CN116589317B - 一种缓释有机多肽组合物及其制备方法和应用 - Google Patents
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Abstract
本发明提出了一种缓释有机多肽组合物及其制备方法和应用，属于植物调节剂技术领域。将大豆经过脱毒处理后，与大麦、玉米混合经过预酶解，与无机盐和无菌水混合得到培养基，接种活化的黑曲霉、纳豆芽孢杆菌菌种种子液，并加入复合蛋白酶，发酵酶解，过滤，冷冻干燥，得到发酵酶解产物，与金属离子螯合后，经过明胶和黄原胶包埋，制得缓释有机多肽组合物。本发明制得缓释有机多肽组合物富含氨基酸与小肽，以及铁、锌等微量元素，易被作物直接吸收利用，用于合成各种酶类，诱导基因表达，平衡作物体内激素生理代谢等，同时还可促进作物对矿质元素的吸收，改善农田环境。
Description
技术领域
本发明涉及植物调节剂技术领域，具体涉及一种缓释有机多肽组合物及其制备方法和应用。
背景技术
我国农业在近几十年的发展下，为了达到增产增收的效益，大量施用化学肥料和化学原料所制成的液体肥料，虽然可对农作物产量做出贡献，但同时不断造成农作物品质和风味下降及化学残留等问题，甚至使土壤恶化、无法持续利用和病害增加，所以只能不断施打化学农药来抑制病害，或使用激素来提高作物抗病能力。由于传统施用化学合成的肥料和农药激素，已难以提高农作物产量，并且带来负面影响，如植物抗病性差、增加病菌抗药性、作物品质下降、土壤板结等严重问题。
因此，为了提高农作物免疫力、平衡作物营养源和让土壤有益微生物达到平衡，以可高产出优良品质和恢复原有风味的农产品。微生物有机肥料起到了重要的作用，同时能提高作物抗病性、减少病害及化学品残留和避免土壤环境恶化，以达到无公害的绿色农业，生产出绿色有机食品。
现代植物营养学研究发现：蛋白质类物质，在土壤中分解后，大多是以短链肽形式被植物吸收的，以游离氨基酸形式吸收的比例很小。进一步的研究又揭示了肽比游离氨基酸吸收更快、更多，表明肽的生物效价和营养价值比游离氨基酸更高。随着在实践中获得的非常积极的结果，许多实验室研究完成了对它的主要作用机理的解释。采用放射性同位素标记的氨基酸，通过叶子的吸收和随后的转运在不同的研究中被证实。同样，主要的作用机理被论证：
a)对某些酶系统的积极作用(这些酶系统有:硝酸还原酶，烟酰胺腺嘌呤二核苷酸葡萄糖脱氢酶，苹果酸脱氢酶，亮氨酸肽酶，磷酸化酶，磷酸酯酶)。
b)对生物和非生物胁迫的强烈影响，除高含量脯氨酸和羟脯氨酸以外，应归于同样的酶系统。
c)对内源和外源植物生长调节剂和对花发育、坐果的积极作用。
d)间接的生物刺激机制应归于与主要营养和微量元素形成螯合物和配合物的结构。
现有的有机肥料有很多种类，但功能性非常单一和成分简单，仅能提高农作物有机或无机营养成份，营养元素不齐全，且不具有提高作物抗逆性、抑制土传疾病、增加土壤有机质等多功能。因此需要一种既能提高作物免疫力，又能提供作物均衡营养和有效维护生态农业环境的有机肥料，将具有深远的意义。
发明内容
本发明的目的在于提出一种有机多富含氨基酸与小肽，以及铁、锌等微量元素，易被作物直接吸收利用，用于合成各种酶类，诱导基因表达，平衡作物体内激素生理代谢等，同时还可促进作物对矿质元素的吸收，改善农田环境。
本发明的技术方案是这样实现的：
本发明提供一种缓释有机多肽组合物的制备方法，将大豆经过脱毒处理后，与大麦、玉米混合经过预酶解，与无机盐和无菌水混合得到培养基，接种活化的黑曲霉、纳豆芽孢杆菌菌种种子液，并加入复合蛋白酶，发酵酶解，过滤，冷冻干燥，得到发酵酶解产物，与金属离子螯合后，经过明胶和黄原胶包埋，制得缓释有机多肽组合物。
作为本发明的进一步改进，包括以下步骤：
S1.大豆预处理：将大豆洗净，放置于上层筛网，在下部容器中加入氨水和乙醇混合溶液，加盖并安装冷凝管，加热，蒸汽处理，得到脱毒大豆；
S2.预酶解：将步骤S1制得的脱毒大豆、大麦、玉米洗净，干燥，粉碎，得到混合粉，加入水中，加入复合酶酶解，灭酶，冷冻干燥，得到酶解混合物；
S3.培养基的制备：将步骤S2中的酶解混合物、无机盐加入无菌水中，灭菌，制得培养基；
S4.菌种的活化：将黑曲霉、纳豆芽孢杆菌接种于高氏培养基中，活化培养，制得菌种种子液；
S5.酶助发酵：将步骤S4中制得的黑曲霉、纳豆芽孢杆菌菌种种子液接种于步骤S3中制得的培养基中，加入复合蛋白酶，发酵酶解，过滤，冷冻干燥，得到发酵酶解产物；
S6.金属离子螯合：将步骤S5制得的发酵酶解产物加入水中，加入金属盐，搅拌混合反应，制得螯合缓释有机多肽组合物；
S7.包埋：将明胶和黄原胶溶于水中，加入步骤S6制得的螯合缓释有机多肽组合物，得到水相，将水相加入食用油中，乳化，调节溶液pH值为第一pH值，搅拌反应，调节pH值为第二pH值，加入谷氨酰胺转氨酶，搅拌反应，离心，洗涤，冷冻干燥，制得缓释有机多肽组合物。
