CN115094107A - 制备大豆多肽组合物及多肽氨基酸肥料的方法及产品 - Google Patents
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Abstract
本申请公开了一种制备大豆多肽组合物的方法，其包括如下步骤：蛋白酶处理步骤：采用复合蛋白酶使经灭菌的豆粕酶解3‑6小时，获得豆粕酶解物，其中，所述复合蛋白酶包括碱性蛋白酶和中性蛋白酶，所述碱性蛋白酶的酶活力大于等于180000U/g，所述中性蛋白酶的酶活力大于等于80000U/g；微生物发酵步骤：采用枯草芽孢杆菌使所述豆粕酶解物发酵46‑52小时，制得所述大豆多肽组合物。本申请的技术方案在降低蛋白酶用量的同时对大豆蛋白具有更强的水解能力，大豆多肽组合物中蛋白质水解率可达48.5％，制备的大豆多肽组合物稳定高，直接储存不易变质产生恶臭、胀气等，自然储存时间延长至1个月以上，可直接应用于制备多肽氨基酸肥料，降低了肥料生产成本。
Description
技术领域
本发明涉及肥料生产技术领域，具体涉及利用菌酶协同制备大豆多肽组合物及多肽氨基酸肥料的方法和产品。
背景技术
豆粕是大豆提取油脂后得到的副产品，我国年产量5000万吨以上，豆粕中粗蛋白含量为30％-50％，可作为植物重要的有机氮源，由于其分子结构复杂、分子量较大，植物根系无法直接吸收，必须被降解成小分子的多肽或游离氨基酸才能为植物利用。一般将多于100个氨基酸通过肽键相联接的聚合物称作蛋白质，2个以上100个以下的氨基酸通过肽键相联接的聚合物称作多肽，通常用于肥料生产的是分子质量小于1000Da的多肽。这类多肽具有植物吸收速度快、效率高的优势，开发多肽类肥料成为肥料发展的新方向。目前应用较多的是动物毛发或低值鱼为原料开发动物源多肽，植物源多肽目前开发较少，虽有用大豆、豆粕或其他花生粕为原料来生产多肽，但多用于饲料。
工业生产大豆多肽主要采用酶解法，此法条件温和，工艺简单，生产周期通常在3-6h，已成为大豆多肽生产的主要方法，但其成本较高，每生产1吨需要添加蛋白酶的成本在600-1000元，过高的生产成本限制其在肥料上的应用。
发酵法是通过微生物产生的酶作用于肽段，大大降低了成本(按10％添加量，每生产1吨菌剂成本在100-200元)。单纯微生物发酵，微生物菌剂添加量大(一般接种量在5％以上)，耗时长(48h以上)，水解度小(不超过35％)，还需要添加玉米粉、葡萄糖等充当碳源，操作相对繁琐。此外微生物发酵时大豆蛋白水解不彻底，获得的大豆多肽含量低，未分解的大豆蛋白难以被根系吸收。
另外，酶解法和发酵法制备的多肽氨基酸稳定性差，易变质产生恶臭，储存时间短，在生产上需要离心后把沉淀物烘干再用于饲料或肥料生产，限制了其在肥料上的广应用。
目前微生物发酵豆粕的研究较多，如管风波(2008)、莫重文(2007)、周伏忠(2007)、杨彩艳(2010)、张鹏飞(2013)等，分别对豆粕微生物发酵菌株筛选、菌种复配和豆粕发酵工艺等方面进行了研究。李善仁等(2009)用枯草芽孢杆菌和米曲霉混合菌固态发酵豆粕，大豆肽的得率为51％。庞宗文等人毛霉发酵豆粕的提取物的大豆肽分子量集中在10ku以下。
目前菌酶协同进行豆粕酶解的研究开展的较少，杨洁芳等(2013)添加枯草芽孢杆菌和碱性蛋白酶，通过菌酶协同制备大豆多肽。方乐等(2011)采用枯草芽孢杆菌、酿酒酵母菌(1比1)和中性蛋白酶处理豆粕制备多肽。上述两者都是菌和酶同时加入，尽管比单独使用能显著提高降解液中大豆肽含量，但由于蛋白酶和微生物菌剂作用条件如：温度、pH均不同，两者同时加入反而限制菌酶协同作用的充分发挥。
发明内容
本申请公开了一种菌酶协同制备大豆多肽组合物以及由其制备多肽氨基酸肥料的制备方法，其包括：
实施方式1、一种制备大豆多肽组合物的方法，其特征在于，包括如下步骤：
