B，是按下述方法制备的：

(1)菌种液体发酵培养：

将嗜碱芽孢杆菌Bacillus sp.III-3菌种接到50mL液体发酵培养基中，于30～35℃、150r/min条件下培养48h，将培养48h的发酵液以14000r/min的转速冷冻离心20min，上清液加入四倍体积的pH 8.0的Tris-HCl缓冲液，即得粗酶液。

(2)III-3-B酶蛋白的分离纯化：

(a)疏水层析

用平衡液为含1M硫酸铵的pH 8.0Tris-HCl缓冲液对Phenyl Sepharose 6Fast Flow(high sub)疏水层析柱平衡后，将Bacillus sp.III-3菌培养48h的粗酶液12000r/min离心后取上清液上样，先用含0.1M(NH₄)₂SO₄的pH8.0Tris-HCl缓冲液进行阶段洗脱后，再用不含硫酸铵的pH 8.0Tris-HCl缓冲液进行洗脱，收集酶活峰。

(b)III-3-B离子交换层析

将上述酶活性峰收集到的样品合并、透析后，上预先用pH 8.0Tris-HCl平衡液充分平衡的DEAE-Sepharose Fast Flow离子交换柱，先用NaCl浓度为0.3M的pH8.0Tris-HCl缓冲液洗脱，再用NaCl浓度为0.35M的pH8.0Tris-HCl缓冲液洗脱，收集酶活峰，得到中性内切葡聚糖酶III-3-B蛋白。

所述中性内切葡聚糖酶III-3-B的MALDI-TOF质谱分析得到质荷比分别为1355.6392、1449.6802、1484.7736、1531.7273、1582.8152、1754.8843、1874.9072、2062.0493、2126.0027、2211.0094、2367.2075、2953.2473、3428.5294的特征峰。中性内切葡聚糖酶III-3-B蛋白分子量约为45kD；最适pH为6～8左右；最适反应温度为40～50℃左右；对Na⁺、K⁺、Mg²⁺、Cu²⁺、Fe²⁺或Ca²⁺等金属离子及SDS、EDTA或EGTA等表面活性剂均具有良好的耐受性，表明III-3-B酶性质优良，符合洗涤剂和纺织等工业用酶的基本要求。

所述嗜碱芽孢杆菌Bacillus sp.III-3产生的碱性内切葡聚糖酶III-3-A在洗涤剂或纺织品等工业中的应用。

所述嗜碱芽孢杆菌Bacillus sp.III-3产生的中性内切葡聚糖酶III-3-B在洗涤剂或纺织品等工业中的应用。

本发明与现有技术相比，具有如下优点和有益效果：

(1)本发明所筛选到的Bacillus sp.III-3属于嗜碱的极端微生物。与当前工业用酶菌株相比，其可在高碱性条件下(pH9.0)培养，具有可有效抑制杂菌污染，有利于大规模的发酵生产的特点。

(2)本发明嗜碱芽孢杆菌Bacillus sp.III-3产生的碱性内切葡聚糖酶III-3-A比活力达420U/mL；III-3-A酶最适pH为8.0～10.0左右；在pH 6～11的范围内，酶活性均可保持80％以上；在55℃以下酶活性稳定。碱性内切葡聚糖酶III-3-A酶蛋白具有耐Na⁺、K⁺、Mg²⁺、Cu²⁺、Fe²⁺或Ca²⁺等金属离子及EDTA或EGTA等的良好特性。将碱性内切葡聚糖酶III-3-A置于终浓度为0.1％的洗涤剂(立白洗衣粉)中保存10min后其残余酶活高达到80％以上，表明碱性内切葡聚糖酶性质优良，在洗涤剂及纺织等工业中具有非常良好的应用前景。本发明可填补目前在研究碱性内切葡聚糖领域所存在的诸如酶比活力低或耐金属离子和表面活性剂及热等能力差等不足。

(3)嗜碱芽孢杆菌主要产生一些碱性酶类，迄今尚未见嗜碱菌产生中性内切葡聚糖酶的报道。嗜碱芽孢杆菌Bacillus sp.III-3产生的中性内切葡聚糖酶III-3-B对Na⁺、K⁺、Mg²⁺、Cu²⁺、Fe²⁺或Ca²⁺等金属离子及SDS、EDTA或EGTA等表面活性剂均具有良好的耐受性。III-3-B酶在纺织品酶洗整理及洗涤剂等工业中具有非常重要的应用价值。根据质谱分析结果结合酶学特性层面分析，中性内切葡聚糖酶III-3-B为一个新发现的优质中性内切葡聚糖酶蛋白。

