CN105878288A - 一种美洲大蠊酶解物及其制备方法和应用 - Google Patents
一种美洲大蠊酶解物及其制备方法和应用 Download PDFInfo
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- Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
Abstract
本发明公开了一种美洲大蠊酶解物及其制备方法和应用，所述的美洲大蠊酶解物中的肽类成分含量高，且能直接被吸收，无需经过胃肠的转化。所述的制备方法包括加入在超高压提取器中进行蛋白酶水解，离心，醇沉，大孔树脂吸附等步骤，本方法可以大大减少酶解时间，使酶解在短时间内得到所需要的小肽成分。本发明研究表明，所述的美洲大蠊酶解物还具有缩短创面修复时间、治疗消化道溃疡效果显著的有益效果。
Description
技术领域
本发明涉及医药技术领域，具体涉及一种美洲大蠊酶解物及其制备方法和应用。
背景技术
美洲大蠊(Periplanetaamericana)为昆虫纲有翅亚纲蜚蠊目蜚蠊科大蠊属昆虫，俗称“蟑螂”，其入药始载于《神农本草经》，其中把它列为中品，谓“味：咸、寒；治：血瘀证坚寒热、破积聚、喉咽闭、内寒无子”。“蟑螂”为其俗名首见于《本草纲目拾遗》，也称其为石姜、滑虫；各地方有其不同的称法，如：偷油婆、茶婆子、灶蚂子等。蜚蠊科(Blattidae)是—个庞大的昆虫家族，在地球上已生存了3.2亿年，与恐龙属同—时代出现的生物。无疑它是世界上生命力最强、最古老、至今繁衍最成功的昆虫类群之一。
近几年来随着我国对传统中医药资源研究开发的重视，有些学者对这一几千年来无法根绝的害虫进行了应用方面的研究，并取得了可喜的成就，发掘出了这一传统意义上的害虫的正面价值。以美洲大蠊醇提物纯化制成的产品“康复新液”，在烧伤、烫伤等外伤创面的良好疗效,同时具有抗炎、消肿、加速病损组织修复、提高免疫力，故可以内服用于治疗十二指肠溃疡，胃溃疡，肺结核。
现代消化理论认为，蛋白质口服后不能被直接吸收进入血液，只有经过胃肠道转化成小分子肽才能被吸收，小分子肽主要指含2～15个氨基酸残基的肽，其相对分子质量在3000以下，具有可直接被消化道吸收、转运速度快、耗能低和不易饱和等特点。而美洲大蠊醇提取物中主要成分除了游离氨基酸外，还有蛋白质，多肽类等大分子物质，而蛋白质这一类大分子是不能被直接吸收进入血液的，而是需要口服后经过胃肠道的转化才能起到相应的作用。因此，需要得到一种新的美洲大蠊提取物，其包含的主要成分为可以直接被吸收进入血液的游离氨基酸、肽类等小分子物质。
发明内容
本发明的目的在于提供一种美洲大蠊酶解物。
所述的美洲大蠊酶解物中肽类成分含量高，能够被直接吸收进入血液，快速的作用病患处。
所述的美洲大蠊酶解物为一种新的美洲大蠊提取物。
本发明的目的还在于提供所述美洲大蠊酶解物的制备方法。
本发明所述的美洲大蠊酶解物的制备方法，它包括如下步骤：
a、取美洲大蠊虫体，粉碎，加入原料药2～20倍的纯水，调解pH值后，加入蛋白酶；
b、将上述含有蛋白酶的料液置于超高压提取器中，在压力为100～400MP，温度20～60℃条件下，酶解1～3次，每次20～60min，过滤，滤液离心，取上清液浓缩后加入无水乙醇至药液中乙醇的体积浓度为60％～90％，静置，滤过；
c、取步骤b得到的滤液，通过吸附树脂柱，纯水冲洗，收集流出液至流出液茚三酮反应呈阴性；然后流出液再通过聚酰胺柱，纯水冲洗，并收集流出液至流出液茚三酮反应呈阴性；
d、将步骤c所得的流出液进行浓缩干燥，即得美洲大蠊酶解物。
其中，步骤a所述的美洲大蠊为脱脂后的美洲大蠊。
其中，步骤a中所述的纯水为原料药的10～20倍。
其中，步骤a中所述的蛋白酶为胃蛋白酶、胰蛋白酶、木瓜蛋白酶、中性蛋白酶、胰凝乳蛋白酶、弹性蛋白酶中一种或者一种以上的组合，其中蛋白酶加入量为原料药的1％～10％。