蛋白酶处理步骤：采用复合蛋白酶使经灭菌的豆粕酶解3-6小时，获得豆粕酶解物，其中，所述复合蛋白酶包括碱性蛋白酶和中性蛋白酶，所述碱性蛋白酶的酶活力大于等于180000U/g，所述中性蛋白酶的酶活力大于等于80000U/g；
微生物发酵步骤：采用枯草芽孢杆菌使所述豆粕酶解物发酵46-52小时，例如48-50小时，制得所述大豆多肽组合物。
实施方式2、根据实施方式1所述制备大豆多肽组合物的方法，其特征在于，
所述经灭菌的豆粕如下制备：将100-180重量份经粉碎的豆粕和820-900重量份的水混合均匀，调节pH值到7.0-8.5，待pH稳定后升温至90-121℃并保持15-45分钟，然后逐渐降温至45-55℃，完成豆粕预处理，获得经灭菌的豆粕；
所述蛋白酶处理步骤具体如下进行：向经灭菌的豆粕中加入1-3wt％复合蛋白酶(按豆粕的重量计)，维持pH值在7.0-8.2，在搅拌条件下持续酶解制得所述豆粕酶解物，其中，所述复合蛋白酶包括40-70重量份碱性蛋白酶和30-60重量份的中性蛋白酶；
所述微生物发酵步骤具体如下进行：将所述豆粕酶解物降温至30-37℃，调节pH至7.0-7.2，加入2-6vol％枯草芽孢杆菌菌液在搅拌条件下进行发酵，所述菌液的有效活菌数(cfu)≥2.0×109个/mL，制得所述大豆多肽组合物。
实施方式3、根据实施方式2所述制备大豆多肽组合物的方法，其中，豆粕预处理过程中所述经粉碎的豆粕细度为70-90目，所述豆粕和水按重量份计的配比为100-120：880-900。
实施方式4、根据实施方式2所述制备大豆多肽组合物的方法，其中，豆粕预处理过程中采用氧化钙对pH值进行调节，蛋白酶处理步骤中采用氢氧化钠溶液维持所需pH。
实施方式5、根据实施方式1所述制备大豆多肽组合物的方法，其中，所述枯草芽孢杆菌在中国普通微生物菌种保藏管理中心的保藏编号为：CGMCC No.15646。
实施方式6、一种制备多肽氨基酸肥料的方法，包括如下步骤：
将实施方式1-5中任一项制备的大豆多肽组合物升温至85-100℃，保持15-30分钟，制得灭菌的大豆多肽组合物；
向所述灭菌的大豆多肽组合物中添加氨基酸粉、植物营养物质、聚谷氨酸和添加剂，混合均匀后在40-60℃下反应60-80分钟，制得多肽氨基酸肥料。
实施方式7、根据实施方式6所述制备多肽氨基酸肥料的方法，其中，所述植物营养物质包括一种或多种含有硅、钙、镁、铁、锰、锌、铜、硼元素的物质，所述添加剂包括聚谷氨酸、维生素B1、维生素B6中的一种或多种。
实施方式8、根据实施方式6所述制备多肽氨基酸肥料的方法，其中，所述植物营养物质包括五水硫酸铜、EDTA螯合铁、一水硫酸锌，所述添加剂包括聚谷氨酸、维生素B1、维生素B6，所述多肽氨基酸肥料按下列配比组成：
600-800体积份的大豆多肽组合物，
150-220重量份的氨基酸粉，
30-40重量份的五水硫酸铜，
40-60重量份的EDTA螯合铁，
15-25重量份的一水硫酸锌，
15-25重量份的聚谷氨酸，
0.01-0.1重量份的维生素B1，
0.01-0.1重量份的维生素B6，和
余量的水。
实施方式9、采用实施方式1至5中任一项所述方法制备的大豆多肽组合物。
实施方式10、采用实施方式6至9中任一项所述方法制备的多肽氨基酸肥料。
采用本申请的技术方案在降低蛋白酶用量的同时对大豆蛋白具有更强的水解能力，大豆多肽组合物中蛋白质水解率可达45％以上，且产物中的游离氨基酸和大豆多肽含量更高，非常适用于植物吸收利用；同时采用本申请所述方法制备的大豆多肽组合物稳定高，直接储存不易变质产生恶臭、胀气等，自然储存时间延长至1个月以上，可直接应用于制备多肽氨基酸肥料，降低了肥料生产成本。由此制备的多肽氨基酸肥料质量稳定，长期放置不会出现沉淀、涨桶等，施用后易于被作物吸收，具有保护根系、减少盐害，缓解低温、弱光等逆境胁迫的作用，还能增大叶片、增加叶片厚度和叶绿素含量，改善光合作用等效果。
