CN108728366A - 鲜藻液的制备方法及其用途 - Google Patents

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Abstract

本发明提供了一种鲜藻液的制备方法及其用途。本发明的鲜藻液的制备方法是藉由无菌培养及冷冻静置后再迅速升温，以达到缩短培养天数的功效；由前述制备方法所获得的鲜藻液的藻细胞不但不产生变异且重金属含量低，更可达到有效抗癌症的用途。

Description

鲜藻液的制备方法及其用途
技术领域
本发明是关于一种鲜藻液的制备方法，尤其是指藉由无菌培养以获得鲜藻液的制备方法。本发明还关于一种前述制备方法所得的鲜藻液，尤其指所含藻细胞无变异的鲜藻液。本发明还关于一种前述鲜藻液的用途，尤其指鲜藻液用于抗癌症的用途。
背景技术
绿球藻(Chlorella)是一种浮游生物，且当该藻体族群浓度比例过高时，藻细胞即会产生自体消化的现象，以维持藻体族群优良的生存、繁殖环境，而产生自体消化的藻细胞，会产生对生物体有害的物质，藻体亦会产生异味。由于绿球藻对于他种生物而言是极为营养的天然物质，因此在自然环境中，常会成为他种生物寄生体，然而，当藻细胞被寄生时，会使藻体产生不可预知的细胞变异。此外，绿球藻本身能够有效地吸附如重金属、农药、化学毒素、多氯联本、戴奥辛、辐射等毒素，但当绿球藻吸附一定量的毒素时亦会使藻细胞产生变异。
现有研究显示，在急流水处是看不到浮游藻类生存繁殖的，如图3所示，现有技术中绿球藻的培养模式却都需依靠强力的水流搅拌、发酵培养及开放式培养(通气培养)，才能使藻细胞不沉淀，只要停止水流搅拌，藻细胞即沉淀死亡。因此，现有商业化培养、生产的绿球藻产品，皆属细胞已产生变异的藻体，非原始的绿球藻藻体。此外，绿球藻细胞若经超过50摄氏度以上的热破坏、处于无水分状态(喷雾干燥、冷冻干燥)、高温破壁处理、高浓度且温度高于0摄氏度存放超过6小时以及处于静止状态2小时，皆会使藻细胞会沉淀或使细胞产生变异。再者，目前检测绿球藻产品的CNS检验标准的重金属含量合格标准从原本5ppm改为20ppm以下，由此可见，现有技术绿球藻培养方法所生产所得的绿球藻不但皆已变异，且是充满环境污染毒素的变异藻细胞。
发明内容
鉴于现有技术培养绿球藻的方法不但培养时间长、高温及破坏细胞壁处理会导致绿球藻的藻细胞变异及变性(degeneration)、充满污染毒素以及绿球藻细胞沉淀死亡的缺点，故本发明的一个目的在于提供一种鲜藻液的制备方法，藉由无菌培养及冷冻静置后再迅速升温，以达到缩短培养天数、不造成绿球藻的藻细胞变异以及重金属含量低的功效。
为达上述目的，本发明提供一种鲜藻液的制备方法，其包括以下步骤：
将绿球藻于无菌设备中培养不超过3天，其中浓度培养达万分之5以上，培养停留时间不超过6小时，以获得培养混合液；其中所述绿球藻可为小球属(Chlorella)；
将培养混合液迅速降温至1℃以下但不结冰并进行离心，且加入无菌水以获得藻液，其中藻液的浓度介于每毫升2.5毫克(mg/mL)至12.5mg/mL；
将藻液冷冻于0℃以下呈全结冻状态并静置12小时至24小时，再于10分钟内升温至40℃至50℃，以形成鲜藻液。
较佳的，所述的绿球藻为蛋白核小球藻(Chlorella pyrenoidosa)。
较佳的，所述的将绿球藻于无菌设备中培养时，搅拌培养液的流速介于每分钟3米(m/min)至每分钟20米。
