BR112019013857A2

BR112019013857A2 - composição para uso no tratamento de tosse, e processo para a preparação de uma composição

Info

Publication number: BR112019013857A2
Application number: BR112019013857A
Authority: BR
Inventors: Mercati Valentino; Mattoli Luisa; Polenzani Paola
Original assignee: Aboca S.P.A. Società Agricola
Priority date: 2017-02-15
Filing date: 2018-02-12
Publication date: 2020-01-28
Also published as: AU2018220880A1; EP3582796B1; CN110300593A; AU2018220880B2; LT3582796T; US20190388448A1; PL3582796T3; CY1124457T1; SI3582796T1; ES2886511T3; NZ754291A; RS62203B1; IT201700016964A1; HRP20211330T1; WO2018150309A1; DK3582796T3; CN110300593B; CA3049843A1; PT3582796T; JP2020506204A

Abstract

a presente invenção refere-se a uma composição nova para uso no tratamento de tosse compreendendo uma ou mais frações de polissacarídeo de plátano, uma ou mais frações de polissacarídeo de marshmallow, mel, açúcar mascavo, uma ou mais frações polifenólicas de agrimônia compreendendo taninas

Description

COMPOSIÇÃO PARA USO NO TRATAMENTO DE TOSSE, E PROCESSO PARA A PREPARAÇÃO DE UMA COMPOSIÇÃO

DESCRIÇÃO [0001] A presente invenção refere-se a uma composição nova para uso no tratamento de tosse, compreendendo uma ou mais frações de polissacarideo de plátano, uma ou mais frações de polissacarideo de marshmallow, mel, açúcar mascavo, uma ou mais frações polifenólicas de agrimônia compreendendo taninas.

ESTADO DA TÉCNICA ANTERIOR [0002] A terapia farmacológica clássica é essencialmente baseada em supressão de tosse por mecanismos químicos e farmacológicos. Com base em seu mecanismo de ação, drogas anti-tosse podem ser classificadas em 3 categorias.

mucolíticos: aumentam fluidez de muco com mecanismos de despolimerização de complexos mucoproteicos e de ácidos nucleicos.

expectorantes: aumentam secreções bronquiais e reduzem indiretamente viscosidade de muco.

. sedativos: inibem o centro de tosse, eliminando o sintoma.

[0003] As limitações de droga anti-tosse situam-se em sua especificidade de ação e em seus efeitos colaterais: mucolíticos somente atuam em tosse úmida; sedativos são indicados em tosse seca somente, dificultando sua ação fisiológica; expectorantes têm um mecanismo de ação pouco racional, tanto assim que na realidade os mesmos não são prescritos. Além disso, drogas anti-tosse são pouco adequadas em idade pediátrica: na realidade, mucolíticos e sedativos centrais são contraindicados em crianças com menos de 2 anos

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2/51 de idade.

[0004] Portanto, um tratamento de tosse por composições não irritantes, eficaz, estável e isento de drogas como, por exemplo, antibióticos ou drogas baseadas em cortisona, que podem, portanto, ser usadas sem contraindicações devido a superdosagem de tais tipologias de drogas e, portanto, também

adequados	para uso	pediátrico,	é de	interesse evidente	no
estado da	técnica.
	SUMÁRIO DA	INVENÇÃO
[0005]	Portanto,	a presente	invenção refere-se a	uma
formulaçãc	> para o tratamento de	tosse	cujos componentes	são

capazes de interagir de modo sinergista de modo a interferir localmente com efeitos mecânico-fisicos de seus mecanismos fisiopatogenéticos e tendo, conjuntamente com um efeito mucoadesivo de proteção de mucosa, também um efeito antioxidante potente.

[0006] A formulação da invenção é capaz de atuar com um efeito principalmente mecânico:

I.	Em	inflamação	(que é o	fator que	desencadeia a
tosse), por	uma	ação indireta realizada através	da formação de
uma camada	de	proteção	que, por	um lado	evita contato
adicional	com	agentes	irritantes	externos	e conserva

hidratação de membrana mucosa, e por outro lado, graças à intervenção de substâncias antioxidantes, diminui o efeito nocivo dos radicais livres produzidos por infeções;

II. no muco, tornando o mais fluido, portanto, mais facilmente removível por mecanismos de clearance fisiológico, por hidratação do mesmo devido a substâncias hidrofílicas que atraem água.

[0007] Desse modo, os sintomas de tosse podem ser diminuídos

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3/51 sem anular seu papel fisiológico e promover uma recuperação de condições normais de muco e membrana mucosa.

[0008] Os autores da presente invenção fizeram uma composição tendo boas propriedades de efeito de barreira e mucoadesivas sobre a membrana mucosa, conjuntamente com propriedades antioxidantes comparáveis com aqueles de dosagens de vitamina C comumente usadas em formulações antitussigenas estáveis ao longo do tempo, portanto não exigindo a presença dos estabilizadores comumente usados para estabilização de ácido ascórbico.

[0009] Os autores fizeram, na realidade, uma composição na qual um ingrediente único, representado por agrimônia (Agrimônia) é responsável tanto pelas propriedades mucoadesivas fortes da formulação, e para suas propriedades antioxidantes, tais propriedades antioxidantes sendo comparáveis com aqueles de vitamina C, porém sendo muito mais estáveis do que a vitamina.

[00010] Na realidade, é sabido que a degradação rápida de ácido ascórbico em produtos aquosos é até a presente data um fator altamente relevante na formulação de produtos contendo a mesma. Também é sabido que oxidação de ácido ascórbico ocorre rapidamente em um ambiente alcalino. Degradação de ácido ascórbico ocorre tanto aeróbica como anaerobicamnete, e depende de muitos fatores, como condições de oxigênio, temperatura, luz, pH e armazenagem.

[00011] A composição tema da invenção mostrou, ao invés, excelentes capacidades de efeito de barreira e mucoadesão, atividade antioxidante comparável com aquela exercida por dosagens comumente usadas de vitamina C, conjuntamente com estabilidade excelente ao longo do tempo. Na realidade, a

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4/51 composição da invenção, mesmo em forma de fluido, provou ser estável ao manter as amostras analisadas em condições extremas, a 40°C e 75% de umidade relativa. Dados obtidos são reportados no ensaio de estabilidade, na seção de Exemplos.

[00012] Como esperado a partir da literatura, e como também observado pelos inventores, vitamina C provou ser acentuadamente instável na mesma forma de fluido (com os mesmos excipientes).

[00013] A presente invenção fornece, portanto, uma composição otimizada para o tratamento de tosse, cujos componentes como selecionados apresentam efeito de barreira, mucoadesivo e efeito antioxidante conjuntamente com estabilidade excelente ao longo do tempo.

[00014] Portanto, a presente invenção refere-se a uma composição para uso no tratamento de tosse compreendendo uma ou mais frações de polissacarideo de plátano, uma ou mais frações de polissacarideo de marshmallow, uma ou mais frações polifenólicas de agrimônia compreendendo taninas, açúcar mascavo, mel.

[00015] A presente invenção também se refere a um processo para a preparação da composição em uma ou mais frações de polissacarideo de plátano, uma ou mais frações de polissacarideo de marshmallow, uma ou mais frações polifenólicas de agrimônia compreendendo taninas são misturadas com mel, açúcar mascavo e um ou mais veículos e/ou excipientes farmaceuticamente aceitáveis.

GLOSSÁRIO [00016] Para fins da presente invenção, por Plátano queremos dizer Plantago lanceolata, por Agrimônia queremos dizer Agrimônia eupatoria e por Marshmallow queremos dizer

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Althaea officinalis.

[00017] Por topos, ou topos de floração, quer se dizer o temo como comumente usado em medicina herbal e em tratados botânicos, portanto, as extremidades aéreas da planta que contêm folhas, hastes (quer dizer galhos e não como caule principal da planta) e flores, ou pelo menos um desses componentes.

[00018] Por frações de polissacarideo de marshmallow e de plátano, querem dizer frações de extratos, preferivelmente hidroalcoólicos ou aquosos, de raízes de marshmallow e frações de extratos, hidroalcoolicos ou aquosos, de folhas de plátano, compreendendo polissacarídeos.

[00019] Por frações polifenólicos de agrimônia compreendendo taninas, querem dizer frações de extratos, preferivelmente hidroalcoólicos ou aquosos, de topos ou topos de floração de agrimônia, compreendendo polifenóis, em particular compreendendo a subclasse polifenólica de taninas.

DESCRIÇÃO DETALHADA DAS FIGURAS [00020] Na figura 1, a percentagem de mucoadesividade do produto sob condições estáticas, em várias diluições, em direção a células bucais humanas é reportada, medida por avaliação da capacidade de produto para aderir a celulares por inibir ligação de lectina com glicoproteínas de membrana, como ilustrado na descrição detalhada e nos exemplos abaixo.

[00021] A figura 1 mostra tal percentagem para uma formulação de acordo com a invenção na forma de xarope com as seguintes diluições: não diluído, diluído 1:2 e diluído 1:5.

[00022] Na figura 2, a resistência da camada mucoadesiva sob condições dinâmicas é reportada, isto é, avaliando a capacidade do produto de permanecer aderido à membrana mucosa

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6/51 ao longo do tempo, por submeter o sistema a um fluxo de 2 ml/min. de saliva artificial em uma célula Franz como ilustrado na descrição detalhada e nos exemplos abaixo.

[00023] A figura 2 mostra a resistência da camada mucoadesiva obtida com o produto na forma de xarope diluída 1:2 em tempos diferentes, 0,5 h, 1 h e 2 h em direção a uma solução salivar simulada (0,9% NaCl de solução fisiológica).

[00024] A figura 3 mostra a avaliação do efeito de barreira exercido pelo produto em xarope, que forma um filme de proteção capaz de proteger células contra insulto de agentes inflamatórios (LPS).

[00025] A figura 4 mostra dados obtidos por executar as mesmas etapas do ensaio de Barreira realizado para a figura 3, inverter, entretanto, a ordem de tensão das células, isto é, primeiramente simulando as células com LPS, e subsequentemente expondo as mesmas à amostra (composição de invenção e controle positivo), os dados obtidos mostram que a atividade antiinflamatória da composição da invenção deve ser atribuída a um efeito de barreira e que não é uma atividade antiinflamatória direta.

[00026] As figuras 5 e 6 mostram os resultados, expressos respectivamente como gráfico representando o desenvolvimento de radicais livres ao longo do tempo, e histograma representando a ação de removedor ao longo do tempo de várias concentrações da composição. Os experimentos foram realizados em 1 grama da composição da invenção, levados a um volume final de 10 ml em solução salina e ensaiados na concentração máxima de 0,5 mg/ml e na concentração mínima de 0,03 mg/ml da composição.