附图说明

图1为碱性内切葡聚糖酶III-3-A分离纯化的SDS-PAGE电泳图谱。

其中，1：Hiload 16/60Superdex 200pg酶活峰；2：DEAE Sepharose CL 6B酶活峰；3：粗酶液；M：Marker。

图2为中性内切葡聚糖酶III-3-B分离纯化的SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳图谱。

1：Marker，由上到下分别为120KD、79KD、46KD、41KD、31KD、14KD；2：粗酶液；3：Phenyl Sepharose Fast Flow(high sub)疏水层析的酶活峰；4、5、6：DEAE Sepharose Fast Flow离子交换层析酶活峰，不同上样量，分别为8、15、30μL。

图3为碱性内切葡聚糖酶III-3-A的MALDI-TOF质谱分析图谱。

图4为中性内切葡聚糖酶III-3-B的MALDI-TOF质谱分析图谱。

具体实施方式

下面结合实施例及附图对本发明作进一步详细的描述，但本发明的实施方式不限于此。

(一)材料

1.菌种

嗜碱芽孢杆菌Bacillus sp.III-3是从造纸厂碱性淤泥中筛选得到的产内切葡聚糖酶菌株。菌种保藏单位：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏日：2007年8月22日，保藏号：CGMCC No.2138。

2.培养基(质量百分比)

斜面培养基：1％可溶性淀粉、0.5％复合蛋白胨、0.5％酵母粉、0.1％KH₂PO₄、0.02％MgSO₄·7H₂O、1％NaCl、0.5％Na₂CO₃(分开灭菌)、1.5％琼脂。

液体发酵培养基：1％复合蛋白胨、0.5％酵母粉、0.5％NaCl、0.1％KH₂PO₄、0.25％Na₂HPO₄·12H₂O、2.0％CMC-Na、0.5％Na₂CO₃(分开灭菌)。

3.主要试剂

疏水层析介质Phenyl Sepharose 6Fast Flow(high sub)，离子交换层析介质DEAE Sepharose Fast Flow和DEAE Sepharose CL-6B)凝胶过滤层析介质Superdex 75prep grade，凝胶过滤层析柱Hiload 16/60Superdex 200pg Column均购自Amersham Pharmacia Biotech.，Uppsala，Sweden公司。BCA蛋白质定量测定试剂盒K3001，购自上海申能博采生物科技有限公司。Acrylamide、N，N-甲叉双丙烯酰胺由Serva进口分装。其它化学试剂均为市售分析纯。

(二)实验方法

1.菌种液体发酵培养

将嗜碱芽孢杆菌Bacillus sp.III-3菌种由斜面接到50mL(250mL三角瓶)种子液体培养基中，于35℃、150r/min下培养4h，制成种子液。然后按2％体积的接种量将种子液加到50mL(250mL三角瓶)液体发酵培养基中，于32℃、150r/min条件下培养48h。将48h发酵液以14000r/min的转速冷冻离心20min，上清液加入四倍体积的pH 8.0Tris-HCl缓冲液，即得粗酶液，并置于-20℃保存备用。

2.酶活性(CMC酶)测定

取1％的羧甲基纤维素钠(CMC-Na)溶液1mL作为底物，加入0.1mL上述酶溶液，在40℃下反应30min，中性内切葡聚糖酶活力测定控制反应pH值为7.0，碱性内切葡聚糖酶活力测定控制反应pH值为9.0。终止反应后，用DNS法于540nm测定还原糖，并扣除空白试验测定值。将上述条件下每小时由底物产生1.0mg还原糖所需的酶量定义为一个酶活力单位，用U/mL表示。菌体浓度采用比色法进行测定。将稀释的菌液于600nm波长下测定吸光值，对照采用同样稀释度的培养基。

3.SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳

按常规方法SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳，分离胶、浓缩胶浓度分别为12％和5％，电极缓冲液为pH 8.3Tris-Gly缓冲液，考马斯亮蓝染色。

4.蛋白浓度测定方法

使用上海申能博采生物科技有限公司生产的BCA蛋白质定量测定试剂盒K3001测蛋白浓度。

5.III-3-A蛋白的分离纯化

(1)离子交换层析

离子交换层析的介质为DEAE Sepharose CL-6B。缓冲液体系采用pH值为8.0的Tris-HCl缓冲液，平衡液为pH 8.0Tris-HCl缓冲液，洗脱液为含NaCl的pH 8.0Tris-HCl缓冲液。取100ml凝胶小心灌入层析柱(Φ2.6cm×30cm)中，使凝胶均匀且无气泡。用300ml的平衡液进行平衡，直至A280稳定后上样(粗酶液)，待穿透峰出现之后开始洗脱。用含不同浓度NaCl(0.4M、0.45M、1M)的pH 8.0Tris-HCl以180ml·h^-1的流速进行梯度洗脱，收集酶活峰，透析过夜。