更佳的，所述的将绿球藻于无菌设备中培养时，于光照条件下使绿球藻吸收碳源；当混合培养液的酸碱值低于6.8时，停止搅拌且同时维持该混合培养液呈现静止悬浮状态(不得沉淀)，待该混合培养液的酸碱值为7以上后再启动搅拌，让该混合培养液吸收碳源。
较佳的，所述的将藻液冷冻静置再升温时，可藉由微波或红外线进行升温。
较佳的，所述的将藻液冷冻于0℃以下呈全结冻状态并静置12小时至24小时的步骤中，冷冻的温度介于-1℃至-21℃。
较佳的，所述的将藻液冷冻于0℃以下呈全结冻状态并静置12小时至24小时，再升温的步骤中，升温的时间是3分钟至10分钟内。
本发明再提供一种如前述的方法所获得的鲜藻液，其能保有绿球藻原始含有的动物体致健康的机能功效，与现有技术所生产的产品有明显的差异，其差异点如下：1.味道鲜美甘甜无异味；现有技术所生产的产品多有不良的异味。2.不用人工破壁处理，人体食用即可完全消化吸收(现有技术所生产获得的产品未经破壁处理，人体无法有效消化吸收)。3.以本发明所述的方法所得的绿藻成长因子(chlorella growth factor，CGF)的含量特高，一般可高于现有技术生产的产品2倍以上。4.可使鲜藻液中的叶绿素功能完全保有，现有技术所述的方法所得的叶绿素经高温处理即会使叶绿素应有的机能功效降低。
依据本发明，所述的绿藻成长因子的含量以CNS总号4202类号N5134食用绿藻中的4.5绿藻热水抽出物指标值测定方法测定，可得到本发明所述的方法所得的鲜藻液的热水抽出物指标值测为3.8至4.9。
依据本发明所述的方法所得的鲜藻液中，以CNS4202类号N5134食用绿藻中的叶绿素检测方法检测含量为3800mg％至4900mg％。
本发明另提供一种如前述的鲜藻液用于制备抗癌症的医药品的用途，其中是将含有鲜藻液的医药品施予受体以达到抗癌症的效果。
根据本发明，“抗癌症”是指有效抑制或舒缓癌症。
较佳的，所述的医药品的有效剂量是以鲜藻液内含固形物作为计算基准，即施予剂量为每公斤体重10毫克(mg/kg)至200mg/kg。
根据本发明，“有效剂量”是指在剂量上及对于所需要的时间段而言对达成所要抑制或舒缓癌症结果有效的量；依据本发明，是指能够使得乳癌肿瘤的生长减缓、停止，甚致死亡，其如本发明所例示者，有效抑制或舒缓乳癌肿瘤的剂量可通过施予特定范围量的含有鲜藻液的医药品，并于特定时间范围内测量肿瘤体积变化而得。
较佳的，所述的医药品的剂型包括，但不限于液体。
本案所述的制备方法所得的鲜藻液不经发酵培养或室外培养，不但可缩短培养天数，且可使所得的鲜藻液所含的重金属含量低；此外，本发明所述的制备方法藉由低流速使得绿球藻不沉淀且不造成绿球藻的藻细胞变异；本发明所述的制备方法不以高温破坏细胞壁、也不以高温进行喷雾干燥或极低温进行冷冻干燥，因此不会造成绿球藻藻细胞变异，使得本发明所述的制备方法所得的鲜藻液不但能够保有较高的绿藻成长因子及叶绿素，且具有较佳的抗癌症效果。
附图说明
图1是本发明制备鲜藻液的方法流程示意图。
图2A是本发明所述的方法所得的鲜藻液用于抑制癌细胞，并于第15天测量肿瘤体积的柱状示意图。
图2B是本发明所述的方法所得的鲜藻液用于抑制癌细胞，并于第22天测量肿瘤体积的柱状示意图。
图3是现有技术制备鲜藻液的方法流程示意图。
具体实施方式
本发明藉由下述的实施例作为例示说明，将使得本发明的范畴与技术特征更为清楚，但不应视为局限本发明的范围的限制。
制备例1绿球藻的培养方法
