CN113025560A - 一种美洲大蠊小肽修复受h2o2氧化损伤的猪卵巢颗粒细胞模型的构建方法 - Google Patents

一种美洲大蠊小肽修复受h2o2氧化损伤的猪卵巢颗粒细胞模型的构建方法 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种美洲大蠊小肽修复受H2O2氧化损伤的猪卵巢原代颗粒细胞模型的构建方法。所述方法包括：猪卵巢颗粒细胞的采集和培养；猪卵巢颗粒细胞氧化应激模型的建立；美洲大蠊小肽对H2O2氧化处理的猪卵巢颗粒细胞的修复作用。本发明建立了猪卵巢颗粒细胞氧化应激模型，为此方面的研究奠定基础；另外，寻找能够提高猪卵巢功能的抗猪氧化应激的活性物质，并探讨其作用机制，为下一步在猪场的应用提供坚实的理论基础。

Description

一种美洲大蠊小肽修复受H2O2氧化损伤的猪卵巢颗粒细胞模 型的构建方法
技术领域
本发明涉及细胞分子领域，具体涉及一种美洲大蠊小肽修复受H2O2氧化损伤的猪卵巢颗粒细胞模型的构建方法。
背景技术
保山猪(生活区海拔2600m)适应性较强、肉质细嫩、香味浓郁，是生产火腿腊肉的优质原料，是云南最具开发潜力的地方优良肉脂兼用型猪种。2011年，该猪种被载入《中国畜禽遗传资源志－猪志》，拥有省级保种场－保山种猪场。但是，保山猪产仔数较少。现在保山猪按照洋猪营养水平和养殖模式进行饲养，长期受到日粮高蛋白、低纤维、限位栏束缚以及高海拔等营养和环境方面的应激可能是保山猪产仔数低的主要原因之一。
母猪的繁殖效率依赖于排出的卵子的数量和质量。颗粒细胞可以向卵母细胞提供营养物质，传递信号，促进卵母细胞的成熟，提高卵子的质量。卵泡闭锁是卵泡发育过程中正常的生理现象，但是，异常的卵泡闭锁将会降低可用卵泡的数目，减少排卵数，进而减少猪的产仔数。颗粒细胞凋亡是卵泡闭锁的主要原因，氧化应激能诱导猪卵巢颗粒细胞的凋亡。因此，寻找一种能够显著抑制猪卵巢颗粒细胞凋亡的修复物质是改善其繁殖效率的重要途径。
过氧化氢(H2O2)致猪卵巢颗粒细胞氧化损伤是研究氧化应激的重要方法，但在保山猪上未见报道，其模型制作所需H2O2的浓度和作用时间有待研究。
美洲大蠊(periplaneta americana)俗称蟑螂，原产于南美洲，是世界性卫生害虫，但其药理作用却日益造福人类。美洲大蠊最早应用于《神农本草经》，具有组织修复、抗肿瘤、增强免疫及保护肝功能等作用。其成分复杂，含有多种氨基酸、多糖、蛋白质和神经肽等。目前，大理大学已经利用美洲大蠊分离出抗病毒、强心等活性成分，制成能增强免疫的创面修复剂“康复新液”，治疗乙型肝炎新药“肝龙胶囊”和治疗心力衰竭新药“心脉隆注射液”。美洲大蠊小肽(PAP)作为美洲大蠊精提物，成分主要为0.181-12.355KDa的小肽，课题组发现其具有显著的组织修复作用，但在生殖方面的效果未见报道。
本项目首先建立保山猪卵巢颗粒细胞氧化应激模型，探讨美洲大蠊小肽对该细胞的氧化应激修复效果及其作用机制。
发明内容
为此，本发明提供一种美洲大蠊小肽修复受H2O2氧化损伤的猪卵巢颗粒细胞模型的构建方法，为此方面的研究奠定基础；另外，寻找能够提高猪卵巢功能的抗猪氧化应激的活性物质，并探讨其作用机制，为下一步在猪场的应用提供坚实的理论基础。
为了实现上述目的，本发明提供如下技术方案：
根据本发明一方面提供的一种美洲大蠊小肽修复受H2O2氧化损伤的猪卵巢颗粒细胞模型的构建方法，所述构建方法包括：
步骤一，猪卵巢颗粒细胞的收集和培养
收集猪卵巢细胞颗粒细胞，并对颗粒细胞进行原代培养和传代培养，传代培养24-48h后进行氧化应激模型的建立；
步骤二，猪卵巢颗粒细胞氧化应激模型的建立
采用不同浓度的H2O2在不同作用时间下对猪卵巢颗粒细胞氧化处理后，CCK-8检测细胞活性及流式细胞术检测细胞凋亡率，筛选合适的H2O2的作用浓度和作用时间；
步骤三，美洲大蠊小肽对H2O2氧化处理的猪卵巢颗粒细胞的修复
将颗粒细胞在H2O2氧化处理后，加入不同浓度的美洲大蠊小肽分别处理不同的时间后，检测细胞活力、凋亡率及MDA和NO含量。
进一步的，所述步骤一中，所述传代培养24-48h后，进行氧化应激模型的建立的指标是培养瓶中颜色正常，未出现浑浊状态，且细胞融合率达到85％-95％。