具体实施方式
为使本公开实施例的目的、技术方案和优点更加清楚，下面对本公开实施例的技术方案进行清楚、完整地描述。显然，所描述的实施例是本公开的一部分实施例，而不是全部的实施例。基于所描述的本公开的实施例，本领域普通技术人员在无需创造性劳动的前提下所获得的所有其他实施例，都属于本公开保护的范围。
在本申请中，除非特别指出或者根据上下文的理解可以得出不同的含义，否则各个术语具有本领域通常理解的含义。
本申请公开了一种利用豆粕制备大豆多肽组合物的方法，包括如下步骤：
蛋白酶处理步骤：采用复合蛋白酶使经灭菌的豆粕酶解3-6小时，获得豆粕酶解物，其中，所述复合蛋白酶包括碱性蛋白酶和中性蛋白酶，所述碱性蛋白酶的酶活力大于等于180000U/g，所述中性蛋白酶的酶活力大于等于80000U/g；
微生物发酵步骤：采用枯草芽孢杆菌使所述豆粕酶解物发酵46-52小时，例如48-50小时，制得所述大豆多肽组合物。
本申请先后通过复合蛋白酶处理步骤和微生物发酵步骤对豆粕进行分解，能够发挥菌酶协同作用，在酶解豆粕的基础上进行枯草芽孢杆菌的深度发酵，不仅能发挥蛋白酶的作用效果，还能通过枯草芽孢杆菌的发酵，提高豆粕酶解蛋白的水解度。通过酶活力大于等于180000U/g的碱性蛋白酶的和酶活力大于等于80000U/g中性蛋白酶复合作用，以及进一步用枯草芽孢杆菌进行发酵，在大幅降低蛋白酶用量的情况下，通过菌酶协同作用使蛋白质水解率保持在45％以上，且产物中的游离氨基酸和大豆多肽含量更高，由此制备的大豆多肽组合物稳定高，自然存储1个月以上不变质，无需进行沉淀干燥即可储存，并直接应用于制备多肽氨基酸肥料，由此降低了产品生产成本低，非常适用于以豆粕为原料的植物源多肽肥料的开发应用。
本申请中，大豆多肽是指大豆蛋白经水解后，由3-6个氨基酸组成的低肽混合物。
在一些实施方式中，所述经灭菌的豆粕如下制备：将100-180重量份经粉碎的豆粕和820-900重量份的水混合均匀，调节pH值到7.0-8.5，待pH稳定后升温至90-121℃并保持15-45分钟，然后逐渐降温至45-55℃，完成豆粕预处理，获得经灭菌的豆粕；经灭菌的豆粕能够避免枯草芽胞杆菌发酵时出现杂菌污染。
所述蛋白酶处理步骤具体如下进行：向经灭菌的豆粕中加入1-3wt％复合蛋白酶(按豆粕的重量计)，维持pH值在7.0-8.2，在搅拌条件下持续酶解制得所述豆粕酶解物，其中，所述复合蛋白酶包括40-70重量份碱性蛋白酶和30-60重量份的中性蛋白酶，这样的酶解条件能够获得最佳的酶解效果。
所述微生物发酵步骤具体如下进行：将所述豆粕酶解物降温至30-37℃，调节pH至7.0-7.2，加入2-6vol％枯草芽孢杆菌菌液(按豆粕酶解物的体积计)，在搅拌条件下进行发酵，所述菌液的有效活菌数(cfu)≥2.0×109个/mL，制得所述大豆多肽组合物。
本申请中，wt％和vol％分别指重量百分比和体积百分比。
由于蛋白酶和微生物菌剂发挥作用所需温度、pH等条件均不同，同时加入微生物和蛋白酶会大大限制两者作用的充分发挥，本申请通过调整工艺条件实现菌酶协同，使其发挥各自优势，在降低蛋白酶用量，降低成本的同时获得更高的水解能力。
在一些实施方式中，豆粕预处理过程中所述经粉碎的豆粕细度为70-90目，优选75至85目，优选80目，所述豆粕和水按重量份计的配比为100-120：880-900。
在一些实施方式中，豆粕预处理过程中采用氧化钙对pH值进行调节，蛋白酶处理步骤中采用氢氧化钠溶液维持所需pH。
在一些实施方式中，所述枯草芽孢杆菌在中国普通微生物菌种保藏管理中心的保藏编号为：CGMCC No.15646。该菌剂的活化如下进行：将枯草芽孢杆菌接种到LB培养基中，在28-37℃的温度条件下培养8-10小时。其中，所述LB培养基的配方为：蛋白胨10g/L，酵母提取物5g/L，NaCl 10g/L，200转/分钟，32-37℃震荡培养24小时，有效活菌数达到2×109CFU/ml后用于发酵。