请参考图1所示，本发明所述的绿球藻的制备方法包含以下步骤：
(1)齐备绿球藻，于本制备例是选用蛋白核小球藻(Chlorella pyrenoidosa)。
(2)无菌培养，其中所需碳源是经过滤的无菌空气、搅拌藻液的水流速不大于每分钟20米，于光照条件下使绿球藻吸收碳源；当混合培养液的酸碱值低于6.8时，停止搅拌且同时维持该混合培养液呈现静止悬浮状态(不得沉淀)，待该混合培养液的酸碱值为7以上后再启动搅拌，让该混合培养液吸收碳源。所述无菌培养培养不超过3天，以获得培养混合液，当培养混合液(即培养液中藻体固形物)的浓度达万分之5以上时，培养停留时间不得超过6小时，不然藻体即会产生自体消化现象。
(3)将培养混合液迅速降温至1℃以下(以不结冰为原则)，并于无菌环境离心去除培养液，再以同等低温的无菌水清洗再脱水后，以无菌水定量至藻体固形物百分之5，以获得藻液。
(4)将藻液冷冻于-20℃静置24小时后再以微波或红外线于10分钟内将冷冻藻液升温至40℃至50℃，使藻体不再具繁殖能力，且无需另外以高温、物理机械、化学等方式破壁处理，即能使人体饮用的消化、吸收达到最完整程度，后以无菌水定量至适当浓度以形成鲜藻液，迅速冷冻至-20℃保存(经由4年人体实际食用发现，在非冷冻状态，绿球藻的机能效果会渐渐降低至消失)。
对照例1现有技术的绿球藻培养方法
如图3所示，现有技术制备绿球藻液是将绿球藻进行发酵培养或室外培养，以形成绿球藻液，其中发酵培养是以葡萄糖作为发酵碳源，搅拌速率为50rpm至100rpm，且需培养5天至10天，以发酵培养所得的藻细胞可说是完全不是浮游藻类，只要一停止搅拌即会沉淀的变异藻细胞；其中室外培养需以醋酸供应碳源，搅拌速率为每秒水流速10米(m)以上，且需培养2周至8周，以室外培养所得的藻细胞也是一停止搅拌即会沉淀的变异藻细胞，且因室外培养而导致累积环境毒素与杂菌污染。
经发酵培养或室外培养的绿球藻液再历经离心浓缩及破坏细胞壁，以形成绿球藻浓缩液。其中破坏细胞壁是以温度为115℃至125℃进行处理，此温度范围导致绿球藻有效抗癌的机能效果功能完全被破坏。
进一步将已破坏细胞壁的绿球藻浓缩液进行喷雾干燥或冷冻干燥，以形成绿球藻粉。其中喷雾干燥的温度为155℃至180℃，此温度范围导致绿球藻有效抗癌的机能效果功能完全被破坏。
本对照例是收集自经过室外培养后，利用喷雾干燥或冷冻干燥的绿球藻粉，其中以喷雾干燥所得的绿球藻粉称为a组，以冷冻干燥的绿球藻粉称为b组，并以制备例1所得的鲜藻液称为c组。
实施例1鲜藻液作为抗肿瘤的用途
将24只BALB/c小白鼠(周龄5周的母鼠)分为四组：对照组、A组、B组与C组，并将乳癌细胞株MDA-MB-231植入各组小鼠的乳腺，采取原位移植(orthotopic)模式将乳癌细胞株(1x106cells/100μL)稀释于PBS并施打于各组并作为第0天，待第4天肿瘤体积长大至58mm3后，分别施予对照组一天两次小鼠重量每次每公斤1mL(1mL/kg)PBS、A组为喂食一天两次对照例1所获得的a组每次10mg/kg、B组为喂食一天两次对照例1所获得的b组每次10mg/kg、与C组为喂食一天两次以制备例1所得的c组每次1mL/kg(鲜藻液浓度配制为10mg/mL)的换算量混合于饲料中，间隔六小时施予食用，并分别于第15天及第22天量测肿瘤体积。
如图2A所示，C组的肿瘤细胞成长比对照组及A、B组更为明显减缓。如图2B所示，可见C组的肿瘤细胞形成减少萎缩状态，而对照组及A、B组的肿瘤细胞皆是增长的现象。
