CN106893676A - 一种从蛋白核小球藻中提取蛋白质的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明一种从蛋白核小球藻中提取蛋白质的方法，属于蛋白提取技术领域。所述方法包括将小球藻在室温下浸泡24h后，离心去色素及乙醇溶液；然后在50℃下经纤维素酶酶解3h；后灭酶，于超声处理30min，后用超高速细胞剪切仪剪切10 min；本发明方法还可以包括对小球藻色素的提取，及检测其抗氧化活性，小球藻蛋白的提取优化。本发明具有以下优点：在对今后小球藻蛋白的提取和利用大幅度提高至70.23%，和将小球藻色素及蛋白在食品、卫生、和医药行业得到广泛应用提供依据。
Description
技术领域
本发明属于蛋白提取技术领域，具体涉及一种从蛋白核小球藻中提取蛋白质的方法。
背景技术
蛋白核小球藻是一种普生性球形单细胞藻类蛋白含量大于63%，生态分布极广，在淡水、海水均能快速生长的。随着蛋白核小球藻的价值逐渐被认识，在日本、美国等国家对蛋白核小球藻开发尤为广泛，并向保健、美容系列产品发展，我国也于2013年将蛋白核小球藻列为新资源食品。蛋白核小球藻分布广、生长快，含有碳水化合物、蛋白质、油脂等营养成分，具有广阔的市场前景，但经热水浸提大部分是游离氨基酸或者是变性蛋白质，而多糖耐热性好，易于提取，有利于高附加值的蛋白核小球藻开发。但是目前其蛋白提取率却不足50%致使在生在和运用中蛋白得到浪费。
发明内容
针对现有技术在蛋白核小球藻蛋白提取率低下的问题，本发明致力于提高蛋白核小球藻蛋白的提取及利用率。酶解法能有效破除细胞壁，降解纤维素，使多糖从细胞中溶解出来，且作用条件温和、效率高，因此利用纤维素酶辅助提取蛋白核小球藻多糖，为蛋白核小球藻蛋白的保健品及药物等的开发利用奠定理论基础。
本发明的目的在于公开了一种从蛋白核小球藻中提取蛋白质的方法。
本发明的目的是通过以下技术方案实现的：
1、一种从蛋白核小球藻中提取蛋白质的方法，包括如下步骤：
(1)、乙醇浸泡小球藻：称取原料小球藻2g，加入40 ml的乙醇室温25℃浸泡24 h，后离心去除用水冲洗3-4次离心；
(2)、保留步骤(1)得到的离心上清液和离心沉淀；
(3)、纤维素酶处理：取步骤(1)的离心沉淀加入20ml水，用NaH2PO3 缓冲溶液调整pH5.0-5.5，加入纤维素酶1%，在水浴50℃中酶解3h，后100℃灭酶10min；
(4)、超声处理：往步骤(3)的产物中加入50ml水后，经超声破碎蛋白核小球藻细胞；
(5)、剪切处理：将步骤(4)的产物用超高速细胞剪切仪剪切，破碎蛋白核小球藻细胞；
(6)、取步骤(5)的产物，离心用水冲洗3-4次收集上清液；
(7)、合并步骤(2)和步骤(6)获得的离心上清液。
上述技术方案所述的方法，其中，步骤(1)中的乙醇浓度为75%。
上述技术方案所述的方法，其中，步骤(1)和步骤(6)中离心时的离心转速为5000r/min，时间为10min。
上述技术方案所述的方法，其中，步骤(4)中超声处理的超声功率为1000W，时间为24min。
上述技术方案所述的方法，其中，步骤(5)中剪切处理的剪切速度为8000r/min，时间为10min。
上述技术方案所述的方法，其中，所述方法还包括对步骤(1)和步骤(6)中所得的离心上清液用微量法96孔板测定蛋白的提取率和用BCA试剂盒测蛋白含量的步骤。
上述技术方案所述的方法，其中，对步骤(1)和步骤(6)中所得的离心上清液用BCA试剂盒测蛋白含量的具体过程为：将上清液稀释20倍，取10μL稀释液用BAC试剂盒在562nm波长下测其中的蛋白含量，及全波扫描吸光度。
超声提取作为一种应用越来越广泛的一种新提取手段，并且能实现破碎、匀质、乳化、混合、提取等功能，故广泛应用于生物、医学、化学、制药、食品、等实验室研究及企业生产，在本实验中能增加细胞破碎率，提高蛋白提取量。