本申请还公开了一种制备多肽氨基酸肥料的方法，包括如下步骤：
将所述大豆多肽组合物升温至85-100℃，保持15-30分钟，制得灭菌的大豆多肽组合物；
向所述灭菌的大豆多肽组合物中添加氨基酸粉、植物营养物质、聚谷氨酸和添加剂，混合均匀后在40-60℃下反应60-80分钟，制得多肽氨基酸肥料。
由此制备的多肽氨基酸肥料具有如下优点：1.大豆多肽的吸收速度很快：由于多肽的分子结构大于氨基酸，这就决定了多肽在吸收时，每次吸收的不仅仅是一个而是多个氨基酸，其吸收效率大大提高。多肽产品施入土壤或喷施在作物上后，能减少呼吸作用对能量的消耗，快速补充植物所需的营养，对提高作物健壮程度和抵抗力的作用十分显著，表现在叶子上，叶片迅速转绿、增大增厚，植物自身对干旱、低温等逆境抗性增加，果实品质改善，采收期提前。2.吸收的完整性：对于作物而言，普通的肥料经植物选择性吸收后，即有部分离子会残留到土壤，还会通过根系或茎叶分泌一些物质，根系分泌物会对下一茬作物产生重大影响。多肽可以直接被吸收，并且完整的被吸收，不会有分泌物产生，使用后可以减少施肥对根际环境的影响。3.被吸收后的作用：协助运输作用，多肽被吸收后可以帮助运输营养物质，增强作物的吸收能力；载体作用，可以将一些有益的微量元素吸附、粘连、装载在本体上；充当信使，可以作为神经递质传递信息，让作物的各个器官互相协调作用。
在一些实施方式中，所述植物营养物质包括一种或多种含有硅、钙、镁、铁、锰、锌、铜、硼元素的物质，所述添加剂包括聚谷氨酸、维生素B1、维生素B6中的一种或多种。由于多肽可以促进植物对有益元素的吸收和利用，本领域技术人员可以可以按需添加植物营养物质。
在一些实施方式中，所述植物营养物质包括五水硫酸铜、EDTA螯合铁、一水硫酸锌，所述添加剂包括聚谷氨酸、维生素B1、维生素B6，所述多肽氨基酸肥料按下列配比组成：600-800体积份的大豆多肽组合物，150-220重量份的氨基酸粉，30-40重量份的五水硫酸铜，40-60重量份的EDTA螯合铁，15-25重量份的一水硫酸锌，15-25重量份的聚谷氨酸，0.01-0.1重量份的维生素B1，0.01-0.1重量份的维生素B6，和余量的水。本申请中的“体积份”与“重量份”相对应，例如，当“重量份”的单位为kg时，体积份的单位为L。通过以菌酶联合降解豆粕制备的大豆多肽组合物为原料，根据作物需求添加营养成分及辅助材料制成的多肽氨基酸肥料，质量稳定，营养全面，施用后易于被作物吸收，具有保护根系、减少盐害，缓解低温、弱光等逆境胁迫的作用。
本申请还公开了一种采用前述任一项方法制备的大豆多肽组合物。
本申请还公开了一种采用前述任一项方法制备的多肽氨基酸肥料。
采用本申请制备大豆多肽组合物的方法，在降低蛋白酶用量的同时获得了更强的水解能力，蛋白质水解率达到48.5％，且产物中的游离氨基酸和大豆多肽含量更高，能够降低豆粕降解成本，且制备的大豆多肽组合物稳定性高，自然储存时间长，可直接应用于制备多肽氨基酸肥料，降低了肥料生产成本。采用本申请所述方法制备的多肽氨基酸肥料，质量稳定，长期放置不会出现沉淀、涨桶等，施入土壤或喷施在作物上后，能够迅速、完整地被作物吸收利用，田间试验表明具有显著的提质增产增效作用。
以上所述的范围可以单独使用或者组合使用。通过下面实施例，能够更容易理解本申请。
实施例
本申请实施例采用的原料及来源如下表1所示：
表1
| 组分 | 参数或性质描述 | 来源 |
| 豆粕 | 粗蛋白含量≥40％ | 益海(连云港)粮油工业有限公司 |
| 碱性蛋白酶 | 酶活力≥20万U/g | 苏州美亿辰生物科技有限公司 |