其中，步骤b所述的超高压压力为100～300Mpa，时间为40～60min。
其中，步骤b所述离心的时间为15～60分钟，速率为10000转/分～28000转/分。
其中，步骤b所述静置温度为0～10℃，静置时间为12～48小时。
其中，步骤c所述吸附树脂柱为极性、弱极性和非极性大孔树脂。
其中，步骤c所述聚酰胺柱中聚酰胺的粒度为100～200目。
本发明的目的还在于提供所述美洲大蠊酶解物在消化道溃疡、创面修复中的应用。
进一步地，所述消化道溃疡为胃溃疡。
进一步地，所述创面为烧烫伤创面。
本发明所述的美洲大蠊酶解物中肽类成分的重量百分比能达到55％以上，色泽浅，无腥臭味，且具有缩短创面愈合时间，无毒副作用，治疗溃疡效果好，保护胃粘膜不受损伤等优点。
本发明制备方法可以缩短酶解的时间，避免酶的失活，酶解出的产物随时间会有很多变化，短时间的高压下即不会影响酶的活性，也能使产物更加稳定，并且获得的肽类成分更多。
以下通过实施例形式的具体实施方式，对本发明的上述内容再作进一步的详细说明。但不应将此理解为本发明上述主题的范围仅限于以下的实例。凡基于本发明上述内容所实现的技术均属于本发明的范围。
具体实施例
实施例1本发明所述的美洲大蠊酶解物的制备方法
称取用石油醚(沸程：30～60℃)脱脂后的美洲大蠊干虫5kg，挥尽石油醚后粉碎成粉末，加入50L的纯水，用10％的氢氧化钠调节pH值为7.8，加入药材重量4％的弹性蛋白酶后，将混合有弹性蛋白酶的料液置于超高压提取器中，调节压力为150Mpa，温度为20℃进行酶解2次，每次时间为30min，将酶解后的料液进行过滤，滤液在28000转速下离心15分钟，上清液浓缩至相对密度为60℃时的1.20，加入无水乙醇至溶液中乙醇体积浓度达60％，在10℃静置12小时，过滤；滤液回收乙醇，加水至15升，过滤；滤液通过型号为HPD300的大孔吸附树脂柱，用纯水冲洗树脂柱，收集流出液直至流出液茚三酮反应呈阴性，流出液再通过粒度为100目的聚酰胺柱，用纯水冲洗聚酰胺柱，收集流出液直至流出液茚三酮反应呈阴性，60℃减压浓缩、干燥、粉碎，得0.94kg浅黄色粉末，即为美洲大蠊酶解物。
采用凯氏定氮法结合氨基酸分析仪，最终测得上述美洲大蠊酶解物中肽类成分含量占67.0％(重量百分比)。
实施例2本发明所述的美洲大蠊酶解物的制备方法
称取用石油醚(沸程：30～60℃)脱脂后的美洲大蠊干虫10kg，挥尽石油醚后粉碎成粉末，加入80L的纯水，用10％的氢氧化钠调节pH值为7.5，加入药材重量5％的中性蛋白酶，混匀，将混合有中性蛋白酶的料液置于超高压提取器中，调节压力为400Mpa，温度为60℃进行酶解1次，每次时间为20min，将酶解后的料液进行过滤，滤液在11000转速下离心60分钟，上清液浓缩至相对密度为55℃时的1.10，加入无水乙醇至溶液中乙醇体积浓度达80％，在5℃静置18小时，过滤；滤液回收乙醇，加水至10升，过滤；滤液通过型号AB-8的大孔吸附树脂柱，用纯水冲洗树脂柱，收集流出液直至流出液茚三酮反应呈阴性，流出液再通过粒度为100目的聚酰胺柱，用纯水冲洗聚酰胺柱，收集流出液直至流出液茚三酮反应呈阴性，65℃减压浓缩、干燥、粉碎，得2.04kg浅黄色粉末，即为美洲大蠊酶解物。
采用凯氏定氮法结合氨基酸分析仪，最终测得上述美洲大蠊酶解物中肽类成分含量占63.6％(重量百分比)。
实施例3本发明所述的美洲大蠊酶解物
称取用丙酮脱脂后的美洲大蠊干虫5kg，挥尽丙酮后粉碎成粉末，加入60L的纯水，用10％HCL溶液调节pH值为1.0，加入药材重量1％的胃蛋白酶，混匀，将混合有胃蛋白酶的料液置于超高压提取器中，调节压力为200Mpa，温度为40℃进行酶解3次，每次时间为20min，将酶解后的料液进行过滤，滤液在10000转速下离心60分钟，上清液浓缩至相对密度为60℃时的1.15，加入无水乙醇至溶液中乙醇体积浓度达70％，在5℃静置12小时，过滤；滤液回收乙醇，加水至10升，过滤；滤液通过型号为D101的大孔吸附树脂柱，用纯水冲洗树脂柱，收集流出液直至流出液茚三酮反应呈阴性，流出液再通过粒度为200目的聚酰胺柱，用纯水冲洗聚酰胺柱，收集流出液直至流出液茚三酮反应呈阴性，60℃减压浓缩、干燥、粉碎，得0.77kg浅黄色粉末，即为美洲大蠊酶解物。