超高速剪切均质乳化机，其剪切速度可以超过100000rpm，转子速度可以达到40m/s并且能实现细胞的破碎、匀质、乳化、混合、提取等功能，能提高本实验蛋白提取的效率。
本发明具有以下有益效果：
1、本次发明与传统的实验相比，传统的酸碱浸泡会影响蛋白结构活性，且不能用于食品医药中，本发明在不破坏蛋白结构的情况能大大提高其蛋白的利用。
2、本发明所采用的方法可以简单、有效地破碎蛋白核小球藻细胞和提取其蛋白，且蛋白提取率高达70.23%。
3、通过响应面优化确定最佳的提取工艺参数，能最大得到蛋白核小球藻的蛋白提取率。
4、能结合目前企业工厂需要并将其应用。
附图说明：
1、图1为超声功率对蛋白提取的影响；
2、图2为超声时间对蛋白提取的影响；
3、图3为超声时料液比对蛋白提取的影响。
具体实施方式：
为使本发明的技术方案便于理解，以下结合具体实施例对本发明一种从蛋白核小球藻中提取蛋白质的方法作进一步的说明。
实施例1：一种从蛋白核小球藻中提取蛋白质的方法：
一种从蛋白核小球藻中提取蛋白质的方法，包括如下步骤：
(1)、乙醇浸泡小球藻：称取原料小球藻2g，加入40 ml的浓度为75%的乙醇室温25℃浸泡24 h，后离心去除用水冲洗3-4次离心；其中，离心时的离心转速为5000r/min、时间为10min；
(2)、保留步骤(1)得到的离心上清液和离心沉淀；
(3)、纤维素酶处理：取步骤(1)的离心沉淀加入20ml水(使得原料小球藻与液体之间的比例为1:10)，用NaH2PO3 缓冲溶液调整pH5.0-5.5，加入纤维素酶1%，在水浴50℃中酶解3h，后100℃灭酶10min；
(4)、超声处理：往步骤(3)的产物中加入50ml水(使得原料小球藻与液体之间的比例为1:35)后，经超声破碎蛋白核小球藻细胞；其中，超声处理的超声功率为1000W、时间为24min；
(5)、剪切处理：将步骤(4)的产物用超高速细胞剪切仪剪切，破碎蛋白核小球藻细胞；其中，剪切处理的剪切速度为8000r/min、时间为10min；
(6)、取步骤(5)的产物，离心用水冲洗3-4次收集上清液；其中，离心时的离心转速为5000r/min、时间为10min；
(7)、合并步骤(2)和步骤(6)获得的离心上清液。
实施例2：一种从蛋白核小球藻中提取蛋白质的方法：
本实施例与实施例1步骤相同，区别在于：本实施例中还包括对实施例1中步骤(1)和步骤(6)中所得的离心上清液用微量法96孔板测定蛋白的提取率和用BCA试剂盒测蛋白含量的步骤；
其中，对步骤(1)和步骤(6)中所得的离心上清液用BCA试剂盒测蛋白含量的具体过程为：将上清液稀释20倍，取10μL稀释液用BAC试剂盒在562nm波长下测其中的蛋白含量，及全波扫描吸光度。
以下通过具体实验例对本发明一种从蛋白核小球藻中提取蛋白质的方法中的具体步骤及参数作进一步的说明。
一、试剂及仪器：
蛋白核小球藻，纤维素酶购自上海伯奥生物科技有限公司；
BCA试剂盒购自南京建成；
本发明试剂均为市场所售分析纯试剂。
分析测试方法：
色素分析用紫外分光光度计测定，蛋白用BCA试剂盒测量。
实验设备：
超声细胞破碎仪、高压脉冲电源系统、离心机、凯氏定氮仪、超高速均质机。
实验例1：从蛋白核小球藻中提取蛋白质的工艺流程：
蛋白核小球藻加水浸泡离心加水酶解灭酶超声破壁细胞剪切破壁离心。
(1)、加水浸泡：
称取2.0g蛋白核小球藻，加入40 ml的乙醇室温25℃浸泡12 h，后离心去除用水冲洗3-4次离心(5000r/min，10min)；
(2)、色素测量及蛋白测定：
取3.0mL的浸泡液，在紫外分光光度计全波段扫描，离心上清液用BCA试剂BCA蛋白的测定，南京建成BCA试剂盒绘制标准曲线。并用微量法96孔板测定蛋白的提取率。上清液稀释20倍，取10μL稀释液的在562nm测其中的蛋白含量。
C1=(A562-0.0348)/0.5003(ml/ml)
C2=(A562-0.0348)/0.5003(ml/ml)