作为本发明的进一步改进，步骤S1中所述氨水和乙醇混合溶液中NH3浓度为5-7wt％，乙醇浓度为20-30wt％，余量为水，所述加热至沸腾，蒸汽处理1-2h；步骤S2中所述脱毒大豆、大麦、玉米的质量比为5-7:3-5:7-10，所述复合酶选自纤维素酶、果胶酶、α-淀粉酶、β-淀粉酶、γ-淀粉酶中的至少两种，优选地，为纤维素酶和果胶酶，质量比为5-7:2，所述酶解的条件为40-50℃，酶解2-3h，所述灭酶为紫外线灭酶。
作为本发明的进一步改进，步骤S3中所述酶解混合物、无机盐、无菌水的质量比为15-20:0.5-1:100-150，所述无机盐选自氯化钠、氯化钾、氯化镁、氯化铁、氯化亚铁、氯化锰、氯化铜、氯化锌、硫酸铁、硫酸钠、硫酸锌、硫酸铜、硫酸锰中的至少一种。
作为本发明的进一步改进，步骤S4中所述活化培养的条件为35-45℃，50-70r/min，活化培养18-24h，制得的菌种种子液的含菌量为108-109cfu/mL；步骤S5中所述黑曲霉、纳豆芽孢杆菌菌种种子液的接种量分别为1-2％和1.2-2.5％，所述复合蛋白酶选自中性蛋白酶、胰蛋白酶、无花果蛋白酶、木瓜蛋白酶、菠萝蛋白酶、碱性蛋白酶中的至少两种，优选地，为木瓜蛋白酶和菠萝蛋白酶，质量比为3-5：2，所述复合蛋白酶的添加量为体系总质量的2-3wt％，所述发酵酶解的条件为35-45℃，50-70r/min，发酵酶解48-72h。
作为本发明的进一步改进，步骤S6中所述发酵酶解产物和金属盐的质量比为100:13-15，所述金属盐选自氯化锌、氯化铁、氯化铜、氯化锰、氯化镁、氯化铝、硫酸锌、硫酸铁、硫酸锰、硫酸铜、硫酸锰、硫酸铝中的至少一种，优选地，为氯化锌、氯化铁的混合物，质量比为3-5:7，所述搅拌混合反应的时间为30-50min。
作为本发明的进一步改进，步骤S7中所述明胶、黄原胶、螯合缓释有机多肽组合物、谷氨酰胺转氨酶的质量比为10-12:7-10:10-15:1-2，所述所述食用油选自大豆油、花生油、菜籽油、芝麻油、亚麻籽油、葵花籽油、玉米油、鱼油中的至少一种；所述乳化条件为12000-15000r/min，时间为3-5min，所述第一pH值为4.3-4.5，所述第二pH值为6.4-6.8。
作为本发明的进一步改进，具体包括以下步骤：
S1.大豆预处理：将大豆洗净，放置于上层筛网，在下部容器中加入氨水和乙醇混合溶液，加盖并安装冷凝管，加热至沸腾，蒸汽处理1-2h，得到脱毒大豆；
所述氨水和乙醇混合溶液中NH3浓度为5-7wt％，乙醇浓度为20-30wt％，余量为水；
S2.预酶解：将5-7重量份步骤S1制得的脱毒大豆、3-5重量份大麦、7-10重量份玉米洗净，干燥，粉碎，得到混合粉，加入100重量份水中，加入2-3重量份复合酶，40-50℃酶解2-3h，紫外线灭酶，冷冻干燥，得到酶解混合物；
所述复合酶为纤维素酶和果胶酶，质量比为5-7:2；
S3.培养基的制备：将15-20重量份步骤S2中的酶解混合物、0.5-1重量份无机盐加入100-150重量份无菌水中，紫外线灭菌，制得培养基；
S4.菌种的活化：将黑曲霉、纳豆芽孢杆菌接种于高氏培养基中，35-45℃，50-70r/min，活化培养18-24h，制得菌种种子液，含菌量为108-109cfu/mL；
S5.酶助发酵：将步骤S4中制得的黑曲霉、纳豆芽孢杆菌菌种种子液接种于步骤S3中制得的培养基中，所述黑曲霉、纳豆芽孢杆菌菌种种子液的接种量分别为1-2％和1.2-2.5％，加入复合蛋白酶，添加量为体系总质量的2-3wt％，35-45℃，50-70r/min，发酵酶解48-72h，过滤，冷冻干燥，得到发酵酶解产物；
所述复合蛋白酶为木瓜蛋白酶和菠萝蛋白酶，质量比为3-5：2；
S6.金属离子螯合：将100重量份步骤S5制得的发酵酶解产物加入200重量份水中，加入13-15重量份金属盐，搅拌混合反应30-50min，制得螯合缓释有机多肽组合物；
所述金属盐为氯化锌、氯化铁的混合物，质量比为3-5:7；
S7.包埋：将10-12重量份明胶和7-10重量份黄原胶溶于100重量份水中，加入10-15重量份步骤S6制得的螯合缓释有机多肽组合物，得到水相，将水相加入200重量份食用油中，12000-15000r/min乳化3-5min，调节溶液pH值为4.3-4.5，搅拌反应20-30min，调节pH值为6.4-6.8，加入1-2重量份谷氨酰胺转氨酶，搅拌反应15-30min，离心，洗涤，冷冻干燥，制得缓释有机多肽组合物。
本发明进一步保护一种上述的制备方法制得的缓释有机多肽组合物。
本发明进一步保护一种上述缓释有机多肽组合物在促进植物生长和发育、提高植物抗逆性、抗虫害，以及提高植物繁殖能力中的应用。
本发明具有如下有益效果：
本发明首先通过化学溶剂法对大豆中的胰蛋白酶抑制素进行脱除，通过溶于带有化学溶剂的高温蒸汽中，部分高温分解，产生可挥发性物质而随蒸气散失，同时，氨水还可以与二硫键反应，进行初步蛋白降解，促进后续微生物发酵效率，大大提高了蛋白质的酶解、发酵的效果，从而提高了蛋白肽、氨基酸的产率；