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DESCRIÇÃO DETALHADA DA INVENÇÃO [00027] Tosse é uma manobra expiratória súbita que pode ocorrer como reflexo ou como uma ação voluntária e tem o objetivo de libertar o trato respiratório de qualquer material presente (expectorar) , desse modo realizando um papel indispensável para o funcionamento fisiológico do sistema respiratório.

[00028] Entretanto, esse sistema para defender o trato respiratório se torna uma condição patológica ao prolongamento em tempo, devido a estímulos irritativos repetidos (agentes infectivos, substâncias irritantes) causando produção excessiva de secreções e muco, que acumulam no trato respiratório e se tornam uma causa concomitante de estímulo tussígeno.

[00029] A membrana mucosa que reveste o trato respiratório desempenha um papel de proteção de barreira funcional entre o ambiente externo e os tecidos:

a) representa uma barreira física real, protegendo tecidos subjacentes do contato com o exterior;

b) devido à presença de células ciliadas, com movimentos sincronizados e unidirecionais empurra matéria estranha retida no muco em direção ao esôfago;

c) produz secreções e mucos;

d) executa funções imunológicas, e na presença de um vírus adota uma série de mecanismos de defesa efetivos cruciais na resposta antiviral.

[00030] Parte de sua função de proteção é realizada pelo muco que cobre o mesmo, que é um adesivo, gel viscoelástico produzido por células caliciformes e cujas macromoléculas principais são glicoproteínas.

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8/51 [00031] Deve ser considerado que o muco, que sob condições normais tem um papel de proteção, no caso de infecção ou outro tipo de irritação se torna causa de tosse: na realidade, uma superprodução e uma viscosidade mais alta do mesmo são testemunhadas.

[00032] Os principais mecanismos que iniciam um evento infectivo e/ou irritativo causando flogose de ouvido e garganta podem ser descritos como a seguir:

1. envolvimento direto de laringe e traqueia, devido a sua proximidade e as relações de comunicação estreita com boca, faringe e nariz;

2. transporte de mediadores de inflamação produzidos no local de infecção, através da corrente sanguínea, para o trato respiratório inferior, onde iniciam uma resposta inflamatória, estudos em porquinhos da índia e seres humanos demonstraram que estímulos sensoriais do tipo químico aferentes de nariz ou esôfago podem aumentam sensibilidade a tosse das vias nervosas centrais, contribuindo para o estado hipertussígeno acompanhando doenças inflamatórias do trato respiratório, nariz e esôfago.

3. no gotejamento pós nasal uma presença contínua de muco ocorre, frequentemente na forma de filamentos viscosos difíceis de expelir a partir da nasofaringe, que por descer ao longo da faringe irrita a mesma. Essa irritação causa uma perda de coordenação entre nervos e músculos de traqueia e esôfago, de modo que parte de secreções em excesso derrama na laringe, causando uma estimulação mecânica da mesma que se traduz em uma tosse persistente, contínua e irritante, muito frequente em crianças.

[00033] Um papel importante em mecanismos de tosse é

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9/51 realizado pelos tipos diferentes de receptores localizados no nivel de esôfago, cuja estimulação pode desencadear tosse por vários mecanismos:

- estimulação de mecanosensores de tensão por meio das tentativas repetidas em deglutição do muco copioso e viscoso no caso de eventos infectivos;

estimulação de receptores de mucosa sensíveis a estímulos de pressão leve exercidos por filamentos mucosos estagnado entre hipofaringe e esôfago;

estimulação de nociceptores por mediadores de inflamação produzidos localmente e carregados por muco para outros locais (mecanismos de estimulação similares foram demonstrados em porquinho da índia, mesmo com estímulos químicos ácidos).

[00034] Com base no fato de que tanto os mecanismos fisiológicos para proteção de membranas mucosas de trato respiratório como os processos patogenéticos de tosse são na realidade baseados em mecanismos do tipo mecânico (muco e membrana mucosa intacta por um lado, superprodução de muco e estimulação mecânica por outro lado) os inventores consideraram que interferência de uma ação de proteção de membrana mucosa pode ser a única abordagem realmente eficaz. Os inventores, além disso, procuraram e destacaram uma formulação, estável ao longo do tempo, com base em substâncias de origens naturais, que teriam uma capacidade mucoadesiva alta, um efeito de barreira eficaz contra agentes irritantes, conjuntamente com uma alta ação antioxidante.

[00035] Isso exigiu o desenvolvimento de uma formulação que seja ativa em sua complexidade, isto é, que seus componentes sejam capazes de interagir sinergicamente de modo a interferir

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10/51 localmente com efeitos mecano-fisicos sobre seus mecanismos fisiopatogenéticos e concomitantemente fornecer um efeito antioxidante que permite uma proteção eficaz contra radicais livres.

[00036] Tendo em mente tal objetivo, uma composição foi feita para uso no tratamento de tosse, compreendendo uma ou mais frações de polissacarideo de plátano, uma ou mais frações de polissacarideo de marshmallow, uma ou mais frações polifenólicas de agrimônia compreendendo taninas, açúcar mascavo e mel, juntamente com um ou mais veículos e/ou excipientes farmaceuticamente aceitáveis.

[00037] Como indicado acima, por frações de polissacarideo da planta x ou y, ou frações polifenólicas da planta z compreendendo taninas, quer se dizer frações de extratos das plantas, compreendendo as classes de compostos indicados e livres de outras classes de compostos comumente persentes nas partes de interesse da planta. Em particular, as frações acima mencionadas podem ser produzidas por técnicas de extração aquosa ou extração hidroalcoólica. Essas frações podem estar na forma de extratos hidroalcoolicos ou aquosos, extratos secos, extratos secos por técnica de secagem por pulverização (diferente de liofilização), extratos ou misturas moles dos mesmos.

[00038] Os extratos liofilizados ou os extratos secos pela técnica de secagem por pulverização de acordo com a invenção

podem	ser	extratos	aquoso	ou hidroalcoolicos secos	ou
liofilizados	•
[00039]	De	acordo	com a	invenção,	as frações	acima

mencionadas são preferivelmente padronizadas em relação ao teor de marcadores característicos.

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11/51 [00040] Em uma modalidade, a fração de polissacarídeo de plátano é uma fração (ou um conjunto de frações) compreendendo polissacarídeos tendo um peso molecular mais alto que 2.0000

Daltons em uma	percentagem em	peso	maior	ou igual a 3%.	Por
exemplo, 4%, 5%	, 6%, 7%, 8%, 9%	, 10%	11%,	12%, 13%, 14%,	15%,
16%, 17%, 18%,	19%, 20%, 21%,	22%,	23%,	24%, 25%, 26%,	27%,
28%, 29%, 30%,	31%, 32%, 33%,	34%,	35%,	36%, 37%, 38%,	39%,
40%, 41%, 42%,	43%, 44%, 45%,	46%	, 47%,	48%, 49%, 50%	. De
acordo com	uma modalidade	adicional, a fração	de
polissacarídeo	de marshmallow é	uma	fraçãc	) (ou um conjunto de

frações) compreendendo polissacarídeos tendo um peso molecular

mais	alto	que 2	. 0000	Daltons em uma percentagem em	peso	maior
que	ou igual a	5% .	Por	exemplo, 6%, 7%	, 8%,	9%,	10%,	11%,
12%,	13%,	14%,	15%,	16%	, 17%, 18%, 19%,	20%,	21%,	22%,	23%,
24%,	25%,	26%,	27%,	28%	, 29%, 30%, 31%,	32%,	33%,	34%,	35%,
36%,	37%,	38%,	39%,	40%	, 41%, 42%, 43%,	44%,	45%,	46%,	47%,

48%, 49%,	50% .
[00041]	De acordo	com	uma	modalidade,	a	fração	de

polissacarídeo de marshmallow é uma fração mucilaginosa extraída da planta.

[00042] De acordo ainda com outra modalidade, a fração polifenólica de agrimônia é uma fração polifenólica (ou um conjunto de frações) (isto é, compreendendo polifenóis), compreendendo taninas, compreendendo polifenóis em uma percentagem em peso maior que ou igual a 3%. Por exemplo, 4%,

5%,	6%, 7	%, 8%, 9%,	10%, 11%, 12%,	13%,	14%,	15%,	16%,	17%,
18%,	19%,	20%,	21%,	22%, 23%, 24%,	25%,	26%,	27%,	28%,	29%,
30%,	31%,	32%,	33%,	34%, 35%, 36%,	37%,	38%,	39%,	40%,	41%,
42%,	43%,	44%,	45%,	46%, 47%, 48%, 49	%, 50	% ·

[00043] Em uma modalidade preferida, a composição compreende

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12/51 uma fração de polissacarideo de plátano compreendendo polissacarídeos com peso molecular mais alto que 2.0000 Daltons em uma percentagem em peso maior ou igual a 3%; uma fração de polissacarideo de marshmallow é uma fração compreendendo polissacarídeos com peso molecular mais alto que 2.0000 Daltons em uma percentagem em peso maior ou igual a 5%, e uma fração polifenólica de agrimônia compreendendo taninas, compreendendo polifenóis em uma percentagem em peso maior ou igual a 3%.

[00044] No caso de plátano e Marshmallow, extratos liofilizados ou extratos secos por secagem por pulverização são preferidos, uma vez que as soluções de extração de polissacarideo com uma baixa percentagem de álcool ou água são convencionalmente usadas, e tais técnicas de secagem são as melhores para fornecer às frações as características adequadas para armazenagem. A preparação de tais tipos de frações pode ser realizada com metodologias bem conhecidas, portanto, nenhuma indicação adicional é necessária para um técnico no campo de realizar a presente invenção. Entretanto, na seção de Exemplos são reportados métodos adequados, não limitando a invenção, para a preparação de frações adequadas para a composição da invenção.

[00045] A composição de acordo com a invenção é adequada para uso em pacientes adultos, de idade geriátrica, em gestação, adolescentes e idade pediátrica. A preparação dos extratos, como já mencionado, pode ser realizada de acordo com qualquer técnica conhecida por uma pessoa versada na arte, em uma modalidade específica, os extratos podem ser extratos liofilizados.

[00046] 0 mel pode ser mel de abelha, mel de melado ou uma

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13/51 mistura dos mesmos, e pode ser usado também em uma forma liofilizada ou em qualquer forma.

[00047] A formulação pode então compreender agentes de formulação como agentes de espessamento, aromatizantes, e conservantes (agentes conservantes) de origem natural ou sintética ou outros adjuvantes tecnológicos que o técnico versado no campo possa selecionar de acordo com o estado da técnica. Como exemplo simples, sucos (como suco de limão ou outros sabores de frutas (por exemplo, sabor de laranja natural, sabor de limão natural, sabor de pêssego natural, sabor de murta natural, sabor de amora natural), agentes espessantes (como goma xantana, goma arábica) podem ser selecionados.