蛋白提取量(g/ml)=C1×V1×稀释倍数+C2×V2×稀释倍数
蛋白提取率（%）=蛋白提取量/总样品蛋白含量
(3)、蛋白提取：
收集离心上清液，沉淀用纤维素酶处理，及将离心沉淀调整料比液(1:10)，用NaH2PO3 缓冲溶液调整pH5.0-5.5，加入纤维素酶1%，在水浴50℃中酶解3h，后100℃灭酶10min，然后调整料液比至1:35,后经超声破碎蛋白核小球藻细胞。
剪切处理：经超高速细胞剪切仪剪切破碎蛋白核小球藻细胞。后离心用BCA试剂盒测蛋白含量。
实验例2：从蛋白核小球藻中提取蛋白质的工艺参数的确定：
一、确定工艺参数所采用的试验步骤：
(1)、乙醇浸泡小球藻：称取小球藻2g，加入40 ml的乙醇室温25℃浸泡24 h，后离心去除用水冲洗3-4次离心；
(2)、纤维素酶处理：取步骤(1)的离心沉淀加入20ml水(使得原料小球藻与液体之间的比例为1:10)，用NaH2PO3 缓冲溶液调整pH5.0-5.5，加入纤维素酶1%，在水浴50℃中酶解3h，后100℃灭酶10min；
(3)、选取超声的时间，功率，及料液比作为单因素试验，通过超声破碎提取的蛋白用微量法96孔板测定蛋白的提取率。上清液稀释20倍，取10μL稀释液的用BAC试剂盒在562nm测其中的蛋白含量，选出最佳的条件；(具体步骤如以下“二、蛋白提取单因素工艺参数(一)单因素实验结果与分析”所述)
(4)、步骤(3)在单因素实验的基础上，利用Box-Benhnken响应面分析法，研究各自变量及其交互作用对蛋白提取率的影响，模拟得到二次多项式回归方程的预测模拟；并选取最佳的条件作为制取工艺；(具体步骤如以下“三、提取工艺最佳参数的确定”所述)
二、蛋白提取单因素工艺参数：
(一)单因素实验结果与分析：
(1)超声的时间对蛋白提取的影响：
用分析天平称取2.00g蛋白核小球藻干粉，加入40 ml的蒸馏水室温25℃浸泡24 h，后离心去除用水冲洗3-4次离心（5000r/min，10min）；后酶解，然后经不同时间进行超声0、10、20、30、40、50min，后剪切并计算蛋白提取率。
结果见图2超声时间对蛋白提取的影响，由图2可知，刚开始时蛋白提取率随着超声时间的增加而增大，在时间达到30min时水解度达到最大66.21%，当继续增加超声时间时，水解度则会下降，所以时间达到30min时是最优水解水平。
(2)超声的功率对蛋白提取的影响：
用分析天平称取2.00g蛋白核小球藻干粉，加入40 ml的蒸馏水室温25℃浸泡24 h，后离心去除用水冲洗3-4次离心（5000r/min，10min）；后酶解，然后经不同功率进行超声600、700、800、900、1000W，后剪切并计算蛋白提取率。
结果见图1超声功率对蛋白提取的影响，由图1可知，刚开始时蛋白提取率随着超声功率的增加而增大，在功率达到10kW时水解度达到最大67.75%，所以功率达到1000W时是最优水解水平。
(3)超声的料液比对蛋白提取的影响：
用分析天平称取2.00g蛋白核小球藻干粉，加入40 ml的蒸馏水室温25℃浸泡24 h，后离心去除用水冲洗3-4次离心（5000r/min，10min）；后酶解，然后在不同料液比进行超声1：20、1:25、1：30、1:35、、1: 40g/g，后剪切并计算蛋白提取率。
结果见图3超声时料液比对蛋白提取的影响，由图3可知，刚开始时蛋白提取率随着料液比的增加而增大，在时间达到30min时水解度达到最大64.84%，当继续增大料液比时，提取率，所以时间所以功率达到1000W时是最优水解水平。
三、提取工艺最佳参数的确定：
利用Box-Benhnken响应面分析法，研究各自变量及其交互作用对蛋白提取率的影响，超声时间，功率，及料液比作为自变量变量X1、X2、X3，取值范围超声时间(20min～40min)，功率(800W～1000W)，及料液比(30～40)如下表1。
表1 响应面分析个因素水平及编码
响应面实验设计及结果分析见表2