本发明中，大豆、大麦、玉米的蛋白质组成中，含有丰富的脯氨酸、羟脯氨酸、丝氨酸等活性氨基酸，从而为后续制备缓释有机多肽组合物提供了丰富且高活性的蛋白质、蛋白肽和氨基酸原料；另外，本发明中原料中还含有丰富的谷胱甘肽和短杆菌肽，对于促进植物生长发育，促进发酵菌增殖，以及促进植物酶合成有很好的促进作用。
本发明选择酶促发酵，一方面，在复合蛋白酶的作用下，能够促进发酵底物中蛋白质的酶解成小分子蛋白肽、短肽，并促进发酵菌发酵形成短肽、氨基酸等小分子活性物质，并在黑曲霉和纳豆芽孢杆菌的协同发酵作用下，使得底物中大部分高蛋白物质变成了活性小分子短肽以及氨基酸等物质，从而制得了发酵酶解产物；
随后，发酵酶解产物与金属盐中的金属离子发生螯合作用，其中的氨基酸，比如谷胱甘肽，是一类很好的金属离子螯合剂，从而固定了大量的微量金属离子，从而制得的螯合缓释有机多肽组合物含有丰富的金属微量元素，进入植物体后能够促进植物各类酶的合成，从而起到很好的生长调控的作用。
进一步，本发明将制得的螯合缓释有机多肽组合物通过在两种带有相反电荷的聚合物材料作为壁材(明胶带正电，黄原胶带负电)的作用下，改变体系pH使带相反电荷的聚合物材料间静电作用相互吸引、溶解度降低，产生相分离，从而胶体自溶液中凝聚出来，制得了包埋产品，使得制得的缓释有机多肽组合物具有缓控释的效果，进入植物体后，能够缓慢释放活性物质，延长了作用时效，提高了作用效果，具有更好的调控作用，同时，使得制得的缓释有机多肽组合物的保质期延长，更能方便贮藏，而避免活性肽失活而丧失调控作用。
本发明制得的缓释有机多肽组合物除了对植物氮平衡的直接影响，也可以作用于提高一些酶系统的活力和调控一些植物生长调节剂的作用和生化过程。同时，可以使大量和微量元素吸收和转运更容易。这些表现容许以植物的真正的“有机生物刺激剂”和天然营养平衡器，不只是一个简单的有机叶面肥料。本发明缓释有机多肽组合物表现出来的多功能作用，包括，营养的效果、普遍的生物刺激剂效果，显著的抗逆作用，类植物生长调节剂的作用。
本发明制得的缓释有机多肽组合物可以促进植物酶系统的构建，包括NR硝酸还原酶，其代表植物体内氮生物化学发生的步骤，明确的被亚康力诺影响。NR硝酸还原酶促成从土壤吸收硝态氮的降低，转而吸收钱态氮合成谷氨酸分子，能明显提高植物抵消水胁迫的能力，增加从土壤氮的吸收比率及其利用率，从而使得植物在盐碱地或干旱土壤中，有明显的提高抗性的能力。
另外，本发明制得的缓释有机多肽组合物还可以发挥调节苹果酸酶的活性，这个酶参与克雷伯氏循环和呼吸代谢调节，以及对亮氨酸-氨肤酶(调节蛋白质水解)、酸性磷酸酶(它主导糖的运转和新陈代谢)、磷酸化酶(作用于淀粉的合成和水解过程)的合成均有明显的促进作用。可见，本发明制得的缓释有机多肽组合物在各个方面均有积极的调节效果。
另外，本发明制得的缓释有机多肽组合物对于植物抗病毒蛋白的合成，以保护他们免受真菌，病毒或昆虫攻击的明显的促进作用。
抵御水缺乏、寒冷环境的作用的关键氨基酸包括脯氨酸和羟脯氨酸，这两个氨基酸是本发明制得的缓释有机多肽组合物中最有代表性的合成化合物，在植物抵抗水、冷缺乏胁迫的生物化学过程表现出一个特别的作用机理。在这两个氨基酸和丝氨酸的存在，表现出抵抗菱蔫、抗霜冻、抵御寒冷的作用，使得植物有明显的的抵抗逆境作用的生物刺激剂特点。
本发明制得的缓释有机多肽组合物能够促进植物催生了更好的繁殖力，它能够增加子房的活力和长寿，刺激小梗粒的发育和花粉管的长度更强壮，这是因为，该缓释有机多肽组合物有相对高含量脯氨酸，这个氨基酸在花粉中的含量很高。另外，由于该机多肽酶组合物能与硼盐形成复合物，从而促进植物对硼的吸收，而硼是正常花粉发育必须的矿物元素，因此，该机多肽酶组合物能促进植物的花粉发育，提高植物的繁殖能力。
本发明制得的缓释有机多肽组合物富含氨基酸和短链肽，还能够通过与微量金属离子的螯合作用，从而促进植物对氮元素的吸收，以及对微量金属离子的吸收，从而均衡了植物的营养，促进植物的生长和发育，包括(1)促进植物根系发育，使植物根系茂盛，提高对养分和水分的吸收利用效率；(2)促进根系细胞生长，细胞排列规则致密，根组织发育良好，抵御土壤病原菌入侵的能力增强，从而减少土传病害的发病率；(3)叶面喷施时，可以直接被叶面细胞吸收，是叶子舒展、厚实、发绿发亮，光合作用增强，更有效的利用光能把二氧化碳转变成葡萄糖等有机物质，使作物增产增收；(4)小肽被吸收后，在植物体内可以直接参与蛋白质的合成，比利用无机氮源合成蛋白质速度快、效率高、消耗更少的ATP，从而减轻植物产能系统的压力，使更多的ATP用于种子和果实物质的合成，从而增产增收；(5)氨基酸和小肽可以直接用于合成植物体内各种酶类，增强植物合成代谢能力，加速植物的生长发育，使植物丰产，早熟。
本发明制得缓释有机多肽组合物是一种新型的生物刺激素，富含氨基酸与小肽，以及铁、锌等微量元素，易被作物直接吸收利用，用于合成各种酶类，诱导基因表达，平衡作物体内激素生理代谢等，同时还可促进作物对矿质元素的吸收，改善农田环境。