进一步的，所述步骤二中，所述不同浓度的H2O2浓度分别为0μmol/L、50μmol/L、100μmol/L、150μmol/L和200μmol/L。
进一步的，所述步骤二中，所述不同作用时间分别为6h、12h、24h。
进一步的，所述步骤二中，所述合适的H2O2的作用浓度和作用时间的指标为H2O2氧化后的颗粒细胞的细胞活力在40％-60％。
进一步的，所述步骤三中，所述H2O2氧化处理的方法是用100μmol/L的H2O2，氧化处理6h。
进一步的，所述步骤三中，所述不同浓度的美洲大蠊小肽浓度分别为0μg/mL、200μg/mL、400μg/mL、800μg/mL和1600μg/mL。
进一步的，所述步骤三中，所述不同处理时间分别为24h、48h和72h。
进一步的，所述步骤三中，所述美洲大蠊小肽修复氧化应激的颗粒细胞的方法是用400μmol/L的美洲大蠊小肽，修复处理24h。
根据本发明另一方面提供的一种修复受H2O2氧化损伤的猪卵巢颗粒细胞的修复剂，所述修复剂是美洲大蠊小肽，其为美洲大蠊精提物，成分为0.181-12.355KDa的小肽；所述美洲大蠊小肽的制备方法是美洲大蠊虫体鲜品或干品经95％乙醇提取、浓缩脱脂、大孔吸附树脂柱层析、80％乙醇洗脱、洗脱液浓缩所得。
其中，美洲大蠊(periplaneta americana)：俗称蟑螂。
美洲大蠊小肽(PeriplanetaAmericana peptide,PAP)：美洲大蠊虫体鲜品或干品经95％乙醇提取、浓缩脱脂、大孔吸附树脂柱层析、80％乙醇洗脱、洗脱液浓缩获得，其主要成分是一类小分子肽，见表1，图1。
表1美洲大蠊提取物中小分子肽分子量范围及其峰面积比例
Figure BDA0002966020510000031
Figure BDA0002966020510000041
其中，以标准物质牛血清白蛋白的出峰时间(tR/min)为横坐标，分子量对数值Log10(Mr)为纵坐标绘制标准曲线，得回归方程，将样品出峰时间带入曲线方程，计算各峰的相对分子质量，通过峰面积归一化法计算不同分子量范围内物质的相对百分比。
FoxO1：叉头框蛋白O1，属于Fox家族成员，主要参与细胞凋亡、应激和DNA损伤/修复等生命过程，氧化应激时，FoxO1转录因子能触发细胞凋亡。
本发明具有如下优点：
本发明建立了猪卵巢颗粒细胞氧化应激模型，为此方面的研究奠定基础；另外，寻找能够提高猪卵巢功能的抗猪氧化应激的活性物质，并探讨其作用机制，为下一步在猪场的应用提供坚实的理论基础。
附图说明
为了更清楚地说明本发明的实施方式或现有技术中的技术方案，下面将对实施方式或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍。显而易见地，下面描述中的附图仅仅是示例性的，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据提供的附图引伸获得其它的实施附图。
本说明书所绘示的结构、比例、大小等，均仅用以配合说明书所揭示的内容，以供熟悉此技术的人士了解与阅读，并非用以限定本发明可实施的限定条件，故不具技术上的实质意义，任何结构的修饰、比例关系的改变或大小的调整，在不影响本发明所能产生的功效及所能达成的目的下，均应仍落在本发明所揭示的技术内容得能涵盖的范围内。
图1为本发明提供的一种美洲大蠊精提物小分子肽与四种标准品分子量分布叠加高效液相色谱(HPLC)图；其中，1为美洲大蠊精提物小分子肽的HPLC图；2为4个标准品的HPLC图，标准品由左到右依次为：A为细胞色素C，B为氧化型谷胱甘肽，C为肌苷，D为酪氨酸。
图2为本发明提供的一种CCK-8检测的不同浓度H2O2处理不同时间的细胞活性比较图；其中，A.不同浓度H2O2处理6h；B.不同浓度H2O2处理12h；C.不同浓度H2O2处理24h；D.100μmol/L的H2O2干预不同时间；不同小写字母间代表差异具有统计学意义(P<0.01)。
图3为本发明提供的一种不经过H2O2处理的颗粒细胞状态图(放大倍数为100×)。
图4为本发明提供的一种50μmol/L H2O2处理6h的颗粒细胞状态图(放大倍数为100×)。
图5为本发明提供的一种100μmol/L H2O2处理6h的颗粒细胞状态图(放大倍数为100×)。