(2)凝胶过滤层析

凝胶过滤层析柱为Hiload 16/60Superdex 200pg Column。缓冲液体系采用pH值为8.0的Tris-HCl缓冲液。将离子交换层析所得酶活峰透析后用PEG-20000进行浓缩，取10mL上预先用pH 8.0的Tris-HCl缓冲液平衡好的层析柱，以60ml·h^-1的流速用0.01M Tris-HCl buffer(pH8.0)洗脱，收集具有CMC酶活性的洗脱峰，并置于4℃保存备用。

6.III-3-B蛋白的分离纯化

(1)Phenyl Sepharose 6Fast Flow(high sub)疏水层析

层析介质为Phenyl Sepharose 6Fast Flow(high sub)。缓冲液体系采用pH8.0的Tris-HCl缓冲液，平衡液为含1M硫酸铵的pH 8.0Tris-HCl缓冲液，洗脱液为不含硫酸铵的pH8.0Tris-HCl缓冲液。取10mL凝胶小心灌入层析柱(Φ2.6cm×30cm)中，用含1M硫酸铵的pH 8.0Tris-HCl平衡液进行平衡，直至A280稳定后上样(粗酶液)，待穿透峰出现后，用不含硫酸铵的pH 8.0Tris-HCl进行洗脱，收集酶活峰，透析过夜。

(2)DEAE Sepharose Fast Flow离子交换层析

层析介质为DEAE Sepharose Fast Flow，缓冲液体系采用pH值为8.0的Tris-HCl缓冲液，平衡液为pH 8.0Tris-HCl缓冲液，洗脱液为含NaCl pH8.0Tris-HCl缓冲液。用300ml的平衡液对层析柱进行平衡，直至A280稳定。然后把疏水层析所得酶活峰透析后加入到平衡好的层析柱上，用含NaCl的pH8.0Tris-HCl缓冲液洗脱，收集具有CMC酶活性的洗脱峰。

7.质谱分析

样品经胰蛋白酶处理后采用MALDI-TOF MS，并用ABI 4700proteomicsanalyzer(Applied Biosystems，Framingham，MA)进行处理。所得质谱数据用Applied Biosystems Data Explorer software package进行搜索。质谱分析的样品制备过程如下：

(1)将酶蛋白SDS-PAGE电泳，切下目的蛋白的条带并收集于1.5mL微型离心管中(在安静空气流通不大的地方)。

(2)加入50％乙氰-25mM NH₄HCO₃(约150μl)反复脱色、温控摇床中操作，每隔半小时一次，共五次。然后在37℃条件下，离心400gX5～15min，风干。

(3)加入1.5mg/ml DTT-25mM NH₄HCO₃ 100～300μl(新鲜配制)，56℃水浴浸泡或者温控振荡(300rmp)1h，弃去上清液。

(4)加入10mg/ml IAA-25mM NH₄HCO₃ 100～300μl(新鲜配制，避光)，37℃暗室浸泡45min，弃去上清液。

(5)用100mM NH₄HCO₃冲洗一次，10min，然后弃去上清液。

(6)加入50％乙氰-25mM NH₄HCO₃ 100～300μl，然后指弹振荡5min，弃去上清液(除尽)，过夜，干燥至极干燥为止。

(7)加入7μl 0.1mg/mL胰蛋白酶和100μl 100mmol/L NH₄HCO₃水溶液使胶充分浸润，振荡后在37℃下保温2h。

(8)充分酶解后，加入200μL 0.2％的三氟乙酸(TFA)，在800run/min、40℃下振荡2h，收集上清于新的微型离心管。剩余的胶加入200μL 0.2％TFA(三氟乙酸)后于800r/min、40℃下振荡4h，累积上清于同一微型离心管中。

(9)真空干燥，粉末采用0.2％TFA(三氟乙酸)溶解，所得上清即可用于质谱检测。

二、实验结果

(一)酶蛋白的分离纯化

1.碱性内切葡聚糖酶III-3-A酶蛋白的分离纯化

将所收集的凝胶过滤层析的酶活峰通过透析浓缩后进行SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳(如图1电泳图的第1泳道)，仅见一条明显的蛋白条带，说明基本达到分离纯化的要求。