应用Design-Expert对实验数据进行多元回归拟合，得到提取率与所选3个因素的二次多项回归模型为：
Y=70.35+2.64*A-0.74*B+1.91*C-1.74*A*B-0.35*A*C+0.18*B*C-2.17*A2-3.43*B2-3.77* C2
表2 响应面实验设计及结果分析
| 实验编号 | 功率(100W) | 时间（min） | 料液比(g/g) | 得率 |
| 1 | 8.00 | 30.00 | 25.00 | 60.01461 |
| 2 | 9.00 | 30.00 | 30.00 | 71.224 |
| 3 | 9.00 | 20.00 | 35.00 | 66.033 |
| 4 | 10.00 | 30.00 | 35.00 | 68.0833 |
| 5 | 9.00 | 20.00 | 25.00 | 61.69265 |
| 6 | 8.00 | 40.00 | 30.00 | 63.0112 |
| 7 | 9.00 | 40.00 | 35.00 | 64.94762 |
| 8 | 8.00 | 30.00 | 35.00 | 63.67163 |
| 9 | 9.00 | 30.00 | 30.00 | 69.9712 |
| 10 | 10.00 | 20.00 | 30.00 | 69.961 |
| 11 | 8.00 | 20.00 | 30.00 | 61.045 |
| 12 | 9.00 | 30.00 | 30.00 | 69.855 |
| 13 | 9.00 | 40.00 | 25.00 | 59.9028 |
| 14 | 10.00 | 30.00 | 25.00 | 65.8384 |
| 15 | 10.00 | 40.00 | 30.00 | 64.96261 |
对该回归模型进行方差分析，结果如表3所示：
表3 二次多项回归模型的方差分析结果
| Items | Sum of Squares | df | Mean Square | F Value | P |
| Model | 201.516 | 9 | 22.39067 | 41.12889 | 0.0004 |
| A- Power | 55.66636 | 1 | 55.66636 | 102.2522 | 0.0002 |
| B-Time | 4.36221 | 1 | 4.36221 | 8.012839 | 0.0366 |
| C-Liquid to solid ratio | 29.21188 | 1 | 29.21188 | 53.65861 | 0.0007 |
| AB | 12.12638 | 1 | 12.12638 | 22.27466 | 0.0052 |
| AC | 0.498519 | 1 | 0.498519 | 0.915718 | 0.3825 |
| BC | 0.124068 | 1 | 0.124068 | 0.227898 | 0.6532 |
| A2 | 17.44401 | 1 | 17.44401 | 32.04249 | 0.0024 |
| B2 | 43.47868 | 1 | 43.47868 | 79.86495 | 0.0003 |
| C2 | 52.604 | 1 | 52.604 | 96.62704 | 0.0002 |
| Residual | 2.722012 | 5 | 0.544402 | ||
| Lack of Fit | 1.569622 | 3 | 0.523207 | 0.908038 | 0.5621 |
| Pure Error | 1.15239 | 2 | 0.576195 | ||
| Cor Total | 204.2381 | 14 |
* Significant, P< 0.05. ** Very significant, P<0.01.
