CN106591264B - 一种内切葡聚糖酶促进因子 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种内切葡聚糖酶促进因子，其是以VB1，VB2、MgSO4及大豆多糖为原料混合制备而成。与未使用内切葡聚糖酶促进因子相比，在基础培养基中加入该内切葡聚糖酶促进因子可显著提高枯草芽孢杆菌SB13、地衣芽孢杆菌BL14产内切葡聚糖酶的能力，因此，将其用于枯草芽孢杆菌SB13、地衣芽孢杆菌BL14等产内切葡聚糖酶细菌的培养，有利于利用该类菌获得高产的内切葡聚糖酶制品，并可应用于能源、食品工业及环境污染治理等领域。
Description
技术领域
本发明属于酶制剂领域，具体涉及一种内切葡聚糖酶促进因子。
背景技术
纤维素分解酶系广泛应用于具有许多重要的生物技术领域，例如：食品、饲料、饮料、纺织品、造纸和乙醇燃料等生产工业。根据酶的活性，纤维素复合酶系可分为内切葡聚糖酶、外切葡聚糖酶和β-葡聚糖苷酶。内切葡聚糖酶负责最初始的分解，主要作用于纤维素的非结晶区域，通过随机切断β-1,4-糖苷键，从而降解纤维素，释放出不同长度的短链低聚糖，如纤维寡糖、纤维三糖等，这些低聚糖通过外切葡聚糖酶作用分解成纤维二糖，最后通过β-葡聚糖苷酶分解成单糖。
内切葡聚糖酶的活力大小直接影响纤维素的降解效率，为提高各菌产内切葡聚糖酶的效率，采用自然筛选、诱变育种、基因工程手段选育高产内切葡聚糖酶的菌株，或通过化学修饰法改造纤维素酶分子等手段已被大量使用，但要获得高效内切葡聚糖酶并使其能更好的应用于各领域，对有效菌株产内切葡聚糖酶的能力做进一步的提升意义重大。
加入内切葡聚糖酶促进因子可以为现有的高效野生菌或基因工程菌酶活力的进一步提升起到很好的辅助作用。目前关于内切葡聚糖酶促进因子的研究甚少，主要体现在添加特异金属离子或者表面活性剂等提高酶活力，但其提高效率极其有限。因此，研究制备其它内切葡聚糖促进因子，以提高内切葡聚糖酶的产酶活力，可产生很好的经济价值和社会效益，对食品加工、能源及环境污染的治理方面都有重要意义。
发明内容
本发明的目的在于提供一种内切葡聚糖酶促进因子，将其应用于枯草芽孢杆菌SB13、地衣芽孢杆菌BL14等产内切葡聚糖酶细菌的培养，可使其产酶效率显著提高，为该酶更好的应用于能源、食品及环境污染治理领域提供帮助。
为实现上述目的，本发明采用如下技术方案：
一种内切葡聚糖酶促进因子，是以VB1、VB2、MgSO4和大豆多糖为原料混合制成；各原料用量按重量百分数计为：VB1 7.4%、VB2 18.5%、MgSO4 59.3%、大豆多糖14.8%。
所述大豆多糖的制备包括如下步骤：
1）将黄豆与水按重量比1:8混合研磨至均匀，倒入干净的8层纱布中，拧干，弃去豆渣；将所得豆浆煮沸后加入硫酸钙水溶液混合均匀（硫酸钙的用量为黄豆重量的2.5%），静置凝固后，倒入8层纱布分离豆腐与废水，所得废水用定量中速滤纸进行真空抽滤以去除大分子物质后获得豆腐废水；
2）将豆腐废水加热浓缩至30mg/mL，按浓缩液体积的10%加入质量浓度40%的三氯乙酸溶液，混匀静置30min，然后在4℃、5000r/min条件下离心10min，得上清液；
3）在所得上清液中加入其4倍体积的无水乙醇，混匀后出现沉淀，再在4℃、6500r/min条件下离心5min，弃去上清液；在所得沉淀物中加入其体积50%的丙酮，混匀洗涤2~3次，4℃、6500r/min条件下离心5min，所得沉淀物于常温下风干，研磨成粉末即得所述大豆多糖。
本发明所得内切葡聚糖酶促进因子具有显著提高部分细菌产内切葡聚糖酶的能力，可用于枯草芽孢杆菌SB13、地衣芽孢杆菌BL14等产内切葡聚糖酶细菌的培养。