[00048] Portanto, a composição acima descrita pode consistir em uma ou mais frações de polissacarideo de plátano, uma ou mais frações de polissacarideo de marshmallow, uma ou mais frações polifenólicas de agrimônia compreendendo taninas, açúcar mascavo, mel e excipientes, aromas, conservantes adequados.

[00049] Em uma modalidade preferida da invenção, os princípios ativos únicos compreendidos na composição serão representados por uma ou mais frações de polissacarideo de plátano, uma ou mais frações de polissacarideo de marshmallow, uma ou mais frações polifenólicas de agrimônia compreendendo taninas, açúcar mascavo, mel.

[00050] Portanto, a composição da invenção pode ser também definida como uma composição consistindo em uma ou mais frações de polissacarideo de plátano, uma ou mais frações de polissacarideo de marshmallow, uma ou mais frações polifenólicas de agrimônia compreendendo taninas, açúcar

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14/51 mascavo, mel e veículos e/ou excipientes farmaceuticamente aceitáveis.

[00051] De acordo com uma modalidade, a composição da invenção pode compreender 30-60% peso/peso de açúcar mascavo; 20-50% peso/peso de mel; 0,1-2% peso/peso de fração de polissacarídeo de plátano; 0,1-2% de fração de polissacarídeo de marshmallow; 0,1-2% de fração polifenólica de agrimônia compreendendo taninas e pelo menos um de veículos e/ou excipientes farmaceuticamente aceitáveis, q.s. até 100%.

[00052] Portanto, a percentagens em peso perto do final superior da faixa de mel, corresponderão percentagens em peso perto do final inferior da faixa de açúcar mascavo e viceversa, visto que a toma total das partes em peso dos ingredientes, incluindo pelo menos um veículo e/ou excipiente farmaceuticamente aceitável é 100.

[00053] Nas faixas acima indicadas, os finais inferior e superior, todos os valores compreendidos entre tais finais, e todas as combinações possíveis de partes em peso dos ingredientes compreendidos em tais intervalos e cuja soma seja 100 são compreendidos.

[00054] A seguir, exemplos não limitadores de modalidades possíveis de acordo com a invenção são fornecidos.

[00055] De acordo com uma modalidade, a composição da invenção pode compreender 30-50% peso/peso de açúcar mascavo; 30-50% peso/peso de mel; 0,1-1% peso/peso de fração de polissacarídeo de plátano; 0,1-1% de fração de polissacarídeo de marshmallow; 0,4-2% fração polifenólica de agrimônia compreendendo taninas, e pelo menos um entre veículos e/ou excipientes farmaceuticamente aceitáveis, de modo que a quantidade total atinja 100% (isto é, q.s. até 100%) .

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15/51 [00056] De acordo com uma outra modalidade, a composição da invenção pode compreender 35-55% peso/peso de açúcar mascavo; 30-50% peso/peso de mel; 0,1-1% peso/peso de fração de polissacarídeo de plátano; 0,1-5% fração de polissacarídeo de marshmallow; 0,2-2% fração polifenólica de agrimônia compreendendo taninas e pelo menos um entre veículos e/ou excipientes farmaceuticamente aceitáveis, q.s. até 100%.

[00057] De acordo com uma modalidade adicional, a composição da invenção pode compreender 40-60% peso/peso de açúcar mascavo; 20-30% peso/peso de mel; 0,1-1% peso/peso de fração de polissacarídeo de plátano; 0,1-5% fração de polissacarídeo de marshmallow; 0,2-2% fração polifenólica de agrimônia compreendendo taninas e pelo menos um entre veículos e/ou excipientes farmaceuticamente aceitáveis, q.s. até 100%.

[00058] De acordo ainda com uma modalidade adicional, a composição da invenção pode compreender 40-60% peso/peso de açúcar mascavo; 20-30% peso/peso de mel; 0,1-1% peso/peso de fração de polissacarídeo de plátano; 0,1-1,7% fração de polissacarídeo de marshmallow; 0,2-1% fração polifenólica de agrimônia compreendendo taninas e pelo menos um entre veículos e/ou excipientes farmaceuticamente aceitáveis, q.s. até 100%.

[00059] De acordo ainda com uma outra modalidade, a composição da invenção pode compreender 40-60% peso/peso de açúcar mascavo; 20-30% peso/peso de mel; 0,1-1% peso/peso de fração de polissacarídeo de plátano; 0,1-1,6% fração de polissacarídeo de marshmallow; 0.3-1% fração polifenólica de agrimônia compreendendo taninas e pelo menos um entre veículos e/ou excipientes farmaceuticamente aceitáveis, q.s. até 100%.

[00060] De acordo ainda com uma outra modalidade, a composição da invenção pode compreender 40-60% peso/peso de

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16/51 açúcar mascavo; 20-30% peso/peso de mel; 0,2-1% peso/peso de fração de polissacarideo de plátano; 0,1-1,6% de fração de polissacarideo de marshmallow; 0.3-1% fração polifenólica de agrimônia compreendendo taninas e pelo menos um entre veículos e/ou excipientes farmaceuticamente aceitáveis, q.s. até 100%.

[00061] Em todas as modalidades da invenção, o termo fração de polissacarideo compreende também um conjunto de frações, bem como o termo fração polifenólica também compreende um conjunto de frações, desde que as classes dos compostos acima indicados estejam presentes, preferivelmente nas concentrações indicadas na presente descrição.

[00062] As composições da invenção são, portanto, compreendidas de um conjunto de substâncias funcionais tendo propriedades químico-físicas de modo a realizar em geral um efeito fluidificante de muco e um efeito de proteger a membrana mucosa no nível do local de aplicação representado pelo trato respiratório superior.

[00063] Como é evidente a partir dos experimentos reportados na presente descrição, a composição de acordo com a presente invenção tem uma percentagem de mucoadesão, quando medida por avaliação da capacidade do produto, não diluído ou diluído a 1:5, de aderir a células da membrana mucosa bucal em cultura, inibindo ligação de lectina com proteínas de membrana, entre 85 e 50%. A capacidade é medida por tratar células da membrana mucosa bucal com a substância a ser ensaiada (nesse caso com a composição da invenção) e então com lectina biotinilada, detectando com um sistema adequado (por exemplo, estreptavidina peroxidase - o-fenil alanina)a lectina ligada às células, comparando a quantidade de lectina ligada na amostra tratada com a composição de interesse com relação à

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17/51 quantidade de lectina ligada no controle, na qual células não são tratadas com a composição de interesse.

[00064] Um esquema do método usado é relatado a seguir:

[00065] A extensão de mucoadesão pode ser medida, por exemplo, por uma reação colorimétrica que permite quantificar os locais em glicoproteínas não engatados pela lectina, como engatados pelo produto mucoadesivo. A reação colorimétrica é possível graças a um sistema de rotulação de lectina peculiar, ilustrando no seguinte diagrama:

[00066] A diminuição no valor de absorvência é proporcional à capacidade do produto aderir (mucoaderir) a células. A capacidade mucoadesiva é expressa como uma percentagem de inibição de ligação de lectina/glicoproteína e representa a percentagem de locais de mucosa ocupados pelo produto de acordo com a equação:

Percentagem de mucoadesão do produto = (1 - amostra abs/controle abs) x 100 [00067] Onde abs é para absorvência medida com um espectrofotômetro a λ = 450 nm.

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18/51 [00068] O produto é aplicado após diluição, considerando o fato de que em uso real, logo após aplicação, uma mistura com a saliva presente na cavidade orofaringea ocorre.

[00069] De acordo com a presente invenção, a composição, não diluída ou diluída a 1:5 com um diluente adequado, pode ter uma percentagem de mucoadesão, medida com ensaio de ligação de

lectina, a figura	entre D .	85% e 50%, preferivelmente	entre	82 e	52% (	vide
[00070]	Com	a expressão entre 85% e	50%,	quer	se dizer
qualquer	intei	ro, que podería ser 85%,	84%,	83%,	82%,	81%,
80%, 79%	, 78%,	77%, 76%, 75%, 74%, 73%,	72%,	71%,	70%,	69%,
68%, 67%	, 66%,	65%, 64%, 63%, 62%, 61%,	60%,	59%,	58%,	57%,
56%, 55%	54%	, 53%, 52%, 51%, 50% e	qualquer decimal	dos
inteiros	acima	indicados mais baixos que	85% e	mais	altos	que

50% (portanto, de 84,9% a 50,1%).

[00071] Qualquer intervalo de capacidade mucoadesiva como medido acima compreendido entre esses dois extremos é objeto da invenção.

[00072] Além disso, a composição da invenção tem, como evidente a partir dos ensaios realizados, uma boa resistência da mucoadesão à lavagem com solução salina, por submeter o sistema a um fluxo de 2 ml/min. de saliva artificial em uma célula Franz. Esse tratamento, simulando a resistência da composição ao fluxo de saliva no local, demonstra que a composição da invenção é caracterizada por uma mucoadesão alta que dura ao longo do tempo, como evidente a partir dos dados reportados na figura 2.

[00073] Além disso, a composição pode ser adicionalmente ou alternativamente caracterizada em que exerce um efeito de barreira de proteção, avaliada por calcular a percentagem de

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19/51 redução da produção de uma citocina em experimentos conduzidos em células na presença do produto da invenção com relação a um Controle positivo sem produto, após contato com um agente inflamatório adequado capaz de induzir a produção da citocina. [00074] Como sistema de medição, qualquer agente inflamatório conhecido e uma citocina correspondente ativada desse modo pode ser usado. Um exemplo de sistema de agente inflamatório possível é representado por lipopolissacarídeo (LPS) e IL-6.

[00075] 0 ensaio de efeito de barreira é um ensaio in vitro do tipo biológico empregado para avaliar a capacidade de produtos acabados e/ou matérias primas para proteger, através da formação de uma camada isolante fina, membranas de mucosa e pele do contato com contaminantes ambientais (pó, polens, microorganismos etc.) .

[00076] 0 ensaio foi desenvolvido para simular in vitro a ação exercida por produtos que são aplicados na pele e/ou membranas de mucosa com o objetivo de criar um filme de proteção contra agressores externos.

[00077] 0 modelo tira proveito do princípio pelo que células submetidas a contato com um agente inflamatório produzem e secretam mediadores pro-inflamatórios (citocinas) no ambiente extracelular em uma quantidade relacionada ao grau de inflamação causada; em uma certa faixa, uma proporcionalidade direta existe entre concentração e tempos de exposição ao agente inflamatório e quantidades de citocinas liberadas.