采用凯氏定氮法结合氨基酸分析仪，最终测得上述美洲大蠊酶解物中肽类成分含量占60.9％(重量百分比)。
实施例4本发明所述的美洲大蠊酶解物
称取用丙酮脱脂后的美洲大蠊干虫10kg，挥尽丙酮后粉碎，挥尽丙酮后粉碎成粉末，加入20L的纯水，用10％的氢氧化钠调节pH值为8.0，加入药材重量3％的胰蛋白酶，混匀，将混合有蛋白酶的料液置于超高压提取器中，调节压力为200Mpa，温度为45℃进行酶解1次，每次时间为60min，将酶解后的料液进行过滤，滤液在15000转速下离心30分钟，上清液浓缩至相对密度为65℃时的1.21，加入无水乙醇至溶液中乙醇体积浓度达95％，在10℃静置24小时，过滤；滤液回收乙醇，加水至15升，过滤；滤液通过型号为X-5的大孔吸附树脂柱，用纯水冲洗树脂柱，收集流出液直至流出液茚三酮反应呈阴性，流出液再通过粒度为200目的聚酰胺柱，用纯水冲洗聚酰胺柱，收集流出液直至流出液茚三酮反应呈阴性，70℃减压浓缩、干燥、粉碎，得1.63kg浅黄色粉末，即为美洲大蠊酶解物。
采用凯氏定氮法结合氨基酸分析仪，最终测得上述美洲大蠊酶解物中肽类成分含量占62.3％(重量百分比)。
实施例5本发明所述的美洲大蠊酶解物
称取用丙酮脱脂后的美洲大蠊干虫10kg，挥尽丙酮后粉碎成粉末，加入100L的纯水，用10％的氢氧化钠调节pH值为7.5，加入药材重量4％的木瓜蛋白酶，混匀，将混合有木瓜蛋白酶的料液置于超高压提取器中，调节压力为300Mpa，温度为50℃进行酶解2次，每次时间为25min，将酶解后的料液进行过滤，滤液在18000转速下离心30分钟，上清液浓缩至相对密度为60℃时的1.15，加入无水乙醇至溶液中乙醇体积浓度达75％，在0℃静置12小时，过滤；滤液回收乙醇，加水至8升，过滤；滤液通过型号HPD100的大孔吸附树脂柱，用纯水冲洗树脂柱，收集流出液直至流出液茚三酮反应呈阴性，流出液再通过粒度为100目的聚酰胺柱，用纯水冲洗聚酰胺柱，收集流出液直至流出液茚三酮反应呈阴性，65℃减压浓缩、干燥、粉碎，得1.68kg浅黄色粉末，即为美洲大蠊酶解物。
采用凯氏定氮法结合氨基酸分析仪，最终测得上述美洲大蠊酶解物中肽类成分含量占61.4％(重量百分比)。
实施例6本发明所述的美洲大蠊酶解物
称取用丙酮脱脂后的美洲大蠊干虫15kg，挥尽丙酮后粉碎，挥尽丙酮后粉碎成粉末，加入300L的纯水，用10％的氢氧化钠调节pH值为9.0，加入药材重量10％的胰凝乳蛋白酶，混匀，将混合有胰凝乳蛋白酶的料液置于超高压提取器中，调节压力为100Mpa，温度为40℃进行酶解3次，每次时间为20min，将酶解后的料液进行过滤，滤液在20000转速下离心25分钟，上清液浓缩至相对密度为65℃时的1.20，加入无水乙醇至溶液中乙醇体积浓度达90％，在10℃静置48小时，过滤；滤液回收乙醇，加水至8升，过滤；滤液通过型号为HPD300的大孔吸附树脂柱，用纯水冲洗树脂柱，收集流出液直至流出液茚三酮反应呈阴性，流出液再通过粒度为200目的聚酰胺柱，用纯水冲洗聚酰胺柱，收集流出液直至流出液茚三酮反应呈阴性，60℃减压浓缩、干燥、粉碎，得2.17kg浅黄色粉末，即为美洲大蠊酶解物。
采用凯氏定氮法结合氨基酸分析仪，最终测得上述美洲大蠊酶解物中肽类成分含量占58.9％(重量百分比)。
实施例7本发明所述的美洲大蠊酶解物