III-3-A分离纯化结果如表3-1所示。结果表明，该酶共提纯280倍，比活力达420U/mg，酶活回收率为16.6％。

2.中性内切葡聚糖酶III-3-B蛋白的分离纯化

将所收集的离子交换的酶活峰通过用PEG-20000浓缩后进行SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳检测(如图2)。从图2可见，电泳检测为单一蛋白条带(第4、5、6泳道)，达到分离纯化的预期效果。目的蛋白条带在疏水层析所得酶液电泳图谱和粗酶液电泳图谱中的相应位置均比较暗，说明III-3-B酶蛋白在Bacillus sp.III-3发酵液中含量比较低。

III-3-B酶蛋白的分离纯化结果见表3-1。结果表明，经过两步分离纯化后，总蛋白含量大幅下降，说明杂质蛋白被大量去除了，共提纯155倍，比活大大提高，达到232U/mg。纯化后的酶稳定性也很好，在4℃保存下，7日内酶活无显著下降。说明该中性内切葡聚糖酶性质稳定，比活力高，具有很好的应用价值。

表3-1III-3-A和III-3-B的分离纯化

(二)III-3-A和III-3-B的酶学性质研究

1.酶蛋白分子量的测定

用SDS-PAGE电泳法测定，结果如图1和图2。电泳后用GelDoc2000(Bio-Rad)进行凝胶扫描。运用扫描系统自带软件Quantity One进行分子量测定，测得碱性内切葡聚糖酶III-3-A和中性内切葡聚糖酶III-3-B蛋白分子量分别约为89kD和45kD。III-3-A属于高分子量的内切葡聚糖酶(分子量80～100kD)，而III-3-B属于低分子量的内切葡聚糖酶(分子量25～50kD)。

2.酶的最适pH

取0.1mLIII-3-A纯酶液和0.1mLIII-3-B纯酶液，分别加到不同pH值的1％CMC-Na溶液，按常规方法测定酶活力。结果可见，III-3-A酶的最适pH为8～10左右，为一典型的碱性内切葡聚糖酶；而III-3-B酶的最适pH为6～8左右，为一典型的中性内切葡聚糖酶。III-3-A和III-3-B在弱酸性、中性和碱性(pH6～10)范围内均具有较高的酶活性，具有pH适应范围广的共同特点。这说明由嗜碱芽孢杆菌Bacillus sp.III-3产生的碱性内切葡聚糖酶III-3-A和中性内切葡聚糖酶III-3-B在洗涤剂及纺织品等工业中均具有良好的应用潜力。

3.酶反应的pH稳定性

为研究III-3-A和III-3-B的pH稳定性，分别将纯酶液置于不同的pH条件下保存30min，再按常规方法分别于pH 9.0和7.0条件下测定其酶活力。结果表明，碱性内切葡聚糖酶III-3-A在pH 6～11的范围内和中性内切葡聚糖酶III-3-B在5～9的范围内，酶活性均可保持80％以上。可见，III-3-A和III-3-B在弱酸和中碱性条件下均具较强的稳定性。

4.酶的最适反应温度

将III-3-A纯酶液和III-3-B纯酶液分别置于含5mM CaCl₂和不含CaCl₂的1％CMC-Na溶液中，分别于不同温度条件下反应20min，测定其酶活力。结果说明，III-3-A和III-3-B的最适反应温度均为40～50℃左右。加入5mM CaCl₂能使III-3-A和III-3-B酶的最适反应温度均提高5℃左右。

5.酶的热稳定性

将III-3-A纯酶液和IH-3-B纯酶液分别置于含5mM CaCl₂和不含CaCl₂的1％CMC-Na溶液中，分别置于不同的温度条件下(30℃～80℃)保温10min，然后于40℃反应20min测定其酶活力。结果表明，III-3-A和III-3-B酶在55℃以下均具有良好的热稳定性，显示它们在生产应用方面的良好应用前景。另外，加入Ca²⁺可以显著提高III-3-A在50℃～80℃的热稳定性，使其在60℃时仍保持较高稳定性，70℃仍有少量酶活力；而加入Ca²⁺对III-3-B酶的热稳定性影响甚微。