| 中性蛋白酶 | 酶活力≥10万U/g | 南宁庞博生物工程有限公司 |
| 氧化钙 | CaO≥98％ | 江西创先精细钙业有限公司 |
| 氢氧化钠 | NaOH≥99％ | 沧州市高峰化工产品有限公司 |
| 氨基酸粉 | 游离氨基酸含量≥60％ | 成都祥云化工有限公司 |
| 五水硫酸铜 | 纯度≥98％，含铜≥25％ | 苏州联胜化学有限公司 |
| EDTA螯合铁 | EDTA螯合铁，铁≥12.8％ | 苏州联胜化学有限公司 |
| 一水硫酸锌 | 含锌≥35.7％ | 常宁市华兴冶化实业有限责任公司 |
| 维生素B<sub>1</sub> | 含量≥99％ | 武汉源正达生物科技有限公司 |
| 维生素B<sub>6</sub> | 含量≥99％ | 武汉源正达生物科技有限公司 |
| 聚谷氨酸 | 含量≥100克/升 | 南京轩凯生物科技股份有限公司 |
实施例1
本实施例公开了一种大豆多肽组合物，其通过如下步骤制备：
(1)豆粕预处理
豆粕粉碎过80目筛，按照100重量份豆粕加900重量份水装入发酵罐，混合均匀，用氧化钙调节pH在7.0-8.5，待pH稳定后保持1小时，升温至121℃下并保持15分钟，逐步降温到45℃-55℃，完成豆粕预处理，获得经灭菌的豆粕。
(2)蛋白酶处理
取40重量份碱性蛋白酶和60重量份的中性蛋白酶形成复合蛋白酶，所述碱性蛋白酶的酶活力为200000U/g，所述中性蛋白酶的酶活力为100000U/g。将3重量份的所述复合蛋白酶(即所述复合蛋白酶占所需酶解豆粕的重量百分比为3％)加入所述经灭菌的豆粕中，维持pH值在7.0-8.2，保持转速50-90转/分钟，酶解4小时，获得豆粕酶解物，酶解过程用0.5mol/L的NaOH维持酶解所需pH。
(3)枯草芽孢杆菌菌剂活化
枯草芽孢杆菌购自中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为：CGMCC No.15646。将枯草芽孢杆菌接种到LB培养基中，在28-37℃的温度条件下培养8-10小时。其中，所述LB培养基的配方为：蛋白胨10g/L，酵母提取物5g/L，NaCl 10g/L。200转/分钟，32-37℃震荡培养24小时，制得枯草芽孢杆菌菌液，所述菌液的有效活菌数(cfu)≥2.0×109个/mL。
(4)微生物发酵
使所述豆粕酶解物降温至30-37℃，调节pH至7.0-7.2，加入3vol％枯草芽孢杆菌菌液，在搅拌条件下进行发酵，转速180转/分钟，发酵48小时，即完成豆粕酶解物的发酵，制得所述大豆多肽组合物。
对比例
作为对照，本申请分别采用酶解法、发酵法处理经预处理的豆粕，所述经预处理的豆粕采用和实施例1中的豆粕预处理步骤制备，具体操作如下：
酶解法：添加6wt％(按豆粕的重量计)的复合蛋白酶，所述复合蛋白酶和实施例1一致，然后采用和实施例1中的蛋白酶处理步骤一致的方法，酶解4小时。
发酵法：添加10vol％枯草芽孢杆菌菌液(按经灭菌的豆粕的体积计)，所述枯草芽孢杆菌菌液和实施例1一致，然后采用和实施例1中的微生物发酵步骤一致的方法，发酵52小时。
检测分析
取实施例1制备的大豆多肽组合物、对比例中的酶解法和发酵法制备的产物，对比分析三个样品的水解度，并观察组合物的稳定性。
1、水解度检测
分别检测实施例1制备的大豆多肽组合物和对比例中采用酶解法和发酵法制备的产物的蛋白质水解率、游离氨基酸含量、大豆多肽质量分数。
蛋白质水解率测定计算方式为：蛋白质水解率(DH)％＝(Ah-A0)/(A总-A0)×100％，其中，Ah＝水解液中的总游离-NH2数，A0＝原料蛋白中固有的游离-NH2数，A总＝原料蛋白经强酸水解后得到的的总游离-NH2数。氨基氮测定按GB5009.235-2016采用甲醛滴定法测定氨态氮含量。
游离氨基酸含量按GB/T 22492-2008进行测定。