图6为本发明提供的一种150μmol/L H2O2处理6h的颗粒细胞状态图(放大倍数为100×)。
图7为本发明提供的一种200μmol/L H2O2处理6h的颗粒细胞状态图(放大倍数为100×)。
图8为本发明提供的一种不同浓度H2O2处理6h的细胞凋亡率检测图；其中，A.流式图片；B.总凋亡率统计。
图9为本发明提供的一种CCK-8检测的不同浓度PAP修复氧化损伤颗粒细胞不同时间的细胞活性比较图，其中，A.不同PAP浓度修复12h；B.不同PAP浓度修复24h；C.不同PAP浓度修复48h；D.400μg/mL PAP修复不同时间；不同小写字母间代表差异具有统计学意义(P<0.01)。
图10为本发明提供的一种不同浓度PAP修复氧化损伤颗粒细胞24h的细胞凋亡率检测图，其中，A.流式图片；B.总凋亡率统计。
图11为本发明提供的一种PAP对氧化应激颗粒细胞MDA、NO含量的影响图，其中，不同小写字母间代表差异具有统计学意义(P<0.01)。
图12为本发明提供的一种PAP对H2O2诱导的颗粒细胞为目的蛋白FoxO1和Caspase-3以及内参β-actin的蛋白条带图。其中，A为目的蛋白FoxO1的表达柱状图；B为目的蛋白Caspase-3的表达柱状图；不同小写字母间代表差异具有统计学意义(P<0.01)。
图13为本发明提供的一种猪FoxO1基因启动子报告质粒图谱。
图14为本发明提供的一种PAP对过表达FoxO1蛋白的影响图，1为空白组；2为H2O2组；3为H2O2+PAP组；4为pEX-FoxO1组；5为pEX-FoxO1+PAP组；6为pEX-NC组；不同小写字母间代表差异具有统计学意义(P<0.01)。
图15为本发明提供的一种免疫荧光检测PAP影响FoxO1出入核图。其中，A为PAP阻止H2O2诱导的颗粒细胞FoxO1入核；B为PAP阻止过表达FoxO1入核。
具体实施方式
以下由特定的具体实施例说明本发明的实施方式，熟悉此技术的人士可由本说明书所揭露的内容轻易地了解本发明的其他优点及功效，显然，所描述的实施例是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
实施例1猪卵巢颗粒细胞的采集和培养
本实施例使用的PBS缓冲液是由99mLPBS缓冲液和1mLSK混合而成的缓冲液。
采集无囊肿的健康的猪的卵巢，清洗卵巢；取8-9mL所述卵巢的细胞液于15mL离心管中，1000r离心5min，去上清液；加入2mL PBS缓冲液，吹打混匀，1000r离心5min，去上清液；再次加入2mL PBS缓冲液，吹打混匀，1000r离心5min，去上清液；最后加4mL全有培养基吹打混匀得颗粒细胞悬液；取10μL所述颗粒细胞悬液稀释100倍后，在显微镜下进行细胞计数，以5×107个/瓶接种到T25培养瓶中，向培养瓶中加入4mL全有培养基，吹打混匀，培养箱中培养，得原代培养细胞；培养48h后，去培养液，用2mL PBS缓冲液清洗贴壁细胞，去清洗液，加入3mL全有培养基，培养箱培养；培养箱培养36h，贴壁率达85％～95％后，加入3mLPBS缓冲液清洗贴壁细胞1-2次，去清洗液；加入1～2mL胰酶，培养箱恒温消化2min；加入与胰酶等量的全有培养基终止胰酶反应，吹打混匀；转移至15mL离心管中，1000r离心5min，去上清液，加入1mL全有培养基，吹打混匀，在显微镜下进行细胞计数；以104个/孔接种到96孔板或以106个/孔接种到6孔板中，并96孔板每孔加入100μL全有培养基或6孔板加入2mL全有培养基，培养箱中培养；培养24-48h后培养瓶中颜色正常，未出现浑浊状态，细胞融合率达到90％左右即可进行氧化应激模型的建立。
实施例2氧化应激模型的建立
分别使用H2O2浓度为0μmol/L、50μmol/L、100μmol/L、150μmol/L、200μmol/L，分别处理卵巢颗粒细胞6h、12h、24h后，CCK-8检测结果发现，随着H2O2浓度的增加，细胞活力极显著地降低；当H2O2浓度为50μmol/L时，细胞活力为80％左右；当H2O2浓度大于100μmol/L时，细胞活力显著低于50％，见图2。由图2A可知，H2O2浓度为100μmol/L，处理6h时，检测的细胞活力为58％，且与对照组差异具有统计学意义(P<0.01)，据文献报道，细胞活力在50％左右比较容易诱导出细胞凋亡，因此对颗粒细胞氧化应激模型的建立，初步选定H2O2浓度为100μmol/L，时间处理6h。