称取用石油醚(沸程：30～60℃)脱脂后的美洲大蠊干虫15kg，挥尽石油醚后粉碎成粉末，加入75L的纯水，用10％氢氧化钠溶液调节pH值为7.5，加入药材重量3％的中性蛋白酶和1％的木瓜蛋白酶，混匀，将中性蛋白酶和木瓜蛋白酶的料液置于超高压提取器中，调节压力为100Mpa，温度为50℃进行酶解2次，每次时间为35min，将酶解后的料液进行过滤，滤液在16000转速下离心45分钟，上清液浓缩至相对密度为60℃时的1.18，加入无水乙醇至溶液中乙醇体积浓度达85％，在10℃静置24小时，过滤；滤液回收乙醇，加水至12升，过滤；滤液通过型号为NK-2的大孔吸附树脂柱，用纯水冲洗树脂柱，收集流出液直至流出液茚三酮反应呈阴性，流出液再通过粒度为100目的聚酰胺柱，用纯水冲洗聚酰胺柱，收集流出液直至流出液茚三酮反应呈阴性，60℃减压浓缩、干燥、粉碎，得1.87kg浅黄色粉末，即为美洲大蠊酶解物。
采用凯氏定氮法结合氨基酸分析仪，最终测得上述美洲大蠊酶解物中肽类成分含量占60.1％(重量百分比)。
实施例8本发明所述的美洲大蠊酶解物
称取用丙酮脱脂后的美洲大蠊干虫10kg，挥尽丙酮后粉碎成粉末，加入150L的纯水，用10％氢氧化钠溶液调节pH值为8.0，加入药材重量1％的弹性蛋白酶和2％的胰凝乳蛋白酶和3％的胰蛋白酶，混匀，将含有弹性蛋白酶、胰凝乳蛋白酶和胰蛋白酶的料液置于超高压提取器中，调节压力为150Mpa，温度为35℃进行酶解3次，每次时间为20min，将酶解后的料液进行过滤，滤液在20000转速下离心20分钟，上清液浓缩至相对密度为60℃时的1.15，加入无水乙醇至溶液中乙醇体积浓度达80％，在10℃静置36小时，过滤；滤液回收乙醇，加水至15升，过滤；滤液通过型号为HPD600的大孔吸附树脂柱，用纯水冲洗树脂柱，收集流出液直至流出液茚三酮反应呈阴性，流出液再通过粒度为100目的聚酰胺柱，用纯水冲洗聚酰胺柱，收集流出液直至流出液茚三酮反应呈阴性，65℃减压浓缩、干燥、粉碎，得1.71kg浅黄色粉末，即为美洲大蠊酶解物。
采用凯氏定氮法结合氨基酸分析仪，最终测得上述美洲大蠊酶解物中肽类成分含量占57.3％(重量百分比)。
参比实施例1美洲大蠊酶解物
称取美洲大蠊10kg，粉碎，加入8倍量(v/w)80％乙醇，于柔性容器装袋密封。置于超高压提取器中,设置压力为400MPa，循环加压3次，每次10min，温度为60℃，卸压，开盖取样，过滤。滤液于65℃减压浓缩至无乙醇味，相对密度为1.12(50℃测)，浓缩液于5℃冷藏48小时，将上层油脂用滤纸吸去，将下层在转速18000r/min下离心25分钟。离心后上清液于65℃减压浓缩、干燥、粉碎，即为美洲大蠊醇提取物5.77kg。
取上述美洲大蠊醇提取物，加纯水配成含有5％的美洲大蠊醇提取物溶液，加10％的氢氧化钠调节溶液的pH为7.0，再加入8400U/mg的木瓜蛋白酶，在55℃条件下进行水解3小时，将水解后的药液过滤，浓缩干燥，即得美洲大蠊酶解物2.38kg。
采用凯氏定氮法结合氨基酸分析仪，最终测得上述美洲大蠊酶解物中肽类成分含量占43.9％(重量百分比)。
参比实施例2美洲大蠊醇提物
称取美洲大蠊10kg，粉碎，加入8倍量(v/w)70％乙醇，于柔性容器装袋密封。置于超高压提取器中,设置压力为400MPa，循环加压3次，每次15min，温度为60℃，卸压，开盖取样，过滤。滤液于75℃减压浓缩至无乙醇味，相对密度为1.10(50℃测)，浓缩液于10℃冷藏48小时，将上层油脂用滤纸吸去，将下层在转速15000r/min下离心40分钟。离心后上清液于75℃减压浓缩、干燥、粉碎，即为美洲大蠊醇提取物5.25kg。
采用凯氏定氮法结合氨基酸分析仪，最终测得上述美洲大蠊醇提取物中肽类成分含量占23.1％(重量百分比)。
参比实施例3美洲大蠊醇提物
称取美洲大蠊10kg，粉碎，加入8倍量(v/w)70％乙醇，于柔性容器装袋密封。置于超高压提取器中,设置压力为400MPa，循环加压3次，每次15min，温度为60℃，卸压，开盖取样，过滤。滤液于75℃减压浓缩至无乙醇味，相对密度为1.10(50℃测)，浓缩液于10℃冷藏48小时，将上层油脂用滤纸吸去，将下层在转速15000r/min下离心40分钟；上清液浓缩至相对密度为65℃时的1.15，加入无水乙醇至溶液中含乙醇体积浓度为70％，在5℃环境中静置12小时，过滤；滤液回收乙醇，加水至10升，过滤，滤液通过HPD400型大孔吸附树脂柱，用纯水冲洗树脂柱，收集流出液直至流出液茚三酮反应呈阴性；流出液通过粒度为100目的聚酰胺柱，用纯水冲洗树脂柱，收集流出液直至流出液茚三酮反应呈阴性；所得的流出液65℃减压浓缩、干燥，粉碎，得浅褐色美洲大蠊提取物3.01kg，即得美洲大蠊醇提物。