[00078] 0 modelo experimental adotado fornece duas câmaras fisicamente separadas por uma membrana semipermeável (poros de 0,4 μη) . As células são semeadas na câmara inferior, ao passo que a câmara superior acomoda o agente inflamatório; na membrana semipermeável separando as duas câmaras um filme fino

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20/51 da amostra em análise é estratifiçada para destacar, se presente, um efeito de barreira para o trânsito livre do agente inflamatório.

[00079] A membrana semipermeável permite passagem do agente inflamatório na câmara inferior e constitui o suporte no qual a amostra a ser avaliada é estratifiçada. Dependendo da capacidade de isolamento da amostra, terá uma diminuição de migração de LPS a partir da câmara superior para a inferior (portanto, uma estimulação menor de células para a produção de citocina).

[00080] Os ensaios realizados mostraram que o efeito de barreira exercido pela composição da invenção reduz produção de marcador IL-6, em células submetidas à ação de um agente inflamatório na presença da composição, de cerca de 65-75%, com relação a células de controle submetidas à ação do mesmo agente inflamatório na ausência da composição.

[00081] Esse ensaio foi desenvolvido para simular in vitro a ação de proteção de substâncias e formulações que, aplicadas na pele e membranas de mucosa, formam um filme isolante em direção aos agentes eternos. O modelo tira proveito do princípio pelo que células submetidas a contato com um agente inflamatório produzem e secretam mediadores pró-inflamatórios (citocinas) no ambiente extracelular em uma quantidade relacionada ao grau de inflamação causada. O ensaio prevê a montagem das duas câmaras fisicamente separadas por uma membrana semipermeável que permite trânsito de solutos suficientemente pequenos.

[00082] Na câmara inferior, consistindo em uma cavidade contendo placas para culturas de células, células são cultivadas (linhagem de célula primária de fibroblastos

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21/51 humanos - HUDE), ao passo que a câmara superior consiste na inserção (transwell) e acomoda o agente inflamatório LPS.

[00083] Na superfície interna da membrana transwell que separa as duas câmaras, um filme fino da amostra sendo examinado é estratifiçado para avaliar qualquer efeito de barreira (BE) após trânsito livre do agente inflamatório.

[00084] A extensão da reação inflamatória é avaliada através de dosagem semiquantitativa das citocinas liberadas no meio de cultura da câmara inferior, em particular de interleucina 5

(IL-6) típica	da fase	tardia da	reação inflamatória.
[00085] Na	Tabela	abaixo,	os resultados	obtidos com o
experimento	acima	descrito,	resumido na	figura 3 são
reportados.

AMOSTRA	IL-6 (pg/pL)	MÉDIA	S.D.
Composição de acordo com a tabela 4 + LPS	325.53	332.97	10.00
Composição de acordo com a tabela 4 + LPS	344.33
Composição de acordo com a tabela 4 + LPS	329.05
Controle + 1 (LPS)	1274.47	1145.56	150.73
Controle + 2 (LPS)	979.83
Controle + 3 (LPS)	1182.39
Controle - 1 (MEM)	72.03	63.28	8.82
Controle - 2 (MEM)	54.40
Controle - 3 (MEM)	63.41

[00086] A partir dos resultados, é evidente uma redução notável em concentração de IL-6 produzido em experimentos nos quais o produto ensaiado está presente.

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22/51 [00087] 0 valor de IL-6 igual a 63.28 pg/qL detectado para o Controle negativo é comparável com o valor basal normal, isto é, uma condição não inflamatória.

[00088] 0 gráfico seguinte mostra claramente a proteção exercida pelos produtos sobre as células. Os dados são expressos em termos de Fold over (F.O.) em comparação com o Controle C- por aplicar a seguinte fórmula:

FOLD OVER (C-) = [IL-6 medido]/[C-IL-6] [00089] A partir dos valores IL-6 médios medidos no ensaio de barreira e no controle positivo, a percentagem de redução de liberação IL-6 é calculada:

100-[(IL-6AMOSTRA)/IL-6C+) X 100] [00090] Portanto, por aplicar a fórmula obtém-se um valor de redução de produção IL-6, nos experimentos conduzidos na presença das amostras ensaiadas. O valor médio obtido por executar o ensaio com a composição da invenção foi 70,93% em comparação com o controle positivo como reportado na figura 3.

[00091] Para verificar que os resultados dependam do efeito de barreira única das amostras ensaiadas e excluam quaisquer interferências com síntese de citocina (efeito antiinflamatório) , concomitantemente com o ensaio de barreira (B.A.) em cada amostra também um ensaio de CONTROLE INTERNO (IC) foi executado, no qual as mesmas etapas do ensaio de barreira descrito acima foram executadas, invertendo, entretanto, a ordem de tensão das células; as células foram primeiramente estimuladas com LPS e subsequentemente expostas à amostra.

[00092] Nesse caso, a produção de interleucina não é afetada pela presença das amostras, como mostrado pelo gráfico

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23/51 relatado na figura 4, indicando que os produtos não possuem atividade antiinflamatória direta. Por último, o ensaio de viabilidade de célula indica que nenhuma das operações realizadas e dos tratamentos executados provaram citotóxicos para as células.

[00093] Os resultados obtidos, não relatados, mostram uma boa capacidade pelos tabletes de formar uma barreira de proteção dificultando o trânsito do agente inflamatório LPS.

[00094] Os autores da invenção realizaram experimentos para avaliar a atividade antioxidante da composição da invenção em várias diluições por um experimento realizado em paralelo na composição da invenção com relação a um modelo e com relação à vitamina C solubilizada no modelo.

[00095] Portanto, os dados reportados a seguir mostram como a composição da invenção tem também uma excelente atividade antioxidante, e como a composição permanece estável também em forma fluida com relação à vitamina C suspensa nos mesmos excipientes.

[00096] Os dados obtidos mostraram que a composição da invenção tem uma ação de removedor de radical livre compatível com aquela exercida pela vitamina C quando introduzida em substituição da fração polifenólica de agrimônia na composição da invenção. As figuras 5 e 6 mostram os resultados, expressos respectivamente como gráfico representando o desenvolvimento de radicais livres ao longo do tempo e histograma representando a ação de removedor ao longo do tempo de várias concentrações da composição. Os experimentos foram realizados em 1 grama da composição da invenção, levada até um volume final de 10 ml em solução salina e ensaiada na concentração máxima de 0,5 mg/ml e na concentração mínima de 0,03 mg/ml de

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24/51 composição .

[00097] 0 experimento foi realizado por avaliar a eficácia da amostra analisada para neutralizar os radicais livres gerados por tratar células cultivadas com uma solução de 500 μΜ de H2O2 · A proteção de tensão oxidativa induzida por H2O2 foi expressa em termos de percentagem de proteção contra desenvolvimento de radicais livres medida com o ensaio reportado no exemplo experimental 2, em um tempo de 100 minutos .

[00098] Na seção experimental são reportados em detalhe os experimentos realizados para a avaliação da atividade de removedor da composição da invenção.

[00099] Os experimentos realizados mostraram que a composição da invenção tem boa ação de removedor, capaz de neutralizar radicais livres induzidos por H2O2 (FR); a primeira dose analisada (0,5 mg/ml) reduz a formação de FR de 39-50-53-55 e 56%, respectivamente, após cada tempo de exposição; a segunda dose analisada (0,25 mg/ml) reduz a formação de FR de 40 - 50 - 51 - 49 - 48 e 47%, respectivamente, após cada tempo de exposição; a terceira dose (0,125 mg/ml) reduz a formação de FR de 41 - 43 - 42 - 35 - 32 e 30%, respectivamente após cada tempo de exposição; a quarta dose (0,0625 mg/ml) reduz a formação de FR de 31 - 32 - 30 - 27 - 25 e 23%, respectivamente, após cada tempo de exposição, e a quinta dose (0,0313 mg/ml) inibe significativamente a formação de FR de 30 -26-24-23-22 e 19%, respectivamente, após cada tempo de exposição.

[000100] Ácido ascórbico (0,05 mg/ml) tem uma ação de removedor capaz de reduzir FRs de 45 - 57 - 60 - 60 - 63 e 61% respectivamente após os seis tempos de exposição à tensão,

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25/51 portanto, com valores comparáveis àqueles da primeira dose de composição examinada.

[000101] De acordo com a presente invenção, a composição pode ser feita para administração oral e pode ser feita na forma de tablet, comprimido, grânulos, pó, xarope, fluido, elixir, pulverização, suspensão, emulsão, solução.

[000102] Para administração oral a composição pode ser feita na forma de dosagens unitárias diárias ou de frações de dosagens unitárias diárias (por exemplo, 2, 3, 4, 5, 6 ou mais tablets, comprimidos, grânulos, ou doses únicas de pó, xarope, elixir, pulverização ou fluido pode podem ser ingeridos durante o dia, de acordo com a decisão do médico que trata) e pode conter excipientes convencionais incluindo, por exemplo, agentes de ligação, agentes de espessamento, como gomas (goma tragacanto, goma arábica), gelatina animal e polivinil pirrolidona; diluentes, como açúcar, polialcoois (sorbitol, manitol, xilitol), maltodextrina, sais inorgânicos (fosfato de cálcio bibásico, carbonato de cálcio), desintegrantes, como amido de arroz, amido de milho e amido de batata; lubrificantes, como estearato de magnésio, polietileno glicóis com pesos moleculares diferentes; glidantes, como silica coloidal; agentes antiaderentes, como, por exemplo, talco; agentes umectantes como lauril sulfato de sódio. Os tabletes podem ser revestidos de acordo com métodos bem conhecidos em prática farmacêutica padrão.

[000103] A composição pode ser também feita em uma forma líquida ou semilíquida, como uma suspensão, emulsão, solução para administração oral e pode conter opcionalmente aromatizantes naturais fornecendo um sabor agradável à mesma.

[000104] A composição na forma de pó ou grânulo pode ser

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26/51 dosada previamente em recipientes adequadas e pronta para uso, por ingestão como tal ou para ser resuspensa em um líquido apropriado como água, chá etc. Nesse caso também, a composição pode conter aromatizantes naturais fornecendo um sabor agradável à mesma.

[000105] Evidentemente, todos os excipientes acima indicados podem ser usados em um grau farmaceuticamente aceitável.

[000106] Em uma modalidade, a composição como descrita aqui, em qualquer uma das modalidades acima indicadas, pode estar na forma de composição farmacêutica, isto é, compreende ingredientes do tipo farmacêutico, ou pode ser ou ser introduzido em um alimento médico ou em um dispositivo médico.