通过大量研究表明，将由VB1、VB2、MgSO4及大豆多糖组成的内切葡聚糖酶促进因子以2.7%（w/v）的量加入到基础培养基中进行发酵培养，可使枯草芽孢杆菌SB13及地衣芽孢杆菌BL14产内切葡聚糖酶的活力得到极大的提高。说明该产品有利于显著提高该两种菌产内切葡聚糖酶的活力，具有极好的应用价值。
具体实施方式
为了使本发明所述的内容更加便于理解，下面结合具体实施方式对本发明所述的技术方案做进一步的说明，但是本发明不仅限于此。
所用枯草芽孢杆菌SB13、地衣芽孢杆菌BL14为实验室自有菌种。
所述大豆多糖的制备包括如下步骤：
1）称取适量黄豆提前一夜浸泡；然后将黄豆与水按重量比1:8分次加入豆浆机中研磨至均匀，将全部研磨好的豆浆倒入干净的8层纱布中，拧干，弃去豆渣；将所得豆浆煮沸后加入硫酸钙水溶液（硫酸钙的用量为黄豆重量的2.5%），用舀翻动直至出现大量絮状物，立即倒入干净盆中，使其凝固冷却后倒入8层纱布，用重物将豆腐压滤干，豆腐废水顺纱布而下，所得废水用定量中速滤纸进行真空抽滤以去除大分子物质后获得豆腐废水，调节pH7.0~7.2；
2）将所得豆腐废水加热浓缩至30mg/mL，按浓缩液体积的10%加入质量浓度40%的三氯乙酸溶液（将400g三氯乙酸加水定容至1L），混匀静置30min，然后在4℃、5000r/min条件下离心10min，得上清液；
3）在所得上清液中加入其4倍体积的无水乙醇，混匀后出现沉淀，再在4℃、6500r/min条件下离心5min，弃去上清液；在所得沉淀物中加入其体积50%的丙酮，混匀洗涤2~3次，4℃、6500r/min条件下离心5min，所得沉淀物于常温下风干，研磨成粉末即得所述大豆多糖。
所用基础培养基配方为：蛋白胨10.0g、牛肉粉5.0 g、NaCl 5.0g。其制备方法为：将上述成分加入蒸馏水中，定容到1000 mL，搅拌溶解，调节pH 7.0~7.2，分装后121℃高压灭菌20 min。（注：固体培养基在这基础上加琼脂粉20.0g）
一、促进因子组合的筛选研究
1、各促进因子的筛选
根据表1中的浓度分别称取各因子于锥形瓶中，然后各加入50mL基础培养基，调pH至7.0，121℃高压灭菌20min，再分别接种0.5mL枯草芽孢杆菌SB13的菌种母液，各做三个平行，37℃、160r /min培养20h后取出，以未加离子的培养基为对照，测定酶活力，并按下式计算相对酶活力，结果如见表1，
相对酶活力（%）=样品酶活力/对照酶活力×100。
酶活力检测方法：取2mL培养好的菌液，4℃、10000rpm/min离心10min，取0.3mL上清液于试管中（以100℃水浴15min失活酶液为对照），加入1% CMC-Na溶液0.5mL，0.05mol/L磷酸缓冲液（pH=6.0）0.7mL，50℃水浴反应45min，最后加入0.5mL DNS溶液，100℃水浴5min.取出冷却，在540nm波长处测酶活。
表1 各因子对枯草芽孢杆菌SB13产内切葡聚糖酶的影响
从表1可知，MgSO4、VB1、VB2、大豆多糖对枯草芽孢杆菌SB13产内切葡聚糖酶的相对酶活分别为114.66%、111.24%、165.72%和152.61，说明以上物质对枯草芽孢杆菌SB13产内切葡聚糖酶有极好的促进作用。
2、促进因子最佳浓度筛选
配制含各浓度VB1、VB2、MgSO4、大豆多糖的培养液，并将其分装到加有50mL基础培养基的锥形瓶中，高压灭菌后接种枯草芽孢杆菌SB13，37℃、160r /min培养20h后测酶活，并计算相对酶活力，结果见表2-表5。
表2 最佳产内切葡聚糖酶的VB1浓度筛选
表3 最佳产内切葡聚糖酶的VB2浓度筛选