采用凯氏定氮法结合氨基酸分析仪，最终测得上述美洲大蠊醇提物中肽类成分含量占28.8％(重量百分比)。
参比实施例4美洲大蠊水提物
称取美洲大蠊干虫5kg，粉碎，加入6倍量的纯水，于柔性容器装袋密封后置于超高压提取器中,设置压力为300MPa，循环加压3次，每次5min，温度为40℃，卸压，开盖取样，过滤。滤液于60℃减压浓缩至相对密度为1.05(50℃测)，浓缩液于0℃冷藏24小时，将上层油脂用滤纸吸去，将下层液于转速15000r/min下，离心30分钟。离心后上清液于60℃减压浓缩、干燥、粉碎，即为美洲大蠊水提物2.25kg。
采用凯氏定氮法结合氨基酸分析仪，最终测得上述美洲大蠊水提物中肽类成分含量占19.7％(重量百分比)。
参比实施例5美洲大蠊水提物
称取美洲大蠊干虫5kg，粉碎，加入6倍量的纯水，于柔性容器装袋密封后置于超高压提取器中,设置压力为300MPa，温度为40℃，超高压提取3次，每次5min，卸压，开盖取样，过滤。滤液于60℃减压浓缩至相对密度为1.05(50℃测)，浓缩液于0℃冷藏24小时，将上层油脂用滤纸吸去，将下层液于转速15000r/min下离心30分钟；上清液浓缩至相对密度为65℃时的1.12，加入体积浓度为95％的乙醇至含溶液中乙醇体积浓度达85％，在5℃静置12小时，过滤；滤液回收乙醇，加水至10升，过滤；滤液通过型号为HPD300的大孔吸附树脂柱，用纯水冲洗树脂柱，收集流出液直至流出液茚三酮反应呈阴性，流出液再通过粒度为100目的聚酰胺柱，用纯水冲洗聚酰胺柱，收集流出液直至流出液茚三酮反应呈阴性，75℃减压浓缩、干燥、粉碎，得1.74kg浅褐色粉末，即为美洲大蠊水提物。
采用凯氏定氮法结合氨基酸分析仪，最终测得上述美洲大蠊水提物中肽类成分含量占25.9％(重量百分比)。
综上，实施例1～实施例8和参比实施例1～5所用提取方法最终得到的美洲大蠊提取物中肽类成分含量比较如表1：
| 蛋白酶 | 肽类成分含量(重量百分比％) | |
| 实施例1 | 弹性蛋白酶 | 67.0 |
| 实施例2 | 中性蛋白酶 | 63.6 |
| 实施例3 | 胃蛋白酶 | 60.9 |
| 实施例4 | 胰蛋白酶 | 62.3 |
| 实施例5 | 木瓜蛋白酶 | 61.4 |
| 实施例6 | 胰凝乳蛋白酶 | 58.9 |
| 实施例7 | 中性蛋白酶+木瓜蛋白酶 | 60.1 |
| 实施例8 | 弹性蛋白酶+胰凝乳蛋白酶+胰蛋白酶 | 57.3 |
| 参比实施例1 | 木瓜蛋白酶 | 43.9 |
| 参比实施例2 | 无 | 23.1 |
| 参比实施例3 | 无 | 28.8 |
| 参比实施例4 | 无 | 19.7 |
| 参比实施例5 | 无 | 25.9 |
由表1中的结果看出，实施例1～8制备的美洲大蠊酶解物中肽类含量均比参比实施例1中制备的美洲大蠊酶解物中的肽类含量高，参比实施例2～5制备的美洲大蠊提取物中的肽类成分含量明显低于本发明所述的美洲大蠊酶解物中的肽类含量。
以下将通过实验例对本发明所述的美洲大蠊酶解物的有益效果进行进一步说明：
一、实验材料
1.实验药物：实施例1和参比实施例5制备的美洲大蠊酶解物。
2.实验动物：
实验动物：昆明种小鼠，SPF级(三级)合格动物。
3.实验试剂
氯化钠注射液(0.9％)，其它试剂均为市售，分析纯。
三、实验方法与结果