[000107] A composição de acordo com a presente descrição pode ser feito na forma de composição farmacêutica ou de dispositivo médico de acordo com qualquer uma das classes descritas em Diretiva 93/42/EEC em dispositivos médicos (compreendendo também substâncias e não somente dispositivos no sentido de objetos).

[000108] No caso de um xarope podem ser usados, além dos componentes ativos acima descritos e um ou mais dos agentes anteriormente descritos (conservantes, agentes de espessamento, excipientes, aromatizante etc.).

[000109] Portanto, em uma modalidade específica da presente invenção, a composição pode consistir em ou compreender os seguintes componentes:

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27/51

Fração de polissacarideo de marshmallow (por exemplo, extrato liofilizado ou seco por pulverização)

Fração de polissacarideo de plátano (por exemplo, extrato liofilizado ou seco por pulverização)

Fração polifenólica de agrimônia (por exemplo, extrato liofilizado ou seco por pulverização)

Opcionais VEÍCULOS, AROMATIZANTES NATURAIS, EXCIPIENTES [000110] Podem estar, por exemplo, nas seguintes proporções:

Tabela 4

Composição geral	%peso/peso
AÇÚCAR MASCAVO	40-60
MEL	20-30
VEÍCULO DE ÁGUA	10-40
Fração de polissacarideo de plátano FOLHAS	0, 1-1
Fração de polissacarideo de MARSHMALLOW	0, 1-1
Fração polifenólica de AGRIMÔNIA	0, 1-1

[000111] A presente invenção também se refere a um processo para a preparação da composição, em que extratos de plátano, de marshmallow e de agrimônia como descrito acima são misturados com mel, açúcar mascavo e um ou mais aromatizantes naturais, conservantes, agentes de espessamento e opcionalmente com excipientes farmaceuticamente aceitáveis.

[000112] Por último, a presente invenção também se refere a um método para o tratamento de tosse seca, tosse produtiva, tosse associada a URTI (infecções de trato respiratório superior) e tosse de gotejamento pós nasal compreendendo a administração de uma dosagem terapeuticamente ativa da composição da invenção a um paciente necessitando do mesmo, em que o

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28/51 paciente pode também estar na idade pediátrica, idade geriátrica, em gestação.

Exemplos de formulação [000113] A seguir, alguns exemplos específicos de formulação líquida são fornecidos que não devem ser entendidos como uma limitação da aplicação.

Tabela 5

EXEMPLO DE COMPOSIÇÃO 1	%peso/peso
AÇÚCAR MASCAVO	30-50
MEL	30-50
Água deionizada e/ou outro excipiente ou veículo adequado	40-60
Fração de polissacarideo de plátano	0, 1-1
Fração de polissacarideo de marshmallow	0, 1-1
Fração polifenólica de agrimônia	0,4-2

Tabela 6

EXEMPLO DE COMPOSIÇÃO 3	%peso/peso
AÇÚCAR MASCAVO	40-60
MEL	20-30
XAROPE DE MANITOL excipiente	10-40
Fração de polissacarideo de plátano FOLHAS	0, 1-1
Fração de polissacarideo de MARSHMALLOW	0,1-1,5
Fração polifenólica de AGRIMÔNIA	0,2-2

Tabela 7

EXEMPLO DE COMPOSIÇÃO 4	%peso/peso
AÇÚCAR MASCAVO	40-60
MEL	20-30
Excipiente de xarope de xilitol	10-40

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29/51

Fração de polissacarideo de plátano FOLHAS	0, 1-1
Fração de polissacarideo de MARSHMALLOW	0,1-1,7
Fração polifenólica de AGRIMÔNIA	0,2-1

Tabela 8

[000114]	EXEMPLO DE COMPOSIÇÃO 5		[000115]	%peso/peso
[000116]	AÇÚCAR	MASCAVO		[000117]	40-60
[000118]	MEL				[000119]	20-30
[000120]	Excipiente de xarope	de
xilitol					[000121]	10-20
[000122]	XAROPE	DE	MANITOL		[000123]	10-20
[000124]	Fração	de	polissacarideo	de
plátano	FOLHAS				[000125]	0, 1-1
[000126]	Fração	de	polissacarideo	de
MARSHMALLOW				[000127]	0,1-1,6
[000128]	Fração		polifenólica	de
AGRIMÔNIA				[000129]	0,3-1

Tabela 9

EXEMPLO DE COMPOSIÇÃO 6	%peso/peso
AÇÚCAR MASCAVO	40-60
MEL	20-30
Água deionizada e/ou outro excipiente ou veículo adequado	10-20
Xarope de glicose	10-20
Xarope de maltitol	10-20
Fração de polissacarideo de PLÁTANO	0,2-1
Fração de polissacarideo de MARSHMALLOW	0,1-1,6
Fração polifenólica de AGRIMÔNIA	0,3-1

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30/51 [000130] Em uma modalidade preferida, em todos os exemplos acima reportados as frações de polissacarídeo e polifenólicas são liofilizadas ou secas por secagem por pulverização.

EXEMPLOS EXPERIMENTAIS [000131] Os seguintes exemplos experimentais têm a finalidade de ilustrar alguns dos ensaios executados na composição da presente invenção.

1. ENSAIO DE MUCOADESÃO [000132] 0 efeito mucoadesivo de um produto, contribuindo para a formação do filme de proteção sobre as membranas de mucosa, pode ser avaliado por modelos in vitro adequados. O modelo usado demonstra que a mucoadesividade de produtos destinados ao tratamento das membranas de mucosa pode ser determinada por avaliação de percentagem de inibição de ligação de lectinaglicoproteína. Células bucais de mucosa são inicialmente tratadas com lectina biotinilada (Con-A), uma proteína contida em algumas Leguminosae (Canavalia ensiformis) tendo uma alta afinidade em relação aos resíduos de glicosídeo e manosídeo presentes nas glicoproteínas da membrana. Os locais das glicoproteínas das membranas de mucosa serão desse modo todos envolvidos com a lectina biotinilada (tratada com biotina, isto é, vitamina H) . as células tratadas com lectina biotinilada, são carregadas com estreptavidina peroxidase, tornando possível formar o complexo de proteína/glicose/lectina/biotina/estreptavidina peroxidase graças à alta afinidade entre biotina e estreptavidina.

[000133] Nesse ponto, as células são lavadas, e o complexo de proteína/glicose/lectina/biotina/estreptavidina peroxidase é quantificado, avaliando a atividade de peroxidase, por meio de

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31/51 uma reação de oxidação da orto-fenileno diamina (avaliação

Na realidade, complexo de proteína/glicose/lectina/biotina/estreptavidina peroxidase catalisará a reação de oxidação:

H₂O₂

O-fenileno diamina

2,3-diaminofenazina (amarelo)

Perox. Estrep.

[000134] A intensidade da coloração amarelo/laranja da solução (medida usando um espectrofotômetro com λ = 450 nm) é proporcional à quantidade de ligações de glicoproteína-lectina portanto, à quantidade de locais disponíveis (glicoproteínas) para mucoadesão.

[000135] 0 valor de absorvência desse modo determinado constitui o controle..

[000136] Ao determinar a mucoadesividade de um produto, as células são tratadas preliminarmente com esse produto (incubação a 30°C por 15 minutos antes do tratamento com lectina).

[000137] Se o produto em exame contiver substâncias mucoadesivas, essas ligarão aos locais de glicosídeo e manosídeo presentes nas glicoproteínas de membrana. Na fase seguinte, com a adição da sequência de lectina biotinilada, estreptavidina peroxidase e orto-fenileno diamina será obtida uma coloração menos intenso, em comparação com o controle, e isso uma vez que parte dos locais de glicosídeo disponíveis para ligação com o Con-A já estavam ocupados pelas substâncias mucoadesivas presentes no produto a ser ensaiado. Na realidade, a ligação inicial entre as substâncias mucoadesivas contidas no produto a ser ensaiado, e os locais de glicosídeo

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32/51 parcialmente compromete a conjugação subsequente do Con-A com o complexo de estreptavidina peroxidase e o desenvolvimento consequente de cor após adição de água oxigenada.

[000138] A diminuição no valor de absorvência é proporcional à capacidade das substâncias em exame mucoaderir a células de mucosa.

[000139] A capacidade mucoadesiva é expressa como uma percentagem de inibição de ligação de glicoproteína/lectina, e representa a percentagem de locais de mucosa ocupados pelo produto de acordo com a expressão.

Percentagem de mucoadesão do produto = (1 -amostra abs/controle abs) x 100 [000140] Além disso, em adição à capacidade mucoadesiva, também é avaliada a resistência da camada mucoadesiva à ação da solução salivar com a qual entra em contato.

[000141] Para essa finalidade, em uma segunda fase do experimento, a resistência ao longo do tempo (0,5 - 2 h) da mucoadesividade do produto após exposição a um fluxo contínuo de solução salivar artificial.

[000142] Para realizar esse ensaio, um sistema de células Franz, em geral sendo usado na avaliação de absorção percutânea de uma substância ou para o estudo de outros processos de permeação através de membranas naturais ou artificiais.

[000143] No experimento, as culturas celulares bucais foram depositadas no doador e foram tratadas com formulações do produto como descrito no ensaio em 2, em diluições diferentes, como reportado na figura 2, (uma diluição em toda probabilidade mais próxima às condições reais que poderíam

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33/51 ocorrer in vivo) . 0 doador foi então alimentado com um fluxo continuo (2 ml/min.) de soluço salivar artificial, por uma bomba peristáltica.

[000144] Na base do doador, na zona de separação com o receptor, uma membrana de acetato de celulose foi colocada capaz de permitir saida da solução salivar a partir do doador para o receptor, retendo as células de mucosa no doador.

[000145] 0 fluxo salivar através das células de mucosa tratadas com o produto em exame foi regularmente descontinuado após 0,5, 1, 2 horas e as células do doador transferidas para um tubo de teste adequado para avaliação de mucoadesividade.

[000146] À luz dos resultados obtidos, é possivel declarar que o produto, demonstrando possuir boa mucoadesividade resistente, pode desempenhar um papel de proteção interessante em células de mucosa do trato oral.

[000147] Para simular a diluição natural de um xarope na cavidade oral, os ensaios de mucoadesividade foram realizados em um produto diluído 1:2, para integridade maior, também a mucoadesividade do produto diluído 1:5 foi avaliada.

[000148] A percentagem de mucoadesividade de produto não diluído, ou diluído (1:2 e 1:5) em direção a células bucais humanas é reportada na figura 1.