大豆多肽质量分数测定计算方式为：大豆多肽质量分数＝待测液中的酸溶蛋白质量分数-游离氨基酸质量分数，酸溶蛋白含量和游离氨基酸含量测定方法见GB/T 22492-2008。
检测结果如下表2所示：
表2
| 检测指标 | 蛋白质水解率 | 游离氨基酸 | 大豆多肽 |
| 实施例1 | 48.5％ | 1.8％ | 1.89％ |
| 对比例酶解法 | 40.4％ | 1.7％ | 1.4％ |
| 对比例发酵法 | 33.8％ | 1.1％ | 1.59％ |
由上表数据可以看出，采用实施例1所述方法的蛋白质水解率最高，为48.5％，表明通过菌酶协同作用，复合蛋白酶用量降低50％，仍然能够获得更强的水解能力，且产物中的游离氨基酸和大豆多肽含量更高。从成本来看，对比例中，酶解法中6wt％复合蛋白酶的添加成本约为630元/吨，发酵法中10vol％枯草芽孢杆菌菌液的添加成本约为200元/吨。实施例1中，3wt％复合蛋白酶和3vol％枯草芽孢杆菌菌液的综合添加成本约为400元/吨，表明本申请所述方法对大豆蛋白的分解更加彻底，且具有成本上的优势。
2、组合物稳定性检测
将实施例1制备的大豆多肽组合物和对比例中采用酶解法和发酵法制备的产物分别置于密封容器中静置储存，每天观察是否产生异味及是否存在涨桶现象。
经观察，实施例1制备的大豆多肽组合物无异味，存储30以上无明显臭味，无涨桶现象；采用酶解法制备的产物在存储第5天即产生恶臭且有严重涨桶现象；采用发酵法制备的产物在存储10天后即产生臭味，随着存储时间延长，臭味加深，且有严重涨桶现象。表明无论是酶解法还是发酵法制备的产物，由于其降低度低，稳定性差，储存时间极短，难以在实际生产中直接应用于直接应用于制备多肽氨基酸肥料。采用本申请所述方法制备的大豆多肽组合物，水解度高，稳定性好，耐储存，直接储存不易变质产生恶臭、胀气等，可直接应用于制备多肽氨基酸肥料，降低了肥料生产成本。
实施例2
取实施例1中制备的大豆多肽组合物，升温至85℃，保持30分钟灭酶灭菌，制得灭菌的大豆多肽组合物；向700体积份所述灭菌的大豆多肽组合物添加200重量份氨基酸粉混合均匀，然后依次加入35重量份五水硫酸铜，50重量份EDTA螯合铁，20重量份聚谷氨酸，20重量份一水硫酸锌，0.03重量份维生素B1，0.05重量份维生素B6，加水至1000体积份并混合均匀后在40℃下反应80分钟，分装制得多肽氨基酸肥料。
作为对照，采用对比例中的酶解法制备的产物替换大豆多肽组合物，添加等量的其他原料，制得对照肥料应用于田间应用试验。
实施例3
本实施例采用实施例2制备的多肽氨基氨酸肥料和对照肥料，在作物上进行应用对比试验。
1.材料与方法
(1)试验地点：重庆市潼南区罐坝村
(2)试验作物：番茄，品种为粉红D—80，2021年2月10日育苗，2021年4月5日定植，2021年6月12日至2021年8月25日采收。
(3)试验设计：试验设四个处理，各处理3次重复，随机区组排列，每个小区面积50平米，呈长方形，设保护行，试验处理设计如下：
处理1：习惯施肥+叶面喷施实施例2多肽氨基氨酸肥料；
处理2：习惯施肥+叶面喷施实施例2制备的对照肥料；
处理3(空白对照)：习惯施肥+叶面喷施等量清水。
(4)施用方法：处理1、2中，多肽氨基酸肥料和对照肥料的施用方法为：600倍稀释液分别于2021年5月1日起每月1日和15日叶面喷施一次，处理3中，清水喷施次数与其他处理一致。
2.试验结果
通过测量以下数据，分析各处理的番茄生物学性状
(1)叶片厚度和叶绿素含量：2021年6月30日，每个处理随机选取10株，每株选取中部位置的6个叶片测量叶片厚度和叶绿素含量求平均值，其中，叶片厚度的测量采用常州德杜精密仪器有限公司的DT-S05叶片厚度测定仪，叶绿素含量的测量采用浙江托普云农科技股份有限公司型号TYS-B叶绿素测定仪。