6.金属离子及表面活性剂对酶活性的影响

将III-3-A和III-3-B酶蛋白分别置于终浓度为1mM的各种金属离子以及0.05％EDTA，0.05％EGTA，0.01％SDS中，30℃保存10min后按照常规方法测定其酶活力。结果表明，III-3-A酶蛋白具有耐Na⁺、K⁺、Mg²⁺、Cu²⁺、Fe²⁺或Ca²⁺等金属离子的良好特性，SDS对III-3-A的酶活性有部分抑制作用，但螯合剂EDTA或EGTA对酶活性影响甚微；而III-3-B对上述金属离子及SDS、EDTA或EGTA等表面活性剂均具有良好的耐受性，表明III-3-B酶符合纺织及洗涤剂等工业用酶的基本要求。为进一步测验III-3-A酶在洗涤剂工业上的应用潜力，将III-3-A置于终浓度为0.1％的洗涤剂(市售立白洗衣粉)中保存10min后按常规方法测定其酶活力，发现其残余酶活高达到80％以上，表明III-3-A酶性质也比较优良，符合洗涤剂及纺织等工业用酶的基本要求。

(三)III-3-A和III-3-B的质谱鉴定

将分离纯化得到的III-3-A和III-3-B进行SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳，将条带切下，进行质谱前处理，然后进行MALDI-TOF质谱分析。

碱性内切葡聚糖酶III-3-A质谱分析结果如图3。由图3得到质荷比分别为833.4243、848.4665、862.4368、878.4152、931.5079、1062.5212、1194.5828、1319.5923、1335.6595、1386.6362、2953.2993、1919.881的特征峰。将其特征峰质荷比进行数据库比对，结果发现碱性内切葡聚糖酶III-3-A与文献中5种内切葡聚糖酶具有某些同源性，在分类学上属于第5家族的内切葡聚糖酶。III-3-A蛋白的质谱分析所得的肽段由表3-2所示。表3-2的肽段氨基酸通过数据库比对进一步证实了来源于Bacillus sp.III-3的碱性内切葡聚糖酶III-3-A与下列5种碱性内切葡聚糖酶之间的某些同源性。

(1)内切葡聚糖酶(内切-1，4-β-葡聚糖酶)(来源于strain1139)；

(2)碱性纤维素酶(EC3.2.1.4)(来源于Bacillus sp.KSM64)；

(3)内切-1，4-β-葡聚糖酶(来源于Bacillus sp.NW-2004a)；

(4)纤维素酶(EC3.2.1.4)(来源于Bacillus sp.22-28)；

(5)碱性纤维素酶(EC 3.2.1.4)(来源于Bacillus sp.KSM-S237)。

中性内切葡聚糖酶III-3-B的MALDI-TOF质谱分析结果由图4所示。由图4得到质荷比分别为1355.6392、1449.6802、1484.7736、1531.7273、1582.8152、1754.8843、1874.9072、2062.0493、2126.0027、2211.0094、2367.2075、2953.2473、3428.5294的特征峰。然而，通过质谱数据库搜索发现，目前尚未见与III-3-B相似性较高的酶蛋白。在酶学性质方面，中性内切葡聚糖酶III-3-B具有耐热、耐金属离子和表面活性剂等特性，目前尚未发现与其酶学特性相同的内切葡聚糖酶。因此，根据质谱分析结果结合酶学特性层面分析，中性内切葡聚糖酶III-3-B为一个新的中性内切葡聚糖酶蛋白。

表3-2III-3-A蛋白的质谱分析所得的肽段

特征峰       质荷比       理论质荷比                氨基酸序列

1            833.4243     833.4152         LSADGWGK

2            848.4665     848.4624         VFVDNVR

3            862.4368     862.4152         EAEKEEK

4            878.4152     878.4149         GNVMSNTR

5            931.5079     931.5094         SVDILGAEK

6            1062.5212    1062.5214        GVNYEPIDR

7            1194.5828    1194.5789        VLWDFNDGTK

8            1319.5923    1319.6014        QGWDWAGESGVK

9            1335.6595    1335.6613        EYADPIVEMLR

10           1386.6362    1386.6323        DPVYAGAEDFFR

11           2953.2993    2953.3711        LSGLDASNDVSEGNYWANARLSADGWGK

12           1919.881     1919.8795        GENDYVAFDFYLDPVR

上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。

Claims (2)

1.一种嗜碱芽孢杆菌(Bacillus sp.)III-3，其特征在于：所述嗜碱芽孢杆菌是产内切葡聚糖酶菌株，菌种保藏单位：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏日：2007年8月22日，保藏号：CGMCC No.2138。

2.权利要求1所述的嗜碱芽孢杆菌的液体发酵培养基，其特征在于：所述液体发酵培养基的成分按质量百分比计为：1％复合蛋白胨，0.5％酵母粉，0.5％NaCl，0.1％KH₂PO₄，0.25％Na₂HPO₄·12H₂O，2％CMC-Na，0.5％Na₂CO₃。

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