[000149] A resistência da camada mucoadesiva obtida com o produto diluído 1:2 em tempos diferentes, 0,5 h, 1 h e 2 h em direção a uma solução salivar simulada (0,9% de solução fisiológica de NaCI) é mostrada na figura 2.

2. ENSAIO DE ATIVIDADE ANTIOXIDANTE DO TIPO REMOVEDOR [000150] A avaliação de atividade antioxidante da amostra em células humanas expostas a tensão oxidativa progressiva do tipo químico.

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34/51 [000151] A avaliação de ação antioxidante é obtida da quantificação de formação de radical livre em células expostas à amostra e à tensão oxidativa.

[000152] 0 método aplicado é baseado no uso da sonda fluorimétrica 2,7 acetato de diclorofluoresceína -DCA-; essa sonda penetra em células, se liga a proteínas de membrana de célula e macromoléculas. Nessa forma, a sonda não é fluorescente somente se tornando fluorescente quando oxidada por radicais livres. As células pré-tratadas com DCA são expostas às várias diluições da amostra e peróxido de hidrogênio. Em intervalos regulares de 20 minutos a 100 minutos (5 medições), a formação de radical livre é avaliada com um fluorímetro (Victor X4 Perkin Elmer): a ação removedora é obtida por uma comparação de radicais livres produzidos por células expostas à amostra e a peróxido de hidrogênio e aqueles expostos ao peróxido de hidrogênio único.

[000153] Composições de acordo com os exemplos 2, 4 e 6 foram preparados.

[000154] 1 g de composição consistindo em 0,2% peso/peso de fração de polissacarideo de marshmallow. 0,35% de fração de polissacarideo de plátano, 0,2% de fração polifenólica de Agrimônia contendo taninas, 25% de mel (para composições 4 e 6, e 35% para composição 2), 46,6% de açúcar mascavo e veículos e excipientes farmaceuticamente aceitáveis (de acordo com os exemplos respectivos) foi pesada e levada até um volume final de 10 ml (10 mg/ml) em solução salina. A solução ensaiada tinha um pH maior que 7. Começando dessa solução mãe, a primeira diluição foi preparada em uma concentração de 0,5 mg/ml em solução salina; a partir daí, por aplicar um fator de diluição de 1:2, as outras quatro diluições foram obtidas.

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35/51 [000155] Outras composições de acordo com os exemplos de composição acima foram também ensaiadas, fornecendo resultados análogos. A ausência de atividade antioxidante dos veículos e excipientes usados nas composições também foi verificada. Concomitantemente com a composição, também um controle positivo e o controle interno foram analisados. Controle positivo: células expostas à 500 qm de solução de H2O2.

[000156] Controle interno: células expostas a uma solução de ácido ascórbico (0,05 mg/ml).

[000157] Controle negativo: células expostas ao meio de inoculação.

[000158] 0 ensaio foi realizado em um modelo de célula simples consistindo em uma monocamada de ceratócitos humanos estabilizados (células foram adquiridas de IZSLER e são garantidas como livres de qualquer contaminação bacteriana/viral e/ou de microplasma).

[000159] Descrição de reagentes/soluções e abreviaturas relacionadas:

Soro de vitelo fetal

FCS

Sulfato de dodecila de sódio

SDS

Meio de cultura: Dulbecco High Glucose (D-MEM) concluída com glutamina (2mM), antibióticos como penicilina (2000 Ul/ml)estreptomicina (1000 Ul/ml)-Fungizone (2pg/ml) e soro de vitelo Fetal (10%), hidrocortisona 0.5ng/ml, Insulina 5pg/ml, fator de crescimento epitelial 0.01pg/ml DMEM

Meio de inoculação: Dulbecco High Glucose (D-MEM) concluída com glutamina (2mM), antibióticos como penicilina (2000 Ul/ml)- estreptomicina (1000 Ul/ml)-Fungizone (2pg/ml) e soro de vitelo fetal (5%), hidrocortisona 0.5ng/ml, Insulina 5pg/ml, Fator de crescimento epitelial 0.01pg/ml DMEMi

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36/51

Tampão de fosfato PBS

Solução de trabalho vermelha neutra: 0,4% de solução de material é diluída em Meio essencial mínimo (MEM), filtrado em papel imediatamente antes do uso. A concentração de uso é 0,04% NRw

Fluido de extração vermelho neutro: preparado alguns minutos antes do uso, consistindo em 49% de água destilada - 50% Etanol - 1% ácido acético glacial ExB

2,7 Diacetato de diclorofluoresceína: 4pm DCA [000160] Dosagens, via de administração e réplicas analíticas [000161] Duas series (na presença e ausência de H2O2) de cinco diluição de base 2 da amostra: de 0,5 - 0,25 - 0,125 - 0,0625 e 0,0313 mg/ml, foram montadas. O mesmo procedimento foi realizado para obter as mesmas cinco diluições em uma solução de 500μΜ H₂O2 em solução salina. 150μ1 por cada diluição (em solução salina e em H2O2) foram distribuídas em quatro cavidades em duas placas diferentes.

Dia 1

Semeadura de célula [000162] Células cultivadas foram desprendidas enzimaticamente do meio de crescimento e contadas com um Contador de célula eletrônico (Scepter); uma suspensão de células foi preparada (em meio de inoculação) na densidade de 300.000 células/ml, que foram então distribuídas em placas de 96 cavidades: 100μ1 por cavidade, obtendo uma densidade de semeadura de 30.000 células por cavidade. Por último, as placas foram colocadas de volta na cultura em um incubador a 37°C e de atmosfera úmida enriquecida com CO2 a 5% pelas 24 horas subsequentes.

Dia 2

Exposição à sonda de DCA

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37/51 [000163] O meio de inoculação foi removido, as células foram lavadas uma vez com PBS, a seguir PBS foi descartado e 150 μΐ de DCA (4μΜ) foram distribuídos nas duas placas. A seguir, as placas foram colocadas de volta no incubador a 37 °C e atmosfera enriquecia com CO2 a 5% por 15 minutos.

[000164] Ao término do período de incubação de DCA, a solução foi removida e as células foram lavadas uma vez com PBS, a seguir 150 μΐ das diluições acima descritas da amostra e dos controles foram distribuídas nas placas. A seguir, a formação de radical livre foi medida a partir de TO (logo após inoculação nas duas placas) a cada 20 minutos, até 100 minutos (5 medições) com um fluorímetro. Ao término das medições após 100 minutos, o inoculado das duas placas foi removido e ensaio de vitalidade de Absorção Vermelho neutro foi executado.

[000165] As células foram deixadas contatar 150μ1 de NRw por 3 horas a 37 °C em um incubador com atmosfera enriquecida com CO2 a 5%. Vermelho neutro (NR) penetra nas células e é armazenado em lisossomos. Somente células vitais que mantiveram a funcionalidade de membrana intacta serão capazes de reter NR. Por conseguinte, quanto maior o número de células vitais, maior a quantidade de NR armazenada nas células. Ao término das três horas de incubação, as placas foram coletadas, a solução de NR foi removida, e as células foram submetidas a lavagens com 150 μΐ de PBS para eliminar NR em excesso. A seguir, a extração de Vermelho neutro acumulado em lisossomos foi realizada por aplicar, em cada cavidade, 150μ1 de ExB. O estágio de extração foi prolongado por 15 minutos sob agitação em temperatura ambiente. Desse modo, um fluido Vermelho é obtido cuja intensidade, proporcional ao número de células

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38/51 vitais presentes, é medido por leitura espectrofotométrica a 570130 nm.

[000166] A intensidade de fluorescência emitida e de Vermelho neutro extraído em placas com 96 cavidades foi medida por leitura fluorimétrica e espectrofotométrica a 540 nm com uma leitora de placa Victor X4 (Perkin Elmer).

Avaliação de resultado e cálculo

Detecção de taxa de sobrevivência %Vitalidade=[(amostra de O.D. ± H₂O₂/ O.D.

ControlPos/Neg)xlOO] % de inibição de Vitalidade = (100—% Vitalidade)

O.D.: densidade ótica

O.D. amostra ± H₂O₂: média de densidade ótica, obtida de células expostas à amostra com e sem H₂O₂

O.D. controle positive/negative: meios de densidade ótica obtidos das células expostas à solução de H₂O₂ou à solução salina única (100% Vitalidade) [000167] Avaliação de atividade antioxidante de removedor [000168] F.U.: unidade de fluorescência [000169] F.U. controle positivo: média de F.U. emitida das células expostas à solução de H₂O₂ (produção máxima de radicais livres) [000170] F.U. controle negativo: média de F.U. emitido de células não expostas à tensão oxidativa [000171] Em cada intervalo de tempo de exposição (T0-T1-T2-T3T4-T5) foram realizados:

1) Normalização [000172] A média de F.U. emitida das células expostas à amostra, para vitamina C sem tensão oxidativa, é subtraída da média de F.U. emitida das células expostas à amostra, para

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39/51 vitamina C e tensão oxidativa. Em outras palavras, os valores médios de fluorescência emitida da placa sem tensão foram subtraídos dos valores médios de fluorescência emitida a partir da placa com tensão.

2) Cálculo da percentagem de redução de radical livre:

[000173] % FR de inibição = [000174] [100-(E.U. Sample_pos-F. U. Sample_neg) / (U. F. Control_posU. F. Control_neg) *100] [000175] F.U. Sample_pos: células expostas à amostra e à tensão oxidativa [000176] F.U. Sample_neg: células expostas à amostra única [000177] F.U. Control_pos: células expostas à tensão oxidativa única [000178] F.U. Control_neg: células expostas à solução salina sem tensão oxidativa

Critérios de aceitação de estudo [000179] amostra- controle negative e positivo: coeficiente de variação deve ser <20%.

[000180] Coeficiente de variação [000181] VC= ( (sd/OD_average) xlOO) [000182] Valor p (teste t de duas caudas tipo 2) deve ser mais baixo que 0,05%.

[000183] A Tabela abaixo reporta dados relacionados ao desenvolvimento de radical livre. Os dados são reportados, processados na figura 5.

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Tabela 10

	Composição da invenção
mg/ml	DESENVOLVIMENTO DE RADICAL LIVRE
	0,5 mg/ml	0,25 mg/ml	0,125 mg/ml	0,063 mg/ml	0,03 mg/ml	Vit, C0,05mg/ml	Controle neg,
para	6311,67	6178	6072	7070	7237	5654	10315
20 MIN	7026	6984	7993	9473	10308	5993	14015
40 MIN	6643	6945	8228	10021	10758	5721	14248
60 MIN	6192	6716	8543	9582	10140	5240	13120
80 MIN	5952	6813	8861	9797	10173	4802	12789
100 MIN	5534	6643	8857	9649	10181	4937	12600

[000184] Os dados reportados na tabela mostram que, em diluições de 0,5 mg/ml e 0,25 mg/ml, os valores obtidos com a composição da invenção são comparáveis com aqueles obtidos com a vitamina C.