为避免因过度氧化而造成的非生理性细胞死亡，本研究继续对能引起颗粒细胞明显凋亡的最低H2O2处理浓度进行筛选。分别采用H2O2浓度为0μmol/L、50μmol/L、100μmol/L、150μmol/L、200μmol/L处理卵巢颗粒细胞6h时，颗粒细胞的形态和数量随着H2O2浓度的提高而发生显著变化见图3、图4、图5、图6、图7，未经H2O2处理的颗粒细胞融合度高，细胞质均匀；经过H2O2处理的细胞融合度随浓度提高而降低，H2O2浓度为100μmol/L时细胞形态和数量能够满足实验需求。
为进一步确定氧化应激诱导保山猪颗粒细胞凋亡的适应的H2O2浓度和作用时间，实验使用各浓度梯度H2O2处理细胞6h，流式细胞仪检测细胞凋亡情况，由图8A可知，随着H2O2浓度的提高，细胞凋亡率在显著增加，细胞在第一象限为机械死亡，在第二象限为晚期凋亡，在第四象限为早期凋亡，正常细胞在第三象限，H2O2浓度越高，正常细胞越少。经过统计细胞总凋亡率，见图8B，H2O2浓度为100μmol/L时，细胞总凋亡率达40％，且显著高于对照组，该结果与CCK-8分析结果一致。
综上，保山猪卵巢颗粒细胞氧化应激模型建立的H2O2浓度选定100μmol/L，时间处理6h。
实施例3美洲大蠊小肽对H2O2处理的猪卵巢颗粒细胞的修复作用
为验证美洲大蠊提取物小肽(PAP)对氧化应激颗粒细胞具修复作用，实验对颗粒细胞进行100μmol/L H2O2处理6h后，加入PAP浓度为0μg/mL、200μg/mL、400μg/mL、800μg/mL、1600μg/mL分别处理24h、48h、72h后，CCK-8测细胞活力。由图9ABC可知，美洲大蠊提取物PAP对氧化应激颗粒细胞具有一定的修复作用，与H2O2处理后的细胞组相比，其余各浓度组的细胞活力均有一定提高，但低于空白组；400μg/mL美洲大蠊提取物对H2O2处理的猪卵巢颗粒细胞具有最明显的修复作用，差异具有统计学意义；由图9D可知，400μg/mL PAP修复24h就已有一定的修复作用，与空白组比差异具有统计学意义。实验使用各浓度梯度PAP处理细胞24h，流式细胞仪检测细胞凋亡情况，由图10可知，与H2O2组相比，随着PAP浓度的提高，细胞凋亡率在显著降低，400μg/mL和800μg/mL PAP效果最好，但二者之间无显著性差异。此外在图11中，随着PAP浓度的提高，氧化应激颗粒细胞MDA及NO含量均呈现先下降后上升的趋势，在400μg/mL的PAP浓度处MDA及NO含量最低，接近空白组水平，因此，PAP修复氧化损伤猪卵巢颗粒细胞的最适浓度及时间分别为400μg/mL、24h。
实施例4PAP通过FoxO1调控猪卵巢颗粒细胞修复作用
一、PAP下调H2O2诱导的颗粒细胞FoxO1蛋白表达，使凋亡颗粒细胞减少
为验证PAP是否通过FoxO1调控猪卵巢颗粒细胞起修复作用，本申请使用H2O2诱导细胞氧化损伤，再用PAP修复氧化损伤细胞，提取细胞总蛋白，Westernblot检测FoxO1蛋白及凋亡相关蛋白caspase-3表达，结果如图12所示，H2O2组FoxO1及caspase-3蛋白的表达显著上调，而H2O2+PAP组与空白组FoxO1、caspase-3蛋白的表达量基本一致，验证了氧化应激引起的颗粒细胞凋亡伴随着细胞核中FoxO1高表达的结论，而PAP则降低了FoxO1蛋白的表达，使凋亡细胞减少。因此，PAP可能通过FoxO1调控猪卵巢颗粒细胞的修复作用。
二、PAP有效抑制猪颗粒细胞外源性FoxO1的过表达，使凋亡颗粒细胞减少
为进一步验证PAP通过FoxO1调控猪卵巢颗粒细胞起修复作用，试验在颗粒细胞中过表达FoxO1基因，再使用PAP继续培养颗粒细胞，看PAP是否抑制FoxO1蛋白的表达。本文过表达所使用的猪FoxO1基因启动子报告质粒图谱如图13所示，由上海吉玛制药技术有限公司构建合成。