实施例2绿藻成长因子(chlorella growth factor，CGF)含量测试
绿藻成长因子的含量以CNS总号4202类号N5134食用绿藻中的4.5绿藻热水抽出物指标值测定方法测定，再与市售的相关商品的标示与检验值比较。
在市面购买绿藻产品三种不同品牌T牌(绿宝绿藻)、G牌(活绿美绿藻)、V牌(味丹绿藻)，与本案方法所得的鲜藻液，同时以CNS总号4202类号N5134食用绿藻中的4.5绿藻热水抽出物指标值测定方法测定绿藻热水抽出物指标值，得指标值：T牌为1.7、G牌为2.3、V牌为1.6、本发明所述的方法所得的鲜藻液的热水抽出物指标值测为3.8至4.9。由此可见，以本发明所述的方法所得的鲜藻液的绿藻成长因子含量是现有技术生产的产品2倍以上。
实施例3叶绿素含量测试
叶绿素于不当的生产、加工、贮存过程中极易降解，因此叶绿素具有绿藻品质稳定度的代表性，故以其作为品管指标有特殊的代表性。本实施例是以CNS4202类号N5134食用绿藻中的叶绿素检测方法作为依据检测，再与市售的相关商品的标示与检验值比较。其中CNS4202类号N5134规定总叶绿素含量为1500mg％以上，然而，检测市售相关产品总叶绿素含量多为2000mg％以下。本案方法所得的鲜藻液中，叶绿素含量以CNS4202类号N5134食用绿藻中的叶绿素检测方法检测含量为3800mg％至4900mg％。由此可见，以本发明所述的方法所得的鲜藻液的叶绿素含量是现有技术生产的产品2倍以上。

Claims (9)

1.一种鲜藻液的制备方法，其包括以下步骤：
将绿球藻于无菌设备中培养不超过3天，其中浓度培养达万分之5以上，培养停留时间不超过6小时，以获得培养混合液；其中所述绿球藻为小球属(Chlorella)；
将培养混合液迅速降温至1℃以下但不结冰并进行离心，且加入无菌水以获得藻液，其中藻液的浓度介于每毫升2.5毫克(mg/mL)至12.5mg/mL；
将藻液冷冻于0℃以下呈全结冻状态并静置12小时至24小时，再于10分钟内升温至40℃至50℃，以形成鲜藻液。
2.根据权利要求1所述的制备方法，其中绿球藻于无菌设备中培养时，搅拌培养液的水流速介于每分钟3米(m/min)至每分钟20米。
3.根据权利要求2所述的制备方法，其中绿球藻于无菌设备中培养时，于光照条件下使绿球藻吸收碳源；当混合培养液的酸碱值低于6.8时，停止搅拌且同时维持该混合培养液呈现静止悬浮状态，待该混合培养液的酸碱值为7以上后再启动搅拌。
4.根据权利要求1所述的制备方法，其中将藻液冷冻静置再升温时，可藉由微波或红外线进行升温。
5.根据权利要求1所述的制备方法，其中将藻液冷冻于0℃以下呈全结冻状态并静置12小时至24小时的步骤中，冷冻的温度介于-1℃至-21℃。
6.根据权利要求1所述的制备方法，其中将藻液冷冻于0℃以下呈全结冻状态并静置12小时至24小时，再升温的步骤中，升温的时间是3分钟至10分钟内。
7.一种如权利要求1至6中任一项所述的方法所获得的鲜藻液。
8.一种如权利要求7所述的鲜藻液用于制备抗癌症的医药品的用途，其中是将含有鲜藻液的医药品施予受体以达到抗癌症的效果。
9.根据权利要求8所述的用途，其中医药品的有效剂量是以鲜藻液内含固形物作为计算基准，即施予剂量为每公斤体重10毫克(mg/kg)至200mg/kg。
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