通过Box-Behnken响应面试验，确定出了提取蛋白的最佳条件。通过验证试验，得到蛋白提取量为70.23%，占模型比为98.5%。模型p<0.0001,模型达到极其显著水平，失拟项p=0.5621不显著，说明方程拟合良好响应面互交作用分析利用Design-Expert软件得到不同因素响应分析图。
通过上述“(一)蛋白提取单因素实验”和“(二)提取工艺最佳参数的确定”的实验，可以确定：
步骤(4)所述最佳工艺条件：超声功率957W循环次数29.26 min料液比37.00；
步骤(4)预测值0.9272g，验证值为0.899g，相对误差3.04%，得率为70.23%
步骤(4)所述蛋白核小球藻提取的蛋白率回归模型为：Y=70.35+2.64*A-0.74*B+1.91*C-1.74*A*B-0.35*A*C+0.18*B*C-2.17*A2-3.43*B2-3.77* C2
以上所述，仅为本发明的较佳实施例，并非对本发明作任何形式上和实质上的限制，凡熟悉本专业的技术人员，在不脱离本发明技术方案范围内，当可利用以上所揭示的技术内容，而作出的些许更动、修饰与演变的等同变化，均为本发明的等效实施例；同时，凡依据本发明的实质技术对以上实施例所作的任何等同变化的更动、修饰与演变，均仍属于本发明的技术方案的范围内。
Claims (7)
1.一种从蛋白核小球藻中提取蛋白质的方法，包括如下步骤：
(1)、乙醇浸泡小球藻：称取原料小球藻2g，加入40 ml的乙醇室温25℃浸泡24 h，后离心去除用水冲洗3-4次离心；
(2)、保留步骤(1)得到的离心上清液和离心沉淀；
(3)、纤维素酶处理：取步骤(1)的离心沉淀加入20ml水，用NaH2PO3 缓冲溶液调整pH5.0-5.5，加入纤维素酶1%，在水浴50℃中酶解3h，后100℃灭酶10min；
(4)、超声处理：往步骤(3)的产物中加入50ml水后，经超声破碎蛋白核小球藻细胞；
(5)、剪切处理：将步骤(4)的产物用超高速细胞剪切仪剪切，破碎蛋白核小球藻细胞；
(6)、取步骤(5)的产物，离心用水冲洗3-4次后收集离心上清液；
(7)、合并步骤(2)和步骤(6)获得的离心上清液。
2.根据专利要求1所述的方法，其特征在于：步骤(1)中的乙醇浓度为75%。
3.根据专利要求1所述的方法，其特征在于：步骤(1)和步骤(6)中离心时的离心转速为5000r/min，时间为10min。
4.根据专利要求1所述的方法，其特征在于：步骤(4)中超声处理的超声功率为1000W，时间为24min。
5.根据专利要求1所述的方法，其特征在于：步骤(5)中剪切处理的剪切速度为8000r/min，时间为10min。
6.根据权利要求1～5中任一权利要求所述的方法，其特征在于：所述方法还包括对步骤(1)和步骤(6)中所得的离心上清液用微量法96孔板测定蛋白的提取率和用BCA试剂盒测蛋白含量的步骤。
7.根据权利要求6所述的方法，其特征在于，对步骤(1)和步骤(6)中所得的离心上清液用BCA试剂盒测蛋白含量的具体过程为：将上清液稀释20倍，取10μL稀释液用BAC试剂盒在562nm波长下测其中的蛋白含量，及全波扫描吸光度。
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