具体实施方式
下面将对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
黑曲霉，货号M4627J，上海圻明生物科技有限公司；纳豆芽孢杆菌，1000亿cfu/g，购于济南金雨源生物技术有限公司；纤维素酶，SDG-2425，1万U/g，果胶酶，SDG-2408，2.5万U/g，木瓜蛋白酶，FDG-2203，10万U/g，菠萝蛋白酶，FDG-2201，10万U/g，谷氨酰胺转氨酶，FDG-2210，1000U/g，均购于夏盛(北京)生物科技开发有限公司。
实施例1
本实施例提供一种缓释有机多肽组合物，制备方法具体如下：
S1.大豆预处理：将大豆洗净，放置于上层筛网，在下部容器中加入氨水和乙醇混合溶液，加盖并安装冷凝管，加热至沸腾，蒸汽处理1h，得到脱毒大豆；
所述氨水和乙醇混合溶液中NH3浓度为5wt％，乙醇浓度为20wt％，余量为水；
S2.预酶解：将5重量份步骤S1制得的脱毒大豆、3重量份大麦、7重量份玉米洗净，干燥，粉碎，得到混合粉，加入100重量份水中，加入2重量份复合酶，40℃酶解2h，紫外线灭酶，冷冻干燥，得到酶解混合物；
所述复合酶为纤维素酶和果胶酶，质量比为5:2；
S3.培养基的制备：将15重量份步骤S2中的酶解混合物、0.5重量份无机盐加入100重量份无菌水中，紫外线灭菌，制得培养基；
S4.菌种的活化：将黑曲霉、纳豆芽孢杆菌接种于高氏培养基中，35℃，50r/min，活化培养18h，制得菌种种子液，含菌量为108cfu/mL；
S5.酶助发酵：将步骤S4中制得的黑曲霉、纳豆芽孢杆菌菌种种子液接种于步骤S3中制得的培养基中，所述黑曲霉、纳豆芽孢杆菌菌种种子液的接种量分别为1％和1.2％，加入复合蛋白酶，添加量为体系总质量的2wt％，35℃，50r/min，发酵酶解48h，过滤，冷冻干燥，得到发酵酶解产物；
所述复合蛋白酶为木瓜蛋白酶和菠萝蛋白酶，质量比为3：2；
S6.金属离子螯合：将100重量份步骤S5制得的发酵酶解产物加入200重量份水中，加入13重量份金属盐，搅拌混合反应30min，冷冻干燥，制得螯合缓释有机多肽组合物；
所述金属盐为氯化锌、氯化铁的混合物，质量比为3:7；
S7.包埋：将10重量份明胶和7重量份黄原胶溶于100重量份水中，加入10重量份步骤S6制得的螯合缓释有机多肽组合物，得到水相，将水相加入200重量份大豆油中，12000r/min乳化3min，调节溶液pH值为4.3，搅拌反应20min，调节pH值为6.4，加入1重量份谷氨酰胺转氨酶，搅拌反应15min，5000r/min离心15min，清水洗涤，冷冻干燥，制得缓释有机多肽组合物。
实施例2
本实施例提供一种缓释有机多肽组合物，制备方法具体如下：
S1.大豆预处理：将大豆洗净，放置于上层筛网，在下部容器中加入氨水和乙醇混合溶液，加盖并安装冷凝管，加热至沸腾，蒸汽处理2h，得到脱毒大豆；
所述氨水和乙醇混合溶液中NH3浓度为7wt％，乙醇浓度为30wt％，余量为水；
S2.预酶解：将7重量份步骤S1制得的脱毒大豆、5重量份大麦、10重量份玉米洗净，干燥，粉碎，得到混合粉，加入100重量份水中，加入3重量份复合酶，50℃酶解3h，紫外线灭酶，冷冻干燥，得到酶解混合物；
所述复合酶为纤维素酶和果胶酶，质量比为7:2；
S3.培养基的制备：将20重量份步骤S2中的酶解混合物、1重量份无机盐加入150重量份无菌水中，紫外线灭菌，制得培养基；
S4.菌种的活化：将黑曲霉、纳豆芽孢杆菌接种于高氏培养基中，45℃，70r/min，活化培养24h，制得菌种种子液，含菌量为109cfu/mL；
S5.酶助发酵：将步骤S4中制得的黑曲霉、纳豆芽孢杆菌菌种种子液接种于步骤S3中制得的培养基中，所述黑曲霉、纳豆芽孢杆菌菌种种子液的接种量分别为2％和2.5％，加入复合蛋白酶，添加量为体系总质量的3wt％，45℃，70r/min，发酵酶解72h，过滤，冷冻干燥，得到发酵酶解产物；
所述复合蛋白酶为木瓜蛋白酶和菠萝蛋白酶，质量比为5：2；
S6.金属离子螯合：将100重量份步骤S5制得的发酵酶解产物加入200重量份水中，加入15重量份金属盐，搅拌混合反应50min，冷冻干燥，制得螯合缓释有机多肽组合物；
所述金属盐为氯化锌、氯化铁的混合物，质量比为5:7；
S7.包埋：将12重量份明胶和10重量份黄原胶溶于100重量份水中，加入15重量份步骤S6制得的螯合缓释有机多肽组合物，得到水相，将水相加入200重量份花生油中，15000r/min乳化5min，调节溶液pH值为4.5，搅拌反应30min，调节pH值为6.8，加入2重量份谷氨酰胺转氨酶，搅拌反应30min，5000r/min离心15min，清水洗涤，冷冻干燥，制得缓释有机多肽组合物。
实施例3
本实施例提供一种缓释有机多肽组合物，制备方法具体如下：