试验将构建的FoxO1质粒转染至颗粒细胞中，再用PAP处理FoxO1过表达细胞，提取总蛋白，Westernblot蛋白免疫印迹法检测FoxO1蛋白的表达，结果表明颗粒细胞FoxO1基因过表达后，FoxO1蛋白显著表达；PAP处理后，FoxO1蛋白表达量显著降低，提示着PAP能显著降低FoxO1蛋白的表达，如图14。
三、PAP阻止FoxO1入核发挥转录活性
大量研究表明，细胞受到氧化应激时会增加FoxO1入核发挥转录活性，为研究PAP通过FoxO1调控猪卵巢颗粒细胞起修复作用，试验对H2O2诱导的颗粒细胞进行了400μg/mLPAP处理。免疫荧光检测结果如图15A所示，与空白组相比，未用PAP处理的细胞中，H2O2刺激会促进FoxO1定位到细胞核，而PAP处理过的颗粒细胞，H2O2诱导的颗粒细胞FoxO1入核受到明显抑制。在过表达FoxO1细胞中，PAP起同样的作用(图15B)。说明PAP能阻止FoxO1入核发挥转录活性。
虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施例对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。

Claims (10)

1.一种美洲大蠊小肽修复受H2O2氧化损伤的猪卵巢颗粒细胞模型的构建方法，其特征在于，所述方法包括：
步骤一，猪卵巢颗粒细胞的采集和培养
收集猪卵巢细胞颗粒细胞，并对颗粒细胞进行原代培养和传代培养，传代培养24-48h后进行氧化应激模型的建立；
步骤二，猪卵巢颗粒细胞氧化应激模型的建立
采用不同浓度的H2O2在不同作用时间下对猪卵巢颗粒细胞氧化处理后，CCK-8检测细胞活性及流式细胞术检测细胞凋亡率，筛选合适的H2O2的作用浓度和作用时间；
步骤三，美洲大蠊小肽对H2O2氧化处理的猪卵巢颗粒细胞的修复
将颗粒细胞在H2O2氧化处理后，分别加入不同浓度的美洲大蠊小肽，加入美洲大蠊小肽分别处理不同的时间后，检测细胞活力、凋亡率及MDA和NO含量。
2.根据权利要求1所述一种美洲大蠊小肽修复受H2O2氧化损伤的猪卵巢颗粒细胞模型的构建方法，其特征在于，所述步骤一中，所述传代培养24-48h后，进行氧化应激模型的建立的指标是培养瓶中颜色正常，未出现浑浊状态，且细胞融合率达到85％-95％。
3.根据权利要求1所述一种美洲大蠊小肽修复受H2O2氧化损伤的猪卵巢颗粒细胞模型的构建方法，其特征在于，所述步骤二中，所述不同浓度的H2O2浓度分别为0μmol/L、50μmol/L、100μmol/L、150μmol/L和200μmol/L。
4.根据权利要求1所述一种美洲大蠊小肽修复受H2O2氧化损伤的猪卵巢颗粒细胞模型的构建方法，其特征在于，所述步骤二中，所述不同作用时间分别为6h、12h、24h。
5.根据权利要求1所述一种美洲大蠊小肽修复受H2O2氧化损伤的猪卵巢颗粒细胞模型的构建方法，其特征在于，所述步骤二中，所述合适的H2O2的作用浓度和作用时间的指标为H2O2氧化后的颗粒细胞的细胞活力在40％-60％。
6.根据权利要求1所述一种美洲大蠊小肽修复受H2O2氧化损伤的猪卵巢颗粒细胞模型的构建方法，其特征在于，所述步骤三中，所述H2O2氧化处理的方法是用100μmol/L的H2O2，氧化处理6h。
7.根据权利要求1所述一种美洲大蠊小肽修复受H2O2氧化损伤的猪卵巢颗粒细胞模型的构建方法，其特征在于，所述步骤三中，所述不同浓度的美洲大蠊小肽浓度分别为0μg/mL、200μg/mL、400μg/mL、800μg/mL和1600μg/mL。
8.根据权利要求1所述一种美洲大蠊小肽修复受H2O2氧化损伤的猪卵巢颗粒细胞模型的构建方法，其特征在于，所述步骤三中，所述不同处理时间分别为24h、48h和72h。
9.根据权利要求1所述一种美洲大蠊小肽修复受H2O2氧化损伤的猪卵巢颗粒细胞模型的构建方法，其特征在于，所述步骤三中，所述美洲大蠊小肽修复氧化应激的颗粒细胞的方法是用400μmol/L的美洲大蠊小肽，修复处理24h。
10.一种修复受H2O2氧化损伤的猪卵巢颗粒细胞的修复剂，其特征在于，所述修复剂是美洲大蠊小肽，其为美洲大蠊精提物，成分为0.181-12.355KDa的小肽；所述美洲大蠊小肽的制备方法是美洲大蠊虫体鲜品或干品经95％乙醇提取、浓缩脱脂、大孔吸附树脂柱层析、80％乙醇洗脱、洗脱液浓缩所得。