预试验：取体重18～22g小鼠70只，雌雄各半，按体重随机分成7组，每组10只，自由饮水，禁食6小时后，其中3组按0.4ml/10g体重分别ig76％、55％、40％实施例1制备的美洲大蠊酶解物液体，另外3组按0.4ml/10g体重分别ig 76％、55％、40％参比实施例5制备的美洲大蠊水提物液体，对照组ig等体积生理盐水，观察小鼠给药后毒性反应及死亡情况，观察7天，每天一次，结果见表2：
表2 毒性结果
由表1中的数据可以看出，在同体积同浓度的药物灌胃小鼠的实验结果比较中得到：参比实施例5的总体的死亡率比实施例1总体死亡率高，初步说明参比实施例5制备的美洲大蠊水提物的毒性比实施例1制备的美洲大蠊酶解物的毒性大。
以下将根据表1所述死亡情况，进行实施例1和参比实施例5制备的美洲大蠊酶解物和美洲大蠊水提物对小鼠半数致死剂量(LD50)测定。
1.1对小鼠的半数致死剂量(LD50)测定：
1.1.1试验方法
取体重在20～22g之间的小鼠60只，雌雄各半，按体重随机分成6组，每组10只，禁食不禁水6h，各组分别ig实施例1制备的美洲大蠊酶解物32.6g/kg、26.9g/kg、22.3g/kg、18.4g/kg、15.2g/kg、0g/kg(NS 0.4ml/10g b.w.)，按不同浓度同体积给药，0.4ml/10g ig，观察20天，每天一次，记录逐日的小鼠毒性反应及死亡数，死亡动物即时尸体解剖，肉眼观察各主要脏器，取心、肝、脾、肺、肾、胃等主要脏器，10％甲醛固定，病理切片检查。存活动物至实验结束处死，取主要脏器病理检查。
同上述试验方法对参比实施例5制备的美洲大蠊水提物进行小鼠急性毒性实验处理，观察20天，做好相应记录。
1.1.2试验结果
1.1.2.1实施例1制备的美洲大蠊酶解物：
(1)给予一次大剂量(32.6g/kg)ig小鼠后,小鼠出现的症状反应为:大多小鼠活动减少，俯卧，对外界刺激反应迟缓，皮肤体温略有下降，部分动物翻正反射消失，呼吸频率减慢，幅度变弱，直至呼吸停止，在1～7小时内死亡情况见表3，存活动物上述症状反应在12～18小时内逐渐消失，恢复正常状态，活动、饮食、饮水均恢复至正常，直至存活20天未见异常情况出现。
(2)死亡小鼠尸检情况：经尸体解剖，观察肉眼观察各主要脏器，仅胃肠内有大量清稀液体，其余各脏器均未见肉眼可见异常病变，取心、肝、脾、肺、肾、胃等主要脏器10％甲醛固定，病理切片检查后，发现毒性作用器官主要在胃，主要体现在胃黏膜损伤。
(3)给药后恢复20天小鼠的解剖结果：心、肝、脾、肺、肾和胃几个脏器未见明显病变。
1.1.2.2参比实施例5制备的美洲大蠊水提物：
(1)给予一次大剂量(32.6g/kg)ig小鼠后,小鼠出现的症状反应为:大多小鼠活动减少，俯卧，对外界刺激反应迟缓，部分动物皮肤温度下降，翻正反射消失，呼吸频率减慢，幅度变弱，直至呼吸停止，在1～4小时内死亡情况见表3，存活动物上述症状反应在16～24小时内逐渐消失，恢复正常状态，活动、饮食、饮水均恢复至正常，直至存活20天未见异常情况出现。
(2)死亡小鼠尸检情况：经尸体解剖，观察肉眼观察各主要脏器，胃肠内有大量清稀液体，其余各脏器均未见肉眼可见异常病变，取心、肝、脾、肺、肾、胃等主要脏器10％甲醛固定，病理切片检查后，发现毒性作用器官主要在胃，主要体现在胃黏膜出血坏死。
(3)给药后恢复20天小鼠的解剖结果：心、肝、脾、肺、肾和胃几个脏器未见明显病变。
1.1.2.3实施例1和参比实施例5所述的药物对小鼠的LD50测定结果如表3和表4
表3 实施例1制备的美洲大蠊酶解物对小鼠的LD50
根据表3中的数据按照寇氏法最终计算得到的本发明实施例1所述的美洲大蠊酶解物对小鼠的LD50＝28.64g/kg；LD50的95％可信区间：26.18g/kg～31.26g/kg。
表4 参比实施例5制备的美洲大蠊水提物对小鼠的LD50
根据表4中的数据按照寇氏法最终计算得到的本发明参比实施5所述的美洲大蠊水提物对小鼠的LD50＝24.27g/kg；LD50的95％可信区间：22.03g/kg～26.67g/kg。