表4 最佳产内切葡聚糖酶的MgSO4浓度筛选
表5 最佳产内切葡聚糖酶的大豆多糖浓度筛选
从表2-表5可知，VB1的最佳促进产酶浓度为0.20%，VB2的最佳促进产酶浓度为0.40%，MgSO4的最佳促进产酶浓度为1.5%，大豆多糖最佳产酶浓度为0.80%。
、最佳促进因子组合的筛选获得
采用正交法对影响枯草芽孢杆菌SB13酶活性的最佳工艺因素进行优化，分别选用VB1、VB2、MgSO4、大豆多糖4个因素、3个水平进行L934正交设计，正交设计的因素水平见表6，正交试验结果见表7。
表6 正交设计因素水平表
表7 正交试验结果分析
极差R的大小可见因素对试验指标的影响为B>D>A>C，即VB2影响最大，其次是多糖，而VB1、镁离子影响最小；以试验结果中四个因素的优水平组合A3B3C3D1为本试验的最优水平组合，即枯草芽孢杆菌葡聚糖内切酶影响因子的最优工艺条件为0.2%VB1，0.5%VB2，1.6%MgSO4，0.4%大豆多糖。
二、促进因子的应用实验研究
根据以上结果，按原料干重比例（即7.4%VB1，18.5%VB2，59.3%MgSO4，14.8%大豆多糖）将VB1、VB2、MgSO4与大豆多糖混合成内切葡聚糖酶促进因子，然后将其以2.7%的量加入基础培养基中，121℃高压灭菌20 min，以体积比0.5%的量分别接种枯草芽孢杆菌SB13及地衣芽孢杆菌BL14，37℃、160r /min培养20h后测酶活，计算相对酶活，结果见表8。
表8 内切葡聚糖酶促进因子对菌产酶促进效果
如表8所示，与未加入促进因子的对照相比，加入该内切葡聚糖酶促进因子以后，枯草芽孢杆菌SB13与地衣芽孢杆菌BL14的产内切葡聚糖酶相对酶活分别为293.05%和173.27%，是未加时的2.93倍和1.73倍，说明该促进因子可以大大提高枯草芽孢杆菌SB13与地衣芽孢杆菌BL14的产酶效率，将该促进因子应用于该两种菌时，对其产酶效果有极好的促进作用。
以上所述仅为本发明的较佳实施例，凡依本发明申请专利范围所做的均等变化与修饰，皆应属本发明的涵盖范围。
Claims (4)
1.一种内切葡聚糖酶促进因子，其特征在于：由VB1、VB2、MgSO4和大豆多糖为原料混合制成；
各原料用量按重量百分数计为：VB1 7.4%、VB2 18.5%、MgSO4 59.3%、大豆多糖14.8%；
所述大豆多糖的制备包括如下步骤：
1）将黄豆与水按重量比1:8混合研磨至均匀，8层纱布过滤，拧干，所得豆浆煮沸后加入硫酸钙水溶液混合均匀，静置凝固后，倒入8层纱布分离豆腐与废水，所得废水用定量中速滤纸进行真空抽滤以去除大分子物质后获得豆腐废水；
2）将豆腐废水加热浓缩至30mg/mL，按浓缩液体积10%加入质量浓度40%的三氯乙酸溶液，混匀静置30min，然后在4℃、5000r/min条件下离心10min，得上清液；
3）在所得上清液中加入其4倍体积的无水乙醇，混匀后在4℃、6500r/min条件下离心5min，弃去上清液；在所得沉淀物中加入其体积50%的丙酮，混匀洗涤2~3次，4℃、6500r/min条件下离心5min，所得沉淀物于常温风干后研磨成粉末即得。
2.根据权利要求1所述的内切葡聚糖酶促进因子，其特征在于：硫酸钙的用量为黄豆重量的2.5%。
3.一种如权利要求1所述内切葡聚糖酶促进因子在培养产内切葡聚糖酶细菌中的应用，其特征在于：其应用方法是按每100mL基础培养基加入2.7g所述内切葡聚糖酶促进因子。
4.根据权利要求3所述应用，其特征在于：所述产内切葡聚糖酶细菌为枯草芽孢杆菌SB13。
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