S1.大豆预处理：将大豆洗净，放置于上层筛网，在下部容器中加入氨水和乙醇混合溶液，加盖并安装冷凝管，加热至沸腾，蒸汽处理1.5h，得到脱毒大豆；
所述氨水和乙醇混合溶液中NH3浓度为6wt％，乙醇浓度为25wt％，余量为水；
S2.预酶解：将6重量份步骤S1制得的脱毒大豆、4重量份大麦、8.5重量份玉米洗净，干燥，粉碎，得到混合粉，加入100重量份水中，加入2.5重量份复合酶，45℃酶解2.5h，紫外线灭酶，冷冻干燥，得到酶解混合物；
所述复合酶为纤维素酶和果胶酶，质量比为6:2；
S3.培养基的制备：将17重量份步骤S2中的酶解混合物、0.7重量份无机盐加入125重量份无菌水中，紫外线灭菌，制得培养基；
S4.菌种的活化：将黑曲霉、纳豆芽孢杆菌接种于高氏培养基中，40℃，60r/min，活化培养21h，制得菌种种子液，含菌量为109cfu/mL；
S5.酶助发酵：将步骤S4中制得的黑曲霉、纳豆芽孢杆菌菌种种子液接种于步骤S3中制得的培养基中，所述黑曲霉、纳豆芽孢杆菌菌种种子液的接种量分别为1.5％和1.9％，加入复合蛋白酶，添加量为体系总质量的2.5wt％，40℃，60r/min，发酵酶解56h，过滤，冷冻干燥，得到发酵酶解产物；
所述复合蛋白酶为木瓜蛋白酶和菠萝蛋白酶，质量比为4：2；
S6.金属离子螯合：将100重量份步骤S5制得的发酵酶解产物加入200重量份水中，加入14重量份金属盐，搅拌混合反应40min，冷冻干燥，制得螯合缓释有机多肽组合物；
所述金属盐为氯化锌、氯化铁的混合物，质量比为4:7；
S7.包埋：将11重量份明胶和8.5重量份黄原胶溶于100重量份水中，加入12重量份步骤S6制得的螯合缓释有机多肽组合物，得到水相，将水相加入200重量份玉米油中，13500r/min乳化4min，调节溶液pH值为4.4，搅拌反应25min，调节pH值为6.6，加入1.5重量份谷氨酰胺转氨酶，搅拌反应22min，5000r/min离心15min，清水洗涤，冷冻干燥，制得缓释有机多肽组合物。
实施例4
与实施例3相比，不同之处在于，复合酶为单一的纤维素酶。
实施例5
与实施例3相比，不同之处在于，复合酶为单一的果胶酶。
实施例6
与实施例3相比，不同之处在于，复合蛋白酶为单一的木瓜蛋白酶。
实施例7
与实施例3相比，不同之处在于，复合蛋白酶为单一的菠萝蛋白酶。
对比例1
与实施例3相比，不同之处在于，未进行步骤S1。
具体如下：
S1.预酶解：将6重量份大豆、4重量份大麦、8.5重量份玉米洗净，干燥，粉碎，得到混合粉，加入100重量份水中，加入2.5重量份复合酶，45℃酶解2.5h，紫外线灭酶，冷冻干燥，得到酶解混合物；
所述复合酶为纤维素酶和果胶酶，质量比为6:2；
S2.培养基的制备：将17重量份步骤S1中的酶解混合物、0.7重量份无机盐加入125重量份无菌水中，紫外线灭菌，制得培养基；
S3.菌种的活化：将黑曲霉、纳豆芽孢杆菌接种于高氏培养基中，40℃，60r/min，活化培养21h，制得菌种种子液，含菌量为109cfu/mL；
S4.酶助发酵：将步骤S3中制得的黑曲霉、纳豆芽孢杆菌菌种种子液接种于步骤S3中制得的培养基中，所述黑曲霉、纳豆芽孢杆菌菌种种子液的接种量分别为1.5％和1.9％，加入复合蛋白酶，添加量为体系总质量的2.5wt％，40℃，60r/min，发酵酶解56h，过滤，冷冻干燥，得到发酵酶解产物；
所述复合蛋白酶为木瓜蛋白酶和菠萝蛋白酶，质量比为4：2；
S5.金属离子螯合：将100重量份步骤S4制得的发酵酶解产物加入200重量份水中，加入14重量份金属盐，搅拌混合反应40min，冷冻干燥，制得螯合缓释有机多肽组合物；
所述金属盐为氯化锌、氯化铁的混合物，质量比为4:7；
S6.包埋：将11重量份明胶和8.5重量份黄原胶溶于100重量份水中，加入12重量份步骤S5制得的螯合缓释有机多肽组合物，得到水相，将水相加入200重量份玉米油中，13500r/min乳化4min，调节溶液pH值为4.4，搅拌反应25min，调节pH值为6.6，加入1.5重量份谷氨酰胺转氨酶，搅拌反应22min，5000r/min离心15min，清水洗涤，冷冻干燥，制得缓释有机多肽组合物。
对比例2
与实施例3相比，不同之处在于，步骤S2中未添加大麦。
具体如下：
S2.预酶解：将6重量份步骤S1制得的脱毒大豆、12.5重量份玉米洗净，干燥，粉碎，得到混合粉，加入100重量份水中，加入2.5重量份复合酶，45℃酶解2.5h，紫外线灭酶，冷冻干燥，得到酶解混合物；
所述复合酶为纤维素酶和果胶酶，质量比为6:2。
对比例3
与实施例3相比，不同之处在于，步骤S2中未添加玉米。
具体如下：
S2.预酶解：将6重量份步骤S1制得的脱毒大豆、12.5重量份大麦洗净，干燥，粉碎，得到混合粉，加入100重量份水中，加入2.5重量份复合酶，45℃酶解2.5h，紫外线灭酶，冷冻干燥，得到酶解混合物；
所述复合酶为纤维素酶和果胶酶，质量比为6:2。