综上，水提法来制备美洲大蠊提取物，得到的提取物对小鼠的半数致死量LD50(参比实施例5)小于使用酶解法制备的美洲大蠊提取物对小鼠的半数致死量LD50(实施例1)，由此说明本发明所述的美洲大蠊酶解物毒性小。
实验例2创面修复试验
1对小鼠实验性烫伤的影响
分组：
取体重18～22g小鼠40只，雌雄各半，按性别与体重随机分为4组，分别为NS对照组，湿润烧伤膏对照组，给药组1、2(实施例5所述的美洲大蠊酶解物和参比实施例1制备的美洲大蠊酶解物)。
试验方法：
将小鼠置于固定器内，小鼠右后足跖部位置于预先调至55℃恒温水浴中15秒，此后每隔半小时各组小鼠分别于右足跖部涂相对应的药物1次，共给药3次，4.5小时后将小鼠脱颈椎处死，于同一部位剪下两足跖部，用精密扭力天平称重，以每鼠右足重减去左足重量为肿胀度，将对照组和给药组的肿胀程度进行比较和统计学处理。结果见表5。
表5 提取物对小鼠实验性烫伤的影响
注：*:P<0.05与对照组比较；
结果显示，本发明所述实施例5制备的美洲大蠊酶解物对热水烫伤致小鼠足跖的肿胀度降低，数据显示实施例5与对照组比较P<0.05,具有显著的统计学意义。表5中数据中还可以得到实施例1制备的美洲大蠊酶解物在对小鼠烫伤足趾肿胀度的抑制率明显高于参比实施例1制备的美洲大蠊酶解物。
2对小鼠实验性烧伤的影响
分组：
取体重18～22g小鼠40只，雌雄各半，将中间挖空2cm×2cm的石棉纸置于小鼠背上，用微量移液器吸取100uL无水乙醇滴于20mg棉球上，置于暴露处，点火燃烧造成Ⅱ度烧伤模型。按性别与烧伤面积随机分为4组，分别为NS对照组，湿润烧伤膏对照组，给药组1、2(实施例5和参比实施例1制备的美洲大蠊酶解物)。
实验方法：
各组分别涂药，连续涂20d，每天2次，换药前将创面清洗干净。观测小鼠烧伤面积和愈合情况，给药6天与13天，分别用数码相机拍照，用IPP5.1图像分析软件包测量各组动物烧伤面积。将所测结果进行t检验。结果见表6。
表6 提取物对小鼠实验性烧伤的影响
注：#:P<0.05与湿润烧伤膏组比较；*:P<0.05与对照组比较
结果显示，与对照组比较，给药6天、给药13天，实施例5制备的美洲大蠊酶解物对小鼠的创面结痂面积有一定的治疗作用，且与湿润烧伤膏组相比具有显著的统计学意义，P<0.05，实施例5制备的美洲大蠊酶解物还能使创面愈合时间大大的缩短。与对照组相比，参比实施例1制备的美洲大蠊酶解物对小鼠的创面结痂面积也有一定的治疗作用，但是与湿润烧伤膏相比没有统计学意义。所以，本实验例表4中的结果说明本发明所述的美洲大蠊酶解物对小鼠实验性烧伤有明显的治疗作用，且效果显著。
实验例3本发明所述的美洲大蠊酶解物对乙醇致小鼠溃疡的影响
1、实验材料
(1)受试药物及分组
实验分为随机分为5个组，每组动物10只，每组小鼠按照0.05g/ml/20g体重给药，具体分组情况如下：
空白对照组：纯水；
阳性药物组：达喜(铝碳酸镁片)，生产企业：拜耳医药保健有限公司；
治疗组1:实施例1所述的美洲大蠊酶解物；
治疗组2：参比实施例3所述的美洲大蠊醇提物；
治疗组3：参比实施例5所述的美洲大蠊水提物；
(2)实验动物
小鼠50只，KM种，SPF级，体重20～24g，雌雄各半，由成都达硕生物科技有限公司提供
2、实验方法
2.1药液的制备
将上述受试药物，分别制成浓度为0.05g/ml的药液；
2.2对胃溃疡粘膜的保护功能评价方法
2.2.1无水乙醇致小鼠胃粘膜损伤模型试验
将各组小鼠常规饲养3天后，按1ml/只进行灌胃给药，每天给药一次，连续10天，动物每3～4天称重一次，根据体重调整给药体积。
第9天给药后禁食24h，自由饮水，末次给药后1h，所有动物均ig无水乙醇0.2ml/只，1小时后处死动物，结扎幽门，1％甲醛固定，再结贲门，将胃剪下，放入10％甲醛溶液中浸泡1小时。沿胃大弯剖开胃，肉眼可见溃疡发生在胃窦部。将胃窦部剪下，采用数码相机拍照记录，将数码照片用Image-Pro Plus 6.0软件处理，记录溃疡区域面积和整个胃窦部面积，计算各小鼠的溃疡指数和溃疡抑制率。