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Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN114032207A (zh) * 2021-08-02 2022-02-11 四川农业大学 一种猪卵巢颗粒细胞的分离及培养方法

Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN105878288A (zh) * 2015-06-30 2016-08-24 陈光健 一种美洲大蠊酶解物及其制备方法和应用
US20170000829A1 (en) * 2015-06-30 2017-01-05 Sichuan Gooddoctor Panxi Pharmaceutical Co.,Ltd. Periplaneta americana extract or periplaneta americana medicinal powder as well as preparation method thereof and application in preparation for medicine used for preventing and treating radiation-induced damages
CN107812016A (zh) * 2017-11-23 2018-03-20 大理大学 一种美洲大蠊提取物、制备方法及其在免疫调节中的应用
CN107929326A (zh) * 2017-12-26 2018-04-20 大理大学 一种美洲大蠊提取物、制备方法及其在抗氧化调节中的应用

Patent Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN105878288A (zh) * 2015-06-30 2016-08-24 陈光健 一种美洲大蠊酶解物及其制备方法和应用
US20170000829A1 (en) * 2015-06-30 2017-01-05 Sichuan Gooddoctor Panxi Pharmaceutical Co.,Ltd. Periplaneta americana extract or periplaneta americana medicinal powder as well as preparation method thereof and application in preparation for medicine used for preventing and treating radiation-induced damages
CN107812016A (zh) * 2017-11-23 2018-03-20 大理大学 一种美洲大蠊提取物、制备方法及其在免疫调节中的应用
CN107929326A (zh) * 2017-12-26 2018-04-20 大理大学 一种美洲大蠊提取物、制备方法及其在抗氧化调节中的应用

Non-Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
MING SHEN等: "Involvement of the Up-regulated FoxO1 Expression in Follicular Granulosa Cell Apoptosis Induced by Oxidative Stress", 《THE JOURNAL OF BIOLOGICAL CHEMISTRY》 *
李烈川等: "过氧化氢诱导猪卵巢颗粒细胞自噬及其对凋亡的影响", 《南京农业大学学报》 *
隋世燕等: "美洲大蠊醇提物对大鼠抗氧化应激的影响", 《四川动物》 *

Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN114032207A (zh) * 2021-08-02 2022-02-11 四川农业大学 一种猪卵巢颗粒细胞的分离及培养方法

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