对比例4
与实施例3相比，不同之处在于，未进行步骤S2预酶解。
具体如下：
S2.将6重量份步骤S1制得的脱毒大豆、4重量份大麦、8.5重量份玉米洗净，干燥，粉碎，得到混合粉。
对比例5
与实施例3相比，不同之处在于，步骤S5中未接种黑曲霉菌种种子液。
具体如下：
S5.酶助发酵：将步骤S4中制得的纳豆芽孢杆菌菌种种子液接种于步骤S3中制得的培养基中，所述纳豆芽孢杆菌菌种种子液的接种量分别为3.4％，加入复合蛋白酶，添加量为体系总质量的2.5wt％，40℃，60r/min，发酵酶解56h，过滤，冷冻干燥，得到发酵酶解产物；
所述复合蛋白酶为木瓜蛋白酶和菠萝蛋白酶，质量比为4：2。
对比例6
与实施例3相比，不同之处在于，步骤S5中未接种纳豆芽孢杆菌菌种种子液。
具体如下：
S5.酶助发酵：将步骤S4中制得的黑曲霉菌种种子液接种于步骤S3中制得的培养基中，所述黑曲霉菌种种子液的接种量分别为3.4％，加入复合蛋白酶，添加量为体系总质量的2.5wt％，40℃，60r/min，发酵酶解56h，过滤，冷冻干燥，得到发酵酶解产物；
所述复合蛋白酶为木瓜蛋白酶和菠萝蛋白酶，质量比为4：2。
对比例7
与实施例3相比，不同之处在于，步骤S5中未添加复合蛋白酶。
具体如下：
S5.,发酵：将步骤S4中制得的黑曲霉、纳豆芽孢杆菌菌种种子液接种于步骤S3中制得的培养基中，所述黑曲霉、纳豆芽孢杆菌菌种种子液的接种量分别为1.5％和1.9％，40℃，60r/min，发酵酶解56h，过滤，冷冻干燥，得到发酵产物。
对比例8
与实施例3相比，不同之处在于，未进行步骤S5。
具体如下：
S1.大豆预处理：将大豆洗净，放置于上层筛网，在下部容器中加入氨水和乙醇混合溶液，加盖并安装冷凝管，加热至沸腾，蒸汽处理1.5h，得到脱毒大豆；
所述氨水和乙醇混合溶液中NH3浓度为6wt％，乙醇浓度为25wt％，余量为水；
S2.预酶解：将6重量份步骤S1制得的脱毒大豆、4重量份大麦、8.5重量份玉米洗净，干燥，粉碎，得到混合粉，加入100重量份水中，加入2.5重量份复合酶，45℃酶解2.5h，紫外线灭酶，冷冻干燥，得到酶解混合物；
所述复合酶为纤维素酶和果胶酶，质量比为6:2；
S3.金属离子螯合：将100重量份步骤S2制得的酶解混合物加入200重量份水中，加入14重量份金属盐，搅拌混合反应40min，过滤，冷冻干燥，制得螯合缓释有机多肽组合物；
所述金属盐为氯化锌、氯化铁的混合物，质量比为4:7；
S4.包埋：将11重量份明胶和8.5重量份黄原胶溶于100重量份水中，加入12重量份步骤S3制得的螯合缓释有机多肽组合物，得到水相，将水相加入200重量份玉米油中，13500r/min乳化4min，调节溶液pH值为4.4，搅拌反应25min，调节pH值为6.6，加入1.5重量份谷氨酰胺转氨酶，搅拌反应22min，5000r/min离心15min，清水洗涤，冷冻干燥，制得缓释有机多肽组合物。
对比例9
与实施例3相比，不同之处在于，未进行步骤S6。
具体如下：
S1.大豆预处理：将大豆洗净，放置于上层筛网，在下部容器中加入氨水和乙醇混合溶液，加盖并安装冷凝管，加热至沸腾，蒸汽处理1.5h，得到脱毒大豆；
所述氨水和乙醇混合溶液中NH3浓度为6wt％，乙醇浓度为25wt％，余量为水；
S2.预酶解：将6重量份步骤S1制得的脱毒大豆、4重量份大麦、8.5重量份玉米洗净，干燥，粉碎，得到混合粉，加入100重量份水中，加入2.5重量份复合酶，45℃酶解2.5h，紫外线灭酶，冷冻干燥，得到酶解混合物；
所述复合酶为纤维素酶和果胶酶，质量比为6:2；
S3.培养基的制备：将17重量份步骤S2中的酶解混合物、0.7重量份无机盐加入125重量份无菌水中，紫外线灭菌，制得培养基；
S4.菌种的活化：将黑曲霉、纳豆芽孢杆菌接种于高氏培养基中，40℃，60r/min，活化培养21h，制得菌种种子液，含菌量为109cfu/mL；
S5.酶助发酵：将步骤S4中制得的黑曲霉、纳豆芽孢杆菌菌种种子液接种于步骤S3中制得的培养基中，所述黑曲霉、纳豆芽孢杆菌菌种种子液的接种量分别为1.5％和1.9％，加入复合蛋白酶，添加量为体系总质量的2.5wt％，40℃，60r/min，发酵酶解56h，过滤，冷冻干燥，得到发酵酶解产物；
所述复合蛋白酶为木瓜蛋白酶和菠萝蛋白酶，质量比为4：2；
S6.包埋：将11重量份明胶和8.5重量份黄原胶溶于100重量份水中，加入12重量份步骤S5制得的发酵酶解产物，得到水相，将水相加入200重量份玉米油中，13500r/min乳化4min，调节溶液pH值为4.4，搅拌反应25min，调节pH值为6.6，加入1.5重量份谷氨酰胺转氨酶，搅拌反应22min，5000r/min离心15min，清水洗涤，冷冻干燥，制得缓释有机多肽组合物。
对比例10
与实施例3相比，不同之处在于，未进行步骤S7。
具体如下：