溃疡指数(％)＝溃疡区域面积/胃窦部面积×100。
溃疡抑制率(％)＝(空白对照组溃疡指数-各给药组溃疡指数)/空白对照组溃疡指数×100。
2.2.2统计方法
数据采用表示，用SPSS 20.0软件进行统计，进行完全随机设计资料的方差分析和多重比较的统计分析，满足正态性和方差齐性采用Dunet t检验，否则采用Tamhane’s T2检验。
3、实验结果
(1)对小鼠体重的影响
各组小鼠连续给药10天，对小鼠体重的影响，结果见表7。
表7 对小鼠体重的影响
由表7可知，阳性药物组和治疗组与空白对照组比较，在各时间点对小鼠体重的影响无显著性差异，P>0.05。说明给药期间，所用药物对小鼠体重无影响。
(2)对无水乙醇致小鼠胃溃疡的影响，结果见表8。
表8 乙醇致小鼠胃溃疡的影响
注：与空白对照组比较，*表示P<0.05，**表示P<0.01；与阳性药物组比较，#表示P<0.05
由表8中的结果得知：实施例1制备的美洲大蠊酶解物对乙醇致小鼠的胃溃疡的抑制率为67.26％；与空白对照组比较具有明显的统计学意义，P<0.01，与阳性药物组(达喜)比较也具有明显的统计学意义，P<0.05。
治疗组2用的药物为参比实施例制备的美洲大蠊醇提取物在对乙醇致小鼠的胃溃疡的抑制率明显低与治疗组1；同理治疗组3用的美洲大蠊水提取物在对乙醇致小鼠的胃溃疡的抑制率明显低于治疗组1。所以，由实验例3中的结果得到，本发明所述的美洲大蠊酶解物具有很好的保护胃黏膜的功能，对胃溃疡具有明显治疗作用。
综上所述，由于本发明所述的美洲大蠊酶解物中的肽类成分含量高，容易被直接吸收进入血液，避免了胃肠转化的过程，所以本发明所述的美洲大蠊酶解物与传统的美洲大蠊水提物和美洲大蠊醇提取物相比，能够大大的缩短烧烫伤创面的修复时间，同时缩短治疗时间；对胃溃疡的抑制率更高。
Claims (9)
1.一种美洲大蠊酶解物，其特征在于，它是由蛋白酶和超高压联合处理美洲大蠊虫体后得到的。
2.根据权利要求1所述的美洲大蠊酶解物，其特征在于，所述的蛋白酶为胃蛋白酶、胰蛋白酶、木瓜蛋白酶、中性蛋白酶、胰凝乳蛋白酶、弹性蛋白酶中一种或者一种以上的组合。
3.权利要求1-2中所述的一种美洲大蠊酶解物的制备方法，其特征在于，它包括如下步骤：
a、取脱脂后的美洲大蠊虫体，粉碎，加入原料药2～20倍的纯水，调解pH值后，加入原料药重量的1%～10%的蛋白酶；
b、将上述含有蛋白酶的料液置于超高压提取器中，在压力为100～400MP，温度20～60℃条件下，酶解1～3次，每次20～60min，过滤，滤液离心，取上清液浓缩后加入无水乙醇至药液中乙醇的体积浓度为60%～90%，在0～10℃环境中静置12～48小时，滤过；
c、取步骤b得到的滤液，通过吸附树脂柱，纯水冲洗，收集流出液至流出液茚三酮反应呈阴性；然后流出液再通过粒度为100～200目的聚酰胺柱，纯水冲洗，并收集流出液至流出液茚三酮反应呈阴性；
d、将步骤c所得的流出液进行浓缩干燥，即得美洲大蠊酶解物。
4.根据权利要求3所述的美洲大蠊酶解物的制备方法，其特征在于，步骤a中所述的纯水为原料药的10～20倍。
5.根据权利要求3所述的美洲大蠊酶解物的制备方法，其特征在于，步骤b中所述的超高压压力为100～300Mpa，时间为40～60min。
6.根据权利要求3所述的美洲大蠊酶解物的制备方法，其特征在于，步骤b中所述离心的时间为15～60分钟，速率为10000转/分～28000转/分。
7.根据权利要求3所述的美洲大蠊酶解物的制备方法，其特征在于，步骤c中所述吸附树脂柱为极性、弱极性和非极性大孔树脂。
8.一种美洲大蠊酶解物在消化道溃疡、创面修复中的应用，其中，所述的消化道溃疡为胃溃疡，所述创面为烧烫伤创面。
9.根据权利要求8所述的美洲大蠊酶解物为权利要求1～7中任一所述的美洲大蠊酶解物。
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