(2)果数和单果重：每个处理随机选取10株，统计采收期内的果数以及果重，计算单株总果数以及平均果重。测量结果见下表3：
表3
| 处理 | 叶片厚度/μm | 叶绿素含量/SPAD | 单株总果数/个 | 平均果重/克 |
| 处理1 | 175.2 | 45.2 | 16.5 | 138.3 |
| 处理2 | 162.5 | 42.8 | 14.7 | 132.5 |
| 处理3 | 152.4 | 37.6 | 13.4 | 124.0 |
由以上数据可以看出，采用本申请的方法制备的多肽氨基酸肥料，相较于单独采用酶解法制备的对照肥料，叶片更为肥厚，叶绿素含量更高，从而能够改善光合作用，增产幅度明显。
实施例4
本实施例对比了本申请制备的多肽氨基酸肥料、常规氨基酸肥料、普利登鱼蛋白肥三种肥料在结球甘蓝上的应用效果。其中常规氨基酸肥料、普利登鱼蛋白肥均为市售产品。试验方案如下：
试验地点：重庆市潼南区罐坝村甘蓝试验示范基地,
基肥：腐熟有机肥1200公斤/亩，15-15-15复合肥50公斤/亩。
试验设三个处理：所用常规氨基酸肥料与多肽氨基酸肥料，两者养分含量类似，均为：游离氨基酸≥100g/L，Cu+Zn+Fe≥20g/L。定植成活后亩冲施2L，从发棵期开始冲施5L/亩，连用2次，同时稀释600倍叶面喷施3次，亩用量80mL，安全间隔期7天；普利登鱼蛋白肥料游离氨基酸≥100g/L、氮(N)+磷(P2O5)+钾(K2O)≥60g/L、Cu+Zn+Fe+Mn+B≥20g/L，冲施及叶面喷施时期、用量等均与两种氨基酸肥料一致。
测定相关指标如下表所示：
表4
由上表数据可以看出，使用多肽氨基酸肥料后，产量较常规氨基酸肥料增加13.99％，维生素C含量增加13.4％，甘蓝结球紧实度高。
普利登鱼蛋白肥是以低值鱼分解后形成的动物多肽为原料加工而成，使用后结球前甘蓝长势好，叶片大而厚，但结球后叶片较为松散，造成产量增加不明显。同时，叶片VC含量较常规氨基酸肥料减少4.69％，较使用多肽氨基酸减少19.21％，甘蓝品质不如前者。
从上述三种肥料的投入来看，肥料单价：多肽氨基酸肥料6.5元/公斤，常规氨基酸肥料8.5元/公斤，普利登肥料9.6元/公斤。多肽氨基酸投入12.24×6.5＝79.56元、常规氨基酸肥料投入104.04元，普利登鱼蛋白肥最高，达到117.50元，较多肽氨基酸肥料高37.94％。
实施例5
本实施例对比了本申请制备的多肽氨基酸肥料、常规氨基酸肥料、普利登鱼蛋白肥三种肥料在哈密瓜上的应用效果。其中常规氨基酸肥料、普利登鱼蛋白肥均为市售产品。试验方案如下：
试验地点：海南省文昌市龙楼镇龙楼村，
基肥：施用腐熟有机肥1500公斤/亩，18-10-20复合肥100公斤，钙镁磷肥80公斤。
品种：西州蜜哈密瓜
试验设三个处理：常规氨基酸肥料、多肽氨基酸肥料和普利登鱼蛋白肥料，三者养分含量同实施例4。定植成活后冲施2公斤，伸蔓期冲施3公斤配合20-10-20肥料3公斤，结瓜期冲施6公斤配合16-8-32肥料8公斤，连用2次，间隔7天。待瓜表面绒毛褪去后，上述两种氨基酸肥料分别稀释600倍叶面喷施，亩用量80mL，连用4次，间隔7天；普利登稀释200倍叶面喷施、使用时期和次数均同前两种肥料。每株留3条蔓，1个瓜，每处理取10株，求平均值做瓜重，亩栽培1500株。测定相关指标如下表所示：
表5
由上表数据可以看出，使用多肽氨基酸肥料后，哈密瓜节瓜部位一致，果型均匀，糖度较常规氨基酸肥料增加17.43％，产量增加11.29％，特别是哈密瓜采收时间平均提前4.5天，商品果率超过85％，增产、增收效果明显。
普利登鱼蛋白前期使用能加快缓苗速度，伸蔓期哈密瓜叶片浓绿，但同氨基酸肥料相比，蚜虫、红蜘蛛和霜霉病病发生严重，后期农药投入加大。同时，哈密瓜果实均匀度差，瓜的大小悬殊，商品果较常规氨基酸肥料和多肽氨基酸肥料分别减少1.53％和25.64％。