S1.大豆预处理：将大豆洗净，放置于上层筛网，在下部容器中加入氨水和乙醇混合溶液，加盖并安装冷凝管，加热至沸腾，蒸汽处理1.5h，得到脱毒大豆；
所述氨水和乙醇混合溶液中NH3浓度为6wt％，乙醇浓度为25wt％，余量为水；
S2.预酶解：将6重量份步骤S1制得的脱毒大豆、4重量份大麦、8.5重量份玉米洗净，干燥，粉碎，得到混合粉，加入100重量份水中，加入2.5重量份复合酶，45℃酶解2.5h，紫外线灭酶，冷冻干燥，得到酶解混合物；
所述复合酶为纤维素酶和果胶酶，质量比为6:2；
S3.培养基的制备：将17重量份步骤S2中的酶解混合物、0.7重量份无机盐加入125重量份无菌水中，紫外线灭菌，制得培养基；
S4.菌种的活化：将黑曲霉、纳豆芽孢杆菌接种于高氏培养基中，40℃，60r/min，活化培养21h，制得菌种种子液，含菌量为109cfu/mL；
S5.酶助发酵：将步骤S4中制得的黑曲霉、纳豆芽孢杆菌菌种种子液接种于步骤S3中制得的培养基中，所述黑曲霉、纳豆芽孢杆菌菌种种子液的接种量分别为1.5％和1.9％，加入复合蛋白酶，添加量为体系总质量的2.5wt％，40℃，60r/min，发酵酶解56h，过滤，冷冻干燥，得到发酵酶解产物；
所述复合蛋白酶为木瓜蛋白酶和菠萝蛋白酶，质量比为4：2；
S6.金属离子螯合：将100重量份步骤S5制得的发酵酶解产物加入200重量份水中，加入14重量份金属盐，搅拌混合反应40min，冷冻干燥，制得螯合缓释有机多肽组合物，即为产品；
所述金属盐为氯化锌、氯化铁的混合物，质量比为4:7。
测试例1
将本发明实施例1-7和对比例1-10制得的产品进行含量组分测定，结果见表1。
通过GB 5009.124-2016《食品安全国家标准食品中氨基酸的测定》测定组合物中氨基酸的含量。通过GB 5009.5-2016《食品安全国家标准食品中蛋白质的测定》测定组合物中蛋白质的含量。
表1
由上表可知，本发明实施例1-3制得的缓释有机多肽组合物中脯氨酸、丝氨酸的含量较高，氨基酸总量和蛋白质总量较高。
测试例2对葡萄柚果实营养成分的影响
将本发明实施例1-7和对比例1-10制得的产品配制成0.2wt％的水分散液，对接近成熟期的长势、胸径相近的火焰品种葡萄柚，采用每隔5天喷洒该水分散液，作为叶面肥喷洒，喷洒量为200mL/株，以未喷洒组为对照组(喷洒等量水)，同时采摘，处理，测定。
采用超声辅助提取糖，总糖含量测定采用苯酚-硫酸比色法，总酸含量采用滴定法测定。水分含量用GB/T 5009.3-2003减压干燥法测定；蛋白质含量采用微量凯氏定氮法测定；维生素C的含量采用紫外分光光度计法测定。矿质元素的测定首先采用微波消解法消解样品，然后采用ICP-MS测定。
结果见表2。
表2
由上表可知，经过喷洒本发明实施例1-3制得的缓释有机多肽组合物作为叶面肥的火焰品种葡萄柚中，总糖、总酸含量提高，提高了葡萄柚的口感，蛋白质、维生素C以及微量元素含量均明显提高。
测试例3对棉花生长的影响
选自四川芙蓉7号为实验品种，株行距为70*12cm，在蕾期施加500g本发明实施例1-7和对比例1-10制得的产品，以常规农家肥作为对照组，每组中包含100株，试验区中耕、施肥、灌水、打顶、病虫草害防治等田管措施都在同一天内完成。4月22日和5月7日中耕，5月22日、6月12日防治蚜虫，6月25日打顶。全生育期灌水12次，随水施肥10次。于6月25日对棉花植株进行调查，每个处理取5个点，每个点取5株定点调查，取平均值；产率测算按照全部100株进行测算。
结果见表3和表4。
表3
由上表可知，经过本发明实施例1-3制得的缓释有机多肽组合物处理后的棉花长势更好。
增产率(％)＝(处理组实收籽棉量-对照组实收籽棉量)/对照组实收籽棉量*100％
表4
/>
由上表可知，经过本发明实施例1-3制得的缓释有机多肽组合物处理后的棉花产量更高。
实施例4、5与实施例3相比，复合酶为单一的纤维素酶或果胶酶。对比例4与实施例3相比，未进行步骤S2预酶解。氨基酸、蛋白质含量下降，葡萄柚中总糖、蛋白质、维生素C含量下降，对棉花的生长促进作用下降。经过纤维素酶和果胶酶的预酶解，使得大豆、大麦和玉米的细胞壁破裂，从而促进蛋白质等活性组分的溶出，起到了很好的预酶解的效果，大大提高了后续活性蛋白肽、氨基酸的产率。
实施例6、7与实施例3相比，复合蛋白酶为单一的木瓜蛋白酶或菠萝蛋白酶。对比例7与实施例3相比，步骤S5中未添加复合蛋白酶。对比例5、6与实施例3相比，步骤S5中未接种黑曲霉或纳豆芽孢杆菌菌种种子液。对比例8与实施例3相比，未进行步骤S5。氨基酸、蛋白质含量明显下降，葡萄柚中总糖、总酸、蛋白质、维生素C、矿物元素含量下降，对棉花的生长促进作用下降。本发明选择酶促发酵，一方面，在复合蛋白酶的作用下，能够促进发酵底物中蛋白质的酶解成小分子蛋白肽、短肽，并促进发酵菌发酵形成短肽、氨基酸等小分子活性物质，并在黑曲霉和纳豆芽孢杆菌的协同发酵作用下，使得底物中大部分高蛋白物质变成了活性小分子短肽以及氨基酸等物质，从而制得了发酵酶解产物。