[000185] Os dados obtidos foram então processados em termos de % de proteção a partir de radicais livres exercida por substâncias analisadas.

[000186] A Tabela abaixo reporta dados relacionados aos resultados obtidos. O reportado na tabela abaixo foi graficamente processado na figura 6.

Tabela 11

	Composição da invenção
mg/ml	% de proteção de radicais livres
	0,5 mg/ml	0,25 mg/ml	0,125 mg/ml	0,063 mg/ml	0,03 mg/ml	Vit, C 0,05mg/ml
para	39	40	41	31	30	45
20 MIN	50	50	43	32	26	57
40 MIN	53	51	42	30	24	60
60 MIN	53	49	35	27	23	60
80 MIN	55	48	32	25	22	63
100 MIN	56	47	30	23	19	61

[000187] Os dados reportados na tabela mostram que, em diluições de 0,5 mg/ml e 0,25 mg/ml, os valores obtidos com a composição da invenção são comparáveis com aqueles obtidos com vitamina C.

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41/51 [000188] A Tabela abaixo reporta a significância estatística de resultados obtidos.

Tabela 12

	Composição da invenção
mg/ml	Significância estatística (valor p)
	0,5 mg/ml	0,25 mg/ml	0,125 mg/ml	0,063 mg/ml	0,03 mg/ml	Vit, C 0,05mg/ml
para	9,26E-11	l,72E-10	8,79E-11	8,61E-09	5,25E-09	7,10E-ll
20 min	l,92E-09	3,38E-09	3,04E-08	l,05E-06	4,93E-06	6,88E-10
40 min	6,56E-10	l,41E-09	l,57E-08	l,27E-06	8,58E-06	2,04E-10
60 min	3,23E-09	2,14E-08	4,76E-07	l,54E-05	7,96E-05	8,91E-10
80 min	l,44E-06	6,42E-06	3,54E-04	3,12E-03	8,32E-03	2,62E-07
100 min	4,43E-07	3,20E-06	3,22E-04	2,42E-03	8,19E-03	l,71E-07

[000189] Como é evidente a partir da Tabela acima, análise estatística de resultados obtidos confirmou que o teste realizado atende todos os critérios de aceitação exigidos, portanto validando os dados gerados para substâncias examinadas.

[000190] Resumindo o acima, os ensaios realizados nas amostras da composição da invenção em várias modalidades como descrito acima demonstraram que a composição tem uma boa ação de remoção, capaz de neutralizar radicais livres induzidos por H2O2 (FR): a primeira dose analisada (0.5 mg/ml) reduz formação de FR de 39-50-53-53-55 e 56%, respectivamente, após cada tempo de exposição. Em virtude desse resultado, essa dose pode ser considerada a dose mais eficaz.

[000191] A segunda dose analisada (0,25 mg/ml) reduz a formação de FR de 40 - 50 -51 - 49 - 48 e 47%, respectivamente, após cada tempo de exposição.

[000192] Na Terceira dose (0,125 mg/ml), formação de FR é reduzida de 41 - 43 - 42 - 35 -32 e 30%, respectivamente, após cada tempo de exposição.

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42/51 [000193] Na quarta dose (0,0625 mg/ml) a formação de FR é reduzida de 31 - 32 - 30 -27 - 25 e 23%, respectivamente, após cada tempo de exposição.

[000194] A quinta dose (0,0313 mg/ml) inibe significativamente a formação de FR de 30- 26 - 24 - 23 - 22 e 19%, respectivamente, após cada tempo de exposição.

[000195] Ácido ascórbico (0,05 mg/ml) tem uma ação de removedor capaz de reduzir FRs de 45 - 57 - 60 - 60 - 63 e 61%, respectivamente, após as seis vezes de exposição a tensão.

[000196] Ensaio de vitalidade de absorção de Vermelho neutro, executado na placa não exposta à tensão oxidativa, não destacou redução de vitalidade de célula de modo a comprometer a significância do ensaio.

[000197] Por conseguinte, a composição da invenção, levando em conta a alta força de tensão aplicada, provou ser um bom agente de remoção.

3. AVALIAÇÃO

DE ESTABILIDADE

DA COMPOSIÇÃO DA

INVENÇÃO [000198] A estabilidade da composição da invenção em forma fluida (xarope, conforme exemplos acima, em 2) com relação a taninas foi avaliada por medir o teor de taninas totais, expresso como pirogalol por meio do método espectrofotométrico descrito na Farmacopeia européia (EP 9.2, 2.8.14) para agrimônia.

[000199] Como pode ser observado a partir dos dados reportados na Tabela abaixo, nenhuma alteração em título é observada no espaço de seis meses, mantendo a amostra sob condições extremas, a 40°C e 75% de umidade relativa.

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43/51 [000200] Vitamina C, em preparações que diferiram em formulação unicamente devido à presença de vitamina C em lugar das taminas, não apresentou estabilidade além de TO.

	Taninas como Pyrogallol
Ponto de verificação	T0	T3 meses	T6 meses
Estabilidade acelerada (40°C, RH 75%)	0.05	0.05	0.05

4. ENSAIO DE EFEITO DE BARREIRA [000201] Para o ensaio de efeito de barreira, duas câmaras fisicamente separadas por uma membrana semipermeável (poros de 0,4 μη) foram usadas. Células de fibroblasto humanas foram semeadas na câmara inferior, ao passo que o agente inflamatório LPS (lipopolissacarídeo de E. coli purificado) foi introduzido na câmara superior; na membrana semipermeável separando as duas câmaras um filme fino da composição como descrito na presente invenção foi estratifiçado.

[000202] A resposta inflamatória induzida foi estimada através de dosagem semiquantitativa de citocina de interleucina 6 (IL6) liberada no meio de cultura da câmara inferior: avaliação de efeito de barreira foi obtida por comparação com o controle positivo no qual as duas câmaras foram separadas pelo mesmo tipo de membrana semipermeável, livre, entretanto de qualquer barreira.

[000203] Com relação ao valor de limiar acima que pode ser dito que uma substância causa um efeito de barreira no ensaio reportado aqui, um valor igual a 15% de inibição em comparação com o controle foi identificado pelos inventores, durante a montagem do ensaio, com base em ensaios realizados em substâncias conhecidas como tendo um efeito de barreira.

[000204] Então, o efeito de barreira da composição nas formulações em 2 acima foi avaliado.

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44/51 [000205] Os dados reportados na figura 3 mostram como a composição tem um efeito de barreira notável.

[000206] 0 ensaio de avaliação foi realizado como a seguir, através de um método desenvolvido para simular in vitro a ação de proteção de substâncias e formulações que, quando aplicadas à pele e membranas de mucosa in vivo, formam um filme isolante contra agentes ambientais.

[000207] 0 modelo tira proveito do princípio pelo que células submetidas a contato com um agente inflamatório produzem e secretam mediadores pró-inflamatórias (citocinas) no ambiente extracelular em uma quantidade relacionada ao grau de inflamação causada. Quanto maior a quantidade de agente inflamatório que atinge as células, maior a quantidade de citocinas liberadas.

[000208] Duas câmaras foram montadas, fisicamente separadas por uma membrana semipermeável que permite o trânsito de solutos dimensionados suficientemente pequenos.

[000209] Na câmara inferior, consistindo em uma cavidade contendo placas para culturas de célula, células HuDe (no. BS PRC 41, adquirido do Instituto Xooprofilattico di Breschia, Itália) são cultivadas, enquanto a câmara superior, consistindo em uma inserção para culturas de célula complexas (transwells) acomoda o agente inflamatório.

[000210] Na superfície da membrana semipermeável da inserção separando as duas câmaras.

[000211] Na superfície da membrana semipermeável da inserção separando as duas câmaras, antes da introdução do agente inflamatório na câmara superior, um filme fino da amostra sendo examinado é estratifiçado para avaliar qualquer BE após o trânsito livre do agente inflamatório.

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45/51 [000212] Dependendo das capacidades isolantes da amostra, terá havido uma diminuição da migração doa gente inflamatório a partir da câmara superior e, como consequência, uma estimulação menor das células para produzir citocinas. A extensão da reação inflamatória é estimada através da dosagem semiquantitativa de citocinas liberadas no meio de cultura da câmara inferior, em particular de interleucina 6 (IL-6).

[000213] Como controle um experimento similar é usado no qual nenhuma amostra é estratifiçada na membrana, desse modo tornando possível medir o efeito do agente inflamatório sem qualquer barreira além da membrana semipermeável.

[000214] Além disso, um controle interno é usado no qual as células cultivadas são pré-tratadas com a substância adaptada para induzir liberação de marcador e a amostra é colocada na membrana semipermeável na ausência da substância, uma ou mais medições em tempo são desse modo realizadas da quantidade de marcador no meio de cultura do controle interno. No controle interno, as células são, portanto, estimuladas primeiramente com a substância de indução e então tem de ser avaliado se a amostra que pode passar pela membrana e entrar nas células empurradas pelo meio acima tem qualquer efeito na diminuição da liberação do marcador não relacionado ao efeito de barreira. Por exemplo, quando um agente inflamatório é usado como a substância de indução, o controle interno torna possível entender se a redução na concentração de citocinas no meio de cultura é devido ao efeito de barreira ou se a amostra que pode passar para dentro das células empurradas pelo meio acima tem qualquer efeito na redução da resposta inflamatória independentemente do efeito de barreira.

[000215] 0 efeito de barreira (BE) é expresso como uma

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46/51 percentagem da redução da liberação de IL-6 e é calculado através da comparação com o controle positivo no qual as duas câmaras são separadas pelo mesmo tipo de membrana semipermeável sem a barreira criada pela amostra.

4.1 PREPARAÇÃO DA CULTURA DE CÉLULA [000216] Para cada amostra ensaiada (conforme 2. Acima), células de linhagem HuDe foram semeadas nas cavidades de uma placa de cultura de células, uma para o ensaio de barreira (T.B.)(BA) e outra para o controle interno em uma densidade de 40.000 células/ml em meio MEM suplementado com soro bovino a 10% (FBS); 1 ml de suspensão de célula por cavidade.

[000217] As células foram tratadas com a AMOSTRA (CAM), com o

CONTROLE POSITIVO (C+) (agente inflamatório sem amostra) e com o CONTROLE NEGATIVO (C-) (meio somente) e cada ensaio foi realizado em triplicata.

4.2 PREPARAÇÃO DE INSERÇÕES PARA CULTURAS DE CÉLULA COMPLEXA [000218] Inserções de Cultura de célula (Becton Dickinson) para culturas de célula complexa foram colocadas em outras placas, e em cada uma delas uma quantidade fixa de colágeno de 0,1 mg/ml foi fornecida. As placas foram incubadas a 37°C, durante a noite (22-24 horas).

[000219] Para prosseguir com o experimento, uma confluência não inferior a 95% é esperada.

[000220] A partir das duas placas (BA e IC) com as inserções o colágeno foi removido, e as inserções foram deixadas sob o fluxo do capuz pelo tempo necessário para deixar as mesmas secarem totalmente (10+15 minutos).

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4.3 ENSAIOS DE BARREIRA (BA) [000221] As etapas descritas abaixo foram realizadas na placa de cultura para o BA.

Montagem da camada de amostra no BA:

[000222] Na membrana semipermeável da amostra, 100 μΐ de uma composição baseada em 0,5% de alginato foram inoculados e deixados estratificar por 20 minutos, enquanto nas inserções C+ e C- nada foi adicionado. Após decorrer 20 minutos, a amostra em excesso foi eliminada e as membranas lavadas com PBS de acordo com procedimentos especificados pelo protocolo.

Adição de LPS (agente inflamatório) a inserções de BA [000223] Após a camada de amostra ter secado, conforme exemplo em 2. Acima, nas três primeiras inserções CAM e nas três C+, 300 μΐ da solução de LPS (lipopolissacarídeo de membrana) foram inoculados na concentração de 1 qg/ml, enquanto nas três restantes de C- 300 μΐ de meio MEM com 5% FBS foram adicionados. As inserções foram inseridas em suas cavidades respectivas com as células e as placas foram incubadas por 1 h a 37°C e sob uma atmosfera enriquecida com CO2 a 5% durante a noite (22-24 horas).

[000224] Após completar a incubação de 1 h, as inserções foram removidas e descartadas e as placas foram incubadas novamente durante a noite (22-24 horas).

4.4 ENSAIO DE CONTROLE INTERNO (IC) [000225] O ensaio de controle interno foi realizado concomitantemente com o BA.

Exposição de células IC a LPS:

[000226] Após secas, nas seis primeiras inserções de IC, três para a amostra a ser analisada, CAM, e três para C+, 300 μΐ da

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48/51 solução LPS foram inoculados, enquanto nas três restantes de C- 300 μΐ do meio foram adicionados.

[000227] As inserções com LPS e MEM foram então inseridas nas cavidades com células IC e todas incubadas por 1 h.

[000228] Remoção de LPS e secagem de membra IC:

[000229] Após completar a incubação de 1 h, as inserções foram removidas das cavidades com as células e transferidas para a placa vazia, enquanto a placa com as células foi colocada em um incubador.

[000230] A solução de LPS ainda presente foi removida das inserções, as últimas foram submetidas a uma lavagem rápida com água estéril ultrapura e deixadas secar.

Disposição de camada de amostra no IC:

[000231] Na membrana semipermeável das três inserções para a amostra, 100 μΐ de uma composição baseada em alginato a 0,5% foram inoculados e deixados estratificar por 20 minutos, enquanto nas inserções C+ e C- nada foi adicionado. Após passar 20 minutos, a amostra em excesso foi eliminada, e as membranas foram lavadas com PBS de acordo com procedimentos especificados pelo protocolo.

Adição de LPS a inserções de IC [000232] Após as inserções com a amostra estarem prontas, 300 μΐ de meio foram adicionados a todas as inserções (CAM, C+, C) . As inserções foram inseridas em suas cavidades respectivas com as células e as placas incubadas por lha 37°C.

[000233] Após concluir a incubação de 1 h, as inserções foram removidas e descartadas e as placas incubadas novamente durante a noite (22-24 horas).

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4.5 COLETA DE SOBRENADANTE E IMUNOENSAIO DE ENZIMAS [000234] Após decorrer 22-24 horas, os sobrenadantes foram coletados de BA e placas de IC para executar o ensaio ELISA e a dosagem semi-quantitativa de IL-6.

AVALIAÇÃO DE EFEITO DE BARREIRA (BE) [000235] O BE de uma substância ou composto é expresso como % de redução na liberação de citocina IL-6 por células expostas a LPS onde a amostra foi ensaiada em relação ao controle positivo (C+) em que as células foram somente expostas a LPS.

BE = % de redução em liberação de citocina IL-6 = 100 - [(pg/μΐ de citocina liberada da amostra / pg/μΕ de citocina liberada de C+) x 100] [000236] Como pode ser visto dos resultados nas figuras 1-4, a composição da invenção tem excelentes propriedades mucoadesivas e um efeito de barreira alta.

[000237] Aparentemente, portanto, além de atividade de remoção de radical livre e estabilidade ao longo do tempo, a composição tem também efeito de barreira e propriedades mucoadesivas altas.

5. PREPARAÇÃO DE FRAÇÕES

1. Exemplo de preparação de fração de polissacarídeo (mucilagem) de Marshmallow [000238] Raiz de marshmallow seca e em farelo é submetida à extração por água, em um extrator estático por digestão percolada, com a planta imersa em solvente e o solvente reciclado do fundo para cima por uma bomba mecânica.

[000239] A razão de droga-solvente (DSR) é igual a 1:10, temperatura de extração é de 90°C, extensão de extração é 12 horas. A partir da mistura resultante, o resíduo insolúvel é

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50/51 separado da fração solúvel por decantação estática e subsequentemente por filtração em filtro de papel. A solução resultante é concentrada por evaporação de etanol, pelo uso de um sistema de concentração a vácuo. Após atingir um grau de concentração de 10:1, a concentração é descontinuada e a secagem é concluída por liofilização ou secagem por pulverização. O material liofilizado constitui a fração de interesse (DER 4-10:1).

2. Exemplo de preparação de fração de polissacarídeo de plátano [000240] Folhas de plátano secas e esfareladas são submetidas à extração por etanol 50% (etanol: água 50:50 v/v) em um extrato estático por digestão percolada, com a planta imersa em solvente e o solvente reciclado do fundo para cima por uma bomba mecânica. A razão de droga-solvente (DSR) é igual a 1:10, a temperatura de extração é de 50°C, extensão de extração é 6-8 horas. A partir da mistura resultante, o resíduo insolúvel é separado da fração solúvel por decantação estática e subsequentemente por filtração em filtro de papel. A solução resultante é concentrada por evaporação de etanol, pelo uso de um sistema de concentração a vácuo. Após atingir um grau de concentração de 10:1, a concentração é descontinuada, e a secagem é concluída por liofilização ou secagem por pulverização. O material liofilizado constitui a fração de interesse (DER 4-10:1).

3. Exemplo de preparação de fração polifenólica de Agrimônia [000241] Topos de agrimônia secos e esfarelados são submetidos a extração por água, em um extrato estático por digestão

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51/51 percolada, com a planta imersa em solvente e o solvente reciclado do fundo para cima por uma bomba mecânica.

[000242] A razão de droga-solvente (DSR) é igual a 1:8, a temperatura de extração é de 90°C, extensão de extração é 12 horas. A partir da mistura resultante, o resíduo insolúvel é separado por decantação estática e subsequentemente por filtração em filtro de papel. A partir da mistura resultante, o resíduo insolúvel é separado da fração solúvel por decantação estática e subsequentemente por filtração em filtro de papel. A solução resultante é concentrada por evaporação de etanol, pelo uso de um sistema de concentração a vácuo. Após atingir um grau de concentração de 10:1, a concentração é descontinuada, e a secagem é concluída por liofilização ou secagem por pulverização. O material liofilizado constitui a fração de interesse (DER 4-10:1) .

Claims

- REIVINDICAÇÕES 1. COMPOSIÇÃO PARA USO NO TRATAMENTO DE TOSSE, caracterizada por compreender uma ou mais frações de polissacarídeo de plátano, uma ou mais frações de polissacarídeo de marshmallow, uma ou mais frações polifenólicas de agrimônia compreendendo taninas, açúcar mascavo, mel e um ou mais veículos e/ou excipientes farmaceuticamente aceitáveis.

2 . Composição para uso, de acordo com a reivindicação 1, caracterizada por uma ou mais frações de polissacarídeo de plátano compreenderem polissacarídeos tendo um peso mole cular mais alto que 2. 0000 Dalton em uma percentagem em peso maior ou igual a 3%. 3. Composição para uso, de acordo com a reivindicação 1 ou de acordo com a reivindicação 2, caracterizada por uma ou mais frações de polissacarídeo de marshmallow compreenderem polissacarídeos tendo um peso molecular mais alto que 2 . 0000 Dalton em uma percentagem em

peso maior ou igual a 5%.

4. Composição para uso de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 3, caracterizada por uma ou mais frações polifenólicas de agrimônia compreendendo taninas compreenderem polifenóis em uma percentagem em peso maior ou igual a 3%.

5. Composição para uso de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 4, caracterizada por os excipientes serem selecionados de aromatizantes naturais, conservantes, agentes de espessamento.

6. Composição para uso, de acordo com a reivindicação 5, caracterizada por um ou mais aromatizantes naturais, conservantes, agentes de espessamento serem

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2/2 selecionados de suco de limão, suco de amora, sabor de laranja natural, sabor de limão natural, sabor de murta natural, goma xantana.
7. Composição para uso de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 6, caracterizada por os extratos estarem em forma liofilizada ou seca por pulverização.
8. Composição para uso de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 7, caracterizada por estar na forma de tablete, pílula, grânulos, pó, xarope, elixir, gelatina dura, gelatina mole, suspensão, pulverização, emulsão, solução.
9. Composição para uso de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 8, caracterizada por terem uma percentagem de mucoadesão medida com uma inibição de ligação de lectina entre 85% e 50% quando não diluído ou diluído até um máximo de 1:5.
10. Composição para uso de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 9, caracterizada por o tratamento ser um tratamento para tosse seca, tosse produtiva, tosse associada a URTI (infecções do trato respiratório superior), tosse de gotejamento pós nasal.
11. PROCESSO PARA A PREPARAÇÃO DE UMA COMPOSIÇÃO, consistindo em fração/ões de polissacarídeo de plátano, fração/ões de polissacarídeo de marshmallow, fração/ões polifenólicas compreendendo taninas de agrimônia, açúcar mascavo, mel e um ou mais de veículos e excipientes farmaceuticamente aceitáveis, em que fração/ões de polissacarídeo de plátano, fração/ões de polissacarídeo de marshmallow, fração/ões polifenólicas de agrimônia, caracterizado por compreender taninas que são misturadas com mel, açúcar mascavo, e um ou mais excipientes e veículos farmaceuticamente aceitáveis.