从上述三种肥料的投入来看，多肽氨基酸投入17.32×6.5＝112.58元、常规氨基酸肥料投入147.22元，普利登鱼蛋白肥最高，达到166.27元，较多肽氨基酸肥料高47.69％。
以上所述仅是本公开的示范性实施方式，而非用于限制本公开的保护范围，本公开的保护范围由所附的权利要求确定。
Claims (10)
1.一种制备大豆多肽组合物的方法，其特征在于，包括如下步骤：
蛋白酶处理步骤：采用复合蛋白酶使经灭菌的豆粕酶解3-6小时，获得豆粕酶解物，其中，所述复合蛋白酶包括碱性蛋白酶和中性蛋白酶，所述碱性蛋白酶的酶活力大于等于180000U/g，所述中性蛋白酶的酶活力大于等于80000U/g；
微生物发酵步骤：采用枯草芽孢杆菌使所述豆粕酶解物发酵46-52小时，制得所述大豆多肽组合物。
2.根据权利要求1所述制备大豆多肽组合物的方法，其特征在于，
所述经灭菌的豆粕如下制备：将100-180重量份经粉碎的豆粕和820-900重量份的水混合均匀，调节pH值到7.0-8.5，待pH稳定后升温至90-121℃并保持15-45分钟，然后逐渐降温至45-55℃，完成豆粕预处理，获得经灭菌的豆粕；
所述蛋白酶处理步骤具体如下进行：向经灭菌的豆粕中加入1-3wt％复合蛋白酶(按豆粕的重量计)，维持pH值在7.0-8.2，在搅拌条件下持续酶解制得所述豆粕酶解物，其中，所述复合蛋白酶包括40-70重量份碱性蛋白酶和30-60重量份的中性蛋白酶；
所述微生物发酵步骤具体如下进行：将所述豆粕酶解物降温至30-37℃，调节pH至7.0-7.2，加入2-6vol％枯草芽孢杆菌菌液在搅拌条件下进行发酵，所述菌液的有效活菌数(cfu)≥2.0×109个/mL，制得所述大豆多肽组合物。
3.根据权利要求2所述制备大豆多肽组合物的方法，其中，豆粕预处理过程中所述经粉碎的豆粕细度为70-90目，所述豆粕和水按重量份计的配比为100-120：880-900。
4.根据权利要求2所述制备大豆多肽组合物的方法，其中，豆粕预处理过程中采用氧化钙对pH值进行调节，蛋白酶处理步骤中采用氢氧化钠溶液维持所需pH。
5.根据权利要求1所述制备大豆多肽组合物的方法，其中，所述枯草芽孢杆菌在中国普通微生物菌种保藏管理中心的保藏编号为：CGMCC No.15646。
6.一种制备多肽氨基酸肥料的方法，包括如下步骤：
将权利要求1-5中任一项制备的大豆多肽组合物升温至85-100℃，保持15-30分钟，制得灭菌的大豆多肽组合物；
向所述灭菌的大豆多肽组合物中添加氨基酸粉、植物营养物质和添加剂，混合均匀后在40-60℃下反应60-80分钟，制得多肽氨基酸肥料。
7.根据权利要求6所述制备多肽氨基酸肥料的方法，其中，所述植物营养物质包括一种或多种含有硅、钙、镁、铁、锰、锌、铜、硼元素的物质，所述添加剂包括聚谷氨酸、维生素B1、维生素B6中的一种或多种。
8.根据权利要求6所述制备多肽氨基酸肥料的方法，其中，所述植物营养物质包括五水硫酸铜、EDTA螯合铁、一水硫酸锌，所述添加剂包括聚谷氨酸、维生素B1、维生素B6，所述多肽氨基酸肥料按下列配比组成：
600-800体积份的大豆多肽组合物，
150-220重量份的氨基酸粉，
30-40重量份的五水硫酸铜，
40-60重量份的EDTA螯合铁，
15-25重量份的一水硫酸锌，
15-25重量份的聚谷氨酸，
0.01-0.1重量份的维生素B1，
0.01-0.1重量份的维生素B6，和
余量的水。
9.采用权利要求1至5中任一项所述方法制备的大豆多肽组合物。
10.采用权利要求6至9中任一项所述方法制备的多肽氨基酸肥料。
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