对比例1与实施例3相比，未进行步骤S1。氨基酸、蛋白质含量明显下降。本发明首先通过化学溶剂法对大豆中的胰蛋白酶抑制素进行脱除，通过溶于带有化学溶剂的高温蒸汽中，部分高温分解，产生可挥发性物质而随蒸气散失，同时，氨水还可以与二硫键反应，进行初步蛋白降解，促进后续微生物发酵效率，大大提高了蛋白质的酶解、发酵的效果，从而提高了蛋白肽、氨基酸的产率。
对比例2、3与实施例3相比，步骤S2中未添加大麦或玉米。氨基酸、蛋白质含量明显下降，葡萄柚中总糖、蛋白质含量下降，对棉花的生长促进作用下降。本发明中，大豆、大麦、玉米的蛋白质组成中，含有丰富的脯氨酸、羟脯氨酸、丝氨酸等活性氨基酸，从而为后续制备有机多肽酶组合物提供了丰富且高活性的蛋白质、蛋白肽和氨基酸原料；另外，本发明中原料中还含有丰富的谷胱甘肽和短杆菌肽，对于促进植物生长发育，促进发酵菌增殖，以及促进植物酶合成有很好的促进作用。
对比例9与实施例3相比，未进行步骤S6。葡萄柚中维生素C、矿物元素含量下降，对棉花的生长促进作用下降。本发明发酵酶解产物与金属盐中的金属离子发生螯合作用，其中的氨基酸，比如谷胱甘肽，是一类很好的金属离子螯合剂，从而固定了大量的微量金属离子，从而制得的螯合有机多肽酶组合物含有丰富的金属微量元素，进入植物体后能够促进植物各类酶的合成，从而起到很好的生长调控的作用。
对比例10与实施例3相比，未进行步骤S7。葡萄柚中总糖、总酸、蛋白质、维生素C、矿物元素含量下降，对棉花的生长促进作用下降。本发明将制得的螯合有机多肽酶组合物通过在两种带有相反电荷的聚合物材料作为壁材(明胶带正电，黄原胶带负电)的作用下，改变体系pH使带相反电荷的聚合物材料间静电作用相互吸引、溶解度降低，产生相分离，从而胶体自溶液中凝聚出来，制得了包埋产品，使得制得的有机多肽酶组合物具有缓控释的效果，进入植物体后，能够缓慢释放活性物质，延长了作用时效，提高了作用效果，具有更好的调控作用，同时，使得制得的有机多肽酶组合物的保质期延长，更能方便贮藏，而避免活性肽失活而丧失调控作用。
以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
Claims (3)
1.一种缓释有机多肽组合物的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
S1.大豆预处理：将大豆洗净，放置于上层筛网，在下部容器中加入氨水和乙醇混合溶液，加盖并安装冷凝管，加热至沸腾，蒸汽处理1-2h，得到脱毒大豆；所述氨水和乙醇混合溶液中NH3浓度为5-7wt％，乙醇浓度为20-30wt％，余量为水；
S2.预酶解：将5-7重量份步骤S1制得的脱毒大豆、3-5重量份大麦、7-10重量份玉米洗净，干燥，粉碎，得到混合粉，加入100重量份水中，加入2-3重量份复合酶，40-50℃酶解2-3h，紫外线灭酶，冷冻干燥，得到酶解混合物；
所述复合酶为纤维素酶和果胶酶，质量比为5-7:2；
S3.培养基的制备：将15-20重量份步骤S2中的酶解混合物、0.5-1重量份无机盐加入100-150重量份无菌水中，紫外线灭菌，制得培养基；
S4.菌种的活化：将黑曲霉、纳豆芽孢杆菌接种于高氏培养基中，35-45℃，
50-70r/min，活化培养18-24h，制得菌种种子液，含菌量为108-109cfu/mL；
S5.酶助发酵：将步骤S4中制得的黑曲霉、纳豆芽孢杆菌菌种种子液接种于步骤S3中制得的培养基中，所述黑曲霉、纳豆芽孢杆菌菌种种子液的接种量分别为1-2％和1.2-2.5％，加入复合蛋白酶，添加量为体系总质量的2-3wt％，35-45℃，50-70r/min，发酵酶解48-72h，过滤，冷冻干燥，得到发酵酶解产物；
所述复合蛋白酶为木瓜蛋白酶和菠萝蛋白酶，质量比为3-5：2；
S6.金属离子螯合：将100重量份步骤S5制得的发酵酶解产物加入200重量份水中，加入13-15重量份金属盐，搅拌混合反应30-50min，制得螯合缓释有机多肽组合物；
所述金属盐为氯化锌、氯化铁的混合物，质量比为3-5:7；
S7.包埋：将10-12重量份明胶和7-10重量份黄原胶溶于100重量份水中，加入10-15重量份步骤S6制得的螯合缓释有机多肽组合物，得到水相，将水相加入200重量份食用油中，12000-15000r/min乳化3-5min，调节溶液pH值为4.3-4.5，搅拌反应20-30min，调节pH值为6.4-6.8，加入1-2重量份谷氨酰胺转氨酶，搅拌反应15-30min，离心，洗涤，冷冻干燥，制得缓释有机多肽组合物。
2.一种如权利要求1所述的制备方法制得的缓释有机多肽组合物。
3.一种如权利要求2所述缓释有机多肽组合物在促进植物生长和发育、提高植物抗逆性、抗虫害，以及提高植物繁殖能